BÀI 4: MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG Y DƯỢC

MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ, ỨNGDỤNG CÔNG NGHỆ SINHHỌC, TRONG Y DƯỢC

BÀI 4: MỞ ĐẦU SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG Y DƯỢC

1 Mở đầu sinh học phân tử:

1.1 Kỹ thuật PCR;

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp này được Kary B Mullis đưa ra năm 1985 Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff

có độ nhạy cao và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,…

a Nguyên tắc

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel

Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt làm trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (92 – 960C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

Bước 2: (bắt cặp, annealing)

Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 54 – 65 0C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây

Mồi xuôi bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’3’ Mồi ngược bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’5’

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa

n: Là số chu kỳ

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao;

và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao

 Đọc kết quả PCR:

Điện di trên gel agarose để phân loại DNA theo kích thước

Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Điện di trên gel (gelelectrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, Protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, khối lượng, hình dạng hay điện tích của chúng

Kĩ thuật này sử dụng một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, xanh coomassie, bạc…) để phát hiện vị trí các phân tử gel sau khi điện di

Một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng

Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực dượng, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn kích thước lớn Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV

b Các yếu tố ảnh hưởng

DNA mẫu (DNA khuôn): khuôn DNA rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn khuôn hoàn toàn tinh sạch, hiệu quả PCR tỷ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuôn Trình tự DNA khuôn không nên quá lớn <1kb

Enzyme: enzyme DNA polymerase càng mạnh, phản ứng PCR càng triệt để Tùy các đặc tính của enzyme, tùy thuộc nguồn gốc tách chiếc enzym hiệu quả các phản ứng PCR khác nhau Taq polymerase là enzym được sử dụng phổ biến, vì enzym này không bị phá

vỡ ở nhiệt độ biến tính Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng

Primer: mồi là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu quả của yếu tố PCR Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu Chọn mồi cần tính toán đảm bảo Tm của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch nhau quá lớn (primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA) Các mồi có trình tự nucleotid

để chỉ có thể bắt cặp bổ sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mồi bắt cặp giữa khuôn thì PCR không thành công Hai đoạn mồi không được có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau Nồng độ các loại nucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) (các deoxynucleotide triphotphat): Nồng độ thường được sử dụng là 20 – 200 μM Sự mất cân bằng trong thành phần các loại nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Nồng độ MgCl2: Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép Mg2+ là Co – factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định và cho ra sản phẩm với số lượng quá lớn nhưng mức

độ chuyên biệt thấp

Dung dịch đệm: cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase

c Ứng dụng của PCR

Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y

Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chăn nuôi:

Chẩn đoán bệnh trên tôm là phương thức quản lý bệnh hiệu quả hơn Bệnh đốm trắng trên tôm, Bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm

Người ta sử dụng PCR bằng cách sử dụng bộ mồi để phát hiện sự hiện diện của gen

mã hóa chất độc alpha của Clostridium perfringens một tác nhân gây bệnh phân bố rộng

gây ra nhiều bệnh của con người và động vật

Ứng dụng trong y học

Xác định quan hệ huyết thống

Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh

Chuẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lý di truyền, một số bệnh ung thư

Pháp y, điều tra hình sự…

 Các kỹ thuật ứng dụng PCR trong phân loại phân tử và xác định di truyền:

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên): các sinh vật có bộ gen giống nhau hoàn toàn khi nhân gen

bằng máy PCR với các mồi ngẫu nhiên, kết quả thu được các đoạn DNA hoàn toàn giống

nhau về kích thước và cấu trúc Điện di kết quả nhân gen thu được điện di đồ gồm những băng vạch DNA ở những vị trí giống nhau trên bảng gel Khi bộ gen của các mẫu kiểm tra có

sự khác nhau cho kết quả khác nhau trên điện di đồ

Kỹ thuật này có ưu điểm: thực hiện nhanh, dễ làm và ít tốn kém giúp xác định tính đa dạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các giống động vật, thực vật và vsv

Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism DNA – đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi các enzyme giới hạn): xử lý các mẫu DNA bằng cùng 1

cặp enzym giới hạn, các bộ gen có cấu trúc khác nhau tạo nên số lượng đoạn cắt có chiều dài khác nhau, còn những bộ gen hoàn toàn giống nhau tạo nên các đoạn cắt hoàn toàn

giống nhau, kết quả trước khi đọc phải tiến hành lai Southern blot (Hiểu một cách đơn giản, Southern blot là quá trình chuyển các phân tử ADN từ gel agarose lên một màng và nhờ đó giúp các nhà nghiên cứu định vị trình tự ADN bên trong một hỗn hợp phức tạp Ví dụ: Southern Blot có thể được sử dụng để xác định vị trí một gen cụ thể trong toàn bộ hệ gen)

Ứng dụng: sử dụng để chọn lọc trực tiếp các cá thể mang gen lặn mong muốn không cần phân tích lai qua nhiều thế hệ Phát hiện quan hệ liên kết giữa các gen hoặc các đặc điểm do nhiều gen kiểm soát Kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo quy luật Melden: kiểm tra gen xác định màu hoa

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism DNA – đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc): Cắt DNA bằng enzym giới hạn có bổ sung các

adaptor đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng có các mồi đã chọn trước Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR ngắt quãng với 2 loại mồi khác nhau, đọc kết quả bằng các phần mềm thông dụng không cần tiến hành lai, do vậy việc thực hiện nhanh hơn

so với RFLP

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats – khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản): sử

dụng các mồi đơn giản để khuếch đại các đoạn DNA lặp lại Dựa vào kết qủa thu được về

độ dài các đoạn lặp DNA khác nhau, số lượng các đoạn lặp DNA khác nhau giữa các giống động vật, thực vật, và VSV có thể xác định được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu so sánh (kỹ thuật SSR nghiên cứu sự khác biệt giữa bộ gen của cây đu đủ đực và cây đu đủ cái) Kỹ thuật SSR có thể phát hiện nhanh sự khác biệt DNA giữa các cá thể, dễ thực hiện và

ít tốn kém

Kỹ thuật PCR ngược: được cải tiến dựa trên kỹ thuật PCR chuẩn để nhân các gen (các đoạn DNA) từ mạch khuôn mà mRNA Phương pháp này được sử dụng để phân lập 1 đoạn DNA cạnh 1 trình tự đã biết trong DNA genome

1.2 Phương pháp giải trình tự DNA theo Sanger (phương pháp Dideoxy)

Giải trình tự DNA là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của 1 vùng quy định trên NST

Giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger được phát triển bởi nhà hoá sinh học người Anh Fred Sanger và cộng sự vào năm 1977 Phương pháp này thường được sử dụng

để giải trình tự các đoạn ADN ngắn dưới 900 base

Thành phần: Giải trình tự ADN theo Sanger thực hiện các bước giống kỹ thuật PCR

Do đó thành phần của phản ứng cũng bao gồm những chất cần thiết để nhân bản DNA, hay cho phản ứng chuỗi polymerase (PCR), sao chép DNA trong ống nghiệm

 DNA cần giải trình tự

 Một enzyme DNA polymerase: xúc tác phản ứng kéo dài mạch

 Một DNA primer (mồi), là một đoạn ngắn của DNA sợi đơn kết hợp với DNA mẫu và hoạt động như một “khởi đầu” cho polymerase

 4 loại Deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

 4 loại Dideoxy nucleotide của cả 4 loại bazo nito (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 hoặc S35

Quy trình:

Thực hiện đồng thời 4 phản ứng tổng hợp DNA trong 4 ống nghiệm khác nhau Mỗi ống nghiệm là hỗn hợp gồm: DNA cần giải trình tự, DNA mồi, enzyme DNA polymerase, 1% ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ cho mỗi phản ứng và 4 loại dNTP

Phương pháp này thực hiện bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’-OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau

do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene

Sản phẩm của 4 ống nghiệmđược điện di hiện hình đồng vị phóng xạ trên cùng một bản gel để quan sát các band DNA Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên bản gel

mà xác định trình tự các nucleotide trong gel theo chiều 5’ – 3’ đọc từ dưới lên trên

Ưu nhược điểm:

Giải trình tự Sanger có thể thực hiện với các đoạn DNA tương đối dài (khoảng 900 cặp base) Tuy nhiên, giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger là tốn kém và không hiệu quả cho các dự án có quy mô lớn hơn, như trình tự toàn bộ hệ gen hay metagenome

 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động:

Nguyên tắc chung của phương pháp này dựa trên cơ sở của phương pháp Dideoxy Máy đọc trình tự trên cả 2 mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật Có 2 loại mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua của các nucleotide, từ đó tổng hợp được trình tự sắp xếp của gen

1.3 Công nghệ DNA tái tổ hợp

1.3.1 Giới thiệu

Trước áp lực của sự gia tăng dân số; nguồn tài nguyên như đất, nước ngày càng khan hiếm , nhu cầu về lương thực của nhân loại ngày càng tăng, đòi hỏi các quốc gia phải tìm kiếm các giải pháp về công nghệ sinh học trong canh tác nông nghiệp Đáp ứng với những thách thức đó, cây trồng biến đổi gen sẽ là 1 hướng đi tất yếu, là "chìa khóa" để đảm bảo

an ninh lương thực, đảm bảo cho nền sản xuất nông nghiệp bền vững trước tác động của biến đổi khí hậu và thiên nhiên

Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây trồng được lai tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gen hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển một hoặc một số gen chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng mong muốn

Năm 2013, 27 quốc gia trên thế giới canh tác đại trà cây trồng công nghệ sinh học (19 quốc gia đang phát triển và 8 quốc gia phát triển), trong đó dẫn đầu là Hoa Kỳ (70,1 triệu hecta), Brazil (40,3 triệu hecta), Argentina (24,4 triệu hecta); Ấn Độ (11 triệu hecta) và Canada (10,8 triệu hecta) Trong 18 năm (1996 - 2013), diện tích đất canh tác cây trồng

công nghệ sinh học trên toàn cầu đã tăng liên tục tới hơn 100 lần (từ 1,7 triệu hecta vào năm 1996 lên 175,2 triệu hecta trong năm 2013) (Hình 1) Điều này cho thấy đối với cây trồng, đây là công nghệ được ứng dụng với quy mô lớn nhất và tốc độ nhanh nhất trên thế giới Các loại cây trồng công nghệ sinh học được trồng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là đậu tương, bông, ngô và cải dầu

Chuyển gen (transgenesis) là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể

đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau Vì vậy khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật và động vật Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell)

Để thực hiện thành công liệu pháp chuyển gen thì vector chuyển gen có vài trò rất quan trọng

1.3.2 Vector chuyển gen

Vector chuyển gen là một đoạn phân tử DNA nhỏ có khả năng mang 1 đoạn DNA ngoại lai cần thiết và khi xâm nhập vào TB chủ thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của TB chủ Vector chuyển gen được sử dụng để khuếch đại số lượng bản sao của một gen hay trình tự DNA nhất định, chuyển các gen ngoại lai vào TB hoặc sản xuất protein với số lượng lớn từ các gen tách dòng

Đặc điểm:

 Vector phải tồn tại trong TB chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn cho TB vật chủ

 Vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để dễ xâm nhập vào TB vi khuẩn và sao chép nhanh

 Vector chuyển gen phải có điểm khởi đầu sao chép (Ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong TB vật chủ

 Có các gen chỉ thị mang đặc điểm cho phép dễ dàng phát hiện, nhận biết chúng trong

TB vật chủ Thường các vector có chứa gen kháng chất kháng sinh hoặc gen tổng hợp chất màu dễ phát hiện trên môi trường thạch

 Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp

 Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzym giới hạn nhận biết để cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu sao chép

để tránh bị cắt nhầm

Ứng dụng:

 Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) một đoạn trình tự của DNA (nhiều bản sao giống nhau)

 Nghiên cứu sự biểu hiện của 1 đoạn trình tự DNA

 Đưa gen vào các TB VSV hoặc các động thực vật

vi khuẩn chủ

Nhược điểm: đôi khi hiệu suất biến nạp vào TB chủ thấp Không hiệu quả khi biến nạp

ở Eukaryote Không tách dòng được các phân đoạn DNA kích thước lớn >10kb

Plasmid được cải tiến qua 3 thế hệ:

Thế hệ thứ nhất là các plasmid tự nhiên và ngày nay hầu như không còn sử dụng như pSC1001, ColE1, …

Plasmid thế hệ thứ hai được cấu tạo phức tạp hơn, tập hợp các đặc tính quý của nhiều plasmid tự nhiên, hoặc gắn thêm các gen chỉ thị tạo nên 1 plasmid mới Một trong những plasmid thế hệ thứ hai được sử dụng rộng rãi là plasmid pBR322

pBR322 có kích thước 4363bp mang 2 gen kháng chất kháng sinh ApR – kháng apicilin,

TcR – kháng tetracilin, và 20 vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Trong số đó có 11 gen nằm trong các gen kháng chất kháng sinh, khi 1 gen lạ được gắn tại các vị trí gen đó làm

mất khả năng kháng chất kháng sinh tương ứng (thêm vào môi trường nuôi cấy chất kháng sinh tương ứng, những TB có mang vector chuyển gen sẽ kháng kháng sinh và tồn tại được, những TB không hợp với vector sẽ bị chết)

Plasmid thế hệ thứ ba là các plasmid đa năng (polycloning plasmid), chuyên dụng có kích thước rất nhỏ và có một đoạn đa liên kết (polylinker), hoặc điểm đa tách dòng (multiple cloning site) Đoạn đa liên kết là đoạn polynucleotide tổng hợp, mang một chuỗi các vị trí nhận biết của nhiểu loại enzym giới hạn Nhóm plasmid này là các plasmid pUC, Điển hình là pUC18 được cải tiến từ pBR322, kích thước 2686 bp mang gen ApR và 1 phần gen lacZ Ưu điểm của nhóm này là coskichs thước nhỏ, vùng polylinker cho phép gắn bất kỳ 1 trình tự DNA lạ nào, gen lacZ giúp dễ dàng phát hiện vector tái tổ hợp một cách rất đơn giản, bằng cách quan sát màu sắt khuẩn lạc trên môi trường thạch

b Vector tách dòng là phage

Ưu điểm: Khả năng xâm nhập TB chủ nhanh Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote Có thể mang gắn các đoạn DNA kích thước 30kb Dễ bảo quản do các hạt virus bền ở nhiệt độ lạnh (4oC)

Nhược điểm: Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn Số bản sao phage hình thành trong mỗi TB thấp hơn số bản sao của plasmid

Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda (λ) có nhiều ưu thế nhất, bởi lẽ

ở phần giữa của bộ gen có chứa một số gen không quan trọng và không liên quan với sự tái bản của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn ADN mong muốn vào đây Các phage không chứa các gen kháng thuốc cho nên việc theo dõi phage tái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan dương tính trên nền vi khuẩn ADN của nó có dạng mạch thẳng kép có hai đầu

bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (đầu cos) Có nhiều loại phage được sử dụng như: EMBL3, EMBL4, λGEM11, phage Bluescipt M13…

Phage Bluescript M13 thường được sử dụng làm vector tách dòng do nó có ADN sợi

đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6400 bp và chỉ xâm nhiễm vào E.coli

c Vector tách dòng là cosmid

Cosmid là vector nhân tạo, ghép nối từ một plasmid với đoạn trình tự cos của phage

λ Trên cosmid có các vùng giới hạn có thể cài lắp DNA lạ và 1 gen chống chịu ampiciline Trình tự cos điều khiển đóng gói DNA của phage Vector tách dòng là cosmid cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước lớn 40 - 50 kb

Cosmid có khả năng xâm nhiễm TB vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn Trong TB chủ nó tự nhân bản như plasmid Do đó chúng được dùng để tách dòng từ những gen lớn để tạo ngân hàng genome Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống chịu với môi trường có ampiciline

Ứng dụng cosmid để tách dòng cũng rất khó khăn và vất vả

d Vector tách dòng là Ti plasmid

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây độc, có kích thước

khoảng 200-250 kb Người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng: vùng DNA (transferred DNA), vùng gây độc (vir - virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi 2 vùng khác liên quan đến sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong

T-Agrobacterium

Vùng T-DNA của ti plasmid được nghiên cứu rất kỹ Đó là một đoạn DNA có kích thước 25 kb trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin (hoocmon thực vật), opine (các dẫn xuất không bình thường của acid amin) và các gen gây khối u (oncogenes) Trong Ti-plasmid, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng RB và LB Ngoài T-DNA

Cơ chế gây bệnh của các Agrobacterium là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh

trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A tumefaciens) hoặc rễ tơ (trường hợp A rhizogenes) Khả năng chuyển gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ

máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn

e Vector tách dòng là virus của TB Eukaryote

Thường sử dụng là các loại virus SV40 Simian virus, adenovirus, retrovivus, virus herpes… các vector trong nhóm này được sử dụng cho tách dòng và chuyển gen ở TB động vật, thực vật bậc cao

Sử dụng vector retrovirus để tạo động vật chuyển gen; cơ chế hoạt động của vector adenovirus

1.3.3 Enzym giới hạn (Restriction Enzyme – RE)

Enzyme giới hạn hay còn gọi là enzyme cắt giới hạn có vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của công nghệ sinh học Chúng là có bản chất là protein những có khả năng nhận diện chính xác một đoạn trình tự ADN ngắn và cắt chính xác phân tử ADN ở vị trí đặc hiệu Bởi vậy nói không ngoa rằng enzyme cắt giới hạn cùng với ligase đã tao nên ngành công nghệ ADN tái tổ hợp

TB vi khuẩn bị nhiễm phage thường bị phage phá hủy Có 1 số chủng vi khuẩn bị nhiễm phage nhưng không bị phage tiêu diệt, do DNA của phage bị cắt thành từng đoạn

nhỏ nhờ 1 số loại enzyme trong TB những enzyme đó gọi là enzyme giới hạn có khả năng cắt DNA phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn

Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiếc từ vi khuẩn có thể cắt DNA của TB động vật, thực vật, và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn, tùy thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn Mỗi loại enzyme giới hạn hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ

và dung dịch đệm thích hợp Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất

 Tên gọi các enzyme giới hạn:

Tên gọi của enzyme giới hạn thường có 3 hoặc 4 chữ xuất phát từ tên của vi sinh vật

mà từ đó, enzyme được xác định và chiết tách

- Chữ cái đầu (viết hoa) là chữ đầu của tên giống của vi khuẩn từ đó enzyme được trích li

- Chữ thứ 2 và thứ 3 (viết thường) là chữ đầu tên loài của vi sinh vật

- Đôi khi có chữ thứ 4 chỉ chủng sinh vật

- Chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (có thể có nhiều RE được phát hiện từ một chủng)

 Các loại enzyme giới hạn:

Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn Dựa vào khả năng nhận biết và cắt trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide người ta chia enzyme giới hạn thành 3 loại:

Loại 1: gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới hạn) di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 - 5000 nucleotide cắt tại đó và giải phóng độ vài chục nucleotide

Loại 2: gồm các enzyme giới hạn nhận biết các vị trí giới hạn cắt ngay tại đó Loại này được sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen và công nghệ DNA tái tổ hợp

Loại 3: gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng

20 nucleotide về phía trước

 Các kiểu cắt của RE

Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặt hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất định Có hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le

 Một số loại enzyme dùng trong kỹ thuật gen

Enzyme polymerase: xúc tác các quá trình tái bản DNA, phiên mã tổng hợp RNA Có

nhiều loại enzyme DNA polymerase:

Enzyme DNA polymerase I (pol I): là enzyme được tách chiết từ E.coli vai trò: xúc tác tổng hợp 1 mạch đơn DNA mới, đồng thời có vai trò sửa chữa sai sót trong tái bản DNA và thùy phân liên kết giữa các nucleotide ứng dụng: chủ yếu để xác định trình tự DNA bằng phương pháp Dideoxy ribonucleotide, tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao, thiết kế các vector mạch đơn…

Enzyme T4 DNA polymerase: có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng thủy phân các liên kết nucleotide

Enzyme Taq polymerase: ly trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus Thường được sử dụng trong nhân gen nhân tạo bằng máy PCR

Enzyme RNA polymerase: được tách chiết từ phage xâm nhiễm E.coli Chức năng xúc tác phiên mã tổng hợp RNA từ mạch khuôn của phân tử DNA

Emzyme ligase: là enzyme xúc tác hình thành các liên kết nối 2 đoạn acid nucleotide

với nhau DNA ligase xúc tác nối các đoạn DNA, RNA ligase xúc tác nối các đoạn RNA

Enzyme nuclease: là enzyme cắt DNA (DNase) và enzyme cắt RNA (RNase) Gồm

những loại sau: enzyme DNase I; nuclease S1; RNase A…

Các nuclease có khả năng phân cắt phân tử DNA hoặc RNA Có ba kiểu phân loại các nuclease sau:

Dựa vào bản chất của cơ chất mà nó tác dụng, người ta chia nuclease làm hai loại

- Deoxyribonuclease (DNase), cơ chất của nó là DNA

- Ribonuclease (RNase), cơ chất của nó là RNA

Dựa theo kiểu liên kết mà enzyme thủy phân, người ta cũng chia ra làm hai loại

- Nuclease "a": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphodiester giữa cacbon (C3’) và nhóm phosphate

- Nuclease "b": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphoester giữa cacbon (C5’) và nhóm phosphate (Hình 4-1)

Dựa theo hoạt tính enzyme, người ta cũng chia ra làm hai loại exonuclease và endonuclease

Exonuclease: Cắt các liên kết phosphoester từ hai đầu của chuỗi poly- nucleotide và

từ đó cắt dần từng nucleotide, chúng đòi hỏi là phải có nhóm OH (3’) hoặc OH (5’) tự do ở hai đầu chuỗi

Endonuclease: Thường thuỷ phân liên kết phosphoester ở vị trí bất kỳ bên trong chuỗi và tạo ra các oligonucleotide

1.3.4 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA là một môn kỹ thuật tiến hành đối với DNA, công nghệ này phát triển từ những năm 70 của thế kỷ XX, còn được gọi là genetic engineering hay nhân bản phân tử Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, khái niệm và phương pháp tái tổ hợp DNA cũng ngày càng được hoàn thiện

Công nhệ tái tổ hợp DNA là tập hợp các kỹ thuật tạo nên các phân tử DNA tái tổ hợp

để nhằm đưa các gen mong muốn mới vào các TB hoặc cơ thể sống Như vậy có thể nói các GMO đều là sản phẩm của công nghệ DNA tái tổhopwjg, hay công nghệ DNA tái tổ hợp là

cơ sở tạo nên các GMO

DNA tái tổ hợp là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau Phân tử DNA lai nhau được ghép nối từ các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong loài hoặc các loài khác nhau gọi là DNA tái tổ hợp

Các bước cơ bản của kỹ thuật tái tổ hợp DNA gồm có: Phân lập gen (tách chiết DNA, RNA) -> Tạo DNA tái tổ hợp -> Chuyển DNA tái tổ hợp vào TB nhận -> Tách dòng chứa DNA tái tổ hợp

Phân lập gen (tách chiết DNA, RNA)

Tách chiết DNA là kỹ thuật cơ bản trong hầu hết các phòng thí nghiệm phân tử, di truyền và sinh học nói chung Phân tử DNA sau tách chiết cần đảm bảo được số lượng và

chất lượng để đáp ứng được các phân tích sau đó Hiện nay trên thị trường có sẵn rất nhiều bộ kít tách chiết ADN khá tiện dụng

Cho đến nay đã có rất nhiều quy trình tách chiết DNA được đưa ra và báo cáo thành công bởi nhiều nhà nghiên cứu Đối với mỗi loại mô, tế bào quy trình tách chiết có thể sẽ khác nhau Dù vậy thì nguyên lý tách chiết ADN từ tế bào vẫn gồm các bước cơ bản sau:

1 Phá màng: nghiền tế bào, mô trong dung dịch chất tẩy (SDS) và proteinase để phá

vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân

tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn

2 Loại bỏ protein: Sau khi phá vỡ tế bào, DNA sẽ được trộn lẫn với các thành phần khác của tế bào chủ yếu là protein trong dung dịch Việc quan trọng lúc này là tách DNA ra khỏi thành phần protein của tế bào Để thực hiện bước này người ta chủ yếu sử dụng hỗ hợp Phenol/Chloroform Phenol-Chloroform không tan trong nước nhưng có khả năng làm biến tính protein Do đó, protein sẽ bị tủa lại khi gặp phenol Trong khi đó DNA thì không bị tủa bởi phenol nên vẫn tan trong nước Khi ly tâm phenol/Chloroform nặng sẽ lắng xuống dưới, protein tủa sẽ nằm tại danh giới của nước và phenol, còn DNA thì nằm lại trong pha nước ở phía trên Thu pha nước chứa DNA này để thực hiện các bước tiếp theo

3 Tủa và thu DNA: Sau bước tủa protein, DNA thu được nằm trong dung dịch với dung môi là nước Sử dụng Ethanol hoặc Isopropanol để tủa DNA trong dung dịch Sau đó

ly tâm để thu cặn DNA Cặn DNA này có thể được rửa trong Ethanol 70% một hoặc hai lần

để làm sạch mẫu Tiếp theo để cho bay hơi cồn và huyền dịch hóa cặn DNA thu được trong đệm

Tạo DNA tái tổ hợp

Chuẩn bị vector: Các vector được sử dụng trong các phương pháp tách dòng truyền thống dựa trên các plasmid và tạo ra một vị trí chèn DNA bằng cách cắt giới hạn bởi các enzym chuyên biệt

Chuẩn bị đoạn chèn: Các đoạn chèn để tách dòng có thể là DNA hệ gen, một phần của một plasmid khác hoặc một đoạn DNA thẳng Bất kể loại DNA có nguồn gốc từ đâu, bước đầu tiên trong quá trình chuẩn bị chèn thường là thực hiện quá trình cắt giới hạn nhằm tạo

ra các đầu tương thích để ghép nối tiếp vào vector Sử dụng enzym cắt cùng loại với enzym cắt vector để tạo ra các đầu nối tương ứng