Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học invitro của cây cần tây

Từ xa xưa, cây Cần tây đã được sử dụng rộng rãi làm thuốc ở nhiều nền văn hóa: người Hy lạp dùng làm thuốc lợi tiểu, người Ai cập dùng Cần tây để chữa bệnh tim, người phương Tây đã dùng

sau đại học đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn của mình Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS.Nguyễn Thu Hằng người thầy đã tận tình chỉ bảo, dồn hết tâm huyết

truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức và kinh nghiệm khoa học vô cùng quý báu

Cô còn là người dẫn đường tận tụy, nhiệt tình đã dìu dắt, động viên, giúp đỡ tôi trên từng bước đường trong suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn thạc sĩ tại bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quốc Huy – Bộ môn Thực vật trường đại học Dược hà nội, TS Nguyễn Văn Hân – Bộ môn công nghiệp

Dược trường Đại học dược Hà nội đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược Liệu trường Đại Học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong toàn bộ thời gian hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn, các anh chị em chuyên ngành Dược học cổ truyền, các em sinh viên khóa 62,63,64 làm đề tài tại bộ môn Dược liệu – trường Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới bố mẹ, gia đình, những người thân đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và đạt kết quả như ngày hôm nay

Hà Nôi, ngày 30 tháng 10 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Hồng Vân

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TÊN GỌI 3

1.2 VỀ THỰC VẬT 3

1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 5

1.4 TÁC DỤNG SINH HỌC 15

1.5 ĐỘC TÍNH 18

1.6 CÔNG DỤNG 19

1.7 MỘT SỐ BÀI THUỐC CÓ THÀNH PHẦN LÀ CẦN TÂY 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 24

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 24

2.2.3 nghiên cứu tác dụng sinh học 25

2.3.4 Xử lý kết quả thực nghiệm 28

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 29

3.1.1.Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu 29

3.1.2 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu 29

3.1.3.Đặc điểm vi phẫu hạt Cần tây 32

3.1.4 Đặc điểm bột Cần tây 32

3.1.4.1 Đặc điểm bột lá 32

3.1.4.2 Đặc điểm bột thân 32

3.1.4.3 Đặc điểm bột rễ 34

3.1.4.4 Đặc điểm bột hoa 34

3.1.4.5 Đặc điểm bột hạt 34

3.2.1.1 Định lượng tinh dầu trong BPTMĐ và hạt Cần tây 37

3.2.1.2 Nghiên cứu thành phần tinh dầu Cần tây bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS) 37

3.2.2 Định tính các nhóm chất chính trong cây Cần tây bằng phản ứng hóa học 41

3.2.3 Định tính dịch chiết methanol BPTMĐ và hạt của Cần tây bằng SKLM 43

3.2.4 Xác định lượng chất chiết được bằng ethanol của BPTMĐ và hạt Cần tây 47

3.2.5 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hạt Cần tây 49

3.2.6 Định tính phân đoạn dịch chiết DC2 50

3.2.6.1 Định tính phân đoạn dịch chiết DC 2 bằng phản ứng hóa học 50

3.2.6.2 Định tính phân đoạn dịch chiết DC 2 bằng SKLM 53

3.2.7 Phân lập chất từ phân đoạn dịch chiết DC2 hạt Cần tây 55

3.2.7.1 Phân lập lần 1 56

3.2.7.2 Phân lập lần 2 57

3.2.7.3 Phân lập lần 3 58

3.2.8 Kiểm tra độ tinh khiết của CT3 bằng SKLM 59

3.2.9.Sơ bộ nhận dạng chất CT3 61

3.2.9.1 Độ hòa tan 61

3.2.9.2 Định tính CT 3 bằng phản ứng hóa học 61

3.2.10 Xác định cấu trúc hóa học của CT3 62

3.3 ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG IN VITRO CỦA DỊCH CHIẾT CẦN TÂY ĐỐI VỚI HỆ ĐÔNG MÁU VÀ SỰ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU 64

3.3.1.3 Tiến hành và kết quả 65

3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng in vitro của dịch chiết hạt Cần tây đối với sự ngưng tập tiểu cầu 67

3.3.2.1 Chuẩn bị dịch chiết dược liệu 67

3.3.2.2 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu 68

3.3.2.3 Tiến hành và kết quả 68

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 70

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

3nB 3-n-butylphthalid

4 Bảng 1.4: Các hợp chất coumarin khác có trong hạt Cần tây 13

5 Bảng 1.5: Một số hợp chất khác có trong cây Cần tây

6 Bảng 2.1: Thành phần các mẫu trong thí nghiệm đánh giá

ảnh hưởng của dịch chiết hạt Cần tây đối với hệ đông máu 26

7 Bảng 3.1: Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu

BPTMĐ và tinh dầu hạt Cần tây bằng phương pháp GC/MS 40

8 Bảng 3.2: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong cây

9 Bảng 3.3: Kết quả SKLM dịch chiết methanol BPTMĐ Cần

tây với hệ dung môi khai triển IV : Toluen : EtOAc : Acid

formic (5:4:1)

45

10 Bảng 3.4 : Kết quả SKLM dịch chiết methanol hạt Cần tây

với hệ dung môi khai triển XI : Toluen : EtOAc :

Chloroform (5:4:1)

46

11 Bảng 3.5 : % lượng chất chiết được bằng ethanol của BPTMĐ

13 Bảng 3.7: Kết quả định tính phân đoạn dịch chiết DC2 từ hạt

14 Bảng 3.8: Kết quả SKLM phân đoạn dịch chiết DC2 với hệ

dung môi XIX

55

15 Bảng 3.9: Độ tan của CT3 trong một số dung môi 61

16 Bảng 3.10 : Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất

17 Bảng 3.12: Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của dịch

18 Bảng 3.13: Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của dịch

chiết hạt Cần tây trên các thời gian APTT 66

19 Bảng 3.14: Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của dịch

20 Bảng 3.15: Kết quả đánh giá ảnh hưởng in vitro của dịch

chiết hạt Cần tây trên sự ngưng tập tiểu cầu 69

4 Hình 3.2: Ảnh chụp các đặc điểm của cây Cần tây 31

5 Hình 3.3: Ảnh chụp vi phẫu quả Cần tây dưới kính hiển vi 33

6 Hình 3.4: Ảnh chụp các đặc điểm bột lá Cần tây dưới kính

14 Hình 3.12: Ảnh chụp sắc ký đồ phân đoạn dịch chiết DC2

hạt Cần tây với hệ dung môi khai triển XIX: Toluen : Ethyl

acetat : Acid formic (5 : 8 : 1,5)

54

18 Hình 3.16: Cấu trúc hóa học của chất CT3 : LUTEOLIN 64

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tự nhiên luôn là đối tượng và mục tiêu nghiên cứu của khoa học hiện đại Thực tế đã cho thấy có rất nhiều thuốc điều trị kinh điển có nguồn gốc từ

tự nhiên như kháng sinh Penicillin được phân lập từ nấm Penicillium

Quinin từ vỏ thân cây Canhkina (Cinchona succirubra L.), Digoxin từ lá cây Dương địa hoàng (Digitalis lanata Ehrh.)… Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều dược liệu quý đã được chứng minh có hiệu quả phòng và điều trị bệnh tốt như Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis KL Dao), Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum

Thunb.)…

Ở Việt Nam cũng có rất nhiều loài thảo dược đáng chú ý trong đó có cả những loài di thực Cần tây cũng là một loài thực vật di thực và đến nay đã thích nghi với điều kiện khí hậu của nước ta Từ xa xưa, cây Cần tây đã được

sử dụng rộng rãi làm thuốc ở nhiều nền văn hóa: người Hy lạp dùng làm thuốc lợi tiểu, người Ai cập dùng Cần tây để chữa bệnh tim, người phương Tây đã dùng rễ Cần tây làm thuốc lợi tiểu…Hạt Cần tây đã được đưa vào

sách Từ điển cây thuốc của Anh (1983) [31] như là một dược liệu dùng để

chữa các bệnh về khớp Bằng thực nghiệm khoa học, Cần tây đã được chứng minh có tác dụng hạ huyết áp [11], [68], hạ lipid máu [69], chống viêm [11], giảm đau [1]… Gần đây, hạt Cần tây được chú ý đến bởi có nhiều tác dụngsinh học quan trọng như tác dụng chống viêm [11], hạ lipid máu [69], hạ huyết áp [68], chống ung thư [64], chống loét đường tiêu hóa [23], bảo vệ gan [31], Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về Cần tây nhưng các nghiên cứu còn rời rạc, chưa thành hệ thống đầy đủ Đặc biệt, những nghiên cứu về

hạt Cần tây còn rất ít Vì vậy, đề tài ―Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành

phần hóa học và một số tác dụng sinh học in vitro của cây Cần tây (Apium graveolens L.)‖ được tiến hành với những mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Cần tây

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cần tây

3 Đánh giá ảnh hưởng in vitro của dịch chiết Cần tây đối với hệ đông máu

và sự ngưng tập tiểu cầu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TÊN GỌI

- Tên khoa học : Apium graveolens L , họ Cần (Apiaceae)

- Tên nước ngoài : Celery (Anh); céléri, persil des marais, ache des marais

(Pháp)

- Tên thường gọi : Cần tây, Cần tàu

1.2 VỀ THỰC VẬT

1.2.1 Vị trí phân loại chi Apium L

Theo hệ thống phân loại Takhtajan (2009) [3], [7], chi Apium L có vị trí

phân loại như sau:

1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Apium L

Cây thảo, sống hàng năm, hoặc 2 năm Thân mọc thẳng, nhẵn, có nhiều

rãnh nông chạy dọc thân Lá có cuống và có bẹ lá, phiến lá hình lông chim xẻ

một đến ba lần Tán hoa kép, mềm và nhỏ, cuống hoa thường ngắn hoặc

không phát triển đầy đủ, lá bắc và lá bắc con tiêu biến, mỗi tán hoa rất ít hoa

Cánh hoa có màu trắng hoặc vàng xanh, hình trứng hoặc gần tròn, đỉnh cánh

hoa hẹp, cụp vào trong Đài hoa tiêu giảm, đế hoa hình nón tù, vòi nhụy ngắn,

thẳng đứng Quả hình cầu hoặc hình elip, tròn 2 đỉnh đầu, mặt bên hơi dẹt Lá

noãn gần như tròn ở mặt cắt ngang, bề mặt tiếp giáp giữa các lá noãn khít

chặt, nhẵn, gồm 5 gân gồ lên, và nhọn, có 1 ống chứa tinh dầu trong mỗi rãnh

và có 2 ống trong mỗi phần tiếp giáp giữa các lá noãn Bề mặt quả nhẵn Cuống lá noãn chắc, liền hoặc nứt đôi ở đỉnh

Trên thế giới, chi Apium L có khoảng 40 loài, phân bố chủ yếu ở vùng

ôn đới ấm và vùng núi cao nhiệt đới Ở Việt Nam, chi Apium L chỉ có một

loài, là cây di thực [20]

1.2.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Apium graveolens L

Cây thảo, cao 15-150cm, toàn thân có mùi thơm, sống 1-2 năm Thân mọc thẳng đứng, nhẵn, có nhiều rãnh dọc, phân nhánh nhiều Lá hình thuôn hoặc hình trứng ngược, dài 7-18cm, rộng 3,5-8cm, chia hoặc xẻ thành 3 thùy, thùy cuối có hình thoi, kích thước 1.2–2.5 × 0.8–2.5cm, có răng cưa hoặc có khía tai bèo Lá phía trên có cuống ngắn, phiến lá hình tam giác rộng, xẻ sâu 3 thùy, thùy cuối có hình trứng Lá ở gốc có cuống dài hơn, bẹ to rộng, mép lượn sóng nhiều, hình tam giác – thuôn hoặc dạng 5 cạnh có gốc cụt, xẻ 3-5 thùy hình tam giác, đầu tù, mép khía răng to, không lông Cụm hoa tán mọc đối diện với lá, kích thước 1,5-4,0cm, gồm nhiều tán dài, ngắn không đều, các tán ở đầu có cuống dài hơn các tán bên trong và có kích thước 4-15mm Tán kép mang 8-12 tán, tán hoa có 7-25 hoa kích thước 6-9mm theo chiều ngang Hoa phía ngoài có 3-8 (-16) cánh hoa mảnh, kích thước 0,5-2,5cm [39] Hoa nhỏ màu trắng hoặc lục nhạt, tràng có cánh khum, bầu nhỏ [39]

Quả đôi dạng trứng, hơi dẹt, nhẵn, có cánh lồi chạy dọc [20], có 5 cạnh [7] Cuống quả dài 1-1.5mm, quả có kích thước 1.3-1.5 x 1-2mm

Ra hoa và ra quả từ tháng 4 đến tháng 7 [39]

Số nhiễm sắc thể 2n=22

Trên thế giới, loài này bắt nguồn từ châu Á và châu Âu rồi được canh tác

rộng rãi trên toàn thế giới làm rau ăn Loài Apium graovelens L thích hợp và phân bố nhiều ở vùng khí hậu ôn đới Tất cả các bộ phận của loài Apium

Tại Việt Nam, loài này được di thực vào trồng làm rau ăn từ lâu Tuy nhiên

do thích hợp với khí hậu ôn đới nên loài Apium graveolens L được trồng tại

miền Nam không ra quả vì vậy hạt giống ở đây chủ yếu phải nhập [15]

Nhìn chung, tất cả các loại rau Cần tây đều ưa khí hậu ẩm mát, nhiệt độ trung bình từ 15 đến 21oC (ở Việt Nam và Đông Nam Á) Về mùa đông, cây chịu được nhiệt độ dưới 5oC trong vài ngày, không chịu được nắng nóng Quần thể rau Cần tây mọc hoang dại ở châu Âu và một vài giống cây trồng ở Trung Quốc có thể chịu được hạn Cây ra hoa quả nhiều, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ quả [6], [18]

1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Theo các tài liệu thu thập được, các nhóm hợp chất được phát hiện trong

cây Cần tây (Apium graveolens L.) gồm flavonoid, tinh dầu, coumarin và một

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid có trong cây Cần tây

[52], [72]

[20], [52], [72]

Nhận xét: Các flavonoid có trong cây Cần tây chủ yếu có khung flavon,

là dẫn xuất của Apigenin hoặc Luteolin Apigenin (1) và dẫn chất là nhóm

chất có tác dụng sinh học mạnh với nhiều tác dụng quan trọng như tác dụng chống viêm [32], [52] , chống ngưng tập tiểu cầu [66], chống ung thư [64]

Luteolin được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa [38], chống viêm [45], chống dị ứng [49], chống ung thư [34], phòng bệnh thận do đái tháo đường [44]…

1.3.2 Tinh dầu

Hàm lượng tinh dầu

- Toàn cây Cần tây có chứa 0,1 % tinh dầu [9]

- Hàm lượng tinh dầu trong thân, lá Cần tây được thu hái tại huyện Gò

Công, tỉnh Tiền Giang tính theo dược liệu khô là 0,35% [17] Hàm lượng tinh dầu trong thân, lá tươi là 0,145 % [9]

- Hàm lượng tinh dầu trong hoa là 0,42 % [17]

- Hàm lượng tinh dầu trong rễ khô là 1,48 x 10-2 % [9]

- Hạt Cần tây chứa 2-3 % tinh dầu [20]

Thành phần hóa học của tinh dầu Cần tây

Thành phần hóa học của tinh dầu Cần tây chủ yếu là các phthalid và các monoterpenoid Các phthalid trong hạt chiếm khoảng 37,4 - 42,3% [62], là các hoạt chất tạo ra mùi thơm, trong đó chủ yếu có 3-n-butylphtalid [20], [30], [62], Sedanolid (3n-butyl-4,5-dihydrophtalid) [20], anhydrid sedanonic [14], [20] Ngoài ra còn có senkiunolid-N, senkiunolid-J [53] Các monoterpenoid chủ yếu là limonen, selinen, myrcen [9], [14], [20] Ngoài ra còn có pinen, terpinen, ocimen [9]

Các thành phần khác của tinh dầu Cần tây là santalol, α và β- eudesmol, dihydrocarvon và L- carvon [9]

Thành phần hóa học của tinh dầu Cần tây được tổng hợp ở bảng 1.2

Bảng 1.2 : Thành phần hóa học của tinh dầu Cần tây (Apium graveolens L.)

(25) 1,5,8-Mentatrien Thân lá 0,28 [15]

Nhận xét : Cho đến nay đã phát hiện đƣợc 45 chất có trong tinh dầu Cần

tây, trong đó các chất sedanolid, ligustilid, 3n-buthyl phthalid, limonene,

α-pinen, β-pinen có trong cả tinh dầu thân lá và tinh dầu hạt Cần tây

1.3.3 Coumarin

Các coumarin có trong Cần tây chủ yếu gồm các hợp chất furocoumarin

có khung cấu trúc đƣợc trình bày ở hình 1.2 và đƣợc tóm tắt ở bảng 1.3

Ngoài ra còn một số các hợp chất coumarin khác đƣợc trình bày ở bảng 1.4

Hình 1.2: Khung cấu trúc các hợp chất furocoumarin

Bảng 1.3: Các hợp chất furocoumarin có trong cây Cần tây

[10], [20]

(59) Isopimpinellin Hạt

(60)

trimethylpsorale

8-hydroxy-5-n

Toàn cây -OCH

Bảng 1.4: Các hợp chất coumarin khác có trong cây Cần tây

Nhận xét : Cho đến nay đã phát hiện đƣợc 19 chất thuộc nhóm coumarin

trong cây Cần tây, trong đó có 13 chất có cấu trúc furanocoumarin

1.3.4 Một số chất khác

Bảng 1.5: Một số chất khác có trong cây Cần tây (Apium graveolens L.)

Nhóm chất hiệu Ký Tên chất Bộ phận trích dẫn Tài liệu

Acid hữu

cơ

(76) 5-p-trans-coumaroylquinic

[1,3-di(cis)-9-glycerol

Nhận xét : Cho đến nay tổng cộng đã có 95 chất đƣợc phát hiện trong cây

Cần tây, trong đó có 10 chất thuộc nhóm flavonoid, 20 chất thuộc nhóm coumarin, 45 chất thuộc nhóm tinh dầu và 20 chất khác

do sự phong tỏa kênh Ca2+

hoặc thông qua điện áp hoạt động và thụ thể trên kênh Ca2+ [68]

Dung dịch 10% của flavonoid toàn phần từ thân lá Cần tây có tác dụng

hạ huyết áp trên chó 90 phút sau uống [11]

1.4.2 Tác dụng hạ lipid máu

Dịch chiết nước cây Cần tây có tác dụng giảm đáng kể lượng cholesterol toàn phần, cholesterol LDL và triglycerid trên nhóm chuột Wistar đã được cho ăn một chế độ giàu chất béo trong suốt tám tuần để làm tăng lipid máu [70]

Dịch chiết nước cây Cần tây đã được chỉ ra giúp giảm đáng kể lượng cholesterol toàn phần trên chuột tăng cholesterol do di truyền khi cho chuột uống dịch chiết trong suốt 8 tuần liên tục Ngoài ra sử dụng một phần nhỏ phân đoạn butanol và phân đoạn nước chiết xuất Cần tây với 7 ngày tiêm phúc mạc có hiệu quả giảm Cholesterol toàn phần trong huyết thanh và lượng Cholesterol HDL trên chuột Rico trưởng thành [69]

Trong luận văn thạc sĩ dược học, Nguyễn Thị Bảo đã xác định được flavonoid trong Cần tây không độc Flavonoid toàn phần của thân, lá Cần tây

có tác dụng hạ cholesterol toàn phần với liều 0,3g/kg chuột [2]

1.4.3 Tác dụng chống viêm

Dịch chiết nước của thân Cần tây được chứng minh là có tác dụng chống viêm trên tai chuột và ức chế carrageenan tác nhân gây phù nề trên khớp chuột [32]

Dịch chiết cồn/nước (1:1) của lá Cần tây có tác dụng chống viêm do tác dụng ức chế đáng kể enzym sản xuất NO (inducible nitric oxide synthase

(iNOS)), một trong những chất trung gian gây viêm Trong mô hình in-vitro

dịch chiết Cần tây có tác dụng ức chế hoạt tính của iNOS ở IC50 là 0.095mg/ml, ức chế sự tổng hợp NO ở IC50 là 0.073 mg/ml Trong mô hình hoạt hóa Lipopolysacchride (LPS) ở tế bào J774.A1 dịch chiết Cần tây có tác dụng chống viêm ở ID50 là 730 µg/cm2 [52]

1.4.4 Tác dụng giảm đau, an thần

Các thành phần phthalid trong tinh dầu Cần tây có tác dụng giảm đau an dịu trên chuột 3-n-butylphthalid có tác dụng chống co giật trên chuột cống thí nghiệm Tác dụng chống co giật yếu hơn dẫn chất diazepam nhưng không độc trên tế bào não [11]

Nghiên cứu vào những năm 1970 và 1980 đã chứng minh rằng tinh dầu

Cần tây có tác dụng làm dịu hệ thần kinh trung ương [1]

Nước ép của Cần tây có tác dụng kéo dài và làm tăng tác động gây ngủ của pentobarbital và tác dụng giảm đau của paracetamol và aminopyrine trên chuột [46]

1.4.5 Tác dụng giải độc, bảo vệ gan

Dịch chiết nước từ rễ, lá và hạt Cần tây có tác dụng làm giảm độc tính

của acrylamid Nghiên cứu thực hiện trên 6 lô chuột: lô chứng, lô trắng và các

lô sử dụng dịch chiết Cần tây Kết quả được đánh giá qua các thông số hóa sinh: thông số hủy tế bào gan (ASAT, ALAT, lactate dehydrogenase), thông

Dịch chiết trong methanol của hạt Cần tây có tác dụng bảo vệ gan chống lại sự nhiễm độc khi dùng quá liều paracetamol và thioacetamid [11]

1.4.7 Tác dụng chống oxy hóa

Tinh dầu hạt, các furanocoumarin [56] và một số thành phần tinh dầu (sedanolid, senkyunolide-J) [53] trong Cần tây đƣợc chứng minh là có khả năng chống oxy hoá

1.4.8 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Tinh dầu hạt Cần tây có tác dụng ức chế sự hoạt động của vi khuẩn

Bacillus subtilis, Vibro cholerae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, Shigella dysenteriae, Corynebacterium diphtheriae, Salmonella typhi, Streptococcus faecalis, Bacillus pumilus, Streptococcus pyogenes và Pseudomonas solanacearum [48]

Các dịch chiết: methanol, chloroform, n-hexan, etyl acetate, tinh dầu thân

lá, tinh dầu hạt có tính kháng khuẩn với Gr (-) : E.coli, P aeruginosa ; Gr (+) : B subtillis, S aureus, nấm mốc Aspegilus niger, F oxyporum và nấm men S cererisiae và không có tính kháng khuẩn với nấm men Candida albicans [11]

1.4.9 Tác dụng chống loét dạ dày

Dịch chiết cồn của Cần tây có tác dụng bảo vệ tốt niêm mạc dạ dày và ức chế sự bài tiết dịch vị của dạ dày chuột ở 2 mức liều 250mg và 500 mg/kg thể trọng [23]

Dịch chiết hạt Cần tây được đánh giá có tác dụng chống lại vi khuẩn

Helicobacter pylori gây bệnh trên dạ dày và những vi khuẩn khác Từ dịch

chiết này, người ta phân lập ra thành phần có cấu trúc được đánh giá là phthalid

có tác dụng trên các vi khuẩn này Nồng độ ức chế tối thiểu và kháng khuẩn tối thiểu là 3.15μg/ml và 6.25-12.5μg/ ml, cơ chế tác dụng của nó là do làm mất tính toàn vẹn của màng và sự ức chế tổng hợp các acid nucleic [74]

1.4.10 Tác dụng ức chế sự ngưng tập tiểu cầu

Apigenin - một flavonoid trong Cần tây có tác dụng ức chế sự ngưng tập tiểu cầu trong máu thỏ gây ra bởi collagen, ADP, acid arachidonic, và các nhân tố hoạt động của tiểu cầu nhưng không tác dụng trong trường hợp đông máu gây ra bởi thrombin hay ionophore [67]

Ngoài ra Cần tây được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết [16], [36], tác dụng giảm cân [16], hạt còn giúp thận thải urate và chất thải khác, làm giảm lượng acid trong máu, cải thiện sự lưu thông máu tới cơ và xương [1]

1.5 ĐỘC TÍNH

Ở châu Âu, Cần tây là thực phẩm có thể gây dị ứng [41]

Nghiên cứu độc tính cấp trên chuột thí nghiệm của dịch chiết cồn hạt Cần tây trong vòng 14 ngày dùng đường uống cho kết quả LD50 là 7,55g/kg [23]

Nghiên cứu độc tính trong 28 ngày trên chuột trưởng thành với dịch chiết cồn hạt Cần tây liều 150mg/kg/ngày hoặc 5000mg/kg/ngày dùng đường uống Kết quả cho thấy không có độc tính trường diễn trên chuột và không có

+ Ở Brasil, nhân dân dùng Cần tây làm thuốc kích thích tử cung khi đẻ [20] + Ở Trung Quốc, nhân dân dùng Cần tây làm thuốc giải nhiệt, giảm ho, giúp tiêu hóa, lợi tiểu và hạ huyết áp [20]

+ Ở Philippin, nước sắc Cần tây để lợi tiểu và điều kinh [20]

+ Ở Australia hạt Cần tây được làm thuốc giảm đau trị đau xương, viêm khớp dạng thấp cho kết hạt tốt [20]

+ Theo kinh nghiệm cổ truyền của châu Âu, rễ Cần tây có tác dụng lợi tiểu, gây trung tiện và là thực phẩm cung cấp vitamin C [20]

Theo Võ Văn Chi [6], [7], Cần tây dùng uống chữa suy nhược cơ thể [3], [8] do làm việc quá sức, trị suy thượng thận, kém tiêu hóa, trạng thái thần kinh

dễ bị kích thích, mất chất khoáng (ho lao), tràng nhạc, sốt gián cách, thống phong, sỏi niệu đạo, sỏi thận Dùng ngoài trị vết thương, mụn nhọt, nứt nẻ [8] Tinh dầu Cần tây có trong thành phần thuốc bổ, thuốc an thần, thông đường ruột hạt và dịch chiết hạt được sử dụng trong thức ăn của người ăn kiêng Tinh dầu còn được dùng trong bệnh phù thũng, đau bàng quang, làm thuốc an dịu thần kinh, chống co thắt và trong trường hợp thấp khớp Các tác dụng này chủ yếu là do các hợp chất phtalid ở trong tinh dầu Cần tây [22], [57]

Ngoài ra, Cần tây còn được chứng minh hoạt tính kháng estrogen và được sử dụng làm thuốc tránh thai [37]

1.6.2 Trong kỹ nghệ hương liệu

Tinh dầu Cần tây làm hương liệu trong nước hoa, xà phòng, chất tẩy rửa [22]

1.6.3 Trong thực phẩm

Cây Cần tây từ lâu đã được sử dụng phổ biến làm rau ăn [3], [13], [14], [22] Tinh dầu hạt Cần tây được sử dụng rộng rãi làm hương liệu trong các sản phẩm thực phẩm (món tráng miệng có sữa lạnh, kẹo bánh, thịt đông, đồ gia vị, súp, nước sốt, đồ ăn nhẹ …), đồ uống có cồn và không có cồn …[3], [13], [14], [22]

Thân Cần tây được dùng như một loại rau bổ dưỡng và để ép nước uống [1]

1.7 MỘT SỐ BÀI THUỐC CÓ THÀNH PHẦN LÀ CẦN TÂY

- Bài thuốc chữa chứng viêm khớp và khớp bị sưng [1]: Cây móng rồng, Cần tây, Cây liễu trắng, mỗi loại lấy 8g dược liệu sắc với 750 ml nước, chia làm 4 liều, mỗi ngày dùng từ 2-3 liều, hoặc lấy những phần cồn thuốc bằng nhau trộn lại, ngày uống 3 lần, mỗi lần 1 muỗng cà phê với nước

- Bài thuốc chữa bệnh viêm khớp liên quan đến chứng dư acid và loét đường tiêu hóa [1]: Hòa tan 2 phần cồn râu dê với 1 phần cồn rau Cần tây, mỗi ngày uống 2-3 lần, mỗi lần uống ½ muỗng cà phê với nước

- Bài thuốc chữa bệnh thống phong [1]: Nước sắc quả Cần tây ( 20 g hạt Cần tây pha trong 500ml nước), chia thành 3 liều và uống trong 1 ngày, hoặc thêm 25g quả vào thức ăn dùng trong 1 ngày

- Bài thuốc chữa cao huyết áp : Cần tây cả cây 50g - 60g, sắc lấy nước uống hàng ngày (chia 3 lần) uống đến khi huyết áp ổn định [16]

- Bài thuốc chữa bí tiểu tiện: Cần tây 50g rửa sạch, vò nát, hãm trong ấm tích hoặc phích nước dùng trong ngày cho ra mồ hôi và thông tiện [16]

- Bài thuốc hạ mỡ máu: 500g rau Cần tây, 250g Táo tầu (bỏ hạt) Nấu chín, ăn cả nước và cái [16]

- Bài thuốc chữa tiểu đường: Cần tây tươi 500g, giã vắt lấy nước uống ngày 2 lần liên tục nhiều ngày [16]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu Cần tây nghiên cứu được thu hái tại xã Hải Nam - Hải Hậu - Nam Định

- Thời gian thu mẫu: Tháng 11 năm 2012

- Mẫu cây có hoa được thu hái vào tháng 2 năm 2013

- Xử lý mẫu: Dược liệu được chia làm 2 phần

+ Phần 1: Toàn cây tươi để cất tinh dầu

+ Phần 2: Hạt (quả - danh từ thực vật học) được phơi khô trong bóng râm 1 tuần, sau đó được bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát

- Mẫu cây có hoa được ép tiêu bản, lưu giữ tại phòng Tiêu bản - bộ môn Thực vật – Trường đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là HNIP/17860/13

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có:

- Các dung môi hữu cơ (PA): Cồn tuyệt đối, n-hexan, Chloroform, Ethyl acetat…

- Silicagel sắc ký cột pha thuận cỡ hạt 0,040mm - 0,06mm (Merck)

- Nhựa trao đổi ion Dianion HP20

- Bản mỏng Silicagel F 254 tráng sẵn (Merck)

- Các thuốc thử: Mayer, Dragendorff,…

- Hóa chất vô cơ: NaOH, AlCl3 , HCl …

- Thuốc tiêm Heparin 5000 IU/ml, lọ 5ml của công ty Dược Sanofi

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S9 (Thụy Sĩ)

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200 (Đức)

- Máy đo độ ẩm Precisa HA60 tại bộ môn Công Nghiệp Dược ĐH Dược

Hà Nội

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Kính hiển vi Leica (Đức)

- Máy siêu âm

- Máy ly tâm Universad 320 (Đức)

- Máy sắc ký khí AGILENT TECHNOLOGIES 7890A, detector khối phổ AGILENT TECHNOLOGIES 5975C tại Bộ môn Dược liệu – Trường đại học Dược Hà Nội

- Máy khối phổ AGILENT 6310 ION TRAP và JEOL JMSHX-100 MASS SPECTROMETER tại Viện Hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

- Máy đo cộng hưởng từ hạt nhân: BRUCKER AM500 FT-NMR SPECTROMETER tại Viện Hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

- Máy CA1500 tại khoa Huyết học - Bệnh viện Bạch Mai

- Máy đo ngưng tập tiểu cầu Chronolog (Mỹ) tại Khoa huyết học - Bệnh viện Bạch Mai

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu cây Cần tây theo phương pháp mô tả

phân tích, đối chiếu với khóa phân loại chi Apium L và bản mô tả loài Apium graveolens L của tài liệu Thực vật chí Trung Quốc [39] để xác định tên khoa

học của mẫu Cần tây nghiên cứu

- Sấy khô dược liệu (lá, thân, rễ, hoa) trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C sau đó dùng thuyền tán và chày cối sứ nghiền nhỏ Với dược liệu là hạt, dùng máy xay làm nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi

- Mẫu hạt Cần tây được cắt vi phẫu bằng máy cắt cầm tay, tẩy bằng nước Javen, nhuộm vi phẫu theo phương pháp nhuộm kép

- Mô tả và chụp ảnh đặc điểm bột và vi phẫu bằng máy ảnh Canon

- Xử lý ảnh bằng phần mềm Microsoft office access 2007

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính các nhóm chất chính trong cây Cần tây

- Cất và định lượng tinh dầu có trong bộ phận trên mặt đất và tinh dầu hạt Cần tây bằng phương pháp cất kéo hơi nước

- Nghiên cứu thành phần tinh dầu Cần Tây bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS) với sự hỗ trợ các phần mềm INSTRUMENT I

và DATA ANALYSIS Xác định hàm lượng tương đối các thành phần của tinh dầu dựa trên diện tích pic Nhận dạng các thành phần của tinh dầu bằng cách đối chiếu phổ khối của các pic trên sắc ký đồ với các thư viện phổ FLAVOR 2, NIST 08 và WILEY W9N08

- Định tính các nhóm chất có trong cây Cần tây bằng phản ứng hóa học

- Định tính dịch chiết methanol bộ phận trên mặt đất và dịch chiết methanol hạt Cần tây bằng SKLM

- Xác định các chất chiết được bằng ethanol của bộ phận trên mặt

đất và của hạt Cần tây theo phương pháp ghi tại Phụ lục 12.10 Dược điển Việt Nam IV [5]

2.2.2.2 Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ hạt Cần tây

Dùng Ethanol tuyệt đối chiết bột hạt Cần tây theo phương pháp ngâm lạnh thu được dịch chiết đặc Hòa tan dịch chiết đặc trong nước nóng theo tỷ

lệ 1:1 dùng đũa quấy đều khi nóng, để phân lớp và để nguội thu được dịch chiết nước (DC1), tủa (DC2) và dịch chiết thân dầu (DC3) DC2 được tách riêng đi đun cách thủy ở 600C thu được 20g cắn DC2 Dịch chiết nước còn lại được cô cách thủy tới cắn thu được cắn (DC1) Phân đoạn DC2 được sử dụng

để phân lập chất tinh khiết từ hạt Cần tây

2.2.2.3 Phân lập chất trong phân đoạn DC 2 từ hạt Cần tây

- Phân lập chất có trong phân đoạn DC22 từ hạt Cần tây bằng sắc ký cột

với chất nhồi cột là Silicagel pha thuận, sắc ký trao đổi ion sử dụng nhựa trao đổi ion Dianion HP20

- Xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được dựa trên dữ liệu phổ MS và NMR

2.2.3 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC

2.2.3.1 Chuẩn bị dịch chiết

- Hạt Cần tây khô được xay thành bột thô bằng máy xay và xác định độ

ẩm bằng máy Precisa thu được kết quả độ ẩm của dược liệu là 8,5%

- Cân chính xác 50,0000 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ Chiết dược liệu bằng ethanol theo phương pháp chiết nóng Gộp dịch chiết, đem cô cách thủy ở 700 đến cắn

- Chuẩn bị dịch chiết thử tác dụng bắt đầu từ nồng độ 10mg/ml với dung môi hòa tan cắn là nước cất với mô hình đánh giá ảnh hưởng trên hệ

đông máu in vitro và dung dịch NaCl 0,9% với mô hình đánh giá ảnh hưởng trên sự ngưng tập tiểu cầu in vitro.

- Từ dung dịch trên pha loãng với nước cất thành các nồng độ thích hợp

thử tác dụng in vitro

Bảng 2.1: Thành phần các mẫu trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của

dịch chiết hạt Cần tây đối với hệ đông máu

2.2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết Cần tây đối với hệ đông máu

- Đánh giá ảnh hưởng trên hệ đông máu của dịch chiết Cần tây dựa trên một

số thông số: thời gian Prothrombin (Thời gian Quick) (PT); thời gian Thromboplastin (Thời gian Cephalin – Kaolin) (ATTP) ; Thời gian Thrombin (TT)

Lấy máu của 1 người tình nguyện khỏe mạnh vào buổi sáng cho vào ống nghiệm có vạch định mức 2ml đã có sẵn chất chống đông Natri citrat 3,8% với tỷ lệ 9 thể tích máu: 1 thể tích chống đông, trộn đều

Mẫu thử: Nhỏ vào ống nghiệm máu đã được tiến hành chống đông như trên dịch chiết Cần tây ở nồng độ thích hợp

Mẫu chứng : Nhỏ vào ống nghiệm máu đã được tiến hành chống đông như trên thay dịch chiết dược liệu bằng nước cất, trộn đều

Mẫu chứng dương : Nhỏ vào ống nghiệm máu đã được tiến hành chống đông như trên thay dịch chiết dược liệu bằng dung dịch Heparin 0,5 IU/ml, trộn đều

Ly tâm mẫu chứng và mẫu thử Dịch sau khi ly tâm được đem đo thời gian Prothrombin (PT); thời gian Thromboplastin (ATTP) ; thời gian Thrombin (TT) trên máy CA-1500 tại Phòng Đông máu, Khoa Huyết học truyền máu – Bệnh viện Bạch Mai So sánh kết quả giữa mẫu thử và mẫu chứng

2.2.3.3 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết Cần tây đối với sự ngưng tập

tiểu cầu in vitro

Theo dõi sự ngưng tập tiểu cầu trong huyết tương theo phương pháp của

Born (1963) ghi trong tài liệu Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo [19] bằng máy đo độ kết tập tiểu cầu tự động tại Phòng

Đông máu, Khoa Huyết học truyền máu – Bệnh viện Bạch Mai

- Chuẩn bị dịch chiết đem thử : Dịch chiết Cần tây được chiết theo quy trình mô tả ở mục 2.2.3.1

- Đánh giá ảnh hưởng trên sự ngưng tập tiểu cầu của dịch chiết Cần tây Mẫu thử : Cho dịch chiết Cần tây ở nồng độ thích hợp vào huyết tương giầu tiểu cầu cùng với chất kích thích ngưng tập tiểu cầu Adenin diphosphat (ADP), ủ ở 37oC trong 10 phút trên máy đo ngưng tập tiểu cầu

Mẫu chứng được tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng thay dịch chiết Cần tây bằng dung dịch NaCl 0,9%

Mẫu chứng dương được tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng thay dịch chiết Cần tây bằng dung dịch Aspirin % pha trong dung dịch NaCl 0,9% Đánh giá tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu của mẫu thử bằng cách so sánh độ kết tập tiểu cầu giữa mẫu thử và mẫu chứng

Độ ức chế ngưng tập tiểu cầu được tính theo công thức :

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu

Quan sát tại thực địa, cây Cần tây có các đặc điểm như sau:

Cây thảo, rỗng, mọc thẳng đứng, cao khoảng 1-1,5m, nhiều rãnh nông chạy dọc thân, thân mang nhiều dóng và đốt, chia nhiều cành Lá mọc so le, lá

ở gốc có bẹ to, cuống lá có màng bao, có rãnh phía trong Lá kép lông chim,

có 3-5 lá chét, kích thước lá chét dài 6-9cm, rộng 5-6cm, phiến lá xẻ làm 3 thùy, thùy cuối có hình thoi, có kích thước 2-3cm×2,5-3cm, mép lá có răng cưa Lá ở ngọn cuống ngắn hoặc không cuống có kích thước 5-6cm×5cm Cành mang hoa mọc lên từ các đốt, đối diện hoặc nằm trong kẽ lá, mang nhiều tán kép, mỗi tán kép rộng 1,0-1,5cm, gồm 2-3 tán đơn và nhiều hoa mọc riêng lẻ Mỗi tán đơn rộng 3- 4mm, khoảng 20-30 hoa Hoa nhỏ, rộng 1-1,5mm, hoa đều lưỡng tính, mẫu 5, 5 cánh hoa, 5 nhị xếp xen kẽ với cánh hoa Đài hoa tiêu biến Tràng hoa màu trắng, bị uốn cong Nhị hoa có chỉ nhị dài, bao phấn màu trắng gồm 2 ngăn, chỉ nhị đính lưng Nhụy hoa gồm 2 nhụy rời nhau, 2 lá noãn liền tạo bầu dưới Quả có cuống dài 1-2mm, quả đôi, hơi dẹt, có gân chạy dọc quả, kích thước quả rộng 0,5mm và dài 0,5-1 mm Mặt cắt ngang của quả cho thấy các ống tiết tinh dầu nằm vỏ quả trong, có 1 ống tiết trong mỗi rãnh và có 2 ống trong phần tiếp giáp giữa 2 lá noãn

Công thức hoa: *♀ K 5 C 5 A 5 G (2)

Ảnh chụp cây Cần tây và các đặc điểm cây Cần tây được trình bày ở hình 3.1, hình 3.2

3.1.2 Xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Căn cứ vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, đối chiếu với khóa

phân loại chi Apium L và bản mô tả loài Apium graveolen L của Thực vật chí Trung Quốc [56], với sự giúp đỡ của TS Nguyễn Quốc Huy, mẫu Cần tây nghiên cứu đã được xác định tên khoa học là Apium graveolens L., họ Cần (Apiaceae)