Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và độc tính cấp của cây cổ an (arcangelisia flava (l ) merr)

LÊ TÙNG SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN ARCANGELISIA FLAVA L.. Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước- nhiệm vụ quỹgen "Đánh giá tiềm năng

ARCANGELISIA FLAVA (L.) MERR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC

LÊ TÙNG SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CÂY CỔ AN

(ARCANGELISIA FLAVA (L.) MERR)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Quỳnh Hoa, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian va tâm huyết tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Dược sĩ Đỗ Phương Lan, người hướng dẫn, người thầy thứ hai, đã theo sát tôi trong tiến trình, giúp tôi vượt qua khó khăn, bỡ ngỡ

Tôi cũng rất cảm ơn Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận

Bạn Nguyễn Thị Lương – A2K65, bạn Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, dược sĩ Nguyễn Thị Thùy Linh, đã sát cánh cùng tôi, luôn động viên, giúp đỡ trong quá trình làm khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu nhà trường, các giảng viên trong trường đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong quá trình rèn luyện, học tập tại trường

Cuối cùng xin được gửi lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình người thân đã tạo quan tâm chăm sóc, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa học

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Tùng Sơn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……… 2

1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CỦA CHI ARCANGELISIA BECCARI 2

1.1.1 Phân loại chi Arcangelisia Beccari 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Arcangelisia Beccari 2

1.1.3 Đặc điểm của một số loài thuộc chi Arcangelisia ở Việt Nam 2

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 3

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC 6

1.4 CÔNG DỤNG 7

1.5 SƠ LƯỢC VỀ BERBERIN 7

1.5.1 Công thức hóa học và tính chất 7

1.5.2 Tác dụng dược lý và ứng dụng 8

1.6 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 9

1.6.1 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 9

1.6.2 So sánh giữa HPTLC và TLC 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………12

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 12

2.1.1 Nguyên vật liệu 12

2.1.2 Thiết bị 13

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Về thực vật 14

2.2.2 Về thành phần hoá học 14

2.2.3 Về tác dụng sinh học 14

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 14

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 15

2.3.3 Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng 18

3.1.2 Giám định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu 21

3.1.3 Đặc điểm vi học bột dược liệu 21

3.1.4 Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá 22

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học 25

3.2.1 Định tính sơ bộ thành phần bằng phản ứng hóa học 25

3.2.2 Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng 27

3.2.3 Bán định lượng berberin trong alcaloid toàn phần của AR7 29

3.3 Kết quả thử độc tính trên chuột nhắt trắng 35

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37

4.1 Về thực vật 37

4.2 Về thành phần hóa học 37

4.3 Về thử độc tính cấp trên chuột 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM

KHẢO Error! Bookmark not defined

ADC Analog-to-digital converter

Hình 1.1 Công thức hóa học của một số chất được phân lập từ Arcangelisa flava (L.)

Hình 3.2 Ảnh hình thái quả và hạt của mẫu AR4

Hình 3.3 Đặc điểm bột dược liệu của 3 mẫu AR4, AR7, AR8

Hình 3.4 Các hình ảnh vi phẫu lá cây Cổ an trong nghiên cứu

Hình 3.5 Các hình ảnh vi phẫu cuống lá cây Cổ An

Hình 3.6 Sắc ký đồ alcaloid toàn phần của cây Cổ an ở bước sóng 254 và 366nm

Hình 3.7.Hình ảnh chồng píc của sắc ký đồ của hệ 4 ở bước sóng 366nm

Hình 3.8 Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 1

Hình 3.9 Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 2

Hình 3.10 Đường chuẩn lập từ dãy chuẩn 3

Hình 3.11 Đồ thị khảo sát độ pha loãng của mẫu AR7

Hình 3.12 Đường chuẩn định lượng berberin mẫu AR7 ở độ pha loãng 400

Bảng 1.1 So sánh một số tham số của HPTLC và TLC

Bảng 2.1 Địa điểm và ngày thu hái 3 mẫu cây Cổ an.

Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu

Bảng 3.2 Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn

Bảng 3.3 Kết quả sắc ký đồ các dịch chiết alcaloid toàn phần ở hệ 4 ở bước sóng

366nm

Bảng 3.4 Các dãy nồng độ của dung dịch Berberin chuẩn

Bảng 3.5 Khảo sát độ pha loãng của dung dịch thử

Bảng 3.6 Kết quả bán định lượng berberin ở mẫu AR7 ở độ pha loãng 400 lần Bảng 3.7 Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ

Bảng 3.8 Mô tả tình trạng chuột ở các lô trong vòng 7 ngày

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một alcaloid có nhân isoquinolin có trong nhiều loài thực vật bậc cao, được sử dụng lâu đời trong các nền y học truyền thống Ngoài các tác dụng thường được biết đến như tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng đơn bào, hạ huyết áp, v.v, ngày nay y học hiện đại đã phát hiện thêm các tác dụng mới của berberin như điều trị ung thư, tiểu đường, v.v[2], [17], [33]

Trên thế giới đã xác định được 150 loài có chứa berberin thuộc 23 chi và 7

họ[7] Ở Việt Nam đã xác định được các chi cho berberin gồm Coscinium, Cyclea (Menispermaceae), Berberis, Podophyllum, Mahonia (Berberidaceae), Euodia, Toddalia (Rutaceae), Coptis, Thalictrum (Ranunculaceae) và một số chi họ Papaveraceae Tuy nhiên việc khai thác tràn lan đã khiến các nguồn dược liệu chứa

berberin ngày càng trở nên khan hiếm và có nguy cơ cạn kiệt

Cây Cổ an (Arcangelisia flava (L.) Merr.) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae)

là một loài cây được đồng bào dân tộc sử dụng nhiều làm thuốc chữa bệnh Trên thực

tế, qua điều tra tại thực địa, nghiên cứu nhận thấy đây là một nguồn dược liệu chứa berberin quý hiếm

Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước- nhiệm vụ quỹgen "Đánh giá tiềm năng

di truyền một số nguồn gen dược liệu chứa Berberin ở Việt Nam", thực hiện đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa họcvà độc tính cấp của cây Cổ an

(Arcangelisia flava (L.) Merr.)” với những mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của mẫu cây Cổ An (Arcangelisia flava (L.)

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CỦA CHI ARCANGELISIA

BECCARI

1.1.1 Phân loại chi Arcangelisia Beccari

Arcangelisia là một chi trong họ Tiết dê (Menispermaceae), được lấy tên của

nhà thực vật học người Italia Giovani Arcangeli (1840-1921), có tên thường dùng là Dây hoàng liên hoặc Cổ an [8]

Chi Arcangelisia có 4 loài, phân bố ở Châu Á: 3 loài ở Đông Nam Á và một

loài ở Trung Quốc Ở Việt Nam, có 1 loài [8], phân bố chủ yếu ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai [9]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi ArcangelisiaBeccari

Cây dây leo lớn hóa gỗ Lá có cuống dài, phiến lớn; gân gốc 3-5; gân lá hình chân vịt, gân giữa mang mỗi bên 1-2 gân Cụm hoa chùm ở nách lá, phân nhánh hình bông Hoa đực có 6 lá đài mà 3 cái ngoài nhỏ, 3 cái trong hơi lớn hơn các cánh hoa; cánh hoa 3; nhị 9-12, chỉ nhị không rõ, bao phấn dính nhau thành hình đầu, có 4 thùy

ít phân biệt, mở ngang Hoa cái có bao hoa như hoa đực; lá noãn 3, mỗi cái chứa 2 noãn; đầu nhụy mập dày, có 3 góc Quả hạch có vân lăn tăn hoặc bị gặm, hình trứng –trụ, có một rãnh vòng quanh, mặt ngoài có lông Vỏ quả ngoài dai, vỏ quả trong cứng Hạt có nhiều phôi nhũ quanh phôi; lá mầm nhỏ, không thẳng [8], [34]

1.1.3 Đặc điểm của một số loài thuộc chi Arcangelisia ở Việt Nam

1.1.3.1 Arcangelisia loureiri(Pierre) Diels– Vẩy đắng, Dây hoàng liên, Cổ sơn

long

Dây leo to hóa gỗ, cành già có khía Lá đơn, mọc so le, hình trứng tròn hoặc hình bầu dục rộng, dài 8-12 cm, rộng 6-10cm, đầu nhọn, gốc gần bằng ngang; gân gốc 3-5; cuống lá phình ở gốc và ở ngọn, dài 3-8 cm Cụm hoa chùm, ở nách lá trên các nhánh già Cụm hoa đực nhỏ, dài 8cm, phân nhánh hình bông, không cuống, lá bắc hình tam giác; lá đài ngoài 3, 3 gần hình thuyền; nhị 9 hướng ngoài, rất ngắn

Cụm hoa cái dài 30-50cm Hoa cái có 6 phiến bao hoa, hình tròn dài hẹp, đầu mút hướng ra sau; nhị thoái hóa nhỏ, dạng vẩy; lá noãn 3; không có vòi nhụy; đầu nhụy rộng, có 3 góc.Quả hạch hình tròn dài, về sau có màu vàng, ở đỉnh có dấu vết của đầu nhụy, mặt ngoài có lông mềm

Phân bố ở Malaysia, Indonesia(Sumatra), Việt Nam và Nam Trung Quốc Ở nước ta cũng chỉ gặp tại tỉnh Đồng Nai (Bảo Chang, Cát Tiên) [8]

1.1.3.2 Arcangelisa flava (L.) Merr – Dây Hoàng Liên, Cổ An

Dây leo to; gỗ vàng tươi, mủ vàng; nhánh non không lông, đen, cũng như cuống lá Phiến to hay trung, kích thước 10-25 x 4,5-19cm, dai cứng, không lông, gốc tròn hay hình tim, gân 5 từ gốc; cuống 3-15cm, phù 2 đầu Chùm tụ tán 10-50cm; hoa đực nhỏ, 3 lá đài ngoài, 3-3 lá đài trong, tiểu nhụy lép như vảy, 3 tâm bì Trái xoan, dài 2 cm, vàng, trên đế hoa phù rộng

Phân bố: Loài phân bố ở Thái Lan, Việt Nam và Nam Trung Quốc, ở nước ta chỉ gặp ở vùng thấp tỉnh Đồng Nai Thu hái quanh năm, rửa sạch, thái lát, phơi khô [9]

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Theo nghiên cứu của Thornber (1970), alcaloid nhân isoquinolin gồm palmatin và jatrorrhizinvà alcaloid berberin đã được ghi nhận phân lập từ

Arcangelisa flava (L.) Merr [31]

Cấu trúc hóa học của một số chất phân lập từ Arcangelisa flava (L.)

Merr.được xác định bởi phương pháp phân tích phổ bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân và đo khối phổ[20] gồm palmatin, jatrorrhizin và berberin được mô tả trong hình 1.1:

Hình 1.1.Công thức hóa học của một số chất được phân lập từ

Arcangelisa flava (L.) Merr

Một số alcaloid khác như columbamin, dehydrocorydalmin, homoaromolin và

thalifendin cũng được phân lập từ thân của Arcangelisa flava (L.) Merr.[32].Nhiều

hợp chất furanoditerpen gồm fibraurin, 6-hydroxyfibraurin, fibleucin, chasmantin, palmalin, columbin, jateorin, isojateorin và tinopylon đã được phân lập từ các cây họ Tiết dê(Menispermacea) Theo Toshinobu Kunii và cộng sự, bốn hợp chất furanoditerpen mới bao gồm 6-hydroxyarcangelisin, 2-dehydroarcangelinisinol,

tinophylol và 6-hydroxyfibleucin đã được phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr

[21]

Năm 2011, theo Toshisada Suzuki và các cộng sự, hai hợp chất furanoditerpen mới là 2a,3a-epoxy-2,3,7,8 a-tetrahydropenianthic acid methyl ester và 2a,3a epoxy-2,3-dihydropenianthic acid methyl ester đã được phân lập và phát hiện từ rễ của

Arcangelisiaflava (L.) Merr.[30]

Hình 1.2 Công thức hóa học của các furanoditerpen được phân lập từ

Arcangelisia flava (L.)Merr

(1): 2a,3a-epoxy-2,3,7,8 a-tetrahydropenianthic acid methyl ester;

(2): 2a,3a epoxy-2,3-dihydropenianthic acid methyl ester

Các thử nghiệm sinh học bằng cất phân đoạn dịch chiết nóng từ thân cây đã giúp phân lập palmatin, berberin, jatrorrhizin, dihydroberberin và 20-hydroxyecdyson

từ Arcangelisia flava (L.) Merr.trong đó 3 chất đầu tiên đã được biết đến là thành phần của Arcangelisa flava (L.) Merr.còn jatrorrhizin, dihydroberberin và 20-

hydroxyecdyson là những sản phẩm tự nhiên được phân lập lần đầu tiên[24]

Hình 1.3.Công thức hóa học của dihydroberberin (4) và 20-hydroxyecdyson (5)

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC

Dịch chiết methanol của Arcangelisia flava (L.) Merr.cho tác dụng chống oxi

hóa trung bình với gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ở liều EC50 là 25-55µg/ml Dịch chiết methanol, chloroformcho tác dụng gây độc tế bào đối với tôm mặn (brine shrimp) và dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với liều LC50 và IC50 giá trị lần lượt là 210-278 và 8-12µg/ml [20]

Hoạt tính kháng khuẩn của Arcangelisia flava (L.)Merr được đánh giá thông qua phương pháp khuếch tán đĩa với dịch chiết nước của Arcangelisia flava (L.)Merr., sử dụng 3 vi sinh vật:Salmonella typhii, Staphylococcus aureus và Trichophyton rubrum Kết quả, cho hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt với 3 chủng vi sinh vật trên[18] Đối với Aeromonas hydrophila, cũng bằng phương pháp khuếch tán đĩa

trong môi trường thạch, trong các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat, diethyl ether,

methanol, aceton và nước từ thì dịch chiết Chloroform của Arcangelisia flava

(L.)Merr.cho hoạt tính kháng cao nhất với vòng ức chế đường kính 17,25mm [23]

Năm hợp chất furanoditerpen được phân lập từ Arcangelisia flava (L.) Merr

gồm 2a,3a-epoxy-2,3,7,8a-tetrahydropenianthic acid methyl ester; dihydropenianthic acid methyl ester; Fibraurin; fibleucin và 2b,3a-dihydroxy-

2a,3aepoxy-2,3-2,3,7,8a-tetrahydropenianthic acid-2,17-lactonecho tác dụng chống nấm với Trametes versicolor và Fomitopsis palustris[30]

Khi đánh giá hoạt tính in vitro kháng Plasmodium falciparum, Arcangelisia flava (L.) Merr.là một trong sáu cây thuốc cho hoạt tính kháng Plasmodium

falciparum tốt (IC50 từ 0.4 đến 8.6 g/ml) với tác dụng chọn lọc đặc hiệu [25]

Các chất phân lập được từ Arcangelisia flava (L.) Merr.gồm palmatin,

berberin, jatrorrhizin, dihydroberberinvà 20-hydroxyecdysonđược đánh giá tác dụng

ức chế sự phát triển của ký sinh trùng Babesia gibsoni gây bệnh lê dạng trùng (babesiasis ) trong điều kiện nuôi cấy 1 tuần Bốn chất đầu đã cho tác dụng ức chế có

ý nghĩa lâm sàng ở nồng độ 1 đến 100µg/ml, trong khi 20-hydroxyecdyson chỉ có tác dụng ức chế khi ở nồng độ 100µg/ml [24]

1.4 CÔNG DỤNG

Ở Thái Lan,gỗ cây đư

và trừ tiêu chảy Rễ đượ

Công thưc hóa học:

Tên khoa học:5,6 dihydro

anthracen clorid dihydrat

Lý tính:

Tinh thể hay bột kết tinh m

dạng base là 145oC (bị phân hủy)

ethanol, khó tan trong eth

trong nước sôi, tan trong

muối sulfat dễ tan trong n

đối nên không có đồng phân quang học

cây được dùng để lợi tiêu hóa, bổ huyết, làm

ợc dùng làm thuốc nhuận tràng [9]

c sử dụng truyền thống để điều trị sốt rét, b

t Nam, theo kinh nghiệm dân gian, cây Cổ an có vị

ng thanh nhiệt giải độc, lợi kinh, trị sốt, giúp ho, ch

ỢC VỀ BERBERIN

ức hóa học và tính chất

20H18NO4Cl 2H2O; Phân tử lư

dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno(5,6anthracen clorid dihydrat[6]

ột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng Độ chảy khi ở

ị phân hủy) Dạng base tan chậm trong nethanol, khó tan trong ether Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400 trong n

ớc sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong chloroform v

ối sulfat dễ tan trong nước ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol.Berberin không có C bất

ực tế không tan trong chloroform và ether Dạng

ớc ở tỷ lệ 1/30, tan trong ethanol.Berberin không có C bất

Hóa tính:

Hóa tính của N + : berberin có tính chất như một base yếu, tạo muối bằng cách

thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà muối tạo thành giống muối hydroxyd kim loại, đồng thời có sự tạo thành phân tử nước

Hóa tính của Oxy: berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh, N không bền vững, dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi là berberinal

Hóa tính của mạch kép: Berberin có thể mất mạch kép tại nhân giữa để cho

các hydro alcaloid không màu[15]

Berberin gần đây đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết và cho thấy hiệu quả tương đường với metformin, cơ chế hoạt động bao gồm việc ức chế aldose reductase, làm giảm đường và ngăn ngừa sự kháng insulin Berberin làm giảm mạnh lượng cholesterol, LDL cholesterol, triglycerid và xơ vữa

nhưng cơ chế hoạt động khác biệt với statin làm cho berberin không gây ra tác dụng phụ điển hình như statin [29]

Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tác dụng chống ung thư của berberin, berberin

có thể ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm ung thư vú, ung thư biểu mô, ung thư tụy, ung thư dạ dày mà không làm ảnh hưởng đến sự phát

triển của các tế bào bình thường ở nồng độ nhất định [26]

1.6 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.6.1 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kỹ thuật SKLM Thiết bị HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động như: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC Scanner 3,4), và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [35]

Về nguyên tắc cơ bản, HPTLC không khác nhiều so với sắc ký lớp mỏng thông thường Cả hai phương pháp đềulà kỹ thuật tách được tiến hành trên một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha đ ng bao g m dung d ch c n phân tích đ c hòa tan trong m t dung môi thích h p

và đ c hút lên b n s c kí b i l c mao d n, (ho c đ a lên b n m ng b ng l c

đ y c a máy), tách dung d ch thí nghi m d a trên tính phân c cc a các thành

ph n trong dung d ch [1]

Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf = dR/dM Trong đó:

dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Bảng 1.1: So sánh một số tham số của HPTLC và TLC

2 Độ dày lớp pha tĩnh 5-6µg 10-12µg

3 Chiều cao đĩa lý thuyết 12µg 30µg

5 Giới hạn phát hiện(Sử dụng

máy đo độ hấp thụ UV-VIS) 100-500pg 1-5 ng

6 Giới hạn phát hiện(Sử dụng

máy quét huỳnh quang) 5-10pg 50-100ng

Ưu điểm của HPTLC so với TLC như sau [10]:

- Khả năng phân tách tốt hơn Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng cũng tốt hơn

- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn

- Thời gian triển khai ngắn hơn

- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc ký tự động, buồng triển khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu Các yếu tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn chế tới tối đa các thay đổi

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên vật liệu

2.1.1.1 Mẫu nghiên cứu

Ba mẫu Cổ An AR4, AR7, AR8, thời gian và địa điểm thu hái được mô tả cụ thể trong bảng 2.1 và phụ lục 3

Bảng 2.1 Địa điểm và ngày thu hái 3 mẫu cây Cổ an

Nguồn gốc

Bến cự - Vườn quốc gia Cát Tiên - Đồng Nai

Vườn quốc gia Cát Tiên - Đồng Nai

Đèo Chuối - Bảo Lộc - Lâm Đồng

HNIP/18120/15 HNIP/18121/15 HNIP/18122/15

Mẫu nghiên cứu thực vật được lấy cả thân, lá và cơ quan sinh sản (nếu có), tiêu bản cây khô được lưu tại phòng Tiêu bản – Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội

Mẫu nghiên cứu hoá học và tác dụng sinh học được lấy phần thân, được thái nhỏ, sấy khô ở 55-60oC, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát

Các hóa chất và thuốc thử định tính: Bột Magie kim loại, dd HCl đặc, dd NH3

đặc, dd NH3 6N, dd NaOH 10%, dd FeCl3 5%, dd NaOH đặc, dd acid sulfanilic, dd NaNO2 5%, dd NaNO2 10%, dd anhydrid acetic, dd H2SO4 đặc, dd H2SO4 1N, dd Pb(CH3COO)2 30%, dd Pb(CH3COO)2 10%, Na2SO4 khan, dd H2SO4 đặc, dd acid Picric 1%, dd Natri nitroprussiat 0.5%, gelatin 1%, tinh thể Na2CO3, dd TT Fehling A

và TT Fehling B, dd Ninhydrin 3%, dd TT Mayer, dd TT Bouchardat, dd TT Dragendorff

Giấy quỳ, ống mao quản, bản mỏng, ống lưu mẫu, hạt silicagel, bản mỏng TLC, giấy bóng bọc, giấy dán nhãn

2.1.1.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g, khỏe mạnh, giống cái,

do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

2.1.2 Thiết bị

- Hệ thống chiết xuất: Bình cầu, ống sinh hàn, dây nối

- Kính hiển vi màn hình Nikon SMZ 745T

- Kính lúp soi nổi Nikon ECLIPSE

- Máy HPTLC Camag bao gồm : thiết bị chấm mẫu Linomat 5, thiết bị khai triển ADC

2, máy soi UV-visualizer

- Bộ dụng cụ hồi lưu cách thủy: Sinh hàn, giá đỡ kim loại, bình chiết hồi lưu, ống cao

su, bếp đun hồng ngoại

- Bình chiết hồi lưu

- Bình triển khai sắc ký

- Nồi đun cách thủy

- Tủ sấy WiseVen ® WOF

- Máy đo hàm ẩm Precisa HA60

- Cân phân tích Shimadzu

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 50, 100 và 200 ml; bình định mức 5 ml, 10 ml, 25

ml, 50 ml, 100 ml; pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Về thực vật

- Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu

- Sơ bộ xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

- Làm tiêu bản vi phẫu thân, mô tả, quan sát đặc điểm cấu tạo giải phẫu

- Quan sát, mô tả đặc điểm bột dược liệu

2.2.2 Về thành phần hoá học

- Định tính thành phần hoá học chính trong mẫu nghiên cứu

- Chiết xuất và định tính alcaloid toàn phần trong các mẫu nghiên cứu

- Bán định lượng các thành phần alcaloid chính của các mẫu thu thập được

2.2.3 Về tác dụng sinh học

- Thử độc tính cấp cao đặc thân Cổ an trên chuột nhắt trắng

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

2.3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái

Mô tả các đặc điểm hình thái bằng phương pháp mô tả phân tích Sử dụng kính lúp soi nổi hoặc quan sát bằng mắt thường, từ đó mô tả các đặc điểm hình thái các cơ quan dinh dưỡng (rễ, thân, lá) và cơ quan sinh sản (nếu có)[4], [5]

So sánh các đặc điểm hình thái mô tả được với các đặc điểm ghi trong khoá phân loại của Thực vật chí Trung Quốc, sơ bộ giám định tên khoa học [34]

2.3.1.2 Làm tiêu bản vi học thực vật

Tiêu bản vi học các cơ quan dinh dưỡng của các mẫu nghiên cứu được làm theo phương pháp cắt và nhuộm kép, sử dụng kính hiển vi quan sát mẫu tiêu bản vi học, từ đó mô tả các đặc điểm định tính và định lượng về cơ quan giải phẫu của các mẫu [4]

2.3.1.3 Soi bột

Dược liệu được sấy khô, xay nhỏ, chọn ra các phần bột kích thước nhỏ, mịn rồi quan sát hình dạng, màu sắc, ngửi, nếm, nhận biết mùi vị của bột Soi tìm đặc điểm bột rồi chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn kết camera Nikon DS Fi2 [13]

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

2.3.2.1 Định tính sơ bộ thành phần bằng phản ứng hóa học

Định tính bằng phản ứng hóa học trong ống nghiệm theo tài liệu Thực tập dược liệu [13]

2.3.2.2 Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng

(1) Chiết xuất alcaloid

Cân chính xác khoảng 1,0g bột dược liệu Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol: acid hydroclorid (100:1) Đun hồi lưu cách thủy 30 phút, lọc lấy dịch chiết Thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol: acid hydroclorid (100:1), chiết lặp lại 2 lần Tập trung dịch chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn Hòa tan trong nước nóng 5 lần, mỗi lần 15ml, lọc lấy dịch chiết Cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn trong methanol, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm vừa đủ methanol tới vạch lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

(2) Tiến hành sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị bản mỏng: Dùng bản mỏng Aluminum silicagel GF254, hoạt hóa bản mỏng ở 110oC trong 1 giờ, sau đó lấy ra để nguội để triển khai sắc ký

Chuẩn bị pha động: Khảo sát các hệ pha động sau để chọn ra hệ có khả năng tách tốt nhất để tiến hành định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng

- Hệ 1: n-butanol: acid acetic: H2O (7: 1:20) [6]

- Hệ 2: Chloroform: methanol (9:1)[22]

- Hệ 3: n-propanol:nước:acid forrmic(90:8:0,4)[12]

- Hệ 4: Ethylacetat:n-butanol:acid acetic:nước (1,5:5,5:1,0:2,0)[19], [22]

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dung dịch berberin chuẩn và palmatin chuẩn dùng

để định tính alcaloid trong các mẫu nghiên cứu là dung dịch có nồng độ 0,06%

Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Là dịch chiết alcaloid toàn phần

(3) Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Pha các dãy dung dịch chuẩn Berberin có các giới hạn nồng độ khác nhau như bảng 2.2

Bảng 2.2 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)

Pha loãng thành dãy chuẩn có nồng độ tương tương ứng với từng dãy ở trên

(4) Chất hấp phụ: Bản mỏng Aluminum silicagel GF254, kích thước 10x20cm hoạt

hóa ở 110oC trong 1 giờ, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

(5) Hệ dung môi khai triển: ethylacetat: n-butanol:acid acetic:nước (1,5:5,5:1:2) (6) Tiến hành sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trên hệ thống HPTLC Camag: sử dụng

phần mềm Wincat

+ Phun mẫu bằng máy Linomat 5, thể tích phun mẫu là 3 µl, độ dài vết 6mm, vị trí chấm cao 0.8mm, cách mép 1.5mm

+ Triển khai sắc ký trên máy ADC 2 trong điều kiện:

Thể tích dung môi dùng để bão hòa là 25ml, thời gian bão hòa dung môi là 20 phút Thể tích dung môi dùng để triển khai sắc ký là 10 ml Chiều dài quãng đường chạy của dung môi là 80 mm Thời gian làm khô dung môi sau khi triển khai là 5 phút

+ Quan sát bản mỏng dưới đèn UV ở bước sóng 254nm và 366nm

+ Đo diện tích pic berberin và palmatin bằng phần mềm Videoscan

+ Xử lí số liệu bằng phần mềm Excel 2010 và Videoscan

Hàm lượng berberin (hoặc palmatin) trong các mẫu nghiên cứu (tính theo dược liệu khô) được tính theo công thức:

Trong đó : X% Hàm lượng berberin trong mẫu cây

Ct : Nồng độ berberin trong dung dịch thử (mg/ml)

Mt : Khối lượng bột dược liệu cân được (mg)

a : Hàm ẩm của bột dược liệu (%)

Động vật: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng từ 18-22 g, khỏe mạnh, giống cái, do viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

b.Phương pháp nghiên cứu

Chuột được nhịn đói 4h trước khi uống chế phẩm thử, nước uống bình thường Sau 4h, chuột được chia thành 6 lô (mỗi lô 10 con), cho chuột uống mẫu thử Thể tích mẫu thử mỗi lần cho chuột nhắt uống là 0,2 ml/10g chuột tương đương với 100g dược liệu/kg chuột

- Lô 1: uống nước muối sinh lý 0,9%

- Lô 2: uống mẫu thử với liều cao nhất có thể cho uống là 100g cao/kg chia làm 2 lần/4h

Chuột được cho ăn trở lại sau 2 giờ, nước uống bình thường Theo dõi liên tục trong vòng 4 giờ đầu và tiếp tục theo dõi trong thời gian 7 ngày sau khi uống chế phẩm thử

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu

- Tỉ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ

- Khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT

3.1.1 Đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu

3.1.1.1 Đặc điểm thực vật mẫu AR4

Cây dây leo to, thân cây tiết diện hình tròn, có khía dọc thân, không gai Vết cắt ngang thân có màu vàng nhạt Lá đơn, nguyên, mọc so le, phiến hình tim, rộng 9-

12 cm, dài 17-18 cm, bề mặt lá sần sùi, gốc phiến lá hình tim, gân lá hình chân vịt, gân từ gốc 5; cuống lá dài 8-12cm, gốc cuống lá phình cong, ngọn lá mũi nhọn Quả thịt, hình gần cầu, đường kính khoảng 4-4,5cm; vỏ quả dày khoảng 1-1,5mm, hạt có kích thước lớn gần hết khoang bên trong quả, bên ngoài có lớp thịt mỏng, bám chắc vào vỏ hạt

Chưa thu được mẫu hoa của mẫu AR4

3.1.1.2 Đặc điểm thực vật mẫu AR7

Cây dây leo to, thân cây có tiết diện tròn, đặc, có khía dọc thân, không gai Vết cắt ngang thân có màu vàng tươi Lá đơn, nguyên, so le, phiến hình trứng, rộng 13-14 cm, dài 8-16 cm, bề mặt lá nhẵn, bóng, gốc phiến lá nhọn, gân lá hình chân vịt, gân từ gốc 5; cuống lá dài 7-12 cm, gốc cuống lá phình cong, ngọn lá nhọn

Chưa thu được mẫu hoa và quả của mẫu AR7

3.1.1.3 Đặc điểm thực vật mẫu AR8

Cây dây leo to, thân cây có tiết diện tròn, có khía chạy xéo thân, không gai Vết cắt ngang thân có màu vàng nhạt Lá đơn, nguyên, mọc so le, phiến hình tim, rộng 7-14 cm, dài 12-20cm, bề mặt lá trơn, nhẵn ngọn lá mũi nhọn, gốc lá hình tìm, gân lá hình chân vịt, 5 gân chính; cuống lá có dài 6-12 cm, gốc cuống lá phình cong

Chưa thu được mẫu hoa và quả của mẫu AR8

3.1.2 Giám định tên khoa h

Bột dược liệu có màu nâu, mùi

quan sát thấy cả 3 mẫu b

tương tự như nhau Các đ

tròn hoặc đa giác, đường kính kho

tinh thể canxi oxalat (3) hình

nh tên khoa học của các mẫu nghiên cứu

m hình thái của các mẫu nghiên cứu, đối chi

t [28], [34]và so sánh với tiêu bản lưu tại Phòng tiêu b

t Các mẫu nghiên cứu được sơ bộ giám định tên khoa h(L.) Merr., Menispermaceae

B

nh các mẫu nghiên cứu (A Mẫu AR4, B Mẫu AR7, C M

Hình 3.2 Ảnh hình thái quả và hạt của mẫu AR4

m quả; B Một quả riêng biệt; C Vỏ quả; D H

bột dược liệu

u có màu nâu, mùi thơm đặc trưng Khi soi b

u bột thân cây Cổ an (AR4, AR7, AR8)đ

ác đặc điểm bao gồm: mảnh mô mềm (1) vách m

ng kính khoảng 200 µm; thể cứng (2) hình (3) hình khối đa diện, dài khoảng 25 µm; m

i chiếu với các tài liệu

mảnh mạch điểm (4);

sợi (5); hạt tinh bột (6) hình tròn, đường kính 10 µm; mảnh mô mềm (7) mang nhiều hạt tinh bột, dài khoảng 280µm; mảnh mang màu(8)có màu đen

Hình 3.3 Đặc điểm bột dược liệu của 3 mẫu AR4, AR7, AR8

1 Mảnh mô mềm; 2 Thể cứng; 3 Tinh thể canxi oxalat; 4 Mảnh mạch điểm; 5 Sợi;

6 Hạt tinh bột; 7 Mảnh mô mềm; 8 Mảnh mang màu

3.1.4 Đặc điểm vi phẫu lá và cuống lá

Đặc điểm vi phẫu của 3 mẫu đều có những điểm tương đồng chung về cấu trúc

3.1.4.1 Vi phẫu lá

Cấu tạo phiến lá từ dưới lên trên của cả 3 mẫu AR4, AR7, AR8 đều bao gồm

các phần: Biểu bì dưới và biểu bì trên là một hàng tế bào nhỏ xếp xít nhau;ngay dưới

lớp biểu bì có một lớp mô dày, gồm các tế bào bắt màu đỏ sẫm, có thành dày lên ở

góc; dưới đó là mô mềm tạo bởi những tế bào vách mỏng, xếp xít nhau, bắt màu hồng; đan xen ở giữa lớp mô mềm có những tế bào mô cứnglà những tế bào chết, có màng dày hóa gỗ, bắt màu xanh; dưới lớp mô mềm là vòng mô cứng màu xanh, làm