Vaccin niem mạc và ứng dụng

Từ thời điểm Edward Jenner thử nghiệm thành công phương thức tiêm chủng virusđậu bò cách đây hơn 200 năm, hiện nay căn bệnh truyền nhiễm gây ra nhiều trận dịchnguy hiểm đã được loại trừ hoàn toàn. Khám phá của Jenner cùng với những bước tiếnsau này của Pasteur đánh dấu sự bắt đầu cho một lĩnh vực mới – lĩnh vực miễn dịchhọc. Miễn dịch ở niêm mạc là một trong những cơ chế hữu hiệu của cơ thể chống lạibệnh tật, và cũng là một tiểu phần của lĩnh vực miễn dịch học. Với mối quan tâm đếnsự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, niêm mạc được xem là cửangõ của cơ thể động vật, là nơi tiếp xúc với những mối nguy từ môi trường sống.Chính vì thế sự hiểu biết về cơ chế hoạt động đáp ứng miễn dịch ở niêm mạc đóng vaitrò hết sức quan trọng trong công tác phòng và trị bệnh cho động vật nói chung và conngười nói riêng. Quan trọng không kém, việc ứng dụng những hiểu biết được đào sâuqua nhiều năm vào sản xuất vaccine niêm mạc cũng là mục tiêu đã và đang được đặtra. Vì lý do trên, trong nội dung của đồ án môn học này, hai nội dung chính được xoáyquanh là cơ chế phòng ngự ở niêm mạc cũng như những ứng dụng kỹ thuật trongnghiên cứu vaccine niêm mạc.

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp HCM, Tháng 06/2011

Lời mở đầu

Từ thời điểm Edward Jenner thử nghiệm thành công phương thức tiêm chủng virus đậu bò cách đây hơn 200 năm, hiện nay căn bệnh truyền nhiễm gây ra nhiều trận dịch nguy hiểm đã được loại trừ hoàn toàn Khám phá của Jenner cùng với những bước tiến sau này của Pasteur đánh dấu sự bắt đầu cho một lĩnh vực mới – lĩnh vực miễn dịch học Miễn dịch ở niêm mạc là một trong những cơ chế hữu hiệu của cơ thể chống lại bệnh tật, và cũng là một tiểu phần của lĩnh vực miễn dịch học Với mối quan tâm đến

sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, niêm mạc được xem là cửa ngõ của cơ thể động vật, là nơi tiếp xúc với những mối nguy từ môi trường sống Chính vì thế sự hiểu biết về cơ chế hoạt động đáp ứng miễn dịch ở niêm mạc đóng vai trò hết sức quan trọng trong công tác phòng và trị bệnh cho động vật nói chung và con người nói riêng Quan trọng không kém, việc ứng dụng những hiểu biết được đào sâu qua nhiều năm vào sản xuất vaccine niêm mạc cũng là mục tiêu đã và đang được đặt

ra Vì lý do trên, trong nội dung của đồ án môn học này, hai nội dung chính được xoáy quanh là cơ chế phòng ngự ở niêm mạc cũng như những ứng dụng kỹ thuật trong nghiên cứu vaccine niêm mạc

MỤC LỤC

Lời mở đầu i

Danh mục từ viết tắt iv

Danh mục hình ảnh vi

Danh mục bảng biểu vii

Danh mục đồ thị vii

Chương 1 Khái quát về miễn dịch niêm mạc 1

1.1 Hệ thống tổ chức miễn dịch niêm mạc 2

1.2 Phân loại tế bào lympho T ở niêm mạc đường tiêu hóa 5

1.2.1 Tuýp a 6

1.2.2 Tuýp b 9

1.3 Tế bào B và sự sản xuất kháng thể ở niêm mạc 12

1.3.1 Sự nhận diện kháng nguyên bởi tế bào B 12

1.3.2 Sự di chuyển của tế bào B 13

1.3.3 Sự sản xuất kháng thể 15

1.3.4 Sự cảm ứng và điều hòa tế bào B tiết IgA .18

1.3.5 Chức năng hoạt động của các lớp kháng thể ở mô niêm mạc 21

1.4 Tế bào M: nguồn gốc, hình thái, vai trò đối với miễn dịch niêm mạc và sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh 22

1.4.1 Nguồn gốc và sự hình thành tế bào M 22

1.4.2 Đặc điểm hình thái của tế bào M 24

1.4.3 Chức năng của tế bào M 25

1.4.4 Sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh thông qua tế bào M 26

1.5 Dung nạp miễn dịch qua đường niêm mạc (Mucosal tolerance) 27

Chương 2 Chất phụ trợ và hệ thống chuyển giao kháng nguyên ứng dụng trong vaccine theo đường niêm mạc 31

2.1 Chất phụ trợ vaccine (Adjuvants) 31

2.1.1 Độc tố Cholera (Cholera toxin) 31

2.1.2 Độc tố ruột không bền nhiệt (heat-labile enterotoxin, LT) .35

2.2 Hệ thống chuyển giao vaccine 37

2.2.1 Sử dụng vector là vi khuẩn và virus sống tái tổ hợp 37

2.2.2 Chuyển giao vaccine theo đường niêm mạc nhờ các hạt polymer kích thước micromet (microparticle) 47

2.2.3 Liposome và ISCOM 49

2.2.4 Vaccine thực vật: gạo chuyển gen cảm ứng dung nạp miễn dịch trong trị liệu dị ứng tuýp 1 53 Chương 3 Ứng dụng các hạt polymer kích thước nano làm hệ thống chuyển giao vaccine đường miệng 57

3.1 Tổng quan ứng dụng hạt polymer nano chuyển giao vaccine 57

3.1.1 Giới thiệu 57

3.1.2 Sự hình thành và tính chất hóa lý của hạt nano 58

3.1.3 Sự vận chuyển hạt nano qua niêm mạc ruột 61

3.1.4 Một số ứng dụng hạt nano trong chuyển giao vaccine đường miệng 67

3.2 Kết quả nghiên cứu ứng dụng polymer PLGA-PEG kích thước nano chuyển giao vaccine đường miệng định hướng mục tiêu tế bào M .69

3.2.1 Tính chất vật liệu polymer và đặc điểm hóa lý của hạt nano 69

3.2.2 Tổng hợp và định tính hạt nano gắn phân tử RGD 71

3.2.3 Kết quả chuyển giao hạt nano in vitro 73

3.2.4 Kết quả chủng ngừa với hạt nano mang kháng nguyên ovalbumin trên chuột 76

3.2.5 Kết luận 76

Chương 4 Kết luận và đề nghị 78

Tài liệu tham khảo 80

Danh mục từ viết tắt

AICD: Activation induced cell death – Sự kích hoạt cảm ứng cái chết tế bào

APCs: Antigen presenting cells – Tế bào trình diện kháng nguyên

CCL, CXCR – là ligand của các thụ thể CCR và CXCR

CCR, CXCR – là các thụ thể biểu hiện đặc trưng trên các tế bào

CD: cluster of differentiation – Dấu ấn trên lympho T

CSR: Class switch recombination – Sự tái tổ hợp chuyển lớp kháng thể

CT: Cholera toxin – Độc tố cholera (gồm cả hai tiểu đơn vị), dạng tiểu đơn vị A A), dạng tiểu đơn vị B (CT-B)

(CT-CTL: Cytotoxic T lymphocyte – Tế bào T độc tế bào

DC: Dendritic cell – Tế bào hình gai

DTH: Delayed-type hypersensity – Phản ứng quá mẫn muộn

FAE: Follicular associated epithelium – Tế bào biểu mô ruột liên kết với nang lympho FDC: Follicular dendritic cell – Tế bào hình gai liên kết trong nang lympho

GALT, NALT: Gut-associated lymphoid tissues, Nasal-associated lymphoid tissues –

Tổ chức mô lympho liên kết với hệ thống tiêu hóa và đường hô hấp

GC: Germinal center – Trung tâm mầm

HEV: High endothelial venules – Tĩnh mạch cho phép sự lưu thông của các tế bào lympho từ mạch máu đến các hạch lympho

IEC: Intraepithelial cell – Tế bào biểu mô

IEL: Intraepithelial lymphocyte – Tế bào lympho trong cấu trúc biểu mô

IL: Interleukine

LP: lamina propria

LPL: Lamina propria lympho – Tế bào lympho trong cấu trúc lamina propria

LPS: Lipopolysaccharide – Nội độc tố của vi khuẩn ruột

LT: Heat-labile enterotoxin – Độc tố ruột không bền nhiệt từ vi khuẩn E coli

MHC: Major histocompatibility comple – Phức hợp phù hợp tổ chức

MLN: Mesenteric lymp node – Hạch lympho ở mô niêm mạc ruột

NK cell: Natural killer cell – Tế bào diệt tự nhiên

OVA, KLH: Ovalbumin, keyhole limpet hemocyanin – Kháng nguyên được dùng trong các thử nghiệm

PCL: poly( ε-caprolactone)

PEG: poly(-ethylene glycol)

pIgR: polymeric Immunoglobulin receptor – Thụ thể vận chuyển kháng thể IgA, IgM (có kết hợp mảnh tiết) qua nội mô tế bào ruột

PLGA: poly(-lactic-co-glycolic acid)

PP: Payer patch – Mảng Payer

RGD: phân tử protein là ligand của thụ thể β1 và α5β1 integrin

SC: Secretory component – Mảnh tiết

TCR: T cell receptor – Thụ thể tế bào T

TI antigen: - T cell independent antigen – Kháng nguyên không phụ thuộc tế bào T TLR: Toll-like receptor – Thụ thể nhận diện không đặc trưng kháng nguyên, thuộc về

cơ chế miễn dịch bẩm sinh

β1 integrin, α5β1 integrin: thụ thể integrin biểu hiện trên một số tế bào ví dụ như tế bào M

Danh mục hình ảnh

Hình 1 1: Hệ thống tổ chức các vùng cơ quan tham gia đáp ứng miễn dịch niêm mạc

đường tiêu hóa 4

Hình 1 2: Sơ đồ di chuyển của các tế bào tham gia miễn dịch ở niêm mạc đường tiêu hóa 5

Hình 1 3: Sự chọn lọc dòng tế bào T ở tuyến ức và sự phân hóa các lớp tế bào T 11

Hình 1 4: Sự di chuyển của các tế bào lympho và sự biểu hiện các thụ thể chemokine 14

Hình 1 5: Cấu trúc kháng thể IgA dạng tiết (SIgA) 16

Hình 1 6: Mô hình cơ chế tiết kháng thể lớp IgA, IgM và IgG ở niêm mạc 17

Hình 1 7: Tái tổ hợp trên gen mã hóa chuỗi nặng của kháng thể chuyển từ sản xuất IgM sang IgA1 18

Hình 1 8: Các yếu tố điều hòa biểu hiện chuỗi J ở chuột 20

Hình 1 9: Vị trí tế bào M trong cấu trúc biểu mô liên kết nang lympho (FAE) ở mảng Payer 24

Hình 2 1: Cấu tạo bộ gen và các tiểu phần chức năng của poliovirus 42

Hình 2 2: Sự hình thành vỏ capsid của bộ gen cDNA poliovirus đã loại bỏ gen mã hóa capsid thông qua trung gian virus vaccinia VV-P1 để biểu hiện protein P1 43

Hình 2 3: Thiết kế một poliovirus replicon với đoạn gen VP4 được giữ lại 44

Hình 2 4: Cấu trúc không gian của liposome 51

Hình 2 5: Cấu trúc không gian của hạt ISCOM rỗng không chứa thuốc 52

Hình 3 1: Con đường di chuyển của hạt nano 62

Hình 3 2: Mô hình nuôi cấy hình thành tế bào FAE in vitro 73

Hình 3 3: Sự biểu hiện thụ thể integrin β1 và α5β1 bởi mô hình giống tế bào M 75

Danh mục bảng biểu

Bảng 2 1: Đặc điểm của độc tố cholera trong vai trò một kháng nguyên niêm mạc (mucosal immunogen) 33 Bảng 2 2: Đặc điểm sử dụng của độc tố cholera 33 Bảng 2 3: Tiềm năng ứng dụng vaccine trị liệu từ thực vật (cụ thể là gạo) 55

Bảng 3 1: Giải pháp cải thiện khả năng được hấp thu của hạt nano chuyển giao

vaccine theo đường miệng 64 Bảng 3 2: Đáp ứng miễn dịch và dung nạp miễn dịch thu được sau chủng ngừa với hạt polymer kích thước nano vận chuyển vaccine theo đường miệng (tất cả các nghiên cứu đều thực hiện trên chuột) 68 Bảng 3 3: Mô tả tính chất hóa học của các polymer 70 Bảng 3 4: Thành phần (% khối lượng) các polymer trong các công thức khảo sát 70 Bảng 3 5: Tính chất hóa lý của hạt nano tạo thành từ các công thức khảo sát 71

Chương 1 Khái quát về miễn dịch niêm mạc

Bề mặt niêm mạc chiếm một diện tích vô cùng lớn (niêm mạc ruột chiếm 300-400

m2) [14] , nhưng lại có đặc điểm là rất dễ bị tổn thương do cấu trúc chỉ gồm một hoặc một vài lớp tế bào mỏng manh Niêm mạc được xem là vị trí thường xuyên bị tấn công bởi nhiều loại vi sinh vật nhất Ví dụ, niêm mạc ở ruột và dạ dày của người, hàng ngày qua việc ăn uống của con người mà niêm mạc ở đây tiếp xúc với hàng loạt những tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, các độc tố, các protein kháng nguyên, hay thậm chí là virus Một ví dụ khác là niêm mạc trong mũi và đường hô hấp, do hoạt động hít thở

mà vô tình đã đem vào cơ thể những chất độc hại như khói bụi, vi sinh vật tồn tại trong không khí, hay những virus gây bệnh truyền nhiễm qua đường hô hấp… Nhưng con người nói riêng hay động vật nói chung đều duy trì được trạng thái khỏe mạnh, đó là nhờ cơ chế bảo vệ phức tạp Hiệu quả của niêm mạc đáp ứng lại các tác nhân gây bệnh, gọi là hoạt động của hệ miễn dịch ở niêm mạc Khi niêm mạc bị tổn thương hay

hệ miễn dịch ở niêm mạc hoạt động bất thường, niêm mạc không có khả năng ngăn cản sự xâm nhiễm thì sự chống chọi với điều kiện xấu sẽ giảm sút làm giảm khả năng bảo vệ cơ thể trước các tác nhân gây bệnh

Hệ thống miễn dịch niêm mạc theo giải phẩu học và chức năng được chia thành 2

vị trí Đầu tiên là nơi mà kháng nguyên lạ bị phát hiện và bắt giữ gọi là vị trí cảm ứng (Inductive sites, IS), sau đó những hoạt động liên tiếp như trình diện kháng nguyên, kích hoạt hệ thống tế bào lympho để các tế bào này biệt hóa và phát triển diễn ra tại một mô đặc biệt gọi là vùng hiệu lực (Effector tissuses, ET) Hệ thống này kết hợp hài hòa và được điều hòa một cách rất chặt chẽ, các hoạt động phối hợp với nhau tạo nên hàng rào phòng thủ bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhiễm Vị trí cảm ứng và hiệu lực nằm rải rác khắp các vùng, cơ quan, bộ phận có hệ thống niêm mạc như hệ thống dạ dày – ruột, niêm mạc ở mũi, mắt, trong tai, hệ thống tiết niệu, cơ quan sinh dục [14]

Một đặc điểm quan trọng của miễn dịch niêm mạc là khả năng không chỉ tạo được đáp ứng miễn dịch tại vị trí niêm mạc chịu sự tấn công của mầm bệnh mà còn tạo ra sự bảo vệ hiệu quả tương tự ở các vị trí niêm mạc ở xa khác và kích hoạt cả hệ thống miễn dịch trung tâm [14] Đây là một ưu điểm đặc trưng của hệ thống miễn dịch niêm mạc, vì trái lại với hệ thống miễn dịch niêm mạc, hệ thống miễn dịch trung tâm không tạo được đáp ứng miễn dịch tại các vị trí niêm mạc Nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này là do tế bào B được kích hoạt ở niêm mạc có mang những thụ thể đặc biệt như CCR10, α4β7-integrin hay L-selectin nên có khả năng di cư đến nhiều mô cơ quan cụ thể là những mô niêm mạc khác hay hệ thống miễn dịch ngoại vi như hạch lympho, lách Tế bào B được kích hoạt ở hạch lympho ngoại vi thì không thể hiện những thụ thể nói trên nên không có khả năng di cư đến vùng niêm mạc Ngoài ra, tế bào gai ở niêm mạc (mucosal DCs) cũng có thể di cư và mang theo kháng nguyên đến cơ quan

lympho ngoại vi Tính chất di cư này cũng được thể hiện tương tự ở tế bào CD8+ T, nhưng về lâu dài thì tế bào nhớ biệt hóa từ CD8+ T lympho này cho thấy hiệu quả hoạt động ở mô, cơ quan mà tại đó kháng nguyên bị bắt giữ [20]

Nhờ đặc tính quan trọng trên mà việc chủng ngừa theo con đường niêm mạc càng tạo ra ý nghĩa to lớn hơn Nhưng để phát triển mạnh hơn vaccine niêm mạc thì những hiểu biết về cơ chế hoạt động ở mức độ tế bào và phân tử cần được đào sâu hơn, nội dung của chương này sẽ trình bày một cách khái quát nhất về cơ chế hoạt động cũng như cơ chế điều hòa của hệ thống miễn dịch niêm mạc với mục đích là nền tảng phục

vụ cho hướng phát triển vaccine theo con đường niêm mạc

1.1 Hệ thống tổ chức miễn dịch niêm mạc

Như đã giới thiệu, hệ thống tổ chức miễn dịch niêm mạc gồm tâp hợp các mô lympho nằm rải rác khắp các bộ phận của cơ thể Thí dụ, mô niêm mạc phần trên cơ thể gồm có hệ thống mô lympho liên quan đến niêm mạc mắt, hay mũi (nasal-associated lymphorecticular tissues, NALT) hay hệ thống niêm mạc ở đường hô hấp như cuống họng, thanh quản, kéo dài tới khí quản, phổi là nơi tiếp xúc với lượng lớn tác nhân gây bệnh qua việc hít thở hàng ngày Phần dưới cơ thể gồm có hệ thống mô lympho liên quan đến niêm mạc dạ dày, ruột (gut-associated lymphorecticular tissuses, GALT) chịu trách nhiệm bảo vệ cơ thể chống lại mầm bệnh qua đường ăn uống, hay

hệ thống niêm mạc theo đường tiết niệu, cơ quan sinh dục của cả nam và nữ Trong đó các hệ thống được nghiên cứu khá chi tiết đó là NALT và GALT đặc biệt là GALT, vì

hệ thống niêm mạc ruột chiếm diện tích lớn nhất 300-400 m2 và số lượng các loại mầm bệnh tiếp xúc với cơ thể qua đường tiêu hóa là rất nhiều, do đó trong phần này chỉ đề cập đến những chi tiết liên quan đến cấu tạo cũng như cơ chế hoạt động của hệ thống

mô lympho liên quan đến niêm mạc dạ dày, ruột (GALT) [14]

Nhìn chung, một kháng nguyên khi xâm nhập và tiếp xúc với cơ thể qua niêm mạc

sẽ dẫn đến đáp ứng miễn dịch với cùng một đặc điểm ở tất cà các hệ thống niêm mạc

đó là sự tương tác với tổ chức tế bào biểu mô gồm một hay vài lớp tế bào kích thích hệ thống bên trong tạo ra đáp ứng miễn dịch, sự tương tác này diễn ra tại vị trí cảm ứng

IS (inductive sites) và sự tương tác ngược lại của cơ thể đối với kháng nguyên lạ này lại diễn ra ở một vị trí hiệu lực khác gọi là ET (effector tissues) Cụ thể hơn tại vị trí cảm ứng, tế bào B và T lympho tương tác với tế bào trình diện kháng nguyên (APCs)

đã bắt kháng nguyên tiếp xúc với niêm mạc, sau đó tế bào B và T phát triển, biệt hóa

và di chuyển đến vùng hiệu lực để thực hiện chức năng loại bỏ mối nguy hiểm

Trên đường tiêu hóa có rất nhiều vị trí cảm ứng đã được biết đến như hệ thống mảng Payer (Payer patch, PP), ruột già và rất nhiều hạch lympho nằm rải rác khắp hệ thống dạ dày, ruột Mảng Payer là hệ thống cấu trúc dạng vòm được bao phủ bởi 1 lớp biểu mô lympho đặc hiệu không có khe hốc hay lông nhung, chứa nang trung tâm và

có sự phân đới mô, tế bào rất rõ ràng [33] Ngay bên dưới cấu trúc dạng vòm là vùng

tập trung nhiều tế bào B và T lympho, đại thực bào, tế bào hình tua (Dendritic cells, DC) và một số lượng nhỏ tế bào plasma Vùng trung tâm mầm (germinal centers) trong các nang trung tâm là nơi nhận thấy sự phân chia của tế bào B, nằm gần phía dưới cấu trúc vòm, đây cũng được xem là vị trí mà tế bào B chuyển định hướng thành

tế bào B sản xuất IgA Ngoài ra, trung tâm mầm cũng là vị trí tế bào B trưởng thành và chứa một lượng lớn tế bào B có kháng thể bề mặt IgA+ Tuy nhiên, không giống như

hệ thống miễn dịch ở các mô lympho ngoại vi, sự hình thành tế bào plasma có khả năng sản xuất kháng thể không diễn ra tại ngay vị trí tế bào B nhận được tín hiệu Bên cạnh các trung tâm mầm là vùng phụ thuộc vào tế bào T (T cells dependent areas hay còn gọi là Thymus dependent areas), vùng này chứa nhiều tế bào T trong đó chiếm 97% là tế bào T có thụ thể (T cell receptor, TCR) trên bề mặt là dimer khác loại αβ, gần 65% tế bào T mang αβ TCR+ ở mảng Payer là tế bào T hỗ trợ với đồng thụ thể là CD4+ và CD8- Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra vai trò của tế bào M (Microfold cell), tế bào M nằm ngay trên bề mặt niêm mạc xen kẽ với các tế bào biểu

mô khác Tế bào M có cấu trúc đặc biệt, mặt trong của tế bào tạo thành một hốc lớn, là nơi tập trung các tế bào B, T, đại thực bào và DC Gần 65 % tế bào T hiện diện trong hốc và xung quanh các tế bào M mang thụ thể CD3+ mang kiểu hình cũng như tính chất của một tế bào T hỗ trợ, hỗ trợ tế bào B nhận diện kháng nguyên sản xuất kháng thể Tế bào M có khả năng tiếp nhận các kháng nguyên từ mặt ngoài niêm mạc dạ dày ruột và chuyển vào bên trong cho đại thực bào hay DC trình diện kháng nguyên, tiếp sau đó là các tế bào B và T bắt tín hiệu từ các APC này [14] Cấu trúc, chức năng của

tế bào M sẽ được thảo luận trong phần sau của chương này

Sau khi kháng nguyên được bắt giữ và trình diện bước đầu cho các tế bào lympho tại vị trí cảm ứng, các tế bào lympho sẽ rời khỏi đây và di chuyển đến vùng mô hiệu lực Tại đây các tế bào lympho sẽ thật sự trưởng thành và thực hiện chức năng của nó Đối với tế bào B khi đã nhận diện kháng nguyên theo con đường chủ yếu là phụ thuộc

tế bào T sẽ biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất ra kháng thể IgA Tuy nhiên sự phát hiện kháng thể hầu như là tại vị trí bề mặt niêm mạc, nơi niêm mạc tiếp xúc với môi trường dạ dày, ruột Vùng hiệu lực của đường tiêu hóa dạ dày, ruột được nghiên cứu rõ nhất là vùng “lamina propria” (LP) LP chứa hầu hết các loại tế bào lympho từ T hỗ trợ đến T độc tế bào, tế bào B cũng như tế bào plasma Ngoài ra, ờ LP còn nhận thấy sự điều hòa chặt chẽ bởi các cytokine Một ví dụ cụ thể là hoạt động của IL-5, tế bào T hỗ trợ tại LP có hoạt động tiết IL-5 gấp 2 lần so với việc sản xuất ra IFN-γ, cho thấy hệ thống miễn dịch niêm mạc ở vùng ET thiên về hướng Th2, là hướng biệt hóa T hỗ trợ,

hỗ trợ lympho B sản xuất kháng thể Ngoài ra IL-5 còn đóng vài tro quan trọng điều hòa việc tạo kháng thể, IL-5 tăng cường việc sản xuất IgA, điều này phù hợp với thực

tế là thành phần kháng thể lớn nhất cũng là IgA, người ta ước tính lượng IgA được sản xuất tại các mô niêm mạc lớn hơn rất nhiều so với tổng lượng các type kháng thể khác trong huyết thanh và niêm mạc gọp lại [14]

Hai vị trí IS và ET được nối kết với nhau thông qua những đường dẫn đến MLN (Mesenteric lymph node) là hạch lympho xuất hiện ở vùng dưới niêm mạc dạ dày ruột,

hệ thống này cũng được nối kết với hệ thống mạch bạch huyết và mạch máu, do đó tín hiệu đáp ứng miễn dịch có thể truyền đến một số mô, hay cơ quan niêm mạc khác hay kích hoạt miễn dịch hệ thống (systemic immunity) (Hình 1.1)

Hình 1 1: Hệ thống tổ chức các vùng cơ quan tham gia đáp ứng miễn dịch niêm mạc đường tiêu

hóa [36]

Tóm lại, sự di chuyển của các tế bào như sau: tế bào B và T chưa nhận diện kháng nguyên và các loại tế bào trình diện kháng nguyên (APCs: DC, đại thực bào) đã bắt được kháng nguyên và chuẩn bị trình diện qua phân tử MHC sẽ di chuyển theo hệ thống mạch bạch huyết đến hạch lympho, trên đường di chuyển các APCs trưởng thành hoàn toàn, và mối liên kết giữa tế bào T và phân tử MHC của các APCs được hình hành ngay tại hạch lympho Lympho bào B, T trưởng thành và biệt hóa thành tế bào đặc hiệu (Effector cells) tiếp tục di chuyển theo con đường rời mạch lympho và mạch máu, kết quả là các tế bào xuất mạch và di chuyển đến vị trí hiệu lực, tại đây các

tế bào B sản xuất kháng thể, tế bào T thực hiện chức năng hỗ trợ (theo hướng Th1 hay Th2) và độc tế bào (Hình 1.2) Kháng thể sản xuất bởi tế bào B có thể là IgA (dạng chuỗi hình J có sự kết hợp với mảnh tiết), IgM hay IgG, riêng IgA và IgM được vận chuyển đến mặt ngoài niêm mạc để tương tác trực tiếp với kháng nguyên, sự vận chuyển này thực hiện bởi thụ thể pIgR (polymer Ig receptor), còn sự vận chuyển IgG qua lớp tế bào biểu mô chưa được hiểu biết cụ thể [31]

Tương tự như hệ thống miễn dịch ở các mô lympho ngoại vi như hạch lympho, lá lách, tế bào đóng vai trò quyết định tạo đáp ứng miễn dịch chống lại các tác nhân xâm nhiễm vào cơ thể là các tế bào lympho (tế bào NK của hệ thống miễn dịch bẩm sinh; tế bào B, T của hệ thống miễn dịch thích ứng) và hoạt động vô cùng quan trọng của các

tế bào trình diện kháng nguyên cụ thể là DC, đại thực bào, hay thậm chí cả tế bào B,

M cũng tham gia vào vai trò này Bên cạnh đó, ở miễn dịch niêm mạc còn có sự hiện diện của một số tế bào được xem như là hàng rào bảo vệ cơ thể của đáp ứng bẩm sinh

như các tế bào biểu mô, là lớp ngoài cùng bao quanh cơ quan như dạ dày, ruột,

cơ quan sinh dục, hệ thống đường hô hấp… Các tế bào biểu mô ở ruột non (Intestinal epithelial cells, IEC) hoạt động như hàng rào vật lý, tách biệt môi trường dịch thể trong ruột non chứa các dịch tiêu hóa, thức ăn cũng như vô số tác nhân khác khỏi khối

mô, cơ quan nằm bên dưới Hệ thống lông nhung kết nối với lớp biểu mô tạo thành cấu trúc cần thiết cho tính thấm hay thẩm thấu từ môi trường ngoài vào trong mô niêm mạc Một số tế bào IEC đặc biệt như tế bào Paneth, các tế bào khác của hệ thống miễn dịch bẩm sinh có khả năng tiết một số hợp chất hóa học để phòng thủ như chất nhầy làm giảm khả năng di chuyển của các vi sinh vật để các enzyme phân giải protein, lysozyme, các peptide kháng khuẩn, nitric oxide ức chế hoặc tiêu diệt các mầm bệnh [10] Một loại tế bào nữa cũng tham gia vào miễn dịch niêm mạc đã được nói đến trên phần giới thiệu là tế bào M sẽ được trình bày rõ ràng hơn sau hoạt động của các tế bào lympho

1.2 Phân loại tế bào lympho T ở niêm mạc đường tiêu hóa

Tế bào T trú ngụ tại ở hệ thống ruột tại những vị trí như hạch lympho (Mesenteric lymph node, MLN), lamina propria (LP) và trong biểu mô niêm mạc Trong khi T lympho ở MLN chủ yếu là tế bào T trưởng thành nhưng chưa được kích hoạt bởi kháng nguyên, còn ở LP và trong biểu mô các T lympho hầu hết là các tế bào hiệu lực (effector cell) hay tế bào nhớ (memory cell) Ở những vị trí khác nhau, số lượng các phân nhóm T lympho, vai trò và cơ chế điều hòa hoạt động cũng khác nhau Dựa vào các thụ thể và đồng thụ thể mà tế bào T được phân thành 2 tuýp chính Tuýp a gồm các

tế bào T mang thụ thể TCRαβ CD4+ hay TCRαβ CD8αβ+, tính chất của nhóm này

Hình 1 2: Sơ đồ di chuyển của các tế bào tham gia miễn dịch ở niêm mạc đường tiêu hóa [4]

giống với hoạt động của tế bào T trong máu, lách và các mô lympho ngoại vi thứ cấp Với tuýp a này, sự di chuyển của tế bào T như đã được trình bày ở trên, sau khi nhận diện kháng nguyên thông qua phân tử MHC lớp I hoặc II tại vị trí cảm ứng, tế bào T sẽ biệt hóa và phát triển thành các tế bào hiệu lực hay tế bào nhớ ở vùng hiệu lực Nhóm thứ 2 được gọi là tuýp b gồm những tế bào T mang thụ thể cả TCRαβ và TCRγδ, nhưng lại có đồng thụ thể chủ yếu là CD8+αα mà thiếu đi CD4 và CD8αβ Sự phân bổ các tuýp tế bào T phụ thuộc vào vị trí nơi tế bào T hoạt động hay còn những yếu như tuổi tác, giống loài và điều kiện sinh lý cũng như tác động ngoại sinh [10]

Nhìn chung, thành phần tế bào T ở LP chủ yếu là tuýp a, còn trong biểu mô là các

tế bào T thuộc tuýp b Tế bào lympho trong biểu mô (Intraepithelial lymphocytes, IEL) tập trung ở lớp biểu mô dạng trụ đứng, được tìm thấy ở tuyến ức của hầu hết các động vật có xương sống, hiện diện cả ở ruột non và ruột già Tuy nhiên mật độ và phân bố của từng tuýp tế bào T rất khác nhau giữa loài này và loài khác, một vài số liệu được khảo sát ở chuột ước lượng mật độ IEL ở ruột non khoảng 1 tế bào IEL trên 5 tế bào biểu mô thông thường (Intraepithelial cell, IEC), còn ở ruột kết mật độ phân bố này thấp hơn nhiều chỉ 1 IEL trên 40 IEC [10] So sánh mật độ phân bố IEL giữa ruột non

ở chuột và người, thì ở chuột phần lớn là tế bào IEL thể hiện thụ thể TCRγδ, phần còn lại bao gồm các TCRαβ+ mà chủ yếu là TCRαβ+CD8+αα, CD8+αβ và số lượng nhỏ TCRαβ+CD4+ Ở ruột non người, tỉ lệ TCRγδ chỉ chiếm khoảng 10% tổng IEL, nhưng khi có tác động ví dụ như tác nhân dị ứng hay phản ứng viêm thì số lượng tăng lên rất nhanh, còn ở ruột già thì có sự tập trung của tế bào mang CD4 thuộc tuýp a (chiếm 30% tổng IEL) [10] Sự phân bổ IEL rất khác nhau ở từng vị trí trong cơ thể phản ánh vai trò của IEL ở những vị trí đó, ví dụ như ở vùng tập trung lượng lớn vi sinh vật đòi hỏi IEL ở đây hoạt động như một hàng rào phòng thủ, tấn công vi sinh vật bào vệ cơ thể, ngược lại ở vùng lượng vi sinh vật ít hơn, hoạt động chủ yếu là hấp thụ chất dinh dưỡng thì IEL lại đóng vai trò điều hòa miễn dịch đáp ứng lại lượng lớn protein, kháng nguyên đồng thời cảm ứng hiện tượng dung nạp miễn dịch (Oral tolerance)

Tế bào T phân bổ khắp LP chủ yếu là CD4+ T hỗ trợ, chiếm tỉ lệ khá ít là CD8+αβ T độc tế bào, lympho T thuộc tuýp b hầu như không phân bổ ở vùng LP này, nhưng ở LP lại có sự xuất hiện của một vài loại tế bào có khả năng tương tác với phân tử MHC đặc biệt (non-classical MHC)

1.2.1 Tuýp a

Lympho T tuýp a cùng một dòng với tế bào T lympho truyền thống, sinh ra từ tủy xương, trưởng thành ở tuyến ức và di chuyển đến cơ quan lympho ngoại vi để bắt gặp kháng nguyên trình diện bởi các tế bào APC theo con đường MHC II biệt hóa thành tế bào Th, hỗ trợ B lympho đáp ứng tạo kháng thể (Th2), kích hoạt hệ thống độc tế bào tiêu diệt tế bào bị xâm nhiễm (Th1) hay theo con đường MHC I biệt hóa thành tế bào T độc tế bào (CTL) tiêu diệt trực tiếp tế bào bị xâm nhiễm Song song với việc hoạt hóa tạo đáp ứng miễn dịch, tế bào T trưởng thành đã nhận diện kháng nguyên biệt hóa

thành dòng tế bào nhớ, giúp cơ thể chống lại mầm bệnh khi bị tái xâm nhiễm Tế bào tuýp a sẽ tăng dần theo tuổi tác, qua thời gian sống, cơ thể thường xuyên phải tạo sự phòng vệ bằng cơ chế miễn dịch đặc hiệu nên số lượng dòng tế bào nhớ đối với từng loại kháng nguyên sẽ tăng lên và tập trung trú ngụ tại các vị trí mô lympho ở niêm mạc, là vị trí cửa ngõ của cơ thể tiếp xúc với mầm bệnh [10]

Khác với tế bào tuýp b, lympho T thuộc tuýp a không phân bổ trong lớp tế bào biểu

mô mà tập trung chủ yếu ở LP và TDL (thoracic duct lymph) Khi kháng nguyên được đưa vào bên dưới lớp biểu mô, tế bào DC di chuyển và tập trung tại vùng tế bào T của mảng Payer và hạch MLN, hầu hết (nhưng không phải là tất cả) các tế bào T sẽ được khởi động kích hoạt ở đây Sau khi kích hoạt, tế bào T di chuyển đến vùng hiệu lực để thực hiện chức năng hỗ trợ hay độc tế bào T lympho di chuyển từ vị trí mô niêm mạc này đến mô niêm mạc khác theo hệ thống mạch bạch huyết và mạch máu, với sự tham gia của rất nhiều cặp thụ thể/ligand ví dụ như LFA-1, ICAM-1, integrin α4β7, MADCAM-1, integrin αEβ7 với ligand là E-cadherin trên bề mặt tế bào biểu mô phía hướng vào trong, hay chemokine CCR9 với ligand là CCL25 thể hiện trên bề mặt tế bào biểu mô ở ruột non [10] Tính chất di chuyển về lại ruột của tế bào lympho được cho là do yếu tố môi trường vùng niêm mạc quyết định hơn là bản chất của kháng nguyên [10] Tế bào DC ở PP và MLN cũng được cho rằng có khả năng rất đặc biệt là tăng cường sự di chuyển của lympho bào về lại ruột sau khi nhận diện kháng nguyên một cách gián tiếp thông qua chất chuyển hóa của vitamin A, retinoic acid (RA) RA cảm ứng biểu hiện α4β7 và CCR9 trên bề mặt tế bào CD4+ và CD8+ và được chứng minh có vai trò quan trọng trong quá trình di cư về của lympho bào ở ruột non qua những nghiên cứu ở chuột thiếu vitamin A Một vài nghiên cứu gần đây thì cho rằng những tế bào biểu mô IEC và tế bào cơ chất ở MLN có khả năng sản xuất RA có thể cũng đóng góp quan trọng trong sự di cư qua trung gian tế bào DC ở niêm mạc [10] Ở ruột già, mặc dù tế bào T cũng biểu hiện α4β7 (không biểu hiện CCR9), nhưng RA dường như không giữ vai trò gì trong sự di cư của lympho bào

T nhớ (memory T cell) có tính chất biểu hiện khả năng độc tế bào khi bị tái xâm nhiễm So sánh với tế bào T nhớ ở mô lympho trung tâm ở lách, thì những tế bào nhớ IEL được kích hoạt một cách rất nhanh chóng, có thể thực hiện chức năng tiêu diệt những tế bào IEC bị xâm nhiễm bởi tác nhân đã được nhận diện trước đây, tạo nên một hàng rào phòng thủ vững vàng bảo vệ cơ thể không bị tái nhiễm Nhưng vốn kiểu hình TCR của tế bào nhớ CD8+ IEL tuýp a giới hạn hơn nên khi tác nhân gây bệnh tái nhiễm dẫn đến sự tập trung nhận diện bởi TCR hoặc đó có thể là những kháng nguyên

có thể được nhận biết độc lập với TCR Trong khi kháng nguyên có thể kích thích sự biệt hóa và tăng sinh từ tế bào nhớ thành tế bào hiệu lực, thì các cytokine như IL-7, IL-

15 có tác dụng ngược lại khi không có sự hỗ trợ của tín hiệu từ TCR Sự hình thành tế bào nhớ IEL là do sau khi tế bào T được kích hoạt, nhận diện kháng nguyên ở mô lympho niêm mạc sẽ di trú đến ruột, một vài tế bào T hiệu lực thực hiện chức năng tiêu

diệt tế bao nhiễm ở lớp biểu mô và cư ngụ tại đó như các tế bào nhớ Một vài nghiên cứu cũng được thực hiện khi chuyển tế bào nhớ CD8+ IEL định hướng một loại kháng nguyên xác định vào vật chủ đã bị xâm nhiễm bởi tác nhân có cùng kháng nguyên đó, thì tế bào T này đã cho thấy vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự phát triển của

một số loại tác nhân truyền nhiễm như LCMV, rotavirus, Toxoplasma gondii, và Giadia lamblia [10]

Mặc dù hầu hết các tế bào CD8αβ+ IEL đều duy trì trạng thái hoạt động bằng cách luôn biểu hiện thụ thể CCR9 hay tăng cường hoạt động độc tế bào để sẵn sàng nhanh chóng đáp ứng với kháng nguyên khi tái nhiễm, thì chúng cũng thể hiện khả năng hạn chế sự tăng sinh và sản xuất các chất điều hòa miễn dịch (cytokine) Tính chất này được giải thích với mục đích là duy trì hàng rào miễn dịch mà không làm tổn hại tính bền vững của mô, cơ quan Hoạt động này do các tế bào CD8αβ+ IEL đồng biểu hiện CD8αα chi phối Khác với CD8αβ+ có chức năng như một đồng thụ thể với TCR, tăng cường tín hiệu cho TCR, CD8αα thể hiện chức năng như một thụ thể kìm hãm hoạt động nhận tín hiệu của TCR Việc biểu hiện CD8αα ngắn hạn khi lympho T nhận diện kháng nguyên trình diện bởi phân tử MHC gắn trên APC giúp cho tế bào tránh khỏi hiện tượng AICD (Activation induced cell death, kích hoạt cái chết tế bào), và cho phép T lympho biệt hóa thành tế bào nhớ [10] Hiện tượng AICD là kết quả của sự tương tác giữa thụ thể Fas trên tế bào mục tiêu và ligand FasL trên T lympho, dẫn đến loại bỏ dòng tế bào T này theo nguyên tắc như “chọn lọc âm tính” (negative selection)

ở tuyến ức AICD là một trong những cơ chế giúp tế bào đào thải những tế bào miễn dịch nhân diện kháng nguyên bản thân để duy trì trạng thái cân bằng, hiện tượng dung nạp miễn dịch và có vai trò quan trọng trong bệnh lý tự miễn (autoimmune diseases) [29] CD8αα có thể nhanh chóng cảm ứng biểu hiện trên tế bào hiệu ứng khi di trú đến vùng hoạt động, và việc biểu hiện CD8αα trên tế bào CD8αβ+ IEL giúp ngăn chặn hoạt động khác thường của những tế bào này, thêm vào đó CD8αα có thể tương tác với ligand TL biểu hiện trên tế bào biểu mô, điều khiển tính cân bằng của việc tăng sinh, sống sót, và hoạt động của tế bào biểu mô

Tóm lại, tế bào lympho T trong lớp biểu mô niêm mạc có thể mang cả 2 thụ thể CD8αβ+ và CD8αα Trong đó tế bào CD8αβ+ IEL có chức năng như tế bào nhớ, luôn sẵn sàng tái đáp ứng lại tác nhân xâm nhiễm, thể hiện hoạt động độc tế bào rất mạnh, bảo vệ lớp tế bào biểu mô IEC tránh khỏi những tổn thương do sự xâm nhiễm của vi sinh vật Còn thụ thể CD8αα không mang tính chất của một tế bào CD8 là tiêu diệt trực tiếp qua hoạt động độc tế bào mà lại thể hiện chức năng như một thụ thể kìm hãm, điều hòa hoạt động của tế bào IEL, bảo vệ IEL không bị đào thải bởi quá trình chọn lọc âm tính khi có hoạt động bất thường như nhận diện kháng nguyên bản thân (self-antigen)

LPL tuýp a như đã trình bày gồm chủ yếu là các tế bào CD4+ TCR αβ Tất cả tiểu phân lớp của dòng tế bào CD4 đều được nhận biết có mặt ở vùng LP, chức năng thực hiện hoạt động đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào liên quan đến hoạt động độc tế

bào của Th1 hay Th2 với đặc tính hỗ trợ B lympho sản xuất kháng thể (ví dụ sản xuất IgE, loại trừ giun sán, nhạy cảm, dị ứng) Tuy nhiên, trong những năm vừa qua, LP cũng được xem là vị trí tập trung của dòng tế bào Th17 có khả năng sản xuất cytokine IL-17A, IL-22, IL-17F và phần lớn tế bào T điều hòa biểu hiện Foxp3 (Foxp3+ Treg) [10] Foxp3+ Treg được biết đến với vai trò duy trì nội cân bằng của hệ thống ruột (intestinal homeostasis) Một trong những hiện tượng rối loạn của hệ miễn dịch ở niêm mạc ruột là hiện tượng viêm (intestinal inflammation), gây ra bởi đột biến trên gen FOXP3 [10] Hơn thế nữa, Treg đã được chứng minh có hiệu quả ngăn chặn hay chữa trị viêm ruột kết trong thí nghiệm chuyển Treg sang chuột bị viêm ruột kết Cơ chế điều hòa của Treg bao gồm việc sản xuất ra cytokine có chức năng điều hòa như IL-10 và TGF-β và biểu hiện thụ thể ức chế là CTLA-4 [10] Treg có 2 nguồn gốc, một phát triển từ tuyến ức, hai là tế bào lympho T cảm ứng tạo thành Treg ở các cơ quan lympho ngoại vi, cả 2 đều tập trung trú ngụ tại ruột Môi trường ở ruột được cho là thuận lợi cho việc biệt hóa thành Treg, ở LP và MLN tập trung nhiểu CD103+ DC có chức năng cảm ứng lympho T biệt hóa thành Treg thông qua phương thức trình diện kháng nguyên và phụ thuộc vào yếu tố TGF-β có rất nhiều ở ruột Bên cạnh tác dụng nói trên, TGF-β khi phối hợp với IL-6 lại hỗ trợ cho sự biệt hóa tế bào hiệu ứng Th17 (effector Th17 cells) Tế bào Th17 có khả năng sản xuất ra cytokine IL-17 đóng vai trò quan trọng giúp cơ thể chống lại tác nhân xâm nhiễm ngoại bào và mầm bệnh từ nấm mốc Nhưng thú vị là trong trường hợp cơ thể ở trạng thái bình thường, ổn định thì tế bào Th17 vẫn tập trung với số lương đông đảo ở LP, sự tồn tại và cùng đóng góp của Treg và Th17 giúp ổn định trạng thái nội cân bằng của hệ miễn dịch được chứng minh

là có mối quan hệ loại trừ lẫn nhau Gần đây, RA cũng được xác định có vai trò then chốt trong điều khiển hiện tượng viêm và kháng viêm, sự cân bằng miễn dịch [10] Tóm lại, có nhiều yếu tố chi phối hoạt động của cả 2 loại tế bào Treg và Th17 như TGF-β, RA, enzyme rectinal dehydrogenase, CD103+ DC, một số loại DC mang những thụ thể khác, TLR5 ligand, đại thực bào cư trú tại LP, vi sinh vật hội sinh trong đường ruột

1.2.2 Tuýp b

Hầu hết tế bào T thuộc tuýp b ở niêm mạc cư trú tại lớp biểu mô ruột non, biểu hiện cả 2 lớp thụ thể TCR αβ và TCRγδ Mặc dù 2 lớp thụ thể này khác nhau hoàn toàn về chức năng nhận diện kháng nguyên và biệt hóa tế bào T thành những dòng khác nhau, nhưng cả hai đều có chung một đặc điểm giúp phân biệt tế bào T tuýp b và tuýp a IEL tuýp b với số lượng lớn là những tế bào T kích hoạt bởi kháng nguyên bản thân (“self”-reactive T cell), ở trạng thái kích hoạt thì tế bào T này chỉ thể hiện đồng thụ thể CD8αα mà không biểu hiện đồng thụ thể khác của TCR là CD4 và CD8αβ, thêm vào đó một số dấu ấn điển hình trên bề mặt thụ thể tế bào T cũng không được phát hiện như CD2, CD28, Thy-1 [10]

Dòng tế bào T này xuất hiện ở trẻ sau khi sinh, và duy trì mức cao ở động vật non,

ở chuột già thì số lượng tế bào T tuýp b giảm đáng kể và thay thế bởi sự tăng nhanh số lượng tế bào T hiệu lực và tế bào nhớ thuộc tuýp a IEL tuýp b có thể được phát hiện ở giai đoạn thai nhi và sự tập hợp chủ yếu là tế bào T tuýp b ở lớp biểu mô ruột diễn ra trong suốt chu kỳ sinh Sau khi sinh sự tập hợp nhanh chóng của vi sinh vật trong đường ruột, cũng như sự thay đổi thành phần và số lượng kháng nguyên khi cai sữa là hai yếu tố chính làm thay đổi số lượng và thành phần tế bào T ở lớp biểu mô và hệ thống niêm mạc [10]

Mặc dù CD8αα+ IEL đã được chứng minh không đi theo con đường chọn lọc thông thường, nhưng quá trình chọn lọc đó diễn ra như thế nào, qua những bước diễn tiến trung gian nào, và cụ thể diễn ra ở đâu vẫn còn là vấn đề đang tranh luận CD8αα+ IEL được cho rằng trải qua sự phát triển độc lập với tuyến ức, nhưng một số ý kiến lại cho rằng dưới điều kiện bình thường thì tất cả IEL ờ niêm mạc ruột kể cả tuýp b IEL đều

có nguồn gốc từ tuyến ức Ở tuyến ức, tế bào T bình thường phát triển và chín, giai đoạn chín này gọi là chọn lọc dương tính (positive selection) dựa trên những tín hiệu trung gian được nhận diện thông qua thụ thể TCRαβ Giai đoạn tiếp theo của quá trình

là chọn lọc âm tính, sau khi tăng sinh tế bào T chọn lọc dương tính tiếp tục phản ứng với MHC đã gắn kháng nguyên của bản thân (self-antigen), những tế bào T nào nhận diện kháng nguyên này sẽ bị loại trừ, nhằm ngăn chặn phản ứng tự miễn và thiết lập cơ chế dung nạp miễn dịch Tuy nhiên, đối với CD4+CD25+ Treg, tế bào NKT và TCRαβ+CD8αα+ IEL thì tiền thân của chúng được cho là trải qua một con đường chọn lọc khác với con đường chọn lọc ở tuyến ức gọi là “agonist selection”, điều kiện tích lũy các tế bào trên cũng là điều kiện ức chế hay thậm chí xóa bỏ dòng tế bào T truyền thống TCRαβ+ [10] Tiền thân của tế bào TCRαβ+ CD8αα+ IEL sau khi trải qua

“agonist selection” sẽ rời khỏi tuyến ức khi đó kiểu hình của IEL là TCRαβ+ CD4CD8-, chúng di chuyển trực tiếp đến ruột thông qua phương thức phụ thuộc sphingosine-1phosphate (S1P), trong giai đoạn trưởng thành tiếp theo, tế bào này sẽ biểu hiện CD8αα, diễn ra ngoài tuyến ức tại vùng niêm mạc đường tiêu hóa giàu IL-15 (Hình 1.3)

-Sự cân bằng CD8αα+ IEL đòi hỏi yếu tố điều hòa của một số cytokine Trong khi IL-7 không thể thiếu cho sự phát triển của tế bào TCRγδ+ IEL, ở chuột thiếu IL-15 thì

cả CD8αα+ TCRαβ+ và TCRγδ+ giảm đi rất mạnh Mặc dù IL-15 không có hiệu quả điều hòa cân bằng dòng tế bào T này ở tuyến ức, nhưng ở niêm mạc ruột thì IL-15 có tác động lên cả 2 dòng tế bào CD8αα+ TCRαβ+ và TCRγδ+ [10] Hơn thế nữa, việc TLR nhận tín hiệu qua trung gian MyD88 cảm ứng IEC tạo ra IL-15 có vai trò thiết yếu giúp duy trì CD8αα+ TCRαβ+ và TCRγδ+ IEL Điều này cho thấy có sự liên quan giữa vi sinh vật hội sinh trong đường ruột đến tính cân bằng của dòng tế bào T thuộc tuýp b

Tế bào T tuýp b ở trong lớp biểu mô như đã giới thiệu gồm có 2 loại chính là TCRαβ+ CD8αα+ và TCRγδ+ CD8αα+ IEL, nhưng cơ chế những thụ thể này nhận diện

kháng nguyên để được kích hoạt vẫn còn chưa sáng tỏ TCRαβ+ CD8αα+ được kích hoạt bởi kháng nguyên bản thân, nhưng đặc tính và bản chất của kháng nguyên này vẫn chưa được tìm ra, bởi tính phức tạp của dòng tế bào này tương tác với có thể cả phân tử MHC truyền thống lớp 1, không truyền thống hay thậm chí cả phân tử MHC lớp 2 Trong thí nghiệm ở chuột, TCRαβ+ CD8αα+ giảm nhanh chóng ở chuột

Hình 1 3: Sự chọn lọc dòng tế bào T ở tuyến ức và sự phân hóa các lớp tế bào T [10]

loại bỏ β2-microglobulin (β2m), nhưng vẫn hiện diện ở thí nghiệm với chuột thiếu protein vận chuyển liên quan đến trình diện kháng nguyên (transporter asocciaated antigen-presenting, TAP) hay phân tử MHC lớp 1 truyền thống [10] Từ đó có thể kết luận TCRαβ+ CD8αα+ IEL ở chuột nhận diện kháng nguyên phụ thuộc vào β2m, và không phụ thuộc vào phân tử TAP cũng như MHC lớp 1 Đối với TCRγδ+ CD8αα+ IEL, nhiều giả thiết được đặt ra rằng tế bào T mang thụ thể này nhận diện kháng nguyên bởi TCR hay gián tiếp qua thụ thể trên tế bào NK, trong một số trường hợp TCRγδ+ CD8αα+ IEL có thể nhận diện cả phân tử protein chưa qua chế biến bởi tế bào APC Ở người, (Vδ1γ)TCR và thụ thể tương tác với tế bào NK NKG2D biểu hiện trên

γδ IEL có thể nhận diện trực tiếp phân tử MICA và MICB lớp 1 (MICA và MICB là phân tử giống với phân tử MHC) dựa trên tín hiệu bị stress của IEC Kích hoạt γδ IEL theo phương cách này giúp biệt hóa chúng thành tế bào T có tính chất độc tế bào (cytolysis) mạnh đối với IEC đã bị tổn thương hay bị nhiễm giúp ngăn chặn sự phát tán mầm bệnh vào bên trong [10]

Một trong những đặc điểm nổi bật nhất của tuýp b là tính chất “activated yet resting” (tạm dịch là được kích hoạt một phần nhưng duy trì ở trang thái nghỉ), mặc dù thể hiện kiểu hình độc tế bào khi tách rời chúng khỏi lớp tế bào biểu mô, nhưng do thiếu tín hiệu kích thích nên dường như chúng không thể tăng sinh và duy trì trạng thái không hoạt động Tính chất này của tế bào IEL tuýp b để duy trì trạng thái cân bằng

giữa kích thích hoạt động miễn dịch và phản ứng quá mẫn của cơ thể Khi nhận được đầy đủ tín hiệu, chúng sẽ tăng sinh nhanh và thực hiện chức năng miễn dịch [10] Tóm lại, TCRγδ+ IEL có chức năng chính là điều khiển tính nội cân bằng của IEC,

đồng thời thí nghiện in vitro chỉ ra rằng IEL tuýp b có thể tăng cường sự phát triển của

IEC thông qua việc tiết ra keratinocyte là yếu tố kích thích sinh trưởng tham gia vào việc phục hồi những tế bào biểu mô bị tổn thương bởi phản ứng viêm[10] Tuy tế bào tuýp b có số lượng kháng nguyên đích hạn chế, nhưng cũng tham gia bảo vệ hệ miễn dịch và chống lại sự xâm nhiễm của mâm bệnh bằng cách tiêu diệt tế bào IECs bị tổn thương thông qua thụ thể nhận diện trực tiếp kháng nguyên bản thân hay thụ thể cảm ứng bởi stress (stress induced receptor)

1.3 Tế bào B và sự sản xuất kháng thể ở niêm mạc

1.3.1 Sự nhận diện kháng nguyên bởi tế bào B

Sự kích hoạt tế bào B có thể diễn ra theo nhiều cơ chế khác nhau Một số chất do vi sinh vật sản sinh ra đóng vai trò là một “siêu kháng nguyên” có thể tương tác trực tiếp với thụ thể tế bào B nằm ngoài vị trí liên kết kháng nguyên với kháng thể bề mặt, một

ví dụ điển hình là protein A của Staphylococcus aureus [23] Một phân tử protein A (có

rất nhiều vị trí liên kết với nhiều epitpoe) có thể gắn đặc hiệu với nhiều thụ thể trên tế bào B và thể hiện tính chất đáp ứng kháng thể đa dòng (polyclonal B cell response) Một vài chất khác có nguồn gốc từ vi sinh vật như polysaccharide, lipid hay những chất phi protein không thể trình diện theo con đường MHC lớp II, nên không phụ thuộc vào sự hỗ trợ của tế bào T gọi là kháng nguyên không phụ thuộc tế bào T (T cell independent antigens, TI) Có hai loại TI là TI-1 gồm những phân tử như đường, cấu trúc lipid, một vài acid nucleic nhất định có thể trực tiếp thúc đẩy sự nguyên phân, tăng sinh tế bào B Loại TI-2 thì ngược lại không thể tự bản thân những kháng nguyên này kích hoạt tế bào B tăng sinh, nhưng lại tạo được liên kết với BCR bởi những cấu trúc quyết định kháng nguyên “epitope” lặp lại Sự kích hoạt bởi kháng nguyên TI-2 đòi hỏi phải có sự hiệp lực của những yếu tố hỗ trợ như cytokine hay sự tương tác với một số tế bào khác Sự khác nhau về cơ chế còn liên quan đến loài, ví dụ như nội độc tốc của vi khuẩn hay lipopolysaccharide (LPS) hoạt động như một kháng nguyên loại TI-1 ở chuột, nhưng lại thể hiện đặc tính của kháng nguyên TI-2 ở cơ thể người [23] Một số polysaccharide cũng có thể thể hiện đặc tính của một kháng nguyên protein tức là kháng nguyên phụ thuộc tế bào T, cơ chế trình diện cũng tương tự như một kháng nguyên protein thông qua tế bào APC trình diện theo con đường MHC lớp II, kích hoạt tế bào Th CD4+ Tế bào T đã biệt hóa thành tế bào T hỗ trợ, đồng thời biểu hiện một số thụ thể chemokine có nhiệm vụ hướng tế bào T rời khỏi vị trí mà nó nhận diện kháng nguyên đến sát vùng nang lympho là vị trí giàu tế bào B, ở đây có sự tương tác giữa tế bào T hỗ trợ và tế bào B (đã nhận được tín hiệu thứ nhất là kháng nguyên)

Tế bào T sẽ cung cấp tín hiệu thứ hai để tế bào B được kích hoạt hoàn toàn, có thể tăng sinh và biệt hóa thành tế bào plasma

Ngoài chức năng nhận diện kháng nguyên và sản xuất kháng thể, tế bào B còn thể hiện một cách hiệu quả chức năng trình diện kháng nguyên như một APC thưc thụ theo con đường MHC lớp II Tế bào B có thể thực bào một cách rất hiệu quả đối với kháng nguyên protein mà nó nhận diện đặc hiệu, protein kháng nguyên đi vào tế bào tiếp tục theo di chuyển trong các bóng màng đến vị trí mạng lưới nội chất, sau quá trình chế biến các epitope được trính diện ra ngoài màng tế bào B nhờ phân tử MHC lớp II Sự tương tác giữa tế bào B và tế bào T nhờ thụ thể CD4+ và CD28, đặc biệt là

sự xuất hiện mối liên hệ giữaa CD40 trên tế bào B với ligand CD40L trên tế bào T, tương tác này phát ra tín hiệu sản xuất cytokine từ tế bào T, tạo ra lớp tín hiệu thứ hai, kích hoạt toàn diện tế bào B thành tế bào có khả năng tăng sinh mạnh và biệt hóa thành tế bào plasma [23]

1.3.2 Sự di chuyển của tế bào B

Sự di chuyển và tương tác của tế bào B và T có thể được tóm tắt như sau: tế bào B

và T từ cơ quan lympho trung tâm, nơi các tế bào này trưởng thành di chuyển đến các

mô lympho thứ cấp trong đó có các mô niêm mạc nhờ hệ thống các tĩnh mạch chuyên biệt (High endothelial venules, HEV), đây là hệ thống mạch cho phép các tế bào lympho di chuyển từ máu trực tiếp đến mô lympho ngoại vi bằng cách chui xuyên qua màng của thành mạch Tế bào B thoát ra khỏi hệ thống mạch tiến tới vùng nang lympho, cụ thể là trung tâm mầm (Germinal center, GC) và cư ngụ tại đây, và đây cũng là vị trí mà tế bào B tiếp xúc với kháng nguyên để nhận tín hiệu kích hoạt đầu tiên Sau đó, tế bào B đã nhận diện kháng nguyên sẽ di chuyển ra khỏi GC và tương tác với tế bào T hỗ trợ, trước đó tế bào T cũng đã nhận diện kháng nguyên bởi APC và

di chuyển khỏi vùng giàu T tiến sát đến nang lympho Sư tương tác giữa tế bào B và T cung cấp đầy đủ tín hiệu cho tế bào B kích hoạt, tế bào B này lại di chuyển ngược trở lại bên trong GC, tiếp theo đó là sự tương tác giữa tế bào B với tế bào FDC và tế bào

TFH (một phân lớp với số lượng khá nhỏ cư trú trong trung tâm mầm) để hỗ trợ tế bào

B tăng sinh và biệt hóa Đồng thời tại GC, hệ gen mã hóa lớp kháng thể cũng có sự tái

tổ hợp chuyển từ tế bào sàn xuất IgM sang chủ yếu là tế bào sản xuất IgA [23] Cuối cùng, tế bào B theo hệ thống mạch bạch huyết di chuyển tiếp tục đến vị trí hiệu lực ở ruột là lamina propria, là nơi tế bào plasma tiết kháng thể và kháng thể được vận chuyển ra khỏi lớp tế bào biểu mô để thực hiện chức năng

Sự di chuyển phức tạp như trên được thực hiện thông qua những thụ thể chemokine (CCR hay CXCR) hay ligand của thụ thể trên (CCL là ligand của CCR hay CXCL là ligand của CXCR) được biểu hiện tại những thời điểm khác nhau của các tế bào lympho (Hình 1.4) Ở giai đoạn đầu, các tế bào lympho thể hiện thụ thể CCR7+ tương ứng với các ligand thể hiện bởi các tế bào trên thành mạch là SLC (CCL21) và ELC

(CCL19) phân bố trên khắp bề mặt trong khoang mạch, nhờ vậy mà tế bào B và T có thể chui qua nhờ cơ chế thoát mạch Sau khi thoát khỏi mạch, các tế bào B phải di chuyển vào nang lympho đến vùng giàu B, lúc này là hoạt động của thụ thể CXCR5 sẽ tương tác với các đầu mút tua của các tế bào FDC với ligand là CXCL13 (hay còn gọi

là ligand BCA-1 ở người) Khi có sự xâm nhập của kháng nguyên lạ, thì tế bào B di chuyển ra khỏi nang lympho nơi tế bào T đang chờ để cung cấp tín hiệu cho tế bào B kích hoạt, hoạt động này cũng thông qua thụ thể CXCR5 Trong trung tâm mầm còn

có sự hiện diện của các tế bào TFH mang thụ thể CD4+ CXCR5+ có vai trò hỗ trợ tế bào

B, một phân lớp nhỏ của tế bào TFH gọi là tế bào GC-Th biểu hiện thụ thể CXCR5+CD57+ được chứng minh là cần thiết cho giai đoạn biệt hóa tế bào B và sự sản xuất kháng thể Tế bào B sau đó thoát khỏi nang và theo hệ thống mạch bạch huyết (mang yếu tố SLC) đến vị trí hiệu thực hiện chức năng của tế bào plasma, lúc này thụ thể chemokine CCR7 được biểu hiện [23]

Hình 1 4: Sự di chuyển của các tế bào lympho và sự biểu hiện các thụ thể chemokine [23]

Để rời khỏi mạch bạch huyết di chuyển đến đúng vị trí hiệu lực cần có sự tham gia của các yếu tố như integrin α4β7 và thụ thể chemokine CCR9 (với ligand là CCL25), CCR10 (với ligand là CCR28), đây là những thụ thể biểu hiện đặc trưng trên tế bào B

ở mô niêm mạc ruột hướng các tế bào này đến vùng lamina propria Trong khi đó, ở

mô niêm mạc trên hệ thống hô hấp hay đường niệu, tế bào B thể hiện trên màng thụ thể integrin α4β1, L-selectin (với ligand là CD62L) và thụ thể chemokine CCR7 (với ligand là CCL21, CCL19) hướng các tế bào B tới vị trí hiệu lực của các mô niêm mạc này [23] Nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt này là do sự biểu hiện những ligand khác nhau trên màng các tế bào stroma (stromal cells) của các cơ quan niêm mạc khác nhau Ligand của integrin α4β7 là MAdCAM-1 thể hiện trên tế bào màng trong thành mạch dẫn đến vùng lamina propria, còn ligand của integrin α4β1 là VCAM-1 biểu hiện trên màng trong mạch dẫn đến mô niêm mạc ở mũi và cuống phổi

Qua những phân tích trên cho thấy, môi trường mô niêm mạc ở vị trí các tế bào lympho bắt gặp hay nhận diện kháng nguyên và hệ thống mạch bạch huyết dẫn các tế bào lympho đến vùng hoạt động tương ứng đặt dấu ấn quyết định sự di chuyển của các

tế bào lympho (đã trở thành tế bào hiệu lực hay tế bào nhớ) này Sự đặt dấu ấn này một phần đã được chứng minh là nhờ tế bào DC tại vùng kháng nguyên được nhận diện qua thí nghiệm với kết quả là các tế bào DC cô lập từ mảng Payer và MLN có tính chất đặc biệt tăng cường biểu hiện yếu tố thụ thể α4β7 trên các tế bào lympho Như đã trình bày ở trên, retinoic acid (sản phẩm oxy hóa vitamin A thực hiện bởi enzyme trong tế bào DC và có thể cả tế bào B và T) tham gia đặt dấu ấn trên màng lympho bào quyết định tính chất di trú của các tế bào này [23]

Sự di chuyển của các tế bào hiệu lực hay tế bào nhớ đến các mô niêm mạc khác nằm xa vị trí mô niêm mạc bị xâm nhiễm hay đến hệ thống mô lympho ngoại vi của hệ miễn dịch trung tâm đang là mối quan tâm lớn trong việc nghiên cứu vaccine niêm mạc hiện nay Hiệu quả di chuyển nói trên có thể thu được nếu sử dụng các tác nhân chuyển giao là vi sinh vật sống có khả năng sao chép, còn đối với những vaccine sử dụng hệ thống chuyển giao không thể sao chép thì không tạo ra được hiệu quả trên [23] Nhìn chung, các tế bào miễn dịch sau khi biệt hóa dường như ưu tiên di chuyển đến vùng mà nó thực hiện chức năng tương ứng với vị trí mà các tế bào này đã nhận diện kháng nguyên

1.3.3 Sự sản xuất kháng thể

Ở người trưởng thành, lượng kháng thể lớp IgA (~ 40mg/kg) được vận chuyển đến môi trường khoang ruột mỗi ngày nhiều hơn tổng lượng IgG (~ 30mg/kg) được tạo thành, và tổng lượng IgA được tạo ra cũng nhiều hơn so với các lớp kháng thể khác cộng lại, lượng IgA dạng tiết có thể được xuất ra xấp xỉ 3g/ngày [23] Dẫn chứng trên cho thấy, niêm mạc ruột đóng vai trò là một cơ quan miễn dịch vô cùng quan trọng đối với hệ miễn dịch qua trung gian kháng thể hay miễn dịch thể dịch (humoral immunity) bởi kháng thể IgA dạng tiết được sản xuất chủ yếu bởi tế bào plasma ở ruột 70-90% tổng số tế bào plasma ở niêm mạc nói chung sản xuất ra pIgA (polymer IgA) chủ yếu

là ở dạng dimer, pIgA cùng với lớp kháng thể IgM dạng pentamer cả hai đều liên kết với chuỗi “J” (joining chain) và được xuất ra ngoài bề mặt khoang tiêu hóa nói riêng

và các bề mặt ở các mô niêm mạc khác nói chung để thưc hiện chức năng bảo vệ Hệ thống dạ dày, ruột được nghiên cứu và hiểu biết rõ ràng nhất về sự đóng góp cho miễn dịch niêm mạc Trên thực tế, niêm mạc ruột chứa ít nhất là 80% tế bào plasma của cơ thể, chủ yếu tập trung tại vùng lamina propria, với 90% tế bào plasma ở đây sản xuất

ra kháng thể IgA [23]

Trong suốt những năm cuối thập kỷ 60 và sang thập kỷ 70 có ít nhất tám ý kiến khác nhau được đề xuất để giải thích bằng cách nào phân tử IgA có thể được đi xuyên qua hàng rào tế bào biểu mô và được tiết ra trên bề mặt “apical” của các tế bào này

Một trong những giả thuyết được đưa ra vào năm 1973-1974 cho rằng phân tử glycoprotein là một thành phần liên kết của SIgA (secertory IgA), sau được WHO đặt tên là mảnh tiết “seceretory component” (SC) có thể hoạt động như một thụ thể đặc hiệu cho pIgA và pentamer IgM gắn trên màng tế bào tiết ở lớp biểu mô [23] Sự hiện diện của chuỗi J và mảnh tiết SC đóng vai trò cơ bản trong cơ chế tiết và hoạt động chức năng của kháng thể pIgA và pentamer IgM (Hình 1.5) Thông qua các phân tử hỗ trợ này mà kháng thể tương tác được với thụ thể trên bề mặt dưới tế bào biểu mô, sau

đó phức hợp “kháng thể + thụ thể” được đưa vào bên trong và vận chuyển xuyên qua

tế bào bằng các bóng màng, khi đến bề mặt trên của tế bào biểu mô, nhờ hoạt động của các enzyme protease phân cắt mối liên kết giữa kháng thể và thụ thể tách kháng thể ra môi trường bề mặt mô niêm mạc

Hình 1 5: Cấu trúc kháng thể IgA dạng tiết (SIgA) gồm chuỗi HJ liên kết hai monomer và kết hợp với mảnh tiết SC để được vận chuyển ra bề mặt biểu mô niêm mạc nhờ thụ thể pIgR [23]

SC có thể tồn tại ở ba dạng: tương tác với màng tế bào biểu mô (ở dạng cấu trúc

nguyên vẹn 100kD của thụ thể pIgR), dạng liên kết với kháng thể hay có thể ở dạng tự

do Hai dạng sau có kích thước 80kD là phần cấu trúc ngoại bào của thụ thể pIgR và dạng SC tự do được phân cắt từ thụ thể không tạo liên kết với kháng thể luôn luôn duy trì ở mức dư thừa khoảng 50% trên tổng số thụ thể được tạo ra [23] Bởi thụ thể pIgR mất đi sau khi vận chuyển kháng thể ra bề mặt lớp biểu mô do bị phân cắt thành SC dạng liên kết kháng thể hay dạng tự do nên đòi hỏi phải có một lượng lớn tế bào với mức biểu hiện pIgR cao Mối tương tác giữa phân tử SC và kháng thể IgA và IgM cũng khác nhau, đối với SIgA, SC tạo liên kết cộng hóa trị với một tiểu đơn vị của kháng thể, có chức năng bảo vệ cấu trúc của kháng thể tránh khỏi trường hợp bị phân giải trong môi trường dịch nhầy của bề mặt lớp biểu mô nhờ tính chất “mucophilic” Còn đối với IgM dạng pentamer thì SC tự do bám trên phân tử kháng thể nhưng không bằng liên kết cộng hóa trị nên IgM tỏ ra không có hoạt tính kháng khuẩn cao như IgA Ngoài ra, mảnh tiết còn co một số tính chất kháng khuẩn tự nhiên, nên có đề nghị cho rằng pIgR có nguồn gốc từ hệ thống miễn dịch bẩm sinh [23]

Chuỗi J là phân tử protein 15-kD được sản xuất bởi các tế bào plasma, lần đầu tiên

được xác định một cách độc lập bởi hai nhóm Halpern&Kosland và Mestecky cùng cộng sự, là phân tử protein tương tác với kháng thể, phổ biến với lớp kháng thể IgM và

SIgA Chuỗi J được cho là có vai trò trong việc polymer hóa một cách chính xác những phân tử kháng thể dạng polymer, hay tạo ra lớp kháng thể có ái lực cao phục vụ cho mục đích ngưng kết kháng nguyên hay tác nhân xâm nhiễm [23] Như đã nhắc đến

ở trên, chuỗi J còn góp phần bắt buộc cho việc liên kết kháng thể SIgA và IgM với SC/pIgR Bên cạnh các tế bào plasma sản xuất IgA và IgM tổng hợp chuỗi J thì gần 70-90% tế bào plasma sản xuất IgG cũng có thể tổng hợp chuỗi J, nhưng chuỗi J không tạo liên kết với dạng kháng thể này nên nó có thể bị phân giải trong môi trường nội bào của tế bào plasma [23] Nhưng IgG vẫn có thể được vận chuyển qua hàng rào biểu mô bằng cách chui qua khoảng giữa các tế bào (Hình 1.6)

Hình 1 6: Mô hình cơ chế tiết kháng thể lớp IgA, IgM và IgG ở niêm mạc [23].

Cấu trúc và sự điều hòa biểu hiện pIgR: pIgR có vùng gắn ligand nằm ngoài tế

bào mang đầu N-, một cấu trúc α-helix gắn với màng tế bào, và một đuôi 103 amino acid nằm bên trong tế bào mang đầu C- Vùng cấu trúc ngoại bào bao gồm 5 khu vực giống phân tử Immunoglobulin (D1-D5) hình thành phân tử dạng móc (hook-shaped) được tách biệt khỏi phần gắn với màng bằng môt cấu trúc linh động, vị trí này cũng là điểm cắt chuyên biệt của enzyme protease [23] pIgR được tổng hợp ở mạng lưới nội chất của tế bào tiết biểu mô và được vận chuyển trực tiếp đến mặt dưới tế bào biểu mô nhờ thể Golgi Ở đây, pIgR lúc này đã có thể gắn với pIgA và pIgM có chứa chuỗi J sản xuất bởi tế bào plasma ở vùng lân cận Ligand của thụ thể này là phần Fc của kháng thể, sẽ tạo liên kết với vị trí D1 của thụ thể, đối với riêng IgA, phức hợp trên còn được ổn định thêm nhờ liên kết hóa trị giữa vị trí D5 và Cα2 của kháng thể Cơ chế của việc tiếp nhận phức hợp kháng thể gắn với thụ thể là con đường thực bào phụ thuộc vào phân tử clathrin (clathrin-mediated endocytosis) Trong khi một số thụ thể theo con đường vận chuyển ngược lại màng ở mặt dưới tế bào biểu mô, thì hầu như phần lớn phức hợp thụ thể – kháng thể tiếp tục theo con đường đến endosome ở mặt trên tế bào biểu mô (apical recycling endosome, ARE) và được xuất ra bề mặt lớp biểu

mô sau khi ARE hòa nhập với màng tế bào, và thụ thể pIgR bị endoprotease phân cắt nhờ leupectin cảm ứng [23] Sự điều hòa tổng hợp và biểu hiện của SC và pIgR được điều khiển bởi hệ gen của tế bào tiết thuộc hàng rào biểu mô, nhưng sự biểu hiện có thể được tăng cường ở mức độ phiên mã bởi một số chất điều hòa miễn dịch như cytokine: Interferon-γ và IL-4 cũng như một số cytokine kích thích phản ứng viêm như TNF và IL-1 [23]

1.3.4 Sự cảm ứng và điều hòa tế bào B tiết IgA

Tái tổ hợp gen chuyển sang lớp kháng thể IgA ( IgA class switch recombination)

Ở hầu hết động vật có vú có một gen mã hóa cho chuỗi CHα (α constant heavy chain, yếu tố quyết định sản xuất kháng thể lớp IgA) nằm ở đầu 3’ của locus mã hóa cho chuỗi nặng Tuy nhiên, ở người và một số loài linh trưởng khác thì có sự tăng gấp đôi vùng mã hóa CH γ  α, tạo nên ở người 2 phân lớp của lớp kháng thể IgA gồm có IgA1 và IgA2 mà tế bào plasma sản xuất ra hai dạng này phân bố khắp hệ thống miễn dịch niêm mạc (phần lớn là lớp IgA2) và miễn dịch hệ thống (ở dạng IgA1 trong huyết thanh) Nhìn chung, các locus mã hóa cho CHα ở động vật có vú gồm 3 exon tương ứng các vùng trên hoạt động trên chuỗi nặng, với một đoạn mã hóa 19 amino acid với chức năng tạo nên dạng tiết của kháng thể nằm ở đầu 3’ của exon thứ 3, và một đoạn exon ngắn khác mã hóa cho đoạn chức năng xuyên màng và đuôi để vận chuyển trong

tế bào chất [23] “Class switch recombination” (CSR) là sự tái tổ hợp đoạn gen nói trên để chuyển từ lớp kháng thể định sẵn trên tế bào plasma là IgM hay IgD sang lớp kháng thể khác nhu IgG hay IgA hay IgE, mà cụ thể mối quan tâm ở đây là lớp IgA, đóng vai trò hết sức quan trong trong hàng rào bảo vệ niêm mạc CSR diễn ra trong quá trình phiên mã đoạn gen từ vị trí promoter Iα ở đầu 5’, và quá trình đòi hỏi có sự tham gia của enzyme AID (activation-induced cytidine deaminase) và một số CSR enzyme khác [23]

Hình 1 7: Tái tổ hợp trên gen mã hóa chuỗi nặng của kháng thể chuyển từ sản xuất IgM sang

IgA1 [23]

Quá trình tái tổ hợp diễn ra như sau: vị trí bắt đầu phiên mã là tại promoter nằm phía trước đoạn VDJ (vị trí mũi tên cong ngắn bên trái VDJ), sự tái tổ hợp diễn ra tại hai vị trí nằm trước locus CHµ (µ mã hóa cho IgM) và vị trí nằm trước locus CHα1 (α1 mã hóa cho lớp IgA1) được ký hiệu với hai mũi tên cong dài (Hình 1.7) Hai vị trí được đánh dấu nói trên sẽ tổ hợp lại tạo thành một vòng kín và được cắt bằng enzyme chuyên biệt tạo thành một episome với đoạn gen được loại bỏ chứa locus CHµ, δ (mã hóa IgD), và γ3, γ1 (mã hóa IgG3, IgG1) và một đoạn gen sẽ đi tiếp quá trình phiên

mã, sau đó là dịch mã tạo ra immunoglobulin thuộc lớp IgA1 [23] Quá trình tương tự

có thể xảy ra ở tế bào plasma khác để sản xuất ra lớp kháng thể IgA2

Quá trình tái tổ hợp nhìn chung được cảm ứng bởi hai tín hiệu, đầu tiên là thông qua các cytokine và tín hiệu thứ hai từ sự tương tác giữa thụ thể CD40 trên tế bào B và ligand CD40L trên tế bào T, tuy nhiên ở chuột thiếu sự biểu hiện của CD40L hay CD40 thì sự sản xuất IgA ở ruột không bị loại bỏ, còn ở người thì nếu bất hoạt biểu hiện của CD40L sẽ xuất hiện hội chứng “hyper IgM” (biểu hiện chủ yếu IgM, không thể tái tổ hợp chuyển sang lớp IgA hay IgG do không thể truyền hay nhận thông tin tái

tổ hợp) [23] Cytokine chính đóng vai trò tín hiệu cho CSR chuyển thành IgA là

TGF-β cùng với một vài sự đóng góp từ IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 và IL-10 [23] Đối với TGF-TGF-β

có hai yếu tố điều hòa là yếu tố điều hòa âm SMAD7 và SMAD2 là yếu tố điều hòa dương Ở chuột nếu thiếu SMDA7 thì sự tái tổ hợp chuyển lớp kháng thể được tăng cường, và ngược lại nếu chuột thiếu SMDA2 thì đối tượng biểu hiện kháng thể IgA ở mức thấp [23] Sự sản xuất IgA ở ruột của chuột độc lập một phần với sự tương tác giữa tế bào B và T, cho thấy có hệ thống các tín hiệu khác cho CSR Đó là hai thành viên trong họ TNF gồm BAFF và APRIL [23] BAFF được biểu hiện bởi bạch cầu đơn nhân và DC với 3 thụ thể BAFF-R, BCMA và TACI APRIL được biểu hiện bởi bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, DC và tế bào T đã kích hoạt, nhưng chỉ là ligand của thụ thể BCMA và TACI Bằng việc nghiên cứu từng cặp đôi giữa 2 loại TNF tương ứng với các thụ thể với thí nghiệm trên chuột, APRIL và TACI được kết luận là sự tương tác cần thiết cung cấp tín hiệu cho sự tái tổ hợp gen chuyển sang lớp IgA cùng với các lớp kháng thể khác như IgG và IgE Vậy một câu hỏi được đặt ra là tại sao lớp kháng thể IgA lại vượt trội so với các lớp khác trong khi sự tương tác giữa APRIL và BCMA với các thụ thể cũng kích hoạt tái tổ hợp sang các lớp kháng thể khác? Như đã nhắc đến tác dụng điều hòa của retinoic acid được sản xuất bời tế bào DC ở mảng Payer và MLN, retinoic acid có thể phối hợp cùng IL-6 hay IL-5 cảm ứng sự sản xuất IgA ở cả chuột và người Chính vì thế, môi trường cytokine và sự biểu hiện kiểu hình của tế bào

DC ở vùng mô lympho góp phần trong việc giải quyết câu hỏi trên [23]

Ngoài ra, thêm vào tính phức tạp của vấn đề tái tổ hợp gen chuyển lớp kháng thể, còn có vấn đề liên quan đến chương trình phiên mã điều khiển sự phát triển của dòng

tế bào từ tế bào B đến tế bào plasma BSAP (B-cell lineage-specific activator protein)

được mã hóa bởi gen pax-5, nên còn được gọi là PAX5 (paired box protein 5) là yếu tố

phiên mã cần thiết cho sự tạo ra và duy trì tính đồng nhất của các tế bào B trong cùng

một dòng, kích hoạt enzyme AID trong phản ứng ở trung tâm mầm, đồng thời sự kết thúc quá trình biệt hóa tế bào B thành tế bào plasma phụ thuộc vào việc ức chế PAX5 bởi tăng cường mức độ biểu hiện của hai yếu tố phiên mã là PRDI-BF và BLIMP1 [23]

Điều hòa biểu hiện chuỗi J

Ở người, chuỗi J là tính chất đặc trưng của tế bào plasma không phụ thuộc vào tế bào đó tạo ra lớp kháng thể nào, nhưng thông tin liên quan đến cơ chế điều hòa biểu hiện của chuỗi J thì chưa được rõ Polypeptide này sẽ bị phân giải trong tế bào chất của tế bào plasma sản xuất IgG hay IgD bởi vì nó chỉ được tiết ra khỏi tế bào khi sẽ liên kết với kháng thể lớp IgA hay IgM Mô hình điều hòa dưới đây cũng là từ những nghiên cứu ở chuột

Các yếu tố điều khiển được định rõ đặc điểm và có liên quan đến điều hòa biểu hiện chuỗi J là JA, JB, JC và JE, với các yếu tố phiên mã B-MEF2, PU.1, và USF-1 có hoạt động tăng cường đối với quá trình phiên mã và lần lượt gắn với yếu tố JA, JB và

JE [23] BASP gắn trên yếu tố JC kìm hãm hoạt động phiên mã bằng cách ngăn cản yếu tố kích hoạt là USF-1 và B-MEF2 gắn vào promoter phiên mã PU.1 cũng tham gia cùng BASP ức chế biểu hiện chuỗi J bằng cách kết hợp với một yếu tố nữa là Groucho-4 (Hình 1.8) Như vừa nhắc đến ở trên, sự kết thúc biệt hóa tế bào B cần có yếu tố ức chế BASP là BLIMP1 sẽ gắn vào vị trí promoter của đoạn gen tổng hợp

BASP là gen pax-5, cùng lúc đó thì tác dụng ức chế của BASP trên sự biểu hiện chuỗi

J cũng được gỡ bỏ

Hình 1 8: Các yếu tố điều hòa biểu hiện chuỗi J ở chuột [23]

Ở chuột, sự biểu hiện chuỗi J chỉ được khởi đầu ở giai đoạn cuối cùng của quá trình biệt hóa tế bào B, trong khi đó ở người sự phiên mã lại diễn ra ở pha sớm của quá trình phát triển của tế bào B Các vị trí gắn của BASP, USF, PU.1, và B-MEF2 đều được bảo tồn trên promoter ở người, nhưng chức năng hoạt động điều hòa của các yếu

tố này chưa được đào sâu nghiên cứu

1.3.5 Chức năng hoạt động của các lớp kháng thể ở mô niêm mạc

Phối hợp với những cơ chế phòng ngự của hệ miễn dịch bẩm sinh ở niêm mạc, kháng thể tiết thực hiện vai trò chính yếu trong việc duy trì hàng rào này, loại trừ kháng nguyên xâm nhiễm, trong đó SIgA đóng vai trò quan trọng nhất, với tính chất là một phân tử có cấu trúc liên kết bền vững, duy trì được hoạt tính kháng thể trong môi trường khắc nghiệt ở khoang tiêu hóa SIgA có những tính chất và chức năng hoạt động sau [23]:

 Ở khoang ruột, SIgA bao phủ lấy hệ vi sinh vật cộng sinh nhưng không làm ngăn chặn sự phát triển của chúng, việc bao phủ như vậy với mục đích không cho vi sinh vật xâm nhập vào bên trong hàng rào biểu mô, hay tăng sinh quá mạnh, và giúp duy trì mối quan hệ cộng sinh giữa vi sinh vật đường ruột và vật chủ

 SIgA có thể lợi dụng một số thụ thể trên trên tế bào M để tế bào này vận chuyển phức hợp kháng nguyên liên kết SIgA vào trình diện với tế bào DC để thực hiện Cơ chế này thường thấy ở trẻ sơ sinh được nuôi bằng sữa mẹ, ở giai đoạn này hệ thống mô niêm mạc ở trẻ chưa phát triển nên phải nhờ kháng thể tiết SIgA từ sữa mẹ như một chất truyền tín hiệu gây đáp ứng miễn dịch cho trẻ

 SIgA có chức năng ngưng kết kháng nguyên vi khuẩn, bất họa các enzyme của

vi khuẩn, cũng như trung hòa virus, hoạt động này thường hiệu quả khi kháng thể ở dạng polymer và dimer như SIgA Trong một thí nghiệm, SIgA còn cho thấy khả năng khóa chặt sự xâm nhiễm của HIV [23]

 SIgA có thể tăng cường sự bám dính của vi khuẩn hay một số phân tử kháng nguyên vào dịch nhầy trên bề mặt niêm mạc, nhờ vào đặc tính hoạt động tốt trong môi trường dịch nhầy của mảnh tiết SC Điều này ngăn chặn sự di chuyển và lan rộng của

vi khuẩn

 Một số cơ chế giả thuyết khác cho hoạt động của SIgA là đẩy mạnh hình thành

“biofilm’, cảm ứng làm mất đi plasmid của vi khuẩn mã hóa cho các phân tử bám dính hay khả năng kháng kháng sinh, gây trở ngại cho vi sinh vật bằng cách tác động vào các yếu tố tăng trưởng (ví dụ như nguyên tố sắt…), enzyme cần thiết cho hoạt động sinh trưởng, hay tăng cường tác động kháng khuẩn của lactoferrin, hệ thống peroxidase…

 Qua thí nghiệm trên nuôi cấy mô và động vật, kháng thể tiết còn được giả thuyết khả năng loại trử và ngăn chặn sự xâm nhiễm không chỉ tại bề mặt biểu mô pIgA và IgM có thể bất hoạt virus đã xâm nhiễm vào bên trong lớp biểu mô trong quá trình vận chuyển xuyên bào bởi trung gian thụ thể pIgRvà mang mầm bệnh ra ngược trở lại bề mặt biểu mô, chính vì thế tránh được tác động của tính chất độc tế bào làm tồn thương tế bào biểu mô pIgA còn được cho rằng có thể loại bỏ kháng nguyên ở laminapropria và trung hòa nội độc tố LPS (lipopolysaccharide) của vi khuẩn bên trong tế bào biểu mô

 Một số thụ thể cho IgA được biểu hiện trên các tế bào bạch cầu ví dụ như bạch cầu đơn nhân, bạch cầu hạt cụ thể là bạch cầu trung tính SC dạng liên kết với kháng thể có thể tương tác và kích hoạt bạch cầu ưa acid Bên cạnh đó, SC dạng tự do có thể ngăn cản sự kích hoạt bạch cầu ưa kiềm (là bạch cầu liên quan đến các phản ứng viêm) bằng cách liên kết và ngăn cản sự hoạt động của các cytokine hay chemokine gây phản ứng viêm như IL-8

Bên cạnh IgA là kháng thể chiếm ưu thế về mặt số lượng và có chức năng hoạt động chính yếu, thì ở vùng niêm mạc còn có sự đóng góp không nhỏ của các lớp kháng thể khác như IgM (dạng pentamer) và IgG với một số chức năng sau [23]:

 SIgM đóng góp vào chức năng bảo vệ đặc biệt ở động vật sơ sinh hay những đối tượng thiếu sự hoạt động của IgA Như đã giới thiệu, do thiếu sự liên kết hóa trị với mảnh tiết SC mà chỉ tương tác với phân tử SC tự do nên SIgM không hoạt động tốt trong môi trường dịch nhầy trên bề mặt biểu mô khoang tiêu hóa hay ở các hệ thống niêm mạc khác

 IgG ở mô niêm mạc có nguồn gốc chủ yếu từ huyết thanh, một lượng nhỏ được sản xuất bởi tế bào plasma ở mô niêm mạc, IgG có hoạt tính độc tế bào rất cao, có khả năng hoạt hóa bổ thể để tiêu diệt đối tượng xâm nhiễm hay tế bào bị xâm nhiễm do đó ảnh hưởng đến tính cân bằng của hàng rào biểu mô Nhưng sự mất cân bằng có thể được kháng cự lại bời đặc tính kháng viêm của IgA và một số cơ chế điều hòa khác của biểu mô niêm mạc

 Một đặc điểm đáng chú ý là SIgA cần thiết cho việc ngăn chặn sự xâm nhập của virus, nhưng kháng thể huyết thanh IgG mới có chức năng trung hòa và loại trừ virus bảo vệ cơ thể chống lại bệnh [23] Chính vì thế, để đối mặt với hầu hết sự xâm nhiễm, điều quan trong là phải chủng ngừa sao cho cảm ứng được sự đáp ứng của kháng thể tiết và kháng thể huyết thanh

1.4 Tế bào M: nguồn gốc, hình thái, vai trò đối với miễn dịch niêm mạc và sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh

1.4.1 Nguồn gốc và sự hình thành tế bào M

Nhắc lại hình thái học của mảng Payer (PP), PP được phân chia thành ba vùng bao gồm khu vực nang (follicular area), vùng xung quanh nang (parafollicular area) và lớp biểu mô che chở, nằm trên, phân cách PP với môi trường dịch tiêu hóa trong đường ruột được gọi là biểu mô tương tác nang lympho (follicular-associated epithelium, FAE) Khu vực nang lympho và vùng xung quanh tạo thành hệ thống nang lympho, trong đó có trung tâm mầm (germinal centre) là khu vực tập trung của tế bào

B tăng sinh, tế bào tua FDC và đại thực bào Xung quanh nang cũng được tập trung nhiều tế bào lympho biểu hiện IgM và IgD, cấu trúc vòm phía trên nang chứa B và T

lympho, DCs và đại thực bào Tế bào M nằm ở vị trí lớp tế bào biểu mô che chở nang, đây là một lớp dày chỉ gồm một lớp tế bào gồm có những tế bào biểu mô ruột (enterocyte) và tế bào biểu mô chuyên biệt gọi là tế bào M Khi nghiên cứu chức năng hoạt động của PP vào năm 1922, Kenzaburo Kumagai nhận thấy sự hấp thu

Mycobacterium tuberculosis ở lớp biểu mô cấu trúc dạng vòm, bên cạnh những quan

sát về sự tiếp nhận những vi khuẩn đã bị chết (heat-killed bacteria), tế bào hồng cầu cừu của PP Khi đó ông kết luận rằng sự tiếp nhận nói trên là một quá trình không định hướng, do nhiều hạn chế về phương tiện hỗ trợ kỹ thuật [30] Năm 1965, tế bào M được xác định lần đầu tiên ở ruột thừa thỏ bởi J.F Schmedtje, nhưng lúc đó lại được gọi là tế bào lympho biểu mô (lymphoepithelial cells) Đến năm 1972, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích siêu cấu trúc, khả năng tiếp nhận kháng nguyên của tế bào

M được khám phá năm 1974 bởi Owen & Jones bằng kính hiển vi điện tử khi nghiên cứu PP ở ruột non người và phát hiện ra cấu trúc “microfold” trên bề mặt ngoài niêm mạc của một vài tế bào biểu mô [30]

Nguồn gốc của tế bào M nằm trong FAE vẫn chưa rõ ràng và là nội dung đang được tranh luận Tế bào biểu mộ ruột trong FAE có nguồn gốc từ những tế bào gốc nằm trong những hốc xen giữa lông nhung và cấu trúc vòm của PP Mỗi hốc là nơi trú

ẩn của nhiều tế bào gốc mà từ những tế bào này sẽ hình thành nên nhiều loại tế bào thực hiện chức năng khác nhau ở biểu mô ruột, có hai hướng di chuyển và biệt hóa của

tế bào gốc Tế bào nằm về phía cấu trúc dạng cột của lông nhung sẽ biệt hóa thành tế bào hấp thu (absorptive enterocyte) với chức năng hấp thu các chất dinh dưỡng đã được phân giải từ thức ăn, tế bào goblet (goblet cell) với chức năng tiết ra dịch nhầy bảo vệ thành ruột khỏi tác động của dịch tiêu hóa cũng như hạn chế sự di chuyển, xâm nhập của vi sinh vật, và tế bào tiết [30] Các tế bào thực hiện chức năng chính là chức năng tiêu hóa này sẽ di chuyển hướng lên theo cấu trúc cột dọc theo lông nhung Khi

di chuyển lên tới đỉnh lông nhung, tế bào đang biệt hóa sẽ đi vào giai đoạn thoái hóa được lập trình sẵn và được tách ra khỏi biểu mô vào môi trường ruột Tế bào gốc nằm

về phía FAE sẽ di chuyển theo cấu trúc vòm và biệt hóa thành tế bào hấp thu và tế bào

M (Hình 1.9) [30]

Theo giả thiết tế bào M và các loại tế bào biểu mô tham gia tiêu hóa ở ruột xuất phát từ cùng một tế bào tiền thân, một câu hỏi được đặt ra là việc tế bào gốc trong hốc biệt hóa trực tiếp thành tế bào M hay có những yếu tố tác động lên tế bào biểu mô tham gia tiêu hóa cảm ứng sự biệt hóa tế bào này thành tế bào M vẫn còn chưa được minh chứng Một số giả thiết khác lại đề cập đến vai trò của các tế bào lympho trong

sự hình thành tế bào M từ các tế bào biểu mô ruột Giả thiết này cho rằng các tế bào lympho tiến tới khoảng giữa những tế bào biểu mô, hình thành nên “cái túi” (pocket) chứa các tế bào lympho này Điều này dẫn đến sự rối loạn trong chức năng của lông tơ (microvilli), làm thay đổi tính chất và đặc điểm của tế bào biểu mô, khiến các tế bào này biệt hóa thành tế bào M, và trên thực tế cũng quan sát được tế bào M có “cái túi”

chứa nhiều tế bào lympho [30] Nhưng giả thiết này bị bác bỏ do những nghiên cứu in vitro và in vivo đều không chứng minh được vai trò của tế bào lympho Đến năm 1999,

phương pháp mô hóa học (histochemistry) và kỹ thuật phân tích siêu cấu trúc được kết hợp để phân tích sự phát triển của tế bào biểu mô ở mảng Payer và tìm tế bào tiền thân của tế bào M Nghiên cứu này cho thấy tế bào M được hình thành từ những tế bào gốc nằm trong hốc, và những hốc này có tính chất và đặc điểm riêng biệt khác với những hốc khác, đồng thời việc phát hiện tế bào tiền thân của tế bào M bằng phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng định hướng tế bào M đã ủng hộ cho giả thuyế tế bào M xuất phát từ một dòng tế bào khác biệt [30]

Hình 1 9: Vị trí tế bào M trong cấu trúc biểu mô liên kết nang lympho (FAE) ở mảng Payer

[30]

1.4.2 Đặc điểm hình thái của tế bào M

So sánh với các loại tế bào hấp thu hay tế bào tiết ở ruột thì tế bào M có đặc điểm rất khác biệt về hình thái học Tế bào M được chia thành hai bề mặt, một tiếp xúc với lumen (khoảng không trong một bộ phận hình ống cụ thể là dạ dày ruột) gọi là “mặt apical”, mặt còn lại hướng vào trong các mô, tổ chức niêm mạc cụ thể ngay bên dưới

tế bào M là vùng lân cận các nang lympho gọi là “mặt basolateral” (Hình 9)

Ở mặt tiếp xúc với không gian trong khoang dạ dày, ruột, tế bào M đặc trưng bởi tổ chức vi lông rất thưa thớt với những vi lông ngắn và phân bố không đều trên diện tích

bề mặt, điều này hoàn toàn trái ngược với tổ chức vi lông của các tế bào biểu mô khác

ở ruột với hệ thống vi lông dày đặc và đồng nhất Dựa vào đặc tính này mà tế bào M

có thể được phát hiện với phương pháp nhuộm bằng kháng thể đối với protein của cấu trúc vi lông là actin và villin, tế bào M được xác định bởi không bắt màu nhuộm do cấu trúc vi lông quá ngắn và phân bố không đều [30] Tế bào hấp thu thường có bề mặt tạo ra bởi 0.3µm bề dày của lớp mucinpolysaccharides và glycocalyx (glycoprotein ngoại bào), ở tế bào M thì ngược lại bề dày của lớp này rất mỏng, được xem như một

tính chất giúp tế bào M dễ dàng cho phép kháng nguyên xâm nhập Ngoài ra, tế bào M không có một số glycoprotein bề mặt như alkaline phosphatase và sucrose-isomaltase,

cả hai được sử dụng như đánh dấu âm tính để phát hiện ra tế bào M [30]

Ở mặt bên dưới tiếp xúc với mô niêm mạc, tế bào M sỡ hữu đặc tính độc nhất của

tế bào biểu mô là tạo ra một không gian lõm vào như cái bao hay cái túi (pocket) Trong túi này chứa các tế bào lympho B và T, đại thực bào cũng như tế bào tua DCs Cái túi này tạo ra một vị trí thuận lợi cho các tế bào lympho hay các tế bào trình diện kháng nguyên APCs áp sát vào tế bào M, rút ngắn khoảng cách trong việc vận chuyển kháng nguyên từ “apical” tới “basolateral” theo con đường vận chuyển thông qua bóng màng Bề mặt dưới của tế bào M được chia thành hai vùng: vùng bên liên quan đến các phân tử đính tế bào với tế bào và chứa các Na+-K+-ATPase; vùng dưới có chức năng tương tác với hệ thống các tế bào lympho và vùng lamina propria [30]

Hiện nay, để phát hiện ra tế bào M đòi hỏi rất nhiều nghiên cứu nữa được thực hiện, do đặc điểm của tế bào M thể hiện rất đa dạng, trong cùng một FAEs thì các tế bào M đã có những tính chất để phát hiện khác nhau (cụ thể là tính chất glycosyl hóa các phân tử glycoprotein trên bề mặt), và sự khác nhau còn thể hiện ở tế bào M ở các

vị trí khác nhau, ở các loài động vật khác nhau Mặc dù nghiên cứu về các phân tử kết dính (adhesion molecules) và glycoprotein trên bề mặt còn hạn chế, nhưng tế bào M được chứng minh là có sự đa dạng và khác biệt so với sự glycosyl hóa ở các tế bào lân cận Lectins đã và đang được nghiên cứu để định tính kiểu glycosyl hóa cũng như nhận dạng tế bào M, vị trí bám của lectin là trên các loại màng sinh chất bao gồm màng ở mặt dưới tế bào M, khoang trống và những bóng màng [30]

1.4.3 Chức năng của tế bào M

Sự thưa thớt và phân bố không đều của hệ thống vi lông, cộng với thiếu sự hoạt động của các enzyme trên bề mặt “apical” cho thấy rằng nhiệm vụ chính của tế bào M

có thể không phải là tiêu hóa thức ăn hay hấp thu chất dinh dưỡng Trong khi đó, những tính chất của bề mặt “apical” thể hiện rằng nhiệm vụ chính yếu của tế bào M là vận chuyển xuyên tế bào biểu mô (trans-epithelial transport) Tế bào M vận chuyển vật chất từ lumen của ruột đi qua hàng rào biểu mô và tới các tế bào miễn dịch nằm bên dưới là nơi đáp ứng miễn dịch được khởi động Tế bào M được cho là có khả năng vận chuyển các phân tử nhỏ như “latex bead”, phân tử có mạch carbon ngắn, liposome hay những đại phân tử như ferritin, horseradish peroxidase, tiểu đơn vị kháng nguyên của

vi khuần V cholera, lectin, và kháng thể kháng virus Tế bào M còn vận chuyển được

các vi sinh vật gồm Vibrio cholera và S typhimurium in vitro [30]

Quá trình vận chuyển diễn ra qua ba bước Đầu tiên, cơ chất được đưa vào trong tế bào nhờ cơ chế thực bào diễn ra tren bề mặt “apical”, tiếp theo và sự vận chuyển thông qua các bóng màng di chuyển tới mặt dưới tế bào M, cuối cùng là sự xuất bào tại vị trí màng của bề mặt “basolateral” [30] Sự vận chuyển trung gian qua tế bào M diễn ra rất

nhanh và hiệu quả, với điều kiện tế bào chất phía trên “pocket” tạo thành một eo hẹp thì quá trình thực bào và xuất bào chỉ diễn ra trong 10 phút [30] Cơ chế tế bào M tiếp nhận vi sinh vật hay những phân tử rất đa dạng tùy theo bản chất của vật chất mà tế bào M tiếp nhận như kích thước, pH bề mặt, tích điện bề mặt, tính chất tương tác với nước, nống độ cơ chất và sự có mặt hay không của thụ thể định hướng tế bào M trên vi sinh vật đó Thí dụ, các đại phân tử hay vi sinh vật được tiếp nhận bằng hiện tượng thực bào nhờ có tương tác với màng tế bào M làm rối loạn và tái sắp xếp lại bộ khung actin (actin cytoskeleton), hay virus và các phân tử có tính chất bám dính thì được thực bào thông qua bóng màng bao phủ bởi clathrin (Clathrin-coated vesicles), hay những chất không có tính bám dính và hòa tan được thu nhận qua cơ chế ẩm bào (pinocytosis) [30]

Bên cạnh chức năng vận chuyển kháng nguyên, tế bào M còn được phát hiện với một số bằng chứng chứng minh có vai trò trong việc trình diện kháng nguyên theo phương thức MHC lớp II, nhưng kháng nguyên đi qua tế bào M không bị biến đổi về cấu trúc do tế bào M thiếu hệ thống những enzyme chuyên biệt có mặt ở tế bào APC

Và, tế bào M còn tham gia trong việc sản xuất các tín hiệu kích thích sự tăng sinh tế bào lympho B, T hỗ trợ đáp ứng miễn dịch, việc phát ra tín hiệu này khi tế bào M vận chuyển kháng nguyên Ví dụ, tế bào M tách từ biểu mô của thỏ được chứng minh có

thể tiết IL-1 in vitro khi được kích thích bởi lipopolysaccharide, dịch nuôi cấy tế bào

kích thích sự tăng sinh của tế bào T [30]

1.4.4 Sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh thông qua tế bào M

Mặc dù tại cửa ngõ tế bào M đã có hàng rào bảo vệ chống lại sự xâm nhập của các

vi sinh vật sống, nhưng vị trí này lại được xem là điểm yếu của hàng rào niêm mạc bởi

tế do đặc điểm vận chuyển kháng nguyên qua nhiều cơ chế định hướng hoặc không định hướng mà tế bào M có thể bị lợi dụng bởi các vi khuẩn hay virus như một phương tiện để xâm nhập vào cơ thể Việc tìm hiểu về cơ chế vi sinh vật sống vượt qua hàng rào niêm mạc thông qua tế bào M tấn công vào cơ thể có thể hỗ trợ cho việc chữa bệnh cũng như hướng đi tốt nhất cho việc thiết kế vaccine trong vấn đề phòng bệnh

Salmonella spp Là đối tượng gây bệnh được nghiên cứu nhiều nhất trong việc

xâm nhập bằng con đường tế bào M Salmonella typhimurium thể hiện tính chọn lọc

mục tiêu hướng tới tế bào M nằm trên mảng Payer (PP), có thể cảm ứng sự tiếp nhận,

đi kèm với việc làm xáo trộn mạnh và làm tổn thương FAE Sự kết dính và xâm chiếm

tế bào M gây ra sự rối loạn hoạt động trên màng và polymer hóa actin, dẫn đến tế bào

vi khuẩn được “nuốt” vào trong, tạo nên hoạt tính độc tế bào của tế bào M cũng như tổn thương FAE Sự tổn thương của FAE có khả năng cho phép sự xâm nhập không hạn chế của vi khuẩn và có thể giải thích tại sao ở bệnh nhân có xuất hiện vết loét hay vết thủng Sự xáo trộn FAE có thể quan sát rõ ở thời điểm sau 30 phút chuột bị nhiễm

với S typhimurium, nhưng lớp các tế bào hấp thu khác vẫn giữ nguyên tính ổn định,

chưa bị ảnh hưởng Sau 90 phút, sự thay đổi trên màng tế bào M được quan sát thì thấy hầu hết màng tế bào M đều bị phá hủy tạo ra những lỗ thủng trên hàng rào lớp biểu

mô, cho phép sự xâm nhập tràn lan của vi sinh vật tấn công vào các mô, cơ quan bên trong trước khi đáp ứng miễn dịch của cơ thể được tạo ra Đoạn gen mã hóa phục vụ

cho cơ chế xâm nhập tế bào M nằm trên SPI1 (Salmonella pathogenicity island 1) Tuy nhiên, đột biến trên SPI1 vẫn giữ đặc tính xâm nhập của Samonella nhưng không gây

ra tính độc tế bào cũng như không phá hủy lớp FAE S typhmurium biểu hiện một số operon (fimbrial operons) bao gồm fim, lpf, và pef, gián tiến bám trên những tế bào biểu mô khác nhau, operon lpf dường như chịu trách nhiệm định hướng bám dính trên

tế bào M, đột biến trên lpfC làm giảm khả năng chiếm cứ mảng PP của vi sinh vật, giảm khả năng phá hủy tế bào M Sau khi di chuyển qua lớp biểu mô và FAE, Samonella được thực bào bởi tế bào DC và đại thực bào, chúng có thể sống sót trong

bóng màng nhờ bô máy di truyền mã háo cơ chế bảo vệ nằm trên SPI2 [30]

Virus: một số virus được vận chuyển bởi tế bào M như reovirus type-1, poliovirus

và HIV type-1 (HIV-1) bằng cách gắn đặc hiệu Reovirus là một họ virus gây bệnh truyền nhiễm qua đường tiêu hóa ở chuột có ảnh hưởng đến hệ thần kinh Reovirus type-1 bám lên tế bào M ở hồi tràng và trực tràng nhờ vào protein vỏ ngoài capsid của

nó Sự bám dính bắt đầu bằng việc protein vỏ ngoài bị phân giải, thụ thể cho reovirus

là phức hợp carbohydrate và sialic acid (α-2-3-linked sialic acid glycoconjugates) gắn với yếu tố haemaglutinin sigma 1 của virus Sự xâm nhiễm của reovirus dẫn đến tiêu diệt tế bào M khỏi FAE, ảnh hưởng đến đáp ứng kháng virus của cơ thể vật chủ, tuy nhiên, virus sẽ được xóa sổ chỉ trong 10 ngày bằng sự sản xuất kháng thể sIgA tiêu diệt virus Sự truyền nhiễm virus HIV-1 thông qua hậu môn, bao quy đầu, biểu mô niệu đạo, và âm đạo chiếm 80% trong các ca lây nhiễm AIDS, HIV-1 phải vượt qua được hàng rào niêm mạc ở hệ thống ruột hay ở cơ quan sinh dục thì mới xâm nhiễm vào tế bào T mang thụ thể CD4, tế bào M của FAE và tế bào biểu mô ở ruột hay nang lympho trong hạch hạnh nhân giữ vai trò chính đối với sự xâm nhiễm của tế bào M Sự xâm nhiễm được nghĩ rằng xảy ra khi hàng rào biểu mô bị tổn thương, nhưng cũng có nghiên cứu cho rằng mô niêm mạc nguyên vẹn cũng có thể bị tấn công bởi HIV-1 HIV-1 đã được chứng minh có thể bám trên tế bào M của FAE chứ không phải tế bào hấp thu trên hệ thống lông nhung hay của FAE ở thỏ và chuột, gần đây một số thụ thể

đã được phát hiện có liên quan đến hoạt động xâm nhập tế bào M của HIV-1 như thụ thể chemokine CXCR4, lactosyl cerebroside (là hai thụ thể biểu hiện trên bề mặt

“apical” của tế bào M) [30]

1.5 Dung nạp miễn dịch qua đường niêm mạc (Mucosal tolerance)

Dung nạp miễn dịch qua đường niêm mạc (Mucosal tolerance) được nghiên cứu chủ yếu ở niêm mạc khoang tiêu hóa và đường hô hấp, từ đó có 2 khái niệm là “Oral

tolerance” (OL) và “Nasal tolerance” (NL) Khái niệm “Oral tolerance” được mô tả là trạng thái của hệ miễn dịch trung tâm không đáp ứng hay đáp ứng ở mức rất thấp (hyporesponsiveness) ở lần gặp sau khi niêm mạc ở ruột đã tiếp xúc với kháng nguyên qua con đường thức ăn trước Hiện tượng trên được mô tả lần đầu tiên vào năm 1911 bởi Wells, khi ông nuôi chuột thí nghiệm với protein trứng và phát hiện cơ thể chúng

có thể ngăn chặn sự quá mẫn khi tiếp xúc với protein đó lần sau Năm 1946, Chase nuôi chuột với tác nhân gây kích ứng da là DNCB (dinitrochlorobenzene) và quan sát thấy mức độ phản ứng với DNCB trên da đã giảm đi Hơn thế nữa Nhiều nhà nghiên cứu khác cũng đã chứng minh rằng việc cho động vật ăn các protein như ovalbumin (OVA) hay tế bào hồng cầu cừu cũng đều không gây ra đáp ứng với những protein kháng nguyên trên khi tiêm chủng vào cơ thể ở lần sau, nhưng đặc biệt là cơ thể vẫn phản ứng bình thường với các kháng nguyên khác [15] Hiện tượng trên cũng đã được nhận thấy trên cơ thể người khi thử nghiệm với kháng nguyên là KLH (keyhole lipet hemocyanin) [15]

Dung nạp miễn dịch là đặc tính cơ bản của hệ thống miễn dịch tạo ra những cơ chế giúp cơ thể có những đáp ứng cần thiết và phân biệt giữa kháng nguyên bản thân hay không phải của bản thân (self-nonself discrimination) Nhờ vậy mà hệ miễn dịch có thể bảo vệ cơ thể chống lại mầm bệnh ngoại nhiễm (external pathogens) mà không gây

ra phản ứng tự miễn dịch Hiện nay, tuy cơ chế dung nạp vẫn chưa được nắm tường tận, nhưng con người đã có thể ứng dụng những hiểu biết nhất định về hiện tượng này

để điều trị các bệnh lý tự miễn

Cơ chế của dung nạp miễn dịch có thể được phân thành 2 cơ chê chính dựa vào cơ chế tác động của hiện tượng dung nạp lên sự cảm ứng tế bào T điều hòa (Treg) kích hoạt sự ức chế đáp ứng miễn dịch hay sự cảm ứng hiện tượng thoái hóa dòng (deletion) hay vô ứng dòng (anergy) Và yếu tố chính yếu định hướng cơ chế diễn tiến của sự dung nạp là liều lượng của kháng nguyên được đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa hay hô hấp [20]

 Với liều lượng thấp, tế bào Treg sẽ quyết định kết quả hiện tượng dung nạp bằng cách cảm ứng các dòng tế bào điều hòa đặc hiệu kháng nguyên (antigen-specific regulatory cells) sau khi được trình diện bởi tế bào APC, các tế bào này tiết ra các cytokine như TGF-β, IL-10, IL-4 Đồng thời, các tế bào T này di chuyển đến các cơ quan lympho để ức chế đáp ứng miễn dịch bằng cách ngăn chặn sự hình thành các tế bào hiệu lực; hay đến các cơ quan mục tiêu khác để ngăn cản sự phát triển của bệnh gây ra bởi kháng nguyên khác bằng cách tiết ra các cytokine không đặc hiệu bởi kháng nguyên mà các APC trình diện cho chính tế bào t đó Trường hợp thứ hai gọi là hiện tượng “bystander suppression”, tức là hiện tượng dung nạp miễn dịch mà tế bào Treg cảm ứng bởi kháng nguyên này có thể ức chế đáp ứng miễn dịch kích thích bởi một kháng nguyên khác, miễn là kháng nguyên tiếp nhận qua đường niêm mạc ở lần đầu hiện diện ở cả những mô, cơ quan hay cấu trúc lân cận [20]

 Với liều lượng kháng nguyên cao gây ra sự vô ứng hay thoái hóa dòng tế bào T đặc hiệu khi kháng nguyên đi xuyên qua hàng rào biểu mô và được trình diện bởi các

tế bào trình diện kháng nguyên ở ruột hay ở các cơ quan miễn dịch hệ thống

Sự thoái hóa hay vô ứng dòng:

Sự thoái hóa dòng là hiện tượng tế bào T bị chết, giảm nhanh số lượng nhận thấy

trong các thử nghiệm in vitro phụ thuộc vào liều lượng và tần số kháng nguyên được

tiếp nhận Giữa hai cơ chế của dung nạp là thoái hóa dòng và sự hình thành dòng tế bào Treg có mối liên hệ thú vị với nhau Như đã nhắc đến ở trên, sự cảm ứng dòng tế bào Treg được điều hòa bởi cytokine TGF-β, và TGF-β lại là sản phẩm của cơ chế thoái hóa dòng Xác tế bào T bị thoái hóa sẽ được xử lý bởi đại thực bào, hoạt đông này kết quả là tạo ra cytokine điều hòa TGF-β Hoặc bản thân tế bào t bị thoái hóa cũng tiết ra môi trường TGF-β ở cả hai dạng không hoạt động và hoạt động Chính sự xuất hiện của TGF-β trong môi trường do sự thoái hóa dòng dẫn đến sự cảm ứng dòng

tế bào Treg hoạt động [20]

Một cơ chế nữa giải thích cho vấn đề thiếu sự hoạt động chức năng của tế bào T nhưng không có sự xuất hiện của cơ chế điều hòa là hiện tượng vô ứng dòng Nên, vô ứng dòng có thể được định nghĩa là sự đáp ứng với cytokine điều hòa IL-2 khi không

có mặt dòng tế bào điều hòa, và là cơ chế dung nạp chính yếu khi kháng nguyên được tiếp nhận với liều lượng cao ở niêm mạc Tế bào vô ứng không có khả năng thực hiện chức năng miễn dịch như chức năng hỗ trợ hay độc tế bào, nhưng vẫn duy trì khả năng sản xuất ra một số cytokine như IL-4, IL-10 Bên cạnh đó, tế bào T CD4+ bị vô ứng có

thể biểu hiện tính chất và hoạt động của tế bào kìm hãm (suppressor cells) in vivo và in vitro nhờ một trong những cytokine như IL-4, IFN-γ, TGF-β [20]

Tế bào Treg và cơ chế kìm hãm:

Tế bào Treg lần đầu tiên được mô tả vào những năm 70 thế kỷ trước, khi đó các nhà khoa học xem dòng tế bào này thuộc về dòng tế bào mang thụ thể CD8+, và được gọi là tế bào T ức chế (suppressor T cells) Những nghiên cứu sau đó đưa ra một số nhận định mới về dòng tế bào T mang thụ thể CD4, CD25 hay FoxP3 Với từng đặc điểm cụ thể của từng dòng tế bào Treg mà cơ chế của hiện tượng dung nạp cả ở vị trí niêm mạc hay hiện tượng dung nạp xảy ra ở tuyến ức Treg có thể được phân chia thành 3 dòng tế bào chính là Tr1, Th3, và nTreg, 3 dòng tế bào này có liên quan đến cơ chế nội cân bằng và dung nạp miễn dịch ở niêm mạc đường tiêu hóa [25]

 Tr1 là dòng tế bào sản xuất IL-10 lần đầu tiên được mô tả trong nghiên cứu về tương tác hỗ trợ của IL-10 đến việc nuôi cấy và sinh trưởng của splenocyte Với sự hỗ trợ của các cytokine điều hòa , tế bào CD4+ có thể phát triển thành dòng tế bào đặc trưng CD4+CD25-Foxp3- với chức năng ức chế, kìm hãm đáp ứng miễn dịch của các tế

bào khác Mặc dù IL-10 là cytokine được sản xuất vượt trội bởi Tr1, nhưng cả TGF-β

và IL-10 đều là các cytokine ức chế hiệu quả, cản trở sự sản xuất cytokine từ các tế bào t đã được kích hoạt, ngăn chặn biểu hiện của những phân tử hoạt hóa (costimulator) trên các APC, và kìm hãm sự sản xuất kháng thể [25]

 Th3 là dòng tế bào T CD4+ sản xuất TGF-β đặc hiệu kháng nguyên, có nguồn gốc từ MLN ở đối tượng chuột thí nghiệm có hiện tượng dung nạp Tế bào Th3 được xem như là một thành phần của dòng tế bào T LAP+ (biểu hiện những đoạn peptide chưa có hoạt tính trên màng tế bào, latency associated peptide) có đặc tính ức chế đáp ứng miễn dịch rất hiệu quả, giúp duy trì trạng thái nội cân bằng Vì TGF-β có thể cảm ứng biểu hiện Foxp3, là một yếu tố đặc trưng của dòng tế bào T điều hòa, nên tế bào Th3 có khả năng tác động lên sự phát triển thành tế bào Treg của các tế bào lân cận, gọi là sự dung nạp lây nhiễm (infectious tolerance) [25] Ngoài ra, sự biểu hiện Foxp3 còn được cảm ứng bởi RA, nên cho thấy vai trò của nhóm các tế bào DC ở ruột (là những tế bào sản sinh RA) trong việc hình thành dòng tế bào Foxp3+ Treg

 nTreg phát triển ở tuyến ức, mang thụ thể CD4, CD25 và biểu hiện ở mức cao thụ thể Foxp3 Sự kìm hãm của nTreg tác động trên các tế bào hiệu lực thông qua một

số phân tử ức chế như CTLA-4 và các cytokine điều hòa như IL-10, TGF-β và IL-35 nTreg có nhiệm vụ duy trì tráng thái cân bằng của hệ miễn dịch trung ương, ngăn chặn bệnh lý tự miễn [25]

Cả 3 dòng tế bào Treg đều tham gia vào hoạt động ức chế miễn dịch của cơ chế dung nạp miễn dịch khi kháng nguyên tiếp xúc với niêm mạc đường tiêu hóa, nhưng

sự đóng góp khác nhau giữa các dòng tế bào và vai trò trong ổn định và duy trì sự dung nạp ở vị trí ngoài mô niêm mạc vẫn còn chưa được xác định Ngoài ra, các dòng

tế bào khác như CD8+, tế bào T TCRγδ, tế bào NKT… và đặc biệt là tế bào DC cũng

có vai trò trong cơ chế hoạt động của hiện tượng dung nạp Đặc biệt, “mucosal tolerance” dường như có thể kích hoạt toàn bộ các loại tế bào T điều hòa, điều này cho thấy con đường niêm mạc là phương thức trực tiếp và hiệu quả nhất để cảm ứng dung nạp ngoại vi (peripheral tolerance) [20]

Chương 2 Chất phụ trợ và hệ thống chuyển giao kháng nguyên ứng dụng trong vaccine theo đường niêm mạc

Vaccine niêm mạc hay sự tiêm chủng theo con đường niêm mạc là phương thức phòng chống bệnh bằng cách cho kháng nguyên vào cơ thể vật chủ thông qua đường miệng, hay được đặt trực tiếp trên bề mặt niêm mạc Với phương thức thực hiện như trên, nên kháng nguyên cũng như các hoạt chất trong vaccine đều phải đối mặt và vượt qua những điều kiện không thuận lợi giống như khi tác nhân gây bệnh muốn xâm nhập vào cơ thể vật chủ đó chính là hàng rào phòng ngự không đặc hiệu bao gồm: ảnh hưởng của các dịch tiết như dịch vị, dịch mật trong khoang tiêu hóa, sự cản trở của lớp dịch nhầy, sự tấn công của các enzyme protease hay nuclease, sự ngăn chặn và loại trừ của hàng rào biểu mô [20] Điều đó đòi hỏi cần phải sử dụng vaccine ở liều lượng cao,

và cũng cần phải xác định chính xác liều lượng thật sự vượt qua được hàng rào trên Đối với các protein kháng nguyên hòa tan truyền thống được sử dụng đơn lẻ thì việc được tiếp nhận thường ở mức rất thấp, hoạt tính kháng nguyên kém và chủ yếu gây ra hiện tượng dung nạp miễn dịch [1, 12]

Với những khó khăn trên, việc thiết kế vaccine niêm mạc cần phải được thực hiện với 4 mục tiêu chính sau: (i) bảo vệ được kháng nguyên khỏi sự tác động của môi trường niêm mạc, giữ nguyên được cấu trúc, hoạt tính; (ii) tăng cường sự tiếp nhận kháng nguyên bởi các tế bào biểu mô, hoặc để có hiệu quả cao hơn thì vaccine được thiết kế với mục đích định hướng nhắm vào tế bào M; (iii) vaccine cần phải kích hoạt được hệ thống miễn dịch bẩm sinh để có thể kích thích chính xác đáp ứng miễn dịch đặc hiệu thích hợp; (iiii) và quan trọng hơn hết và vaccine phải có hiệu quả cao, duy trì trong thời gian dài, việc này đòi hỏi vaccnine phải cảm ứng hình thành miễn dịch nhớ (immunological memory) [30] Để thực hiện được những mục tiêu trên phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ việc thiết kế kháng nguyên, chọn lựa vị trí tiêm chủng, đến việc kết hợp sử dụng chất phụ trợ (adjuvants) và các hệ thống chuyển giao vaccine (deliver systems)… Trong đó, hai yếu tố hỗ trợ góp phần to lớn đến hiệu quả tiêm chủng là sự phối hợp sử dụng chất phụ trợ và chọn lựa phương thức chuyển giao Trong nội dung của chương này sẽ đề cập đến hai vấn đề trên

2.1 Chất phụ trợ vaccine (Adjuvants)

2.1.1 Độc tố Cholera (Cholera toxin)

Cấu tạo độc tố Cholera (Cholera toxin, CT) gồm hai tiểu đơn vị A và B Tiểu đơn

vị A (CT-A) là phần mang độc tố, là một protein khối lượng 28 kDa, tham gia vào

phản ứng ribosyl hóa ADP của protein Gs trong phức hợp enzyme adenylate cyclase nằm trên màng ở bề mặt hướng vào các mô niêm mạc (basolateral surface) của các tế bào biểu mô ruột Tiểu đơn vị A sau khi dịch mã được cắt thành hai đơn vị nhỏ hơn là A1 và A2, trong đó A1 là phần mang hoạt tính của enzyme, A2 là chuỗi peptide dạng α-helix gắn kết A1 và tiểu đơn vị B Tiểu đơn vị B của độc tố Cholera (CT-B) là một pentamer đồng dạng gồm 5 tiểu đơn vị giống nhau tương tác với nhau bằng các liên kết phi hóa trị hình thành tiểu đơn vị B với kích thước 11.6 kDa tạo ra một cấu trúc dạng vòng với lỗ trung tâm là vị trí tiểu đơn vị A2 gắn xuyên qua để cố định 2 phần A

và B với nhau Tiểu đơn vị B có khả năng bám đặc hiệu trên GM1(monosialoganglioside) là phân tử biểu hiện trên màng của hầu hết các tế bào có nhân, bao gồm bề mặt của lớp tế bào biểu mô ruột, đây là mục tiêu tấn công khi độc tố xâm nhập vào cơ thể Độc tố Cholera được thực bào ở mặt tiếp xúc với khoang tiêu hóa bởi các tế bào hấp thu ở ruột và qua nhiều bước theo các bóng màng, độc tố được vận chuyển tế bề mặt bên dưới và tương tác với phức hợp adenylate cyclase Vị trí chính xác nơi xảy ra tương tác giữa A1 và phân tử Gs vẫn chưa được biết rõ Việc đưa độc tố Cholera vào bên trong tế bào theo cơ chế thực bào có thể xảy ra ở rất nhiều loại tế bào khác nhau kể cả các tế bào neuron thần kinh và các tế bào lympho, trong đó việc bám tiểu đơn vị B lên màng tế bào là bước cần thiết cho quá trình thực bào [14]

Trong vai trò là một kháng nguyên, độc tố Cholera được xem là một trong những

kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh nhất theo con đường niêm mạc, bao gồm đáp ứng kháng thể S-IgA rất mạnh, cộng với đáp ứng kháng thể IgG trong máu sau khi chủng ngừa theo đường miệng [14] Trái ngược với hầu hết kháng nguyên là protein, việc tiếp xúc với kháng nguyên là độc tố Cholera theo đường miệng hay đường niêm mạc nói chung không gây ra hiện tượng dung nạp miễn dịch (đối với đáp ứng kháng thể) Điều này được thể hiện trong một nghiên cứu về khả năng gây đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào và phản ứng quá mẫn muộn (DTH), kết quả cho thấy độc tố Cholera chủng ngừa theo đường miệng trước khi kháng nguyên thứ hai được đưa vào ở phương pháp tiêm chủng truyền thống thì ghi nhận được hiện tượng dung nạp đối với đáp ứng DTH của kháng nguyên thứ 2 nhưng không dung nạp đối với đáp ứng kháng thể do độc tố Cholera gây ra [27] Độc tố này còn có đặc điểm cảm ứng được đáp ứng miễn dịch nhớ khi được tiêm chủng ở nhiều vị trí niêm mạc khác nhau trong một số nghiên cứu Một số nghiên cứu khác nhấn mạnh khả năng gây đáp ứng mạnh của độc tố Cholera ở các vị trí khác nhau theo đường niêm mạc nhưng đáp ứng mạnh nhất tại vị trí độc tố trực tiếp được chủng ngừa [14] Những đặc điểm kháng nguyên của độc tố Cholera được tóm tắt bên dưới (Bảng 2.1) cho thấy độc tố Cholera

là một kháng nguyên mạnh, và những đặc điểm này được xem là có liên quan đến hoạt động như chất hỗ trợ hiệu quả cho vaccine niêm mạc