bài tiểu luận-phân loại sinh học phân tử

Các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu sau: + Phân tích acid nucleic + Phân tích protein + Phân tích glicolipit + Hóa phân loại học... Phân tích DNA plasm

Bài tiểu luận:

PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ

Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Mậu NCS: Nguyễn Thị Thu Ngà

Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân

tử

Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cứu tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, gồm quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp DNA, RNA, Protein và cách thức điều hòa các mối tương tác này

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng có hiệu quả trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng sinh vật

Phân loại Sinh học phân tử là phương pháp phân loại sinh vật bằng

đặc điểm gen ở mức độ phân tử Tức là phân loại bằng các dẫn liệu so

sánh hóa sinh các phân tử lớn như DNA, RNA, protein

Các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu sau:

+ Phân tích acid nucleic

+ Phân tích protein + Phân tích glicolipit + Hóa phân loại học

1.Phân tích và so sánh acid nucleic

1.1 Phân tích DNA plasmid (Sử dụng trong phân loại vi sinh vật 1.2 Phân tích ADN nhiễm sắc thể

1.3 Lai ADN/ADN

1.4 Lai DNA/RNA

2 Kỹ thuật nhân gene PCR

2.1 Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction)

1 Phân tích và so sánh acid nucleic

1.1 Phân tích DNA plasmid (Sử dụng trong phân loại vi sinh vật)

Phương pháp phân tích ở đây

các phân đoạn để phân biệt các

chủng vi sinh vật với nhau

Di chuyển của plasmid mạch

thẳng (L) và siêu xoắn (OC) khi điện di

1.2 Phân tích ADN nhiễm sắc thể

Phương pháp phân tích ở đây bao gồm:

+ tách ADN của nhiễm sắc thể

+ cắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt giữa các sinh vật với nhau Các đoạn cắt nên có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb

Việc phân tách các đoạn cắt được thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong

trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis)

• Kỹ thuật chính của PFGE là: đổi chiều dòng điện chạy qua gel điện di, gây xung điện theo chu kỳ

• Ưu điểm: kỹ thuật PFGE có khả năng phân tách theo kích thước những đoạn DNA kích thước tới vài megabase

1.3 Lai ADN/ADN

- Nguyên tắc đƣợc tiến hành nhƣ sau:

+ ADN tổng số được tách ra và xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt hạn chế)

+ điện di trên gel agarose

+ chuyển lên màng lai

+ Mẫu dò (probe) được chuẩn bị và lai với màng ADN ở trên Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt giữa các mẫu ADN khác nhau

Phương pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot

Một số nhân tố tham gia vào kết quả của phép lai: mẫu dò ADN, phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai, điều kiện tiến hành và phương pháp đánh giá kết quả phép lai

- Phương pháp này cho phép so sánh và phân biệt nguồn gene của những sinh

vật thuộc các taxon khác nhau có quan hệ xa.

- Trong phép lai DNA/RNA sử dụng r-RNA hoặc t-RNA

- Kỹ thuật lai cũng gồm có các khâu cơ bản tương tự như lai DNA/DNA

2 Kỹ thuật nhân gene PCR

Kỹ thuật lai ADN đã được sử dụng rộng rãi cho nhiều nghiên cứu xác

định và phân loại trên đối tượng sinh vật Nguồn ADN đích đôi khi

chỉ có hàm lượng ít Khó khăn này được khắc phục bằng cách làm

tăng nguồn ADN đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân

gene PCR

2.1 Kỹ thuật nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Nguyên lý: dựa trên khả năng xúc tác của enzyme DNA polymerase trong phản ứng kéo dài đoạn trình tự bổ sung bắt đầu từ đoạn mồi trình

tự ngắn gắn trên 2 sợi đơn của đoạn DNA khuôn để tạo phiên bản của

đoạn DNA cần phân tích

đơn từ sợi khuôn xoắn kép

Bước 2: bắt cặp hai mồi

vào hai sợi đơn của khuôn

Bước 3: kéo dài chuỗi

theo mồi, chiều 5’-3’ với

quá trình gắn các dNTP

dọc theo sợi khuôn để tạo

thành phiên bản mới theo

nguyên tắc bổ sung

Revert transtriptase PCR

Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu

Kết quả ribotyping với Helicobacter pylori

3 Giải trình tự ADN

Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo

ra các đoạn ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’ Các đoạn có base đánh đấu được tách ra trên gel

polyacrylamid Các đoạn được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid Việc tạo ra các

đoạn ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp:

+ Phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) + Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi

(Sanger, 1997)

+ Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger:

Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có:

+ đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase

+ 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs)

Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP)

Phân tích trình tự DNA bằng máy tự động

Cấu tạo r-RNA biến đổi chậm trong quá trình tiến hóa, trình tự nucleotide của r-RNA đa dạng, ổn định Vì vậy phân tích và so sánh trình tự nucleotide của r-RNA cung cấp những bằng chứng khách quan tin cậy làm cơ sở để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài, giữa các taxon bậc trên loài

4 Phân tích trình tự r-RNA (ribotyping)

1 Kỹ thuật nghiên cứu định

10 20 30 40 50 60 70 80 90

| | | | | | | | | | | | | | | | |

|

RAV2-Solanum -S Y GVV P P N R G Q Y K Q -V L T N EE N AA R Y IAA Q F

-G D V N

K -RAV1-Arabidopsis -S Y GVV P P N R G Q Y K Q -V L T N EEDEAA R Y V V R R

-RR D V N K

V -RAV2-Arabidopsis -S Y GVV P P N R G Q Y K Q -V L T N Q EEAA R Y IAAC F

-G D VV N K

V -RAV1-Solanum -S F GVV P P N R G Q Y K Q -I L T N EEEAA R Y IAA Q F

-G D V N

K -GmDREBc -C Y G R R - G W A I E - R - N L L T P A GAAL Y DEAA Q M

-G C R

-GmDREBa -C Y G R R - G W A I E - R -S L L T P A SAAL Y DEAAM M

-G C R N P

V -TaDREB1 -C Y G R R - G W A I E - R - N L L S P A EAA R Y DDAA R M

-G K R N S Q

-OsDREB2A -C Y G R R - G W A I E - R - RR L L S P A EAAH Y DEAA R M

-G T R N A N

-GhDBP2 -K Y G R R - G W A I L - N -T L L T D AEEAAL Y KAA Y L

-G F R N P L HHG H G Y GmDREB3-DQ055133.1 -L R V Q H W K V E R P K R -T L L T D AEEAAL Y KAA Y L

-G F R N P

L -GmDERBb -K Y G R R - G W A I L - N -T L L T D AEEAAL Y N AA F L

-5 So sánh Protein

Phương pháp xác định và so sánh trình tự acid amin của các protein có

cùng chức năng là phương pháp trực tiếp và được sử dụng rộng rãi nhất

Số liệu so sánh trình tự cytochrome, các protein vận chuyển điện tử

(electron transport protein), trình tự các histone, các protein sốc nhiệt, protein

phiên mã, dịch mã được dùng rất phổ biến trong phân loại học

Nhờ những nghiên cứu sinh học phân tử, nhiều chương trình khoa học đã được xây dựng phục vụ cho công tác phân loại sinh vật Nổi bật là ý tưởng đồng hồ phân tử và

mô hình cây nguồn gốc chủng loại