Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây đơn châu chấu ( aralia armata (wall )seem )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY ĐƠN CHÂU CHẤU ARALIA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY ĐƠN CHÂU CHẤU

(ARALIA ARMATA (Wall.) Seem.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY ĐƠN CHÂU CHẤU

(ARALIA ARMATA (Wall.) Seem.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển

2 Ts Phương Thiện Thương

HÀ NỘI 2013

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển - người thầy đã tận tình chỉ bảo, luôn

động viên, hỗ trợ, dành nhiều thời hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Ts Phương Thiện Thương - người thầy đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi

điều kiện và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội, tập thể khoa Hóa phân tích, khoa Dược lí – Viện Dược liệu đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các bạn, các anh chị em chuyên nghành Dược liệu - Dược cổ truyền đã chia sẻ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân, các bạn sinh viên đã luôn đồng hành, động viên, khích lệ tôi giúp tôi vượt qua khó khăn trong thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2013

Học viên

Ngô Thị Huyền Trang

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 THỰC VẬT 3

1.1.1.Vị trí phân loại của chi Aralia L 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Aralia L 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Aralia armata (Wall.) Seem 4

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 5

1.2.1 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Aralia L 5

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Aralia armata (Wall.) Seem 18

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC 20

1.3.1 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Aralia L 20

1.3.2 Tác dụng sinh học của Aralia armata (Wall.) Seem 25

1.3.3 Công dụng của Aralia armata (Wall.) Seem 26

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 ÐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Thiết bị 27

2.2.2 Dung môi, hóa chất, thuốc thử 28

2.2.3 Súc vật thí nghiệm 29

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 29

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 30

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học 30

2.3.3.1 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu 30

2.3.3.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa in vivo của cao Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu 34

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 36

3.1.1 Đặc điểm hình thái 36

3.1.2 Đặc điểm giải phẫu 38

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá 38

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu thân 39

3.1.2.3 Đặc điểm vi phẫu rễ 41

3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 42

3.1.3.1 Đặc điểm bột lá Đơn châu chấu 42

3.1.3.2 Đặc điểm bột thân Đơn châu chấu 43

3.1.3.3 Đặc điểm bột rễ Đơn châu chấu 44

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 45

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây Đơn châu chấu bằng phản ứng hóa học 45

3.2.2 Chiết xuất các chất trong thân cây Đơn châu chấu 55

3.2.3 Định tính cắn các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng 57

3.2.4 Phân lập và xác định cấu trúc các thành phần trong thân 61

3.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học 67

3.3.1 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu 67

3.3.1.1 Phương pháp xác định khả năng dọn gốc tự do DPPH 67

3.3.1.2 Phương pháp xác định khả năng dọn gốc tự do Superoxid 69

3.3.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa in vivo của cao Ethanol toàn phần của thân Đơn châu chấu 70

3.3.2.1 Tác dụng bảo vệ gan 70

3.3.2.2 Tác dụng chống oxy hoá 74

Chương 4 BÀN LUẬN 76

4.1 Về thực vật 76

4.2 Về hóa học 76

4.3 Về tác dụng sinh học 77

4.3.1 Tác dụng chống oxy hóa in vitro 78

4.3.2 Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo 79

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy

IR: Infrared Spectroscopy

MDA: Malonyl dialdehyd

3 Bảng 3.3 Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ, thân, lá

Đơn châu chấu bằng phương pháp hóa học 54

4 Bảng 3.4 Số liệu phổ 1

H- và 13C-NMR chất DC-1 66

6 Bảng 3.6 Hoạt tính dọn gốc superoxid 69

7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của cao Đơn châu chấu lên hoạt độ

enzym ALT trong huyết thanh chuột của các lô thí nghiệm 71

8 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của cao Đơn châu chấu lên hoạt độ

enzym AST trong huyết thanh chuột của các lô thí nghiệm 72

9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của cao Đơn châu chấu lên hàm lượng

bilirubin trong huyết thanh chuột của các lô thí nghiệm 72

10

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của cao Đơn châu chấu lên hàm lượng

MDA trong gan chuột của các lô thí nghiệm (nmol/100mg

gan)

74

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số Diterpen đƣợc phân lập từ

2 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số Triterpen đƣợc phân lập từ

3 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số Flavonoid đƣợc phân lập từ

4 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của một số Coumarin đƣợc phân lập từ

5 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của một số Phenylpropanoid đƣợc

phân lập từ một số loài thuộc chi Aralia L 14

5 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của một số Alcaloid đƣợc phân lập từ

một số loài thuộc chi Aralia L

15

6 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của một số Lignan đƣợc phân lập từ

7 Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của một số chất đƣợc phân lập từ

Aralia cachemirica, chi Aralia L

17

8 Hình 1.9 Cấu trúc hóa học của các saponin đƣợc phân lập từ loài

Aralia armata

19

9 Hình 3.10 Ảnh hình thái cây Đơn châu chấu 37

11 Hình 3.12 Vi phẫu thân cây Đơn châu chấu 40

12 Hình 3.13 Tinh thể calci oxalat trong mô mềm vỏ của thân khi

quan sát ở vật kính 40 (a), và vi phẫu gai Đơn châu chấu (b)

41

13 Hình 3.14 Vi phẫu rễ cây Đơn châu chấu 41

14 Hình 3.15 Một số đặc điểm bột lá Đơn châu chấu 42

15 Hình 3.16 Một số đặc điểm bột thân Đơn châu chấu 43

16 Hình 3.17 Một số đặc điểm bột rễ Đơn châu chấu 44

17 Hình 3.18 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn các nhóm chất trong thân

18 Hình 3.19 SKĐ phân đoạn n-Hexan khai triển với hệ dung môi

Toluen- Ethylacetat – Aceton - Acid formic (10:2:2:1) 58

19 Hình 3.20 SKĐ phân đoạn Ethyl acetat khai triển với hệ dung môi

Chloroform – Methanol – Acid formic (4: 1: 0.1)

59

20 Hình 3.21 SKĐ phân đoạn n-Buthanol khai triển với hệ dung môi

Ethylacetat – Acid acetic – Acid formic – H2O (10:1:1:1) 60

21 Hình 3.22 Ảnh SKĐ chất DC1 trên 3 hệ dung môi 63

23 Hình 3.24 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn Ethyl acetat trong

23 Hình 3.25 Công thức cấu tạo của acid oleanolic 67

24 Hình 3.26 Đồ thị biểu diễn % dọn gốc DPPH của cao ethanol toàn

25 Hình 3.27 Đồ thị biểu diễn % dọn gốc superoxid của cao ethanol

26 Hình 3.28 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển, tạo ra hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Trong số đó có rất nhiều các loài thuốc quí đã và đang được

sử dụng Nguồn cây thuốc dân gian cũng như vốn sử dụng dược liệu phong phú của đồng bào các dân tộc vẫn là kho tàng quí giá để khám phá Tuy nhiên, việc sử dụng chúng chủ yếu là theo kinh nghiệm dân gian hay trong y học cổ truyển được lưu truyền từ đời này sang đời khác, còn rất nhiều cây thuốc chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa có hệ thống Vì vậy việc nghiên cứu cây cỏ làm thuốc một cách đầy đủ và toàn diện là điều cần thiết, góp phần nâng cao tính an toàn và hiệu quả điều trị

Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại là sự gia tăng của bệnh tật, trong số đó có các bệnh lí về gan Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm siêu vi B cao nhất thế giới, khoảng 15-20% dân số và tỷ

lệ ung thư gan ở Việt Nam cũng đứng hàng thứ hai trên thế giới Các nhà chuyên môn trong nước ước tính, bình quân hằng năm, số ca mắc mới bệnh ung thư gan trên cả nước là khoảng 10.000 người, một con số rất lớn Trong những năm gần đây, với sự phát triển của khoa học và được sự hỗ trợ của các phương tiện kĩ thuật hiện đại, các nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong các hệ thống sinh học cũng như sự liên quan giữa gốc tự do với một số quá trình bệnh lý, trong đó có bệnh viêm gan Đã có nhiều nghiên cứu về thuốc có tác dụng bảo vệ gan theo cơ chế gốc tự do Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp Tây y hiện đại chữa bệnh gan Tuy nhiên, nhiều người vẫn chọn cách sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu vì tính an toàn của nó và có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài Chính vì vậy việc tìm kiếm các nguồn dược liệu có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan là điều cần thiết

Cây Đơn châu chấu còn gọi là Đinh lăng gai, Rau gai, Cẩm giàng, có tên

khoa học là Aralia armata, họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Từ lâu đã được nhân

dân ta sử dụng làm thuốc chữa các bệnh viêm gan cấp, viêm họng, viêm amydal, viêm bạch hầu, viêm khớp, viêm thận phù thũng, viêm sưng vú…[5], [6], [7] Đã có một số công trình khoa học nghiên cứu về Đơn châu chấu song chưa thật sự đầy đủ Vì vậy, để góp phần cung cấp thêm thông tin và làm sáng

tỏ kinh nghiệm dân gian cũng như thực tế ở địa phương dùng Đơn châu chấu

chữa bệnh gan, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Đơn châu chấu (Aralia armata (Wall.) Seem.)” với các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật và vi học của cây Đơn châu chấu

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Đơn châu chấu

3 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của cây Đơn châu chấu

Để đạt được 3 mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

 Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm vi học của cây Đơn châu chấu:

- Mô tả đặc điểm hình thái, thẩm định tên khoa học của cây nghiên cứu

- Xác định đặc điểm vi học gồm: đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột dược liệu

 Nghiên cứu về thành phần hóa học:

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cây Đơn châu chấu

- Chiết xuất và phân lập một số chất chính từ thân cây Đơn châu chấu

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được

 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:

- Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao Ethanol toàn phần

của thân Đơn châu chấu

- Khảo sát tác dụng bảo vệ gan và chống oxy hóa in vivo của cao Ethanol

toàn phần của thân Đơn châu chấu

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 THỰC VẬT

1.1.1.Vị trí phân loại của chi Aralia L

Theo Hệ thống phân loại Takhtajan, chi Aralia L được xếp vào họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Vị trí phân loại của chi Aralia L được tóm tắt theo

Hoa lưỡng tính hoặc lưỡng tính và đơn tính đực trên cùng 1 cây, hợp thành cụm hoa hình chùy, tán hoặc ngù, thường mọc ở đầu cành hoặc nách lá Cuống nhỏ, có khớp nối bên dưới bầu nhụy Hoa mẫu 5, đài 5 răng cưa, cánh hoa xếp lợp, nhị hoa 5 Bầu nhụy có 5 hoặc 6 lá noãn, rời hoặc dính liền tại gốc [23]

Quả hạch, thường có hình cầu, khi chín màu đen [23]

Hạt hẹp theo bề ngang, nội nhũ đồng nhất [23]

1.1.2.2 Phân bố

Chi có khoảng 40 loài: chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, và Trung

Quốc, một số ít ở châu Mỹ Ở Trung Quốc có 29 loài [23]

Ở Việt Nam có khoảng 10-15 loài [1]

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Aralia armata (Wall.) Seem

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật

Đơn châu chấu còn có tên gọi khác như: Đinh lăng gai, cây cuồng, cây răng, xương cá gai, cẩm giàng (Tày), lồ cổ (H’Mông), lay tóng (Dao) [12]

Cây nhỏ, cao 1-2m, có thân mảnh, mang nhiều gai Cành mọc lòa xòa

Lá mọc so le, kép lông chim 2-3 lần, có 9-11 lá chét với phiến hình trứng dài 4-8cm, rộng 2-3cm, gốc tròn, đầu nhọn, trên gân có những gai nhỏ như sợi tơ, mép có răng cưa, cuống lá có bẹ, lá kèm nhỏ [5], [6], [7], [10], [12]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành thành chùy gồm nhiều tán dài, phân nhánh nhiều, cuống hoa có gai Hoa nhỏ, màu lục vàng hoặc vàng nhạt [5], [6], [7], [10], [12] Đài có 5 răng hình tam giác, tràng 5, nhị 5, bầu hình trứng

5 ô, 5 vòi tự do [12] Quả hạch hình cầu, khi chín màu đen, đường kính 3- 4mm [5], [6], [7], [10], [12]

Mùa hoa quả tháng 7- 9 [5], [6], [7], [12]

Ở Việt Nam, Đơn châu chấu phân bố tương đối rộng rãi từ vùng núi có

độ cao khoảng 1500m đến trung du và đôi khi cả ở đồng bằng Cây mọc hoang khắp nơi từ Bắc vào Nam [5], [6], [7] Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng mát nhất là ở thời kì cây con, thường mọc ở ven rừng ẩm, rừng thứ sinh, trên nương rẫy đã bỏ hoang lẫn với những loại cây bụi khác Cây sinh trưởng mạnh trong mùa hè thu, sau khi quả chín có hiện tượng rụng lá vào mùa đông Đơn châu chấu có nhiều hoa, quả Quả chín rụng xuống đất

hoặc bị chim ăn Cây con mọc từ hạt quanh gốc cây mẹ được thấy vào tháng 4-5 Đơn châu chấu có khả năng tái sinh cây chồi sau khi bị chặt phát [12]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

1.2.1 Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Aralia L

Từ những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về thành phần hóa

học của một số loài thuộc chi Aralia L cho thấy các hợp chất được phân lập

chủ yếu thuộc các nhóm sau:

20 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D- glucopyranosyl (1→3)-β-D-gluco-

pyranosyl oleanolic axit

glucopyranosyl} oleanolic 28-O-β-D-

glucopyranosyl acid ester

1.2.1.2 Diterpenoid

1 Kaurenoic acid (ent-kaur-16-en-19-oic

acid) Rễ A.continentalis A cordata

[21] [37]

3 Continentalic acid Rễ A cachemirica A cordata

A.continentalis

[37] [18]

[24] Thân rễ A.fargesii [44]

4 Tetrahydro continentalic acid Rễ A.cachemirica [18]

16α-17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

CH2OH (-)-pimara-8(14),15 dien-19-ol

CHO (-)-pimara-8 (14),15 dien-19-al

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một số diterpen đƣợc phân lập từ một số loài

thuộc chi Aralia L

Acid echinocystic Hederagenin

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số triterpen đƣợc phân lập từ một số loài

thuộc chi Aralia L

và quả chín A.cordata

Cấu trúc hóa học của một số Flavonoid đƣợc thể hiện trong hình 1.3

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số Flavonoid đƣợc phân lập từ một số

loài thuộc chi Aralia L

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của một số Coumarin đƣợc phân lập từ một số loài

thuộc chi Aralia L

(-)-4'-(4"-hydroxy-3"-methylbutyloxy)-(-)-4'-(4"-hydroxy- 3"- methylbutyloxy) -3-phenylpropenol

(+)-4'-(4"-hydroxy phenylpropenal

3"methylbutyloxy)-3-(+)-4'-(4"-methoxy- oxobutyloxy)-3-phenylpropenal

3"-methyl-4"-Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của một số Phenylpropanoid đƣợc phân lập từ một

số loài thuộc chi Aralia L

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của một số Alcaloid đƣợc phân lập từ một số loài

thuộc chi Aralia L

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của một số Lignan đƣợc phân lập từ một số loài

thuộc chi Aralia L

1.2.1.9 Một số chất khác

Năm 2012, từ rễ của loài Aralia cachemirica thu thập từ khu vực

Aharbal, Kashmir, Ấn Độ, các nhà khoa học Ấn Độ phân lập đƣợc bốn hợp chất mới [18]:

Cấu trúc hóa học của các chất này đƣợc thể hiện ở hình 1.8

4α, 4β, 8β, 10β, 13β, 17β hexamethyl perhydrophenanthrenyl -3β-n decanoate

1β, 4α, 4β-trimethyl-6 (10,14,18-trimethyl-tridec-6-enyl)-cyclohexane-4β-ol

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của một số chất đƣợc phân lập từ Aralia

cachemirica, chi Aralia L

Từ phần gỗ của loài A.bipinnata, các nhà khoa học đã phân lập được 8

hợp chất thơm là: p-hydroxybenzaldehyd, vanillin, syringaldehyd, coumaraldehyd, methyl trans-p-coumarat, transconiferylaldehyd, trans-

trans-p-sinapaldehyd và 5- (hydroxymethyl) furfural [27]

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Aralia armata (Wall.) Seem

- Lá Đơn châu chấu chứa nước 84,5% ; protid 3,1%; glucid 8,3%; xơ 2,5 %, tro 1,5 %; caroten 1,65 %, vitamin C 12% [12]

- Rễ chứa nhiều saponin triterpen [12]

- Vỏ rễ đem chiết với methanol, hỗn dịch cao methanol đem chiết với ether rồi chiết với buthanol bão hòa nước Phần buthanol làm sắc ký riêng

được 17 saponin kiểu olean Đó là: calendulosid E (1), dẫn xuất methyl este của calendulosid (2), dẫn xuất buthyl este của calendulosid (3), narcissiflorin

(4), narcissiflorin methyl ester (5), momordin Ia (6), calendulosid G (7),

oleanolic acid - 3 – O- [ß - D –galactopyranosyl-(1-3)-ß - D –

glucuronopyranosid-6-O-methyl ester] (8), oleanolic acid - 3 – O- [ß - D – galactopyranosyl-(1-3)-ß – D –glucuronopyranosid-6-O-buthyl ester] (9), stipuleanosid R1 (10), chikusetsusaponin IVa (11), dẫn xuất methyl este của chikusetsusaponin IVa (12), dẫn xuất buthyl este của chikusetsusaponin IVa

(13), aralosid A methyl este (14), oleanolic acid - 3 – O- [ß - D –

galactopyranosyl-(1-3)-ß - D –glucuronopyranosid-6-O-methyl ester] -28 –

O- ß - D –glucopyranosid (15), oleanolic acid - 28 – O- ß - D -glucopyranosid

(16), và hederagenin 3- O- ß -D-glucuronopyranosid-6'- O-methyl ester (17)

[28]

Theo Zha-pu F., Jiang-ling L., Xian-yi Z và cs, 11 thành phần được chiết tách từ vỏ rễ Đơn châu chấu là deglucose chikusetsusaponin, Na chikusetsusaponin IVa, Zingibrosid R1, ginsenin R0, decaisneanasid, armatosid aralosid A, acid octacosanoic, ß- sitosterol, hỗn hợp ß- sitosterol và stigmasterol, acid oleanolic [70]

Rễ còn chứa 0,06% tinh dầu, là một chất lỏng linh động màu da cam, tỷ trọng 0,83, thành phần chủ yếu là camphol [12]

Cấu trúc hóa học của các saponin đƣợc thể hiện trong hình 1.9

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC

1.3.1 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Aralia L

Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới công bố về tác dụng sinh học của

một số loài thuộc chi Aralia L., trong đó chủ yếu là các tác dụng sau:

1.3.1.1 Tác dụng chống oxy hóa

Từ vỏ rễ của loài Aralia taibaiensis, các nhà khoa học Trung Quốc đã

phân lập được 12 saponin triterpenoid Các hợp chất này cùng với dịch chiết ethanol toàn phần được đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH Kết quả cho thấy các hợp chất 3-O-{β-D-xylopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucuronopyranosyl}- oleanolic acid 28-O-β-D- glucopyranosyl

ester (TA5),

3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucuronopyranosyl}- olean-11,13(18)-diene-28-oic acid 28-O-β-D-

glucopyranosyl ester (TA7), 3-O- {β-D-

glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D- glucuronopyranosyl}- oleanolic acid

28-O-β-D-glucopyranosyl ester (TA9) ở nồng độ 0,1 mM và dịch chiết ethanol toàn

phần nồng độ 100 μg/ml làm giảm đáng kể độ hấp thụ của DPPH khi so sánh với nhóm chứng (P < 0,05) Trong đó dịch chiết ethanol toàn phần là có tác dụng quét gốc tự do mạnh nhất Ngoài ra, các hợp chất 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (TA35), 3-O-[α-L-arabinofuranosyl-(1→4)-β-D-

glucuronopyranosyl]-oleanolic acid (TA24) và dịch chiết ethanol toàn phần

cũng có tác dụng ức chế lipid peroxy trong gan chuột gây ra bởi cumine hydroperoxid (CHP) hoặc CCl4/NADPH Từ những kết quả trên cho thấy tác

dụng chống oxy hóa của dịch chiết toàn phần Aralia taibaiensis có sự đóng

góp ít nhất là một phần bởi tác dụng hiệp đồng của các hợp chất tinh khiết được phân lập từ nó [61]

Một polysaccharid tan trong nước (AEP-W1) đã được các nhà khoa học

Trung Quốc phân lập từ vỏ rễ của Aralia elata Cấu trúc của nó đã được xác

định là một arabinogalactan, bao gồm arabinose, galactose và glucose với tỷ

lệ mol là 6,3: 3,5: 0,2 AEP-W1 được tiến hành khảo sát hoạt tính chống oxy

hóa và bảo vệ tim mạch in vitro Kết quả cho thấy AEP-W1 thể hiện hoạt tính

dọn gốc superoxide và gốc hydroxyl khá mạnh Sử dụng 50-400 g/ml W1 24 giờ trước khi tiếp xúc H2O2 làm giảm đáng kể những tế bào H9c2 bị chết AEP-W1 còn thể hiện khá rõ khả năng ức chế hiện tượng apoptosis cơ tim, rối loạn chức năng của ty lạp thể [67]

AEP-1.3.1.2 Tác dụng bảo vệ gan

Các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của dịch

chiết ethanol từ rễ loài Aralia continentalis (AC) trên mô hình tert - butyl

hydroperoxide (t-BHP) - chất gây ra nhiễm độc gan trong một dòng tế bào nuôi cấy Hepa1c1c7 và trong gan chuột Kết quả cho thấy việc điều trị với

AC trước khi sử dụng t-BHP giúp ngăn chặn đáng kể sự gia tăng của men gan (ALT, AST) và lipid peroxy và làm giảm stress oxy hóa, được đo bằng lượng glutathion trong gan [29]

Trong một nghiên cứu khác, chuột được cho uống dịch chiết ethanol từ

rễ loài Aralia continentalis (AC) với liều 10, 50 hoặc 200 mg/kg, mỗi ngày

một lần trong 3 ngày liên tiếp Sau khi uống dịch chiết 3 giờ, chuột được gây độc gan bằng cách tiêm màng bụng CCl4 liều 20 mg/kg Sau khi gây độc gan

18 giờ, giết chuột lấy máu định lượng ALT, AST Kết quả cho thấy việc điều trị AC trước khi gây độc bằng CCl4 giúp ngăn chặn đáng kể sự gia tăng hoạt

độ enzym huyết thanh ALT và AST cũng như sự hình thành của Malondialdehyde (MDA) Đánh giá mô bệnh học của gan cũng tiết lộ rằng

AC giảm tỷ lệ tổn thương gan gây ra bởi CCl4 Heme oxygenase-1 (HO-1) được sinh ra bởi stress oxy hóa và có tác dụng bảo vệ chống lại tổn thương

mô oxy hóa AC làm tăng sự biểu hiện của HO-1 ở chuột được gây độc bằng CCl4 Những kết quả này cho thấy AC đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ gan bằng cách thúc đẩy protein chống oxy hóa biểu hiện [30]

1.3.1.3 Tác dụng chống viêm

Từ kinh nghiệm truyền thống sử dụng Aralia cordata để điều trị viêm

khớp, các nhà khoa học Hàn Quốc đã tiến hành nghiên cứu tác dụng bảo vệ

sụn của dịch chiết cồn – nước (1:1) của Aralia cordata Đầu gối phải của thỏ được gây viêm bằng cách tiêm collagenase Thỏ được uống Aralia cordata

(200mg/kg) mỗi ngày một lần trong 28 ngày sau khi gây viêm Kết quả cho

thấy Aralia cordata có tác dụng bảo vệ sụn Các trung gian gây viêm liên

quan đến sự phá hủy sụn như prostaglandin E2 (PGE2) và cyclooxygenase-2

(COX-2) đã bị ức chế ở nhóm được điều trị bằng Aralia cordata Dược liệu

còn cho thấy tác dụng chống apoptosis thông qua việc ức chế caspase - 3 hoạt động [22]

Các thành phần được tách từ rễ của Aralia continentalis là axit

continentalic, axit pimaradienoic (hợp chất I), 7β-hydroxy-ent -pimara-8 (14), 15- dien-19-oic axit (hợp chất II), 7-oxo-ent-pimara-8 (14), 15-dien-19-oic axit (hợp chất III), 15α, 16α - epoxy-17-hydroxy-ent-kauran-19-oic axit (hợp chất IV) và axit kaurenoic (hợp chất V) đã được nghiên cứu tác dụng chống viêm Đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng tác nhân gây viêm lipopolysaccharid Kết quả cho thấy các thành phần trên có tác dụng ức chế COX-2, là chất xúc tác tổng hợp PGE 2 và ức chế enzym tổng hợp nitric oxide cảm ứng (iNOS), là chất xúc tác tạo nitric oxide (NO) Trong số các hợp chất thử nghiệm, hợp chất III và V ức chế NO sản xuất một cách vừa phải Ngoài ra, hợp chất III ức chế yếu PGE 2 sản xuất, trong khi các hợp chất

II và IV ở nồng độ 100 microM không có tác dụng đáng kể Ngược lại, hợp chất I chỉ ức chế yếu PGE 2 và NO sản xuất Hợp chất III ức chế yếu COX-2

và iNOS ở nồng độ 50-100 microM, và ức chế NF-kappa B kích hoạt Tiêm màng bụng 4-100 mg/kg hợp chất I và V, cho thấy tác dụng ức chế đáng kể phù nề chân do carrageenan gây ra ở chuột, trong khi hợp chất III không có tác dụng Tóm lại, các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng một số thành phần

của Aralia continentalis, đặc biệt là các hợp chất I, III và V có tác dụng chống

viêm Điều này chứng tỏ các thành phần trên đóng góp, ít nhất là một phần

vào tác dụng chống viêm của rễ Aralia continentalis [39]

Dịch chiết từ rễ của Aralia elata đã được nghiên cứu tác dụng chống

viêm trên đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng tác nhân gây viêm lipopolysaccharide Kết quả cho thấy dịch chiết phân đoạn ethyl acetat của

Aralia elata ức chế NO sản xuất, ức chế đáng kể sinh tổng hợp PGE 2 và

COX-2 Ngoài ra, dịch chiết methanol của Aralia elata còn ức chế 1 và

IL-6 (ức chế hơn 99%) theo kiểu phụ thuộc vào nồng độ Hoạt tính kháng viêm của nó có thể liên quan đến sự ức chế NF-kappa B kích hoạt trong các đại thực bào bị kích thích bởi lipopolysaccharid Các kết quả nghiên cứu cho thấy

dịch chiết phân đoạn ethyl acetat của Aralia elata có tác dụng làm giảm và

chậm phát triển các phản ứng viêm do cơ chế tự miễn [32]

1.3.1.4 Tác dụng kháng khuẩn

Continentalic acid (CA,(-)-pimara-8 (14), 15-dien-19-oic acid) được các nhà khoa học Hàn Quốc phân lập từ rễ của Aralia cordata CA thể hiện rõ hoạt tính chống lại chủng Enterococcus kháng vancomycin (VRE) và

Enterococcus nhạy cảm vancomycin (VSE) Các hoạt tính kháng khuẩn của

CA đối với Enterococcus faecalis và Enterococcus gallinarium ước lượng

bằng cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Hợp chất này thể hiện hoạt tính mạnh chống lại các chủng VRE là chủng có khả năng kháng kháng sinh mạnh Những phát hiện này cho thấy rằng acid continentalic có thể hữu ích trong việc kiểm soát nhiễm khuẩn đường ruột [34]

Dịch chiết từ thân rễ loài Aralia nudicaulis ở Canada cũng thể hiện hoạt

tính chống lại vi trùng lao chủng H37Ra [38]

1.3.1.5 Tác dụng chống ung thư

Năm 2012, từ lá Aralia elata, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân

lập được 4 hợp chất mới và 2 hợp chất đã biết Các thành phần này được tiến hành thử tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư HL60, A549 và DU145 Kết quả cho thấy một hợp chất mới là 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranosyl oleanolic axit (1), cho thấy hoạt động ức chế sự phát triển của tế bào ung thư HL60 và A549 với giá trị IC50 6,99 mM và 7,93 mM tương ứng Ngoài ra, hai hợp chất đã biết là [3-O-[β-D-glucopyranosyl (1→3)-α-L-arabinopyranosyl]-echinocystic acid và 3-O-α-L - arabinopyranosyl echinocystic axit cũng thể hiện tác dụng gây độc

tế bào đáng kể trên tế bào ung thư HL60 với giá trị IC50 là 5,75 mM và 7,51

mM, tương ứng [69]

Một protein gây độc tế bào mới là Aralin được tách từ cành non của

loài Aralia elata Aralin bao gồm hai tiểu đơn vị A và B có phân tử lượng là

29.100 và 32.200, tương ứng Aralin cho thấy tác dụng gây độc tế bào mạnh, chống lại các dòng tế bào ung thư ở người, các tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung (HeLa), với giá trị IC50 là 0,08 ng/ml [55]

Araloside A là một thành phần được tách từ rễ loài Aralia elata Đánh

giá tác động kháng u của Araloside A trên các dòng tế bào ung thư ở thận người GRC-1 và 786-O cho thấy Araloside A nồng độ 1, 3, 10, 30 và 100 μM làm giảm đáng kể khả năng di động của tế bào GRC-1 từ 96,3 ± 4,0 đến 82,3

± 5,7; 75,7 ± 6,8; 59,3 ± 5,6; 51,6 ± 6,0 và 43,3 ± 6,2%; tương ứng (n = 6 thí nghiệm độc lập, p < 0,05) Araloside A nồng độ 10 μM cũng giảm mạnh khả năng tồn tại của tế bào GRC-1 50,4 ± 6,9 và 42,9 ± 7,1% sau 48 và 72 giờ ủ Tương tự như vậy, Araloside A nồng độ 1, 3, 10, 30 và 100 μM cũng làm giảm khả năng di động của 786-O từ 97,1 ± 4,3 đến 90,5 ± 5,7; 81,5 ± 6,3; 71,5 ± 6,2; 65,7 ± 6,1 và 47,9 ± 7,3% (n = 6 thí nghiệm độc lập, p < 0,05) sau

24 giờ ủ Kết quả này cho thấy Araloside A có thể gây ra apoptosis trong GRC-1 và 786 - O phụ thuộc vào liều lượng và thời gian [66]

1.3.1.6 Tác dụng hạ đường huyết

Năm 2005, từ dịch chiết nước và cồn từ rễ loài Aralia cachemirica, các

nhà khoa học Ấn Độ đã tiến hành thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết trên chuột nhịn ăn bình thường và chuột tăng đường huyết do sử dụng glucose Kết quả cho thấy dịch chiết nước và cồn tại liều 250 mg/kg đều thể hiện hoạt tính hạ đường huyết (p < 0,01) ở chuột sử dụng glucose, tuy nhiên không có tác dụng hạ đường huyết ở chuột nhịn đói bình thường [18]

1.3.1.7 Các tác dụng khác

Các tác dụng khi điều trị bằng đường uống với Aralox chứa dịch chiết

của Aralia mandshurica và Engelhardtia chrysolepis trên một số thông số của

quá trình trao đổi chất béo đã được nghiên cứu ở phụ nữ bị béo phì không bị

tiểu đường với chế độ ăn kiêng ít calo đã được công bố năm 2005 Nghiên

cứu ngẫu nhiên kiểm soát giả dược bao gồm 32 tình nguyện viên cho thấy rằng điều trị Aralox làm giảm đáng kể tổng trọng lượng cơ thể và lượng chất béo, làm giảm hàm lượng perilipin trong các tế bào mỡ, hàm lượng triglyceride trong huyết tương, kích thích hoạt động của lipase nhạy cảm với hormon [15]

1.3.2 Tác dụng sinh học của Aralia armata (Wall.) Seem

Vỏ rễ Đơn châu chấu có những tác dụng:

- Chống viêm, đặc biệt tác dụng ức chế khá mạnh giai đoạn mạn tính của phản ứng viêm Các saponin triterpen và acid oleanolic từ rễ Đơn châu chấu là thành phần có hoạt tính chống viêm cấp, viêm mạn và gây thu teo tuyến ức chuột cống trắng đực non [12]

Kích thích sự chuyển dạng lympho bào trong thí nghiệm nuôi cấy in

-vitro, điều này chứng tỏ Đơn châu chấu có tác dụng kích thích miễn dịch [12]

- Có tác dụng nội tiết kiểu estrogen trên động vật thí nghiệm [12]

- Kháng khuẩn đối với phế cầu, liên cầu khuẩn tan máu

- Thí nghiệm với acid oleanolic được phân lập từ rễ Đơn châu chấu, liều 60 mg/kg (tiêm dưới da), kết quả thu được tỷ lệ giảm trọng lượng tuyến

ức là 40,9% với P < 0,01 [14]

Theo y hoc cổ truyền: vỏ rễ có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu thũng, tán ứ, khu phong trừ thấp Rễ có tác dụng kháng sinh mạnh, có thể giải độc Thân, nhất là lõi thân có tác dụng bổ Lá có tác dụng tiêu độc [5]

1.3.3 Công dụng của Aralia armata (Wall.) Seem

Vỏ rễ dùng chữa các chứng viêm như viêm gan cấp, viêm họng, viêm amydale, viêm bạch hầu, viêm khớp, viêm thận phù thũng, viêm sưng vú, phong thấp tê bại, dao chém thương tích, sốt rét cơn và rắn cắn [5], [6], [7]

Lõi thân dùng làm thuốc bổ Lá non làm rau ăn (do có nhiều gai nên gọi

là rau gai) Lá dùng đắp mụn nhọt làm tan chắp lẹo ở mắt Lá còn có tác dụng tiêu độc Quả sao khô tán bột thổi vào mũi chống ngạt mũi [5], [6], [7]

Trong dịch viêm họng ở Bình Gia - Lạng Sơn vào năm 1956, nhân dân

đã dùng rễ cây này sắc vừa uống vừa ngậm [10]

- Cây tươi mang lá để làm tiêu bản vi học cấu tạo giải phẫu

- Rễ, thân, lá phơi khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

- Bình chạy sắc kí lớp mỏng, cột sắc ký, bếp điện, đèn tử ngoại Camag

- Máy chấm mẫu Linomat 5 của Camag (Thụy Sỹ)

- Tủ sấy: Memmert

- Kính hiển vi, Máy ảnh Canon

- Cân kĩ thuật Precisa

- Cân phân tích Precisa

- Máy cất quay Buchi

- Máy cắt vi phẫu cầm tay

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình cầu, phễu, pipet, lam kính, lá kính

- Máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems (Đức)

- Máy định lƣợng sinh hoá bán tự động Scout

- Máy đo quang MINI 1240 SHIMAZU

- Máy nghiền đồng thể

- Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng tráng sẵn GF254 của Merk

2.2.2 Dung môi, hóa chất, thuốc thử

 Dung môi: n-Hexan, Ethyl acetat, Methanol, n- Butanol, Ete dầu

- Hoá chất tinh khiết: KCl, Acid tricloracetic, Acid thiobarbituric,

HCl 0,1N chuẩn, Acid acetic, n- Buthanol, CCl4 , dầu oliu, Quercetin (Sigma Aldrich)

- Cloralhydrat 75%, Acid acetic 5%, xanh methylen, đỏ son phèn, Glycerin, Javen

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng

lượng 20±2g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

 Đặc điểm vi học: nghiên cứu đặc điểm vi học theo tài liệu Thực tập dược liệu (phần vi học) [3], [11] Cụ thể: sau khi thu hái, mẫu được đem xử lý bằng các phương pháp thích hợp rồi nghiên cứu:

- Vi phẫu: tiến hành làm tiêu bản vi phẫu theo các bước sau:

+ Chọn mẫu thích hợp

+ Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay

+ Xử lý lát cắt: lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch javen, rửa sạch bằng nước cất, tẩy tiếp bằng chloralhydrat 75%, rửa lại bằng nước cất, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước cất đến hết acid Sau đó tiến hành nhuộm kép với xanh methylen và đỏ son phèn

+ Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch

glycerin : nước (1:1) rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu,

chụp ảnh bằng máy ảnh qua kính hiển vi

- Bột dược liệu:

+ Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột

+ Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị

+ Lên tiêu bản bột dược liệu bằng dung dịch glycerin : nước (1:1), quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột qua kính hiển

vi Ảnh các đặc điểm được chuyển vào máy vi tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu Thực tập dược liệu (phần hóa học) [2]

- Chiết xuất các hoạt chất trong dược liệu bằng cồn công nghiệp Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn cồn toàn phần

- Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết cồn toàn phần bằng các dung môi

có độ phân cực tăng dần: n-Hexan, Ethyl acetat, n-Buthanol

- Phân lập các hợp chất trong mẫu cao dược liệu bằng sắc kí cột với chất hấp phụ là silica gel, cỡ hạt 0,04 - 0,063mm Theo dõi các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được bằng việc phân tích các đặc điểm hóa lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) và dựa trên số liệu các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học

2.3.3.1 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao Ethanol toàn

phần của thân Đơn châu chấu

a) Phương pháp xác định khả năng dọn gốc tự do DPPH

Thực hiện theo phương pháp của Blois (1958) [47]

Nguyên tắc: Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH

(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình ôxy-hóa bằng sự chuyển các gốc tự do của DPPH sang trạng thái ổn định hơn Nhƣ vậy, khi có mặt của chất chống ôxy hóa, nó sẽ khử gốc tự do của DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm