Luân Văn Phân Bón Vi Sinh Đại học Nông Ngiệp

Phân bón được chia làm 3 nhóm chính: phân hữu cơ, phân hóa học và phân vi sinh, với sự khác biệt lớn giữa chúng là nguồn gốc, chứ không phải là những sự khác biệt trong thành phần dinh dưỡng.Các loại phân bón hữu cơ và một số loại phân bón khai thác vô cơ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ, trong khi các loại phân bón hoá học tổng hợp vô cơ chỉ được phát triển mạnh từ thời cách mạng công nghiệp. Sự hiểu biết và sử dụng tốt các loại phân bón là những thành phần quan trọng của cuộc Cách mạng Nông nghiệp Anh tiền công nghiệp và cuộc cách mạng xanh công nghiệp ở thế kỷ 20.

Phần 1 : Mở đầu

Phân bón là yếu tố quan trọng trong sản xuất nông nghiệp Từ đầu thế kỷ

XX, việc sản xuất và sử dụng phân bón vô cơ đã góp phần quan trọng nâng caosản lợng nông sản, giải quyết nạn đói cho nhân loại Tuy vậy, nếu chỉ sử dụngphân vô cơ để nâng cao năng suất cây trồng sẽ dẫn đến sự ô nhiễm môi trờng vàsuy giảm chất lợng nông sản vì các lý do sau:

- Để sản xuất phân vô cơ , cần sử dụng một lợng lớn nhiên liệu: Than đá ,dầu mỏ quá trình thiêu đốt các loại nhiên liệu, đã tạo nên hàng triệu tấn khí thải

độc hại, thổi vào khí quyển và hàng tỷ mét khối nớc thải đổ vào các nguồn nớcmặt Nguồn khí, nớc thải này đã góp phần làm ô nhiễm môi trờng sinh thái củatrái đất, tăng cờng hiệu ứng nhà kính [18]

- Sử dụng phân vô cơ lâu ngày với liều lợng cao, sẽ hạn chế sự đa dạng củaquần thể sinh học đất, mật độ tế bào vi sinh vật trong đất giảm, số lợng giun đấtgiảm nghiêm trọng thậm chí bị mất đi Chính những yếu tố này, làm cho đất ngàycàng trở nên chai cứng, độ phì nhiêu của đất giảm nghiêm trọng

Chính vì vậy, trong những năm gần đây xu hớng xây dựng một nền nôngnghiệp bền vững, nhằm nâng cao năng suất nông sản nhng vẫn giữ đợc độ phì của

đất lâu dài đang đợc phát triển Sử dụng cân đối giữa phân vô cơ, phân hữu cơ( phân xanh, phân chuồng, phân ủ ) và phân vi sinh vật là một nội dung quantrọng của nền sản xuất nông nghiệp bền vững[18]

Phân bón vi sinh vật là sản phẩm sinh học, có tác dụng nâng cao năngsuất và chất lợng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ và góp phầntạo cân bằng sinh thái Phânbón vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trọng việc bảo

vệ môi trờng và xây dựng nền nông nghiệp sạch bền vững Do vậy, nghiên cứu sửdụng rộng rãi phân bón vi sinh vật trong nông - lâm nghiệp đã và đang đợc nhiềunớc trên thế giới quan tâm và đầu t phát triển Kết quả nghiên cứu từ các nớc

Mỹ , Canada, Nga, ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản Cho thấy sử dụngchế phẩm vi sinh vật có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30-60 kg N / ha /nămhoặc thay thế một lợng lớn lân vô cơ bằng quặng photphat Ngoài ra, qua hoạt

động sống của vi sinh vật cây trồng đợc nâng cao khả năng trao đổi chất , khảnăng chống chịu bệnh tật và qua đó góp phần nâng cao năng suất và chất lợngnông sản Các loại phân bón vi sinh vật đang đợc thế giới nghiên cứu và sửdụngcó thể kể đến là : Phân vi sinh vật cố định Nitơ cộng sinh, hội sinh và tự do;phân vi sinh vật phân giải hợp chất Photpho khó tan; chế phẩm vi khuẩn lam; chếphẩm nấm rễ

So với lịch sử phát triển của phân bón vi sinh vật trên thế giới, việc nghiêncứu thử nghiệm phân vi sinh vật ở Việt Nam còn rất mới mẻ Việt Nam mới chỉtập trung nghiên cứu về vi sinh vật cố định Nitơ và đang đợc sản xuất, ứng dụngtại một số đối tợng cây trồng nông nghiệp chính nh: Lúa, đậu, lạc song qui môcòn hết sức hạn chế và cha đáp ứng đợc yêu cầu của ngời sử dụng Trong khi

đó, thực tế sản xuất nông - lâm Việt Nam lại đòi hỏi một số lợng lớn, không chỉphân vi sinh vật cố định Nitơ mà cả phân vi sinh vật phân giải lân - Một loại phân

vi sinh vật mới đợc đề cập đến trong khuôn khổ đề tài cấp nghành mà ViệnKHKTNN Việt Nam đã tiến hành trong giai đoạn 1992-1995 Kết quả nghiên cứucho thấy, sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 30-50% phân vô cơbằng quặng photphat mà năng suất cây trồng không thay đổi [18]

Tiếp tục nghiên cứu để mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân bón visinh vật, đề tài KHCN 02-06 giai đoạn 1996-2000 do Ts: Phạm Văn Toản làmchủ nhiệm đề tài đã nghiên cứu và tạo thêm một số chế phẩm phân vi sinh vậtphục vụ cho sản xuất nông - lâm nghiệp [18]

Nhằm góp phần tạo sản phẩm phân bón vi sinh vật phục vụ cho sản xuấtnông - lâm nghiệp chúng tôi chọn đề tài: ” Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu

đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tiêu “

Trong khuôn khổ đề tài này chúng tôi tập chung giải quyết những vấn đềchính sau:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giảiPhotphat khó tan

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng tuyển chọn

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng đến khả năng sinh trởng và phát triển của chủng vi sinh vật phân lập đợc , nhằm tạo điều kiện phát huy hoạt tính sinh học của chúng

Phần 2: Nội dung

Chơng I: Tổng quan tài liệu I.1 Lý thuyết về phân giải photpho

I.1.1 Vai trò của photpho đối với sự sinh trởng phát triển của cây trồng

Photpho là nguyên tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố dinh dỡng đa lợngchính của cây trồng( N,P,K) là nguyên tố cơ bản cần thiết cho sự sống của tất cảcác loài sinh vật đặc biệt là thực vật Photpho là thành phần xây dựng nên các hợpchất quan trọng bậc nhất của tế bào nh: Photphoprotein, photpholipit,photphoeste, trong các vitamin( B1,B6).Đặc biệt photpho là thành phần không thểthiếu của ATP, ADP,GTP,FAD,NADP,coA, đây là những phân tử trao đổi năng l-ợng, có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình quang hợp và hô hấp của thựcvật [ 7 ]

Photpho có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trởng của cây trồng Dới tác độngcủa photpho cây trồng có hạt chín sớm hơn 5 -7 ngày, cây ăn quả có số quả chínsớm nhiều hơn đạt tới 78%( nếu không bón phân photpho chỉ chín 32%) [2] Bón photpho làm tăng tính chịu rét, tăng độ đờng cho củ cải, tăng lợng tinhbột cho củ khoai tây, nói chung là photpho có tác dụng tăng chất lợng cùng năngsuất cho cây trồng lên rất nhiều [12]

Ngoài ra, photpho còn giúp cho cây chịu hạn tốt hơn nhờ khả năng ngậm nớccao của nó Đối với cây họ đậu photpho còn giúp cho quá trình cố định Nitơ tốthơn [3]

Trong quá trình sinh trởng của cây, photpho có tác dụng khống chế độ độccủa lợng đạm khoáng cao trong cây vì nó giúp cho thực vật tăng cờng việc chuyểnhoá đạm khoáng thành đạm Protein Hơn nữa sự có mặt của photpho làm cây hấpthụ đợc lợng đạm khoáng nhiều hơn [1]

Thực tế đã chứng minh rằng khi thiếu photpho sự hình thành tế bào mới bịchậm lại, cây còi cọc ít phân cành đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, khôngsáng Thiếu Photpho năng xuất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng , ngay cả khicây đợc cung cấp đầy đủ Nitơ

I.12 Vòng tuần hoàn của Photpho trong tự nhiên

Chu trình Photpho ở trong đất đợc thể hiện qua sơ đồ 1 Sơ đồ 1 cho thấy, visinh vật phân giải Photphat có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình chuyểnhoá Photpho ở trong đất Photpho dễ tiêu đợc giữ lại trong đất dới dạng các hợpchất khó tan và chỉ đợc trả lại cho đất dới dạng dễ tan cho cây nhờ vào vi sinh vậtchuyển hoá chúng[23]

Sơ đồ 1: Chu trình chuyển hoá Photpho trong đất [23]

I.1.3 Các dạng của Photpho trong tự nhiên

Các khoáng chất chứa Apatit, photphorit là những loại quặng chứa Photphohoặc từ xác động thực vật Photpho tồn tại ở trong đất có hai dạng chính: Photphovô cơ và Photpho hữu cơ Trên thực tế Photpho vô cơ chiếm u thế

Cây trồng rất khó sử dụng phohot hữu cơ Quá trình chuyển hoá từ photphohữu cơ thành Photpho vô cơ để cây trồng có thể sử dụng đợc là nhờ hệ vi sinhvật

Photpho vô cơ thì tồn tại ở hai dạng chính sau:

Thực

vật

Các photphat tan

VSV phân giải photphatKhoáng hoá

Hấp thụ

Chất mùn P- hữu cơ Photpho khoáng photpho khó tan

+ Loại Photphat không tan chiếm đa phần, hầu nh không tan trong nớc.Thực vật không trực tiếp sử dụng loại Photphat này đó là các Apatit, các muối gốcPhotphat của kim loại mang tính axit nh: FeS04, AlS04, Photphat của kim loạikiềm thổ mang tính kiềm hoặc trung tính: Ca3(P04)2; Al3(P04)2

+ Loại Photphat tan trong nớc thờng gặp là KH2PO4; Na2HPO4; K2HPO4;Ca(HPO4)2; Mg(HPO4)2 Thực vật dễ dàng sử dụng tốt các loại Photpho này, nhng

đáng tiếc là hàm lợng của chúng lại rất thấp ( chỉ chiếm 0,1- 1% so với lợngPhotpho tổng số ) cho nên cây trồng thờng bị thiếu Photpho nghiêm trọng

Photpho hữu cơ tồn tại ở các chất có nguồn gốc từ động vật, thực vật Từ xáccủa động thực vật qua sự phân giải của vi sinh vật trong đất tạo thành dạng chấtmùn Do vậy, việc sử dụng lâu dài phân chuồng có thể làm tăng hàm lợngPhotpho hữu cơ trong đất

I.1.4 Các dạng chế biến phân Photpho

Chia làm hai loại: Phân Photpho chế biến bằng axit và phân Photpho chế biếnbằng nhiệt

I.1.4.1 Phân photpho chế biến bằng axit

Phân photpho chế biến bằng axit còn đợc gọi là Superphotphat, nó có côngthức là CaHPO4.CaSO4 Về nguyên tắc sản xuất, ngời ta cho quặng Apatit chứa

P2O5 đã nghiền nhỏ tác dụng với H2SO4 theo tỷ lệ 1: 1

Phơng trình phản ứng xảy ra nh sau:

Ca3(PO4)2.CaF2 + 3 H2SO4 = Ca(HPO4)2 + CaSO2 + HF

Trong thành phần của Superphotphat, ngoài monohidrophotphatcanxicòn có 40% CaCo3, một phần axit H3PO4 tự do với hàm lợng 5- 6

%.Superphotphat là một loại phân mang tính axit nên chỉ sử dụng cho đất bão hoàkiềm hoặc trung tính Nếu sử dụng cho đất chua có nhiều Fe, Al sẽ làm mất hiệulực của phân Photpho [14] [4]

I.1.4.2 Phân Photpho chế biến bằng nhiệt.

Phân Photpho chế biến bằng nhiệt còn đợc gọi là phân lân nung chảy, đợc sảnxuất từ sự gia nhiệt làm nóng chảy Apatit với Mg, Silicat ở nồng độ loãng sau đó

đợc làm lạnh đột ngột Đây là phơng pháp để chuyển các hợp chất muối Ca, Psang dạng dễ tan

Phân Photpho nung chảy có thành phần dinh dỡng nh sau:

P2O5: 18-24%; MgO: 13-18%; SiO2:17-25%; CaO: 25-35% Ngoài ra còn

có một số nguyên tố khác nh Na, K

Với thành phần và cấu trúc đặc biệt nên phân lân nung chảy không hoà tanvào trong nớc mà chỉ hoà tan trong axit yếu Trong axit Xitric 2% phân Photphonung chảy gần nh tan hoàn toàn, nó có thể đạt tới 99% Phân Photpho nung chảy

có hiệu lực tốt nhất trong đất axit [14][4] nhng trong tất cả các loại đất phânPhotpho đều bị các ion của đất giữ lại nhiều hay ít phụ thuộc vào từng loại đất,

đặc điểm cây trồng, độ khoáng hoá, độ mùn của từng loại đất

I.1.5 Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan.

Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan là các vi sinh vật có khả năngchuyển hoá hợp chất Photphat khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sửdụng.Vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan đợc biết đến nay là:

Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Selerotium, Aspergillus, nấm rễ (Mycorrhira) Các vi sinh vật này không chỉ phân giải hợp

chất Photphat Canxi mà cả Photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cảquặng Kết quả nghiên cứu hiệu quả phân giải lân đợc thể hiện qua bảng 1

Bảng 1: Khả năng phân giải hợp chất Photphat khó tan

Tên chủng vi

sinh vật Nguồn Photphat % phân giải Nguồn tài liệu

Vi khuẩn Photphat Canxi 3 3-17 Moreau - 1995

Pseudomonas Photphat Canxi 3 13-58 Ostwaba.Bhide -1992Aspergillus Photphat Canxi 3Photphat Canxi 2

Photphat nhômPhotphat sắt

30,858,424,025,6

Gaura Gaind-1983

Penicillium Photphat Canxi 3Photphat sắt

Photphat nhôm

90,049,328,1 Gaura Gaind-1983Bacillus Quặng Photphat 5-10 Gaura Barrdiga-1972

Penicillium Quặng Photphat 10-17 Asea et Al-1988

I.1.6 Cơ chế phân giải hợp chất Photphat khó tan nhờ vi sinh vật.

Cơ chế của quá trình phân giải hợp chất Photphat khó tan đến nay vẫn còncha đợc hiểu đầy đủ và còn rất nhiều tranh cãi trong vấn đề này Sản sinh ra axithữu cơ có thể là nguyên nhân chính song CO2, H2S, axit, kiềm cũng là các yếu tố

đợc nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến

I.1.6.1 Phân giải Photphat khó tan do sự tạo thành axit của vi sinh vật [10]

Theo nghiên cứu của Bardia và Gaur(1972-1974), cho thấy trong quá trìnhnuôi cấy vi sinh vật khi mà pH môi trờng bị giảm sút mạnh, lúc đó hàm lợngPhotpho tan trong môi trờng tăng lên Sau khi nuôi cấy vi sinh vật phân giải hợpchất Photphat khó tan ngời ta tìm thấy nhiều axit hữu cơ nh: Axit axetic, axitfocmic, axit glucolic, axit oxalic,axit sucinic, axit malic, axit xitric trong môi tr-ờng Các axit hữu cơ này tác dụng với hợp chất Photphat không tan nhờ sự liênkết với Cation: Mg+2, Ca+2, Al+3 , Fe+3 qua đó tạo nên hợp chất Photpho mới tantrong nớc.

Kapoor (1998), cho rằng phần lớn các chủng nấm sợi có khả năng phân giảimạnh các hợp chất Photphat khó tan là nhờ axit hoá môi trờng, do tạo ra các axithữu cơ

Goldstein A.H (1996) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxi hoá glucoza sảnsinh ra axit gluconic và 2-ketogluconic có ở vùng xung quanh tế bào vi khuẩn dẫn

đến làm tan Ca3(PO4)2 của môi trờng

I.1.6.2 Sự phân giải Photphat khó tan nhờ phản ứng Cacbondioxit (CO 2 và

H 2 S )

Nhiều nghiên cứu trớc đây cho rằng CO2 sản sinh bởi rễ cây và vi sinh vật cótác dụng phân giải các hợp chất Photphat khó tan Sau đó Goerge (1938) tìm rarằng: CO2 làm tăng cờng khả năng tan của Photphat và sử dụng Photpho của câytrồng Trong quá trình phát triển, cây trồng và vi sinh vật đã tạo ra một lợng lớncacbondioxit Hợp chất này cùng với nớc đồng thời tác dụng lên các hợp chấtPhotphat khó tan biến chúng thành dạng dễ tan nh phơng trình sau [24]:

Ca3(PO4)2 +CO2 +H2O = 2 CaHPO4 + CaCO3

Ca3(PO4)2 + 2 CO2 + 2H2O = Ca(H2PO4)2 + 2CaCO3

Năm 1958 Sawby và Sperber đã chứng minh rằng vi sinh vật phân huỷaminoaxit chứa Lu huỳnh hoặc vi khuẩn Lu huỳnh oxi hoá khử Sulfur hoặc tạo ra

H2S , H2S có khả năng phân giải hợp chất Photphat khó tan nh phơng trình sau[24]:

H2S + FeSO4 = FeS + H2SO4

I.2 Những thành tựu nghiên cứu vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat khó tan trên thế giới và ứng dụng.

Trên thế giới vấn đề khu hệ vi sinh vật sống dị dỡng trong đất, vùng rễ đã đợcnghiên cứu khá nhiều Hàng loạt vi sinh vật phân giải lân khó tiêu đã đợc thu thập

và tuyển chọn Đặc biệt có các chủng vi sinh vật có thể pphaan giải tới 70%quặng Photphat thành lân dễ tiêu Khi sử dụng loại phân vi sinh này có thể tiếtkiệm đợc 50% lợng lân cần bón mà vẫn không thay đổi năng suất chất lợng nôngsản Điều này đã mở ra một triển vọng cực kỳ to lớn cho nhu cầu lơng thực toàncầu Nó đã khắc phục đợc tình trạng bế tắc, thiếu hiệu quả của các loại phân bónhoá học trớc đây.Theo tài liệu công bố tổ chức lơng thực thế giới (FAO) thì đểtăng sản lợng nông sản lên 2- 3 lần thì con ngời phải tạo ra một lợng phân đạmtăng khoảng 30 lần, Kali 10 lần Điều đó cho thấy là hết sức tốn kém về công sức

và của cải Việc sử dụng các chế phẩm phân vi sinh trong đó có vi sinh vật phângiải lân đã đợc sử dụng rộng rãi ở nhiều nớc trên thế giới nh Hoa Kỳ, Canada,Nga, Trung Quốc chế phẩm “Điền lực bảo “ do Trung Quốc sản xuất là loạiphân có nhiều giá trị sinh học và thực tiễn Trong mỗi gam phân bón đã phát hiệnthấy có chứa tới trên 5.109 tế bào vi sinh vật có khả năng chuyển hoá lân khó tanthành dạng dễ tan

Năm 1970 ở Liên Xô đã dùng Bacillus Megatheriumval Photphatium để sản

xuất chế phẩm Photphobacterin Chế phẩm này đợc sử dụng rộng rãi ở Liên Xô

và các nớc Đông Âu dùng bón cho lúa mỳ, ngô, lúa nớc Kết quả cho thấy sản ợng tăng 5-10% so với đối chứng

Grimer và Mount (1981) đã nghiên cứu tác động của Pseudomonas Putida

phân lập từ đất xung quanh cây họ đậu Phaseollus Vulgaris Các ông tthấy rằngkhi bổ xung P.putida vào đất trồng làm cho cây họ đậu này tạo ra nhiều nốt sần

hơn, do đó tăng khả năng hấp thu Photphat của cây [22]

Năm 1982, Datta và cộng sự đã ứng dụng thành công vi khuẩn Bacillus firmus

có khả năng phân giải Photphat khó tan làm tăng năng suất lúa ở vùng đông bắc

ấn Độ Chủng này vừa có khả năng sinh IAA (Indolactic axit) - là hooc môn sinhtrởng rất cần thiết cho cây trồng vừa có khả năng chuyển hoá Photphat khó tan[23]

I.3 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật phân giải lân và ứng dụng trong phân bón vi sinh ở Việt Nam.

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật cố định Nitơ cũng nh phângiải Photphat khó tan đã đợc tiến hành từ những năm 60 Năm 1968 Lê Văn Căn

và Đặng Văn Ngữ đã nghiên cứu một số nấm mốc có khả năng phân giải Photpho

khó tan, trong đó có Aspergillus niger sau 4 tuần nuôi cấy đã chuyển hoá đợc

17,2% Photpho tổng số trong Photphorit

Hiện nay, chế phẩm phân hữu cơ vi sinh đợc công ty Thiên Nông sản xuất lần

đầu tiên ở nớc ta từ tháng 10-1990 Đó là một dạng chế phẩm bao gồm nhiều loại

vi khuẩn đợc công bố là có khả năng chuyển hoá Photpho vô cơ và nhiều tác dụngkhác Mục tiêu chung của các nhà khoa học Việt Nam là phấn đấu có đợc nhiềuloại phân bón sinh học tốt, để có thể giảm dần việc sử dụng phân hoá học trên

đồng ruộng đó cũng là mong muốn của những ngời làm nông nghiệp

Kết quả nghiên cứu về phân lân vi sinh trong khuôn khổ đề tài cấp nghành màViện Khoa Học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam giai đoạn 1992 - 1995 cho thấy

sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế đợc 30-35% lợng lân vô cơ cầnbón bằng quặng Photphorit mà năng suất cây trồng không thay đổi [17]

Nguyễn Hoài Hà và cộng sự (1960 )[8], đã phân lập từ đất trồng ngô ngoạithành Hà Nội đợc 100 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải Photphat khó tan,trong đó có 52% phân giải yếu (D-d <5 mm), 45% phân giải trung bình (D-d =5-

10 mm) và 3% có khả năng chuyển hoá tốt ( D - d >10 mm ) Ba chủng mạnh cókhả năng chuyển hoá đợc > 41% quặng Photphorit

Nghiên cứu của Nguyễn Phơng Chi và cộng sự (1998), Viện CNSH đã lựachọn chủng Aspergillus awamori Nakazawa MN1 [11] Chủng này đã chuyển hoá

đợc 84,7% P2O5 sang dạng dễ tiêu từ quặng Photphorit chứa 20% P2O5 Mặt khác,chủng này cũng chuyển hoá đợc quặng Apatit chứa 25% P2O5 sang dạng dễ tan,tuy nhiên ở mức độ nhỏ hơn (61,5%) Do đó chủng A.awmori Nakazawa MN1 đ-

ợc sử dụng làm phân lân vi sinh, giúp cây trồng sử dụng Photphat hữu cơ hữu hiệuhơn

Trong khuôn khổ đề tài cấp nhà nớc, KHCN 02-04 giai đoạn 1996-1998 doGS-TS Lê Văn Nhơng TTCNSH-Đại học Bách Khoa làm chủ nhiệm, các cán bộkhoa học, đã phân lập và nghiên cứu chủng nấm sợi Aspergills japonicus VTCCN 11vừa có khả năng phân giải Photphat khó tan vừa có khả năng phân giảiXenluloza Chủng nấm sợi này, có thể chuyển hoá 18,4% P2O5tan từ quặngPhotphorit, 6,6% từ quặng Apatit và 18,84% từ Ca3(PO4)2 Chủng nấm sợi trên đã

đợc sử dụng để tạo chế phẩm phân vi sinh vật [12]

Đề tài Khoa học cấp nhà nớc KHCN 02 - 06 giai đoạn 1996- 2000 do TSPhạm Văn Toản Viện Khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp chủ nhiệm, đã nghiên cứuhàng loạt chủng giống vi sinh vật có khả năng cố định Nitơ, phân giải Photphatphục vụ cho Nông Nghiệp Đề tài đã xây dựng quy trình chế phẩm vi sinh vậtphân giải hợp chất Photphat khó tan từ nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn

pseudomonas Sản phẩm đợc chứng minh có tác dụng tốt đối với sự sinh trởng,

phát triển của ngô và lúa [17]

I.3.1 Tình hình sản xuất và sử dụng phân vi sinh vật phân giải Photphat khó

tan ở Việt Nam

I.3.1.1 Các loại phân lân vi sinh

Hiện nay trên thị trờng phân lân vi sinh thờng đợc chia làm hai nhóm sau:

+ Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng

Quy trình sản xuất phân vi sinh trên nền chất mang thanh trùng đợc thể hiệnthông qua sơ đồ 2 Các loại phân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng cómật độ vi sinh vật hữu hiệu lớn từ 108- 10 9tế bào / gam, vi sinh vật tạp ít Sử dụngphân bón vi sinh vật này để nhiễm vi sinh vật vào hạt, tới vào gốc cây non Hiệuquả của phân dựa trên năng suất và phẩm chất của nông sản [14]

Sơ đồ 2: Quy trình sản xuất phân lân vi sinh vật trên nền chất mang thanh trùng [14]

+Phân lân vi sinh vật trên nền chất mang không thanh trùng

Phân lân vi sinh đợc sản xuất trên nền chất mang không thanh trùng cómật độ vi sinh vật hữu ích thấp chỉ khoảng 106-108 tế bào /gam và vi sinh vật tạpkhá cao Hiệu quả của phân bón dạng này thờng dựa trên các chất dinh dỡng cótrong chất mang Chất mang ở đây thờng là các chất hữu cơ: than bùn, phế thảinông nghiệp, rác thải thành phố và các chất vô cơ khó tiêu: Apatit, Photphorit,bột đá vôi Các loại chất mang hữu cơ thờng đợc ủ háo khí hay yếm khí tuỳ loại

nguyên liệu hữu cơ.Nhợc điểm của loại phân này là chất lợng không ổn định vàkhó bảo quản.

I.3.1.2 Hiệu quả sử dụng các loại phân lân vi sinh vật

Hiệu quả của các loại phân lân vi sinh thờng đợc đánh giá thông qua các chỉtiêu sau:

- Tăng cờng cung cấp thêm lân dễ tiêu cho cây trồng

- Tăng cờng sức hoạt động của các loại vi sinh vật khác trong đất

- Cung cấp các chất điều hoà sinh trởng

- Cung cấp các chất kháng sinh phòng chống sâu bệnh hại cây trồng

Cho đến nay, tuy rằng phân vi sinh vật phân giải lân khó tiêu đợc sản xuất,bán trên thị trờng nhng số lợng không nhiều vì lý do sau: Hiệu quả của chúng cha

đợc ổn định, giá thành đắt, khó khăn về bảo quản và vận chuyển [14]

I.3.2 Yêu cầu về chất lợng, thời gian bảo quản phân lân vi sinh

Theo TCVN của Bộ Nông Nghiệp và phát triển nông thôn -Viện khoa học kỹthuật Nông Nghiệp Việt Nam quy định tiêu chuẩn phân bón vi sinh vật phân giảiPhotphat nh sau:

- Thời gian bảo hành của phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất Photphat

-Trong đó: CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc

Cho đến nay, có nhiều nhà sản xuất phân lân hữu cơ vi sinh nh: Phân hữucơ Thiên Nông, phân lân sinh hoá hữu cơ Komix của công ty hoá sinh nông

nghiệp và thơng mại Thiên Sinh, phân sinh hoá hữu cơ Biomix của công ty phânbón hoá chất Kiên Giang, Biofer của Hội Phân Bón Việt Nam đều sản xuất phânlân vi sinh nhng số lợng không nhiều, hiệu quả cha thật ổn định, giá thành đắt,khó khăn về bảo quản và vận chuyển hơn nữa không phải bón cho vùng đất nàocũng phù hợp và cho hiệu quả cao [14].

Mặt khác thành phần, số lợng , hoạt tính của các vi sinh vật phân giải hợp chấtPhotphat khó tan trong các mẫu đất ở các vùng địa lý khác nhau cũng rất khácnhau [17] Bởi vậy, việc tìm kiếm và bổ xung các vi sinh vật phân giải lân khó tan

từ các vùng đất có khí hậu và điều kiện địa lý đặc thù, để đa vào ứng dụng trongthực tế mà có hiệu quả là điều rất cần thiết, đòi hỏi các nhà nghiên cứu quan tâm

và đầu t

Chơng II : Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu.

II.1 Vật liệu và thiết bị:

II.1.1 Vật liệu.

II.1.1.1 Chủng vi sinh vật: Các chủng vi khuẩn đợc phân lập từ các mẫu đất

trồng ngô, lúa, đậu tơng và đất vờn trên địa bàn Hà Nội

II.1.1.2 Giống cây trồng thí nghiệm đối với chủng vi sinh vật phân giải lân khó tiêu.

Sử dụng giống đậu tơng DT84 do bộ môn giống cây trồng Trờng Đại họcNông Nghiệp cung cấp

II.1.2 Thiết bị thí nghiệm.

Thiết bị đợc sử dụng của phòng các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinhvật -Viện CNSH

Nồi khử trùng ớt (Trung Quốc)

Nồi khử trùng khô (Trung Quốc)

Máy đo pH Mettler Toledo -320 (Nhật)

Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật)

Máy lắc do Viện Khoa học Việt Nam chế tạo 220 vòng /phút

Tủ ấm (Trung Quốc)

Cân phân tích ADNHR- 200 (Nhật)

Máy đo độ đục Novaspec II (Pharmacia- Thuỵ Điển)

Và các dụng cụ khác phục vụ cho thí nghiệm: Micro pipet,ống nghiệm,bình tam giác, hộp Petri do Trung Quốc và Đức sản xuất

II.1.3 Hoá chất.

Các hoá chất sử dụng đều tinh sạch ở mức độ phân tích, đạt tiêu chuẩn chấtlợng trong nghiên cứu (P.A)

Bao gồm : Ca3(PO4)2 ; các loại đờng glucose, sacarose; cao nấm men,thạch , Pepton và các nguyên tố vi lợng: FeS04, MnS04 do phòng “ các chất có

hoạt tính sinh học từ vi sinh vật cung cấp”.

II.2 Môi trờng nuôi vi sinh vật phân giải Photphat.

II.2.1 Môi trờng Pikovskaya [27,6] (dùng phân lập giữ giống và nghiên cứu khảnăng phân giải photphat của các chủng vi sinh vật)

II 2.2 Môi trờng Pikovskay lỏng: dùng để nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng đến

khả năng sinh trởng và phát triển của vi sinh vật phân giải lân khó tiêu

II.2.3 Môi trờng nớc chiết đất.

Cân 1.5kg đất (đất Cổ Nhuế ) +1000 ml nớc máy, hoà đều rồi đem đun sôitrong 30- 40 phút Để lắng rồi gạn ra và ly tâm bỏ cặn Phân phối vào các bìnhtam giác và đem khử trùng ở 1 atm / 45 phút

II.3 Phơng pháp nghiên cứu.

II 3.1 Phơng pháp lấy mẫu.

Dùng thìa vô trùng lấy đất ở vùng bề mặt ( độ sâu từ 2-5 cm ) cho vào bìnhtam giác, túi nilon sạch Mỗi khu đất thờng lấy từ 8-10 vị trí khác nhau,mỗi vị trílấy từ 10-15g đất, buộc kín hoặc đậy nút và ghi lý lịch, ngày lấy mẫu

II.3.2 Phơng pháp phân lập trên môi trờng thạch đĩa [6].

Các mẫu đất lấy ở mỗi địa điểm khác nhau đợc trộn đều Cân mỗi mẫu đất10g cho vào bình tam giác chứa 99 ml nớc vô trùng lắc thật đều Sau đó pha loãngliên tục bằng nớc vô trùng sao cho đạt đến độ pha loãng từ 101-107

- Dùng Pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch từ ống nghiệm có độ pha loãngnhất định nhỏ lên bề mặt môi trờng thạch đĩa Thông thờng ta lấy dịch ở độpha loãng 102, 103, 105, và 107,

- Dùng que trang thuỷ tinh dàn đều dịch vừa nhỏ lên bề mặt thạch saocho bề mặt thạch thật khô Các thao tác làm trên ngọn lửa đèn cồn trong tủBox để tránh nhiễm vi sinh vật

Nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 25-30oC từ 3- 5 ngày vi sinh vật phát triểnthành các khuẩn lạc có vòng phân giải Ca3(PO4)2 Mỗi khuẩn lạc khác nhau vềmặt hình thái đợc coi là một chủng vi sinh vật

- Cấy truyền vào các ống nghiệm chứa môi trờng thạch nghiêng, giữ ở

tủ ấm 3- 5 ngày Khi các chủng vi sinh vật đã phát triển dày kín mặt thạch ởtrong ống nghiệm thì cất giống vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC

II 3.3 Phơng pháp giữ giống [6 ].

Các chủng vi khuẩn có thể giữ ở 4- 5oC trong tủ lạnh khoảng 2- 3 tháng.Cấy truyền định kỳ trên các môi trờng tơng ứng, hai tháng một lần

II 3.4 Phơng pháp đếm số lợng tế bào

Số lợng tế bào sống trong các cơ chất phân lập trên môi trờng dinh dỡng

đặc, đợc biểu thị bằng đơn vị CFU (colony foming Unit) 1 CFU là 1 khuẩn lạc

phát triển từ một tế bào (hay bào tử) lúc đầu , của một loại vi sinh vật trên môi ờng dinh dỡng trong đĩa thạch mà mắt thờng ta quan sát đợc.

tr-Cách đếm: Tiến hành pha loãng nh phơng pháp phân lập trên môi trờngthạch đĩa Sau khi nuôi cấy một thời gian thích hợp (3- 5 ngày) ở 30oC trong tủ

ấm, lấy ra đếm số lợng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong một đĩa Petri, từ đótính ra số lợng tế bào trong 1g ( hay 1ml ) cơ chất theo công thức:

N = a.b.c

Trong đó : N: Tổng số CFU trong 1g (1ml) cơ chất đem phân tích

a: Số CFU trung bình đếm đợc trên một đĩa Petri (số tế bàotrên 0,1ml dịch mẫu phân tích ở độ pha loãng b)

b: độ pha loãng c: Số lợngvi sinh vật trong 1ml dịch ở độ pha loãng b

Số khuẩn lạc trên đĩa Petri đợc coi là tốt để tính CFU nếu khi lấy 0,1mldịch pha loãng mẫu trên môi trờng có khoảng 5- 100 khuẩn lạc Nếu số lợng nàynhỏ hơn 5 thì kết quả loại bỏ

II 3.5 Phơng pháp xác định khả năng phân giải Ca 3 (PO 4 ) 2 [12].

- Cấy chấm điểm vi sinh vật đã phân lập đợc trên môi trờng thạch đĩaPikovskaya

- Theo dõi khả năng hình thành vòng phân giải của các chủng vi sinhvật trong thời gian 3- 7 ngày

- Vi sinh vật có hoạt tính phân giải sẽ tạo thành vòng tròn trong suốtxung quanh khuẩn lạc còn vùng cha phân giải có màu đục hơn

- Hoạt tính phân giải đợc đánh giá bằng hiệu số D - d (mm) trong đó

D là đờng kính vòng phân giải, d là đờng kính của khuẩn lạc vi sinh vật

II 3.6 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng phơng pháp nhuộm Gram và nhuộm đơn giản.

II 3.6.1 Phơng pháp nhuộm đơn giản.

- Mục đích: Quan sát đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn

Làm tiêu bản

Lấy phiến kính sạch, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn

Nhỏ một giọt nớc vô trùng lên phiến kính.

Khử trùng que cấy Dùng que cấy lấy ít vi khuẩn trong ống thạch nghiêng,

đa vào giọt nớc trên phiến kính, giàn đều một lớp mỏng có diện tích 1- 2 cm2

Cố định vết bôi: Hơ nhẹ phía dới vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn

Tiến hành nhuộm:

Nhuộm vết bôi bằng cách nhỏ vài giọt thuốc Safrarin giữ trong 1- 2 phút.Rửa nớc

Làm khô tiêu bản

Đem quan sát bằng vật kính dầu

II 3.6.2 Phơng pháp nhuộm Gram.

Nhuộm Gram là một phơng pháp nhuộm đặc biệt do nhà khoa học ĐanMạch Chriatian Gram tìm ra năm 1884 Mục đích của phơng pháp này là xác định

đợc chủng là vi khuẩn Gram (+) hay Gram (-), để có thể phân biệt sự khác nhaugiữa các loại vi khuẩn giống nhau về hình thái và kích thớc

Phơng pháp nhuộm Gram đợc tiến hành nh sau:

Làm vết bôi (giống nh nhuộm đơn)

Nhuộm bằng tím gential lên vết bôi giữ trong 1- 2 phút

Nhỏ dung dịch lugol bằng cồn 95o trong 30-40 giâyRửa bằng nớc máy, để khô

Nhỏ fucsin lên vết bôi, giữ từ 1-2 phútRửa nớc, làm khô

Quan sát dới kính hiển vi bằng vật kính dầu Tế bào vi khuẩn Gram(+) bắt mầu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt mầu theo màu của thuốc nhuộm bổsung (mầu đỏ hồng của fucsin)

II.3.7 Phơng pháp nhuộm bào tử của Miler.

Mục đích: xác định đợc tế bào của chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tửhay không Chúng tôi sử dụng phơng pháp nhuộm bào tử của Miler

Làm vết bôi, cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn

Nhỏ dung dịch axit HCl 1% (hoặc phenol 5%) trong 1-2 phút

Rửa nớc, nhuộm lại bằng xanh Metylen - loeffler trong 1phút.

Rửa nớc, làm khô Khi quan sát tế bào vi khuẩn sẽ nhuộm mầu xanh,còn bào tử bắt mầu hồng đỏ ( mầu của fucsin ziel )

II.3.8 Phơng pháp xác định các yếu tố ảnh hởng đến sự sinh trởng và phát triển của chủng vi khuẩn phân giải Photphat.

II.3.8.1 ảnh hởng của pH ban đầu

Chủng vi khuẩn phân giải photphat đợc tuyển chọn, cấy vào bình tam giácchứa 100ml môi trờng Pikovskaya đã đợc điều chỉnh các độ pH khác nhau: 4 ; 5 ;

6 ; 7 ; 8

Nuôi cấy trên máy lắc ( 220 vòng/ phút ), nhiệt độ 30oc trong 60 giờ Xác

định khả năng sinh trởng và phát triển của chủng bằng cách đo độ đục OD ở bớcsóng 560 nm trên máy so màu

II.3.8.2 ảnh hởng của nguồn cacbon khác nhau.

Sử dụng 1% các nguồn cacbon khác nhau là: sacaroza, rỉ đờng và tinh bột đểthay thế lần lợt cho glucoza trong 100ml dịch lỏng Pikovskaya

Nuôi trên máy lắc ( 220 vòng/ phút ) trong 60 giờ ở 30oc Cứ sau 12 giờ lại

đo OD một lần để xác định sinh khối

II 3.8.3 ảnh hởng của nguồn nitơ khác nhau.

Chủng vi khuẩn đợc tuyển chọn nuôi cấy vào các bình tam giác chứa 100 mlmôi trờng Pikovskaya với 1% các nguồn nitơ khác nhau là: (NH4)2SO4, NaNO3,pepton, Ure.Nuôi cấy trên máy lắc (220 vòng/phút) trong 60 giờ Cứ 12 giờ lạitiến hành đo OD một lần trên máy so màu ở bớc sóng 560 nm

II 3.8.4 ảnh hởng của nhiệt độ khác nhau.

Sử dụng môi trờng lỏng Pikovskaya có pH = 7 Sau đó cấy chủng vi khuẩntrong các ống nghiệm chứa môi trờng đã vô trùng và để ở các thang nhiệt độ khác