Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thương giác mạc

Mục tiêu của đềtài là: 1. Xây dựng qui trình nuôi cấy, nhận dạng tếbào gốc biểu mô vùng rìa giác mạc thỏtrên nền màng ối người, tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Ghép thành công tấm biểu mô nuôi cấy trên mắt thỏ. 2. Tạo tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy, phục vụghép tựthân cho một sốbệnh nhân tổn thương giác mạc. Mục tiêu cụthể: 1. Xây dựng qui trình thu nhận, xửlý và bảo quản màng ối người làm giá đỡcho tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy từtếbào gốc biểu mô vùng rìa. 2. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tếbào gốc BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi cấy. 3. Tạo mô hình thực nghiệm gây tổn thương khu trú giác mạc thỏ. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Xây dụng các tiêu chuẩn đánh giá về hiệu quảghép trên mắt thỏ. 4. Bước đầu tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy, ghép tựthân cho một số bệnh nhân tổn thương giác mạc. ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 3 1.1. Cấu trúc của bềmặt nhãn cầu [2].............................................................................. 3 1.1.1. Giác mạc............................................................................................................ 3 1.1.3. Kết mạc nhãn cầu............................................................................................... 4 1.1.3. Vùng rìa giác mạc và tếbào gốc vùng rìa giác mạc........................................ 5 1.1.4. Các yếu tốliên quan đảm bảo sựtoàn vẹn của BMNC [36]............................. 8 1.2. Màng ối và các phương pháp xửlý màng ối làm nền nuôi cấy........................................ 10 1.2.1. Màng ối............................................................................................................ 10 1.2.2. Chuẩn bịmàng ối làm nền nuôi cấy................................................................ 12 1.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từtếbào gốc vùng rìa giác mạc. .......................... 14 1.3.1. Chuẩn bịmẫu mô vùng rìa đểnuôi cấy........................................................... 14 1.3.2. Môi trường nuôi cấy........................................................................................ 15 1.3.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từtếbào gốc VRGM..................................... 16 1.3.4. Định danh tếbào của tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy.................................... 17 1.4. Điều trịtổn thương bềmặt nhãn cầu bằng phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. ......................................................................................................................... 17 1.4.1. Hội chứng suy giảm tếbào gốc VRGM [24, 42, 46, 48]................................ 17 1.4.2. Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm tếbào gốc VRGM...................... 18 1.4.3. Chẩn đoán xác định hội chứng suy giảm tếbào gốc VRGM........................... 19 1.4.4. Phân loại mức độtổn thương của hội chứng suy giảm tếbào gốc VRGM [17] .................................................................................................................................... 19 1.4.5. Phương pháp điều trịhội chứng suy giảm tếbào gốc VRGM bằng ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy......................................................................................... 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................ 23 2.2 Mô hình nghiên cứu ................................................................................................. 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 24 2.3.1. Xây dựng qui trình thu nhận, xửlý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy.............................................................................................................................. 24 2.3.2.Xây dựng qui trình trích thủvà xửlý mẫu vùng rìa giác mạc.......................... 25 2.3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy:........................................................................ 27 7 2.3.4. Ghép thực nghiệm trên thỏ.............................................................................. 27 2.3.5. Ghép trên bệnh nhân tình nguyện.................................................................... 30 2.4. Kỹthuật sửdụng trong nghiên cứu......................................................................... 33 2.5. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................... 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢNGHIÊN CỨU.......................................................................... 35 3.1.Xây dựng qui trình thu nhận, xửlý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 35 3.1.1. Lựa chọn màng ối............................................................................................ 35 3.1.2. Lựa chọn phương pháp xửlý màng ối:............................................................ 37 3.2. Lựa chọn phương pháp xửlý mảnh vùng rìa đểnuôi cấy....................................... 39 3.2.1. Mẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ được chuẩn bịcho nuôi cấy........................... 39 3.2.2. Diện tích phát triển của tấm BMVRGM nuôi cấy trên nền màng ối................ 40 3.2.4. Hình thái của tấm BMGM sau nuôi cấy.......................................................... 42 3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy:............................................................................... 44 3.4. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy............................................................................. 45 3.4.1. Tỷlệnuôi tạo thành công tấm biểu mô giác mạc (Bảng 3.3)......................... 45 3.4.2. Chất lượng của tấm biểu mô........................................................................... 45 3.5. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tếbào gốc BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tếbào của tấm BMVR nuôi cấy. ................................................................................................................................. 47 3.5.1. Cấu trúc vi thểcủa tấm biểu mô nuôi cấy....................................................... 48 3.5.2. Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy...................................................... 49 3.5.3. Cấu trúc hoá học của tấm biểu mô nuôi cấy................................................... 51 3.6. Mô hình gây bỏng cho thỏ. ..................................................................................... 52 3.7. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ........................................................ 53 3.8. Nuôi và ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện. .......................... 56 3.8.1. Đặc điểm tình hình bệnh nhân (Bảng 3.4)....................................................... 56 3.8.2. Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô (Bảng 3.5)..... 56 3.8.3. Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô (Bảng 3.6).................................................... 57 3.8.4. Kết quảphẫu thuật tại các thời điểm theo dõi (Bảng 3.7)............................... 57 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN................................................................................................. 61 KẾT LUẬN........................................................................................................................ 69 KIẾN NGHỊVÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP ............................................................. 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 7

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

-o0o -

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

nghiªn cøu nu«i cÊy tÕ bµo r×a gi¸c m¹c vµ øng dông trong ®iÒu trÞ mét sè tæn th−¬ng gi¸c m¹c

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Thị Bình

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Hà nội

8020

Hà Nội - 2009

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

o0o

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

nghiªn cøu nu«i cÊy tÕ bµo r×a gi¸c m¹c vµ øng dông trong ®iÒu trÞ mét sè tæn th−¬ng gi¸c m¹c

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Thị Bình

Thư ký đề tài : TS Nguyễn Khang Sơn

Cơ quan chủ trì đề tài:Trường Đại học Y Hà nội

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI

CỦA ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

1 Tên đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị

một số tổn thương giác mạc”

2 Chủ nhiệm đề tài : PGS TS Nguyễn Thị Bình

3 Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học Y Hà nội

4 Thời gian thực hiện : 8/2006- 8/2009

5 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 380 triệu đồng, trong đó kinh phí từ ngân sách là

380 triệu đồng

6 Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:

6.1.Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc: Đề tài đã hoàn thành đầy đủ

khối lượng các công việc đã đề ra trong đề cương : Gồm:

- Tấm màng ối người đã xử lý: 240 tấm

- Tấm biểu mô giác mạc thỏ nuôi cấy : 120 tấm

- Tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy:20 tấm

- Gây bỏng giác mạc cho thỏ: 32 thỏ

- Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ: 20 mắt

- Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện: 6 mắt

- Đã đăng 3 bài báo có nội dung liên quan đến đề tài ở Tạp chí Nghiên cứu Y học:

1 “Đánh giá phương pháp xử lý mẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ trong nuôi

cấy tạo tấm biểu mô giác mạc”; Tạp chí Nghiên cứu Y học, Supplement, Volume 62,

N 0 3- May , 2009

2 “Nghiên cứu quy trình tạo tấm màng ối làm nền nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa

giác mạc”; Tạp chí Nghiên cứu Y học, Volume 63,N04- June, 2009

3 “Nghiên cứu định danh tế bào tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy”; Tạp chí

Nghiên cứu Y học, Volume 64, N05- October, 2009

- Đào tạo :

+ 1 cao học chuyên ngành Mô –Phôi (BS Phạm Thị Nhung): Tên đề tài:

“Đánh giá hiệu quả xử lý mẫu mô vùng rìa sinh thiết trong tạo tấm biểu mô giác

mạc thỏ nuôi cấy”

+ 1 NCS chuyên ngành Nhãn khoa (ThS Vũ Thị Tuệ Khanh): Tên đề tài:

“Nghiên cứu phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc vùng rìa nuôi cấy điều trị

hội chứng suy giảm tế bào nguồn sau bỏng mắt do kiềm”

6.2 Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN: Đối chiếu với yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm

đặt ra trong đề cương, đề tài đã đạt đầy đủ:

- Tấm màng ối người đã xử lý: có kích thức 3x3 cm, vô khuẩn, dai và đàn hồi tốt, làm nền nuôi cấy mảnh mô vùng rìa tạo tấm biểu mô thành công, không bị phân hủy khi ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho thỏ và bệnh nhân

- Tấm biểu mô giác mạc thỏ và người nuôi cấy: có đầy đủ đặc điểm về cấu trúc hình thái và hóa học của biểu mô giác mạc: rộng 4cm2, là biểu mô lát tầng không sừng hóa gồm 4-5 hàng tế bào , các tế bào liên kết chặt chẽ với nhau bằng các mộng bào tương và thể liên kết, không có tế bào tiết nhày, bào tương chứa K3 và K12, sống và áp sát vào nhu mô của giác mạc khi ghép cho thỏ và cho người (thỏ: 3 tháng, người: 9 tháng)

- Gây bỏng giác mạc cho thỏ: Xây dựng thành công mô hình gây bỏng giác mạc thực nghiệm cho thỏ: phá hủy toàn bộ biểu mô giác mạc và vùng rìa giác mạc, tạo thành sẹo giác mạc

- Ghép thành công tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho 20 mắt thỏ : tấm biểu mô dán sát vào nhu mô giác mạc, các tế bào biểu mô có bào tương

và nhân bình thường

- Ghép thành công tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho 6 mắt bệnh nhân: tấm biểu

mô áp tốt, biểu mô bề mặt nhãn cầu nhẵn bóng, nhuộm biểu mô bề mặt nhãn cầu bằng fluorescein không thấy tổn thương, màng xơ mạch không phát triển, hiện tượng viêm trên

bề mặt nhãn cầu đã được giải quyết, các triệu chứng chủ quan của người bệnh được cải thiện đáng kể, thị lực sau phẫu thuật tăng từ 1 đến 3 dòng so với trước phẫu thuật

- Đội ngũ các nhà khoa học, các bác sĩ, y tá, kỹ thuật viên có kiến thức và tay nghề vững vàng trong nuôi cấy tấm biểu mô giác mạc và phẫu thuật ghép tấm biểu mô nuôi cấy

6.3 Về tiến độ thực hiện: Đề tài đã thực hiện đúng tiến độ đã đề ra (Mặc dù đề tài

được phê duyệt từ ngày 16/8/2006; tuy nhiên ngày 11/10/2006, đề tài mới được phân bổ kinh phí)

7 Về những đóng góp mới của đề tài:

Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn phẩm trong và ngoài nước đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có những điểm mới sau đây:

7.1 Về giải pháp khoa học - công nghệ: Đề tài đã xây dựng mô hình nghiên cứu

toàn diện và công phu Trước tiên, các nghiên cứu được tiến hành trên thực nghiệm Những kết quả thu được trên thực nghiệm sẽ là định hướng cho nghiên cứu trên bệnh nhân Thông qua nghiên cứu thực nghiệm, các bác sĩ, y tá kỹ thuật viên rút ra được nhiều kinh nghiệm cũng như rèn luyện được tay nghề trước khi tiến hành thử nghiệm tên bệnh nhân

7.2 Về phương pháp nghiên cứu: Kết hợp các kỹ thuật thông thường như: nhuộm

giemsa, nhuộm H.E với các kỹ thuật hiện đại như: hiển vi điện tử xuyên và quét, nhuộm hóa mô miễn dịch, nhuộm huỳnh quang

7.3 Những đóng góp mới khác: đây là công trình đầu tiên ở Việt nam đã nuôi cấy

và ghép thành công tấm biểu giác mạc nuôi cấy , mở ra một phương pháp hiện đại điều trị cho các bệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào nguồn giác mạc

8 Tình hình sử dụng kinh phí: Giải ngân đầy đủ, đúng tiến độ và đúng các quy định về

tài chính hiện hành, có bản xác nhận chi tiêu kèm theo

Hà nội, ngày 15 tháng10 năm 2009

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

PGS.TS Nguyễn Thị Bình

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2] 3

1.1.1 Giác mạc 3

1.1.3 Kết mạc nhãn cầu 4

1.1.3 Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc 5

1.1.4 Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36] 8

1.2 Màng ối và các phương pháp xử lý màng ối làm nền nuôi cấy 10

1.2.1 Màng ối 10

1.2.2 Chuẩn bị màng ối làm nền nuôi cấy 12

1.3 Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc 14

1.3.1 Chuẩn bị mẫu mô vùng rìa để nuôi cấy 14

1.3.2 Môi trường nuôi cấy 15

1.3.3 Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc VRGM 16

1.3.4 Định danh tế bào của tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 17

1.4 Điều trị tổn thương bề mặt nhãn cầu bằng phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 17

1.4.1 Hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [24, 42, 46, 48] 17

1.4.2 Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 18

1.4.3 Chẩn đoán xác định hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 19

1.4.4 Phân loại mức độ tổn thương của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [17] 19

1.4.5 Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM bằng ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Mô hình nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy 24

2.3.2.Xây dựng qui trình trích thủ và xử lý mẫu vùng rìa giác mạc 25

2.3.3 Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 27

2.3.4 Ghép thực nghiệm trên thỏ 27

2.3.5 Ghép trên bệnh nhân tình nguyện 30

2.4 Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 33

2.5 Địa điểm nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1.Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy 35 3.1.1 Lựa chọn màng ối 35

3.1.2 Lựa chọn phương pháp xử lý màng ối: 37

3.2 Lựa chọn phương pháp xử lý mảnh vùng rìa để nuôi cấy 39

3.2.1 Mẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ được chuẩn bị cho nuôi cấy 39

3.2.2 Diện tích phát triển của tấm BMVRGM nuôi cấy trên nền màng ối 40

3.2.4 Hình thái của tấm BMGM sau nuôi cấy 42

3.3 Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 44

3.4 Lựa chọn phương pháp nuôi cấy 45

3.4.1 Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô giác mạc (Bảng 3.3) 45

3.4.2 Chất lượng của tấm biểu mô 45

3.5 Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế bào gốc BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi cấy 47

3.5.1 Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy 48

3.5.2 Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy 49

3.5.3 Cấu trúc hoá học của tấm biểu mô nuôi cấy 51

3.6 Mô hình gây bỏng cho thỏ 52

3.7 Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ 53

3.8 Nuôi và ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện 56

3.8.1 Đặc điểm tình hình bệnh nhân (Bảng 3.4) 56

3.8.2 Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô (Bảng 3.5) 56

3.8.3 Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô (Bảng 3.6) 57

3.8.4 Kết quả phẫu thuật tại các thời điểm theo dõi (Bảng 3.7) 57

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 61

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.3 Cấu tạo màng rau thai người 10

Hình 2.1: Mô hình nghiên cứu 23

Hình 2.2: Bánh rau và màng rau 24

Hình 2.3: Mô hình nghiên cứu thực nghiệm 28

Hình 2.4: Phân nhóm thực nghiệm 29

Hình 3.1 Màng ối trên bề mặt bánh rau (H.E x 250) 35

Hình 3.2: Bề mặt màng ối người (giemsa, x 1000): 36

Hình 3.3: Màng ối cắt đứng dọc (HE x 800): 36

Hình 3.4 Màng ối không nạo biểu mô(H.E x 250) 37

Hình 3.5 Màng ối nạo biểu mô bằng cơ học(H.E x 250) 37

Hình 3.7 Tấm biểu mô nuôi trên màng ối còn biểu mô 38

Hình 3.8 Tấm biểu mô nuôi trên màng ối nạo biểu mô bằng cơ học 38

Hình 3.9 Tấm biểu mô nuôi trên màng ối nạo biểu mô bằng Ammonium 38

Hình 3.10: Mẫu mô vùng rìa không xử lý enzym (HE x250): 39

Hình 3.11: Mẫu mô vùng rìa được xử lí bằng dispase (HEx 250): 39

Hình 3.12:Biểu mô vùng rìa tái tạo sau 7 ngày trích thủ (HE x 250) 40

Hình 3.13: Sự phát triển và lan rộng của tấm BMGM nuôi cấy 41

Hình 3.14: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 4 (KHV soi nổi x 25): 42

Hình 3.15: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày (Giemsa x 200) 43

Hình 3.16: Tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày 43

Hình 3.17 Tấm biểu mô nuôi cấy 12 ngày, vùng đặt mảnh VRGM(H.E x 250) 43

Hình 3.18: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 16 ngày (Giemsa x 200) 44

Hình 3.19: Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (Nhuộm huỳnh quang x 250) 44

Hình 3.20 Nuôi cấy bằng dịch treo 4 ngày( Giemsa x 400) 46

Hình 3.22: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 3 46

Hình 3.21 Tấm biểu mô nuôi cấy bằng dịch treo 18 ngày (H.E x500) 47

Hình 3.23 Tấm biểu mô nuôi cấy bằng mảnh mô vùng rìa 16 ngày (H.E x500) 47

Hình 3.24 : Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (giemsa x250) 48

Hình 3.25 : Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (H.E x500) 49

Hình 3.26 Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy14 ngày (x5000) 49

Hình 3.27 Mặt dưới màng ối (x 10.000) 50

Hình 3.28: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x4000) 50

Hình 3.29: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x10.000) 50

Hình 3.30 Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (P.A.S x 1000) 51

Hình 3.31: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (K3x500) 51

Hình 3.32: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (K12x500) 51

Hình 3.33: Mắt thỏ trước bỏng 52

Hình 3.34: Mắt thỏ ngay sau khi gây bỏng 52

Hình 3.35: Mắt thỏ sau bỏng 1 tháng 52

Hình 3.36: Sau bỏng 7 ngày (H.E x 100) 53

Hình 3.37: Sau bỏng 15 ngày (H.E x100) 53

Hình 3.38: Sau bỏng 45 ngày (H.E x 100) 53

Hình 3.39: Mắt thỏ ngay sau ghép 53

Hình 3.40 Mắt thỏ sau ghép 7 ngày 54

Hình 3.41 Giác mạc thỏ sau ghép 7 ngày 54

Hình 3.42: Mắt thỏ sau ghép 15 ngày 54

Hình 3.43: Giác mạc thỏ sau ghép 15ngày 54

Hình 3.44 Mắt thỏ sau ghép 1 tháng 55

Hình 3.45: Giác mạc thỏ sau ghép 1 tháng 55

Hình 3.46: Mắt thỏ sau ghép 3 tháng 55

Hình 3.47: Giác mạc thỏ sau ghép 3 tháng 55

Hình 3.48: Mắt của bệnh nhân số 1 sau bỏng 3, 5 tháng 58

Hình 3.49: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 1 tuần, 2 tháng 59

Hình 3.50: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 6 tháng 59

Hình 3.51: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 8 tháng 60

DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Diện tích của tấm BMVRGM nuôi cấy theo thời gian 41

Bảng 3.2 : Lựa chọn môi trường nuôi cấy 44

Bảng 3.3: Tỉ lệ nuôi cấy thành công tấm biểu mô giác mạc 45

Bảng 3.4: Đặc điểm tình hình bệnh nhân trước phẫu thuật 56

Bảng 3.5: Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô 56

Bảng 3.6: Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô 57

Bảng 3.7: Kết quả phẫu thuật tại các thời điểm theo dõi 57

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tổn thương giác mạc là một bệnh lý thường gặp trong nhãn khoa Nguyên nhân gây tổn thương giác mạc rất khác nhau nhưng đều làm mất độ trong của giác mạc và gây giảm thị lực ở nhiều mức độ khác nhau Trong một số trường hợp, vùng rìa giác mạc - nơi cư trú của tế bào gốc biểu mô giác mạc cũng bị tổn thương, di chứng để lại cho bệnh nhân là hội chứng suy giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc Hậu quả của hội chứng này làm mất

độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt của giác mạc, loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát [12, 15, 34, 41, 46] Để điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc, các nhà nhãn khoa đã sử dụng các phương pháp khác nhau: Ghép kết mạc rìa tự thân, ghép giác - củng mạc rìa từ giác mạc

tử thi, ghép màng ối Kết quả điều trị khá tốt, đặc biệt với những trường hợp tổn thương một mắt Tuy nhiên với các kỹ thuật này, mảnh mô dùng để ghép lấy từ bên mắt lành hoặc từ mắt tử thi cần có một diện tích khá lớn hoặc cần toàn bộ giác mạc

Trong vài năm gần đây, y – sinh học hiện đại đã đạt được những thành tựu lớn trong việc đổi mới mô bằng ghép tế bào gốc Trong nhãn khoa, công nghệ tạo tấm biểu mô giác mạc từ việc nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc trên thực nghiệm và trên người đã có những thành công nhất định Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy mang lại hiệu quả tốt cho việc phục hồi cấu trúc

và chức năng của giác mạc

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trong nước, nhiều bệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cần được điều trị và với mong muốn đưa ra được một phương pháp hiện đại điều trị hội chứng này, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thương giác mạc”

Mục tiêu của đề tài là:

1 Xây dựng qui trình nuôi cấy, nhận dạng tế bào gốc biểu mô vùng rìa giác mạc thỏ trên nền màng ối người, tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy Ghép thành công tấm biểu mô nuôi cấy trên mắt thỏ

2 Tạo tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy, phục vụ ghép tự thân cho một số bệnh nhân tổn thương giác mạc

Mục tiêu cụ thể:

1 Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm giá

đỡ cho tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy từ tế bào gốc biểu mô vùng rìa

2 Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế bào gốc BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi cấy

3 Tạo mô hình thực nghiệm gây tổn thương khu trú giác mạc thỏ Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy Xây dụng các tiêu chuẩn đánh giá về hiệu quả ghép trên mắt thỏ

4 Bước đầu tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy, ghép tự thân cho một số bệnh nhân tổn thương giác mạc

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2]

Bề mặt nhãn cầu (BMNC) là vùng được giới hạn bởi hai đường xám của mi trên và mi dưới BMNC gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và được ngăn bởi biểu mô vùng rìa giác mạc (VRGM)

1.1.1 Giác mạc

Giác mạc chiếm 1/6 vỏ ngoài của nhãn cầu, hình hơi bầu dục, dày 0,8 – 0,9 mm ở vùng trung tâm và 11,7 mm ở chu biên Giác mạc là cấu trúc vô mạch, gồm 5 lớp: Biểu mô giác mạc, màng Bowman, chân bì giác mạc, màng Descemet và nội mô giác mạc (Hình 1.1)

Hình 1.1 Ảnh vi thể giác mạc bình thường ( H.E x 250)

1 Biểu mô trước giác mạc 2 Nhu mô

3 Màng Desmert 4 Nội mô giác mạc

• Biểu mô giác mạc: là biểu mô lát tầng không sừng hoá, gồm 4-6 hàng tế bào, chiếm khoảng 10% bề dày của giác mạc Biểu mô được chia thành 3 lớp: lớp đáy, lớp tế bào hình cánh, lớp bề mặt Các tế bào lớp đáy hình trụ có khả năng phân chia, các tế bào liên kết với nhau bằng thể liên kết và liên kết với màng đáy bằng thể bán liên kết, các tế bào được sinh ra sẽ phát triển lên phía trên Các

tế bào lớp giữa (tế bào hình cánh) có nhân tròn hoặc dài, các tế bào liên kết với nhau bằng thể liên kết và các mộng liên kết Các tế bào

bề mặt có hình đa diện dẹt, liên kết với nhau bằng vòng dính, dải bịt và thể liên kết, bề mặt tế bào có những vi nhung mao ngắn và được phủ bởi một lớp glycocalyx Lớp glycocalyx này liên kết với mucin của phim nước mắt giúp dàn đều làm phim nước mắt bền vững để bảo vệ sự toàn vẹn của BMNC Trong bào tương của các

tế bào biểu mô giác mạc có nhiều loại keratin khác nhau, tuy nhiên K3 và K12 được coi là những dấu ấn của những tế bào biểu mô giác mạc đã biệt hóa Đặc biệt K12 là dấu ấn tốt nhất và chỉ có ở những lớp trên đáy của biểu mô giác mạc

• Màng Bowman: Gồm màng đáy của biểu mô và màng Bowman chính thức Màng Bowman là lớp ngoài của chân bì giác mạc (nhu

mô giác mạc), gồm các sợi collagen xếp theo các hướng khác nhau Màng Bowman rất dai và là lớp bảo vệ quan trọng của nhãn cầu

• Chân bì giác mạc: Chiếm 90% bề dày giác mạc, gồm các sợi collagen chủ yếu là type I, III, ít collagen type IV và V Xen giữa các sợi và lá collagen là những tế bào sợi dẹt gọi là giác mạc bào (keratocyte) khoảng gian sợi và gian bào chứa chất căn bản giàu glycosaminoglycan

• Màng Descemet: Dày 5-10µm, là lá đáy được tạo ra từ chất tiết của nội mô giác mạc

• Nội mô giác mạc: Là biểu mô lát đơn gồm 1 hàng tế bào đa diện dẹt xếp đều đặn phủ mặt sau giác mạc Các tế bào nội mô giác mạc không có khả năng phân chia

1.1.3 Kết mạc nhãn cầu

Kết mạc trải từ vùng rìa củng mạc đến đường xám của bờ mi, được chia thành 3 phần: kết mạc mi, kết mạc cùng đồ và kết mạc nhãn cầu

Biểu mô kết mạc nhãn cầu là biểu mô trụ tầng Các tế bào liên kết với nhau lỏng lẻo, khoảng gian bào rộng Trong biểu mô có khoảng 5-10% tế bào hình đài tiết nhày Lớp đệm của kết mạc là mô liên kết thưa, chứa mạch máu, mạch bạch huyết và các loại tế bào: lympho, dưỡng bào, tương bào và bạch cầu đa nhân

1.1.3 Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc

* Tế bào gốc vùng rìa giác mạc:

Trong cơ thể người, biểu mô giác mạc luôn được đổi mới Các tế bào gốc vùng rìa phân chia và biệt hóa tế bào để bù lại về mặt số lượng và chất lượng các tế bào đã mất đi Tế bào gốc biểu mô giác mạc là các tế bào hình trụ, nằm ngay trên màng đáy của lớp biểu mô vùng rìa, có khả năng phân chia mạnh Từ cuối thập kỷ 80, sự tồn tại của tế bào gốc của biểu mô giác mạc tại vùng rìa củng giác mạc đã được nhiều nhà nhãn khoa trên thế giới

nêu ra và nghiên cứu chứng minh sự tồn tại đó bằng các phương pháp khác nhau Davanger và Evansen (1971) là những người đầu tiên mô tả đặc điểm của các tế bào biểu mô thuộc vùng rìa giác mạc [9] Sau đó, nhiều công trình nghiên cứu khoa học cơ bản đã được tiến hành chứng minh sự tồn tại của tế bào gốc giác mạc [11, [41], [42]

Với phương pháp đánh dấu tế bào bằng đồng vị phóng xạ, nhiều tác giả đã chứng minh hoạt động gián phân và biệt hoá tế bào xảy ra tại vùng rìa Mặt khác, tế bào biểu mô giác mạc chứa các lọai keratin khác nhau tuỳ theo mức độ biệt hoá của tế bào Sự có mặt của keratin K3 và keratin K12 chứng

tỏ mức độ biệt hoá cao của tế bào biểu mô giác mạc Các loại kêratin này không bao giờ thấy ở tế bào đáy thuộc vùng rìa Tính chất này phù hợp với tính chất của tế bào gốc Sự biểu mô hoá bắt đầu từ phía chu vi giác mạc, có

xu hướng về phía trung tâm giác mạc Bình thường, kiểu hình biểu mô giác mạc được duy trì nhờ sự cân bằng của những tế bào biểu mô bị bong ra trên

bề mặt và sự thay thế do gián phân của tế bào lớp đáy biểu mô và sự di cư về phía trung tâm giác mạc của những tế bào đáy được sinh ra từ những tế bào gốc trong vùng rìa giác mạc

Thoft và cộng sự đã có những công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại cùng các hoạt động phân chia của tế bào gốc BMGM bằng những

phương pháp nhuộm, đánh dấu phóng xạ, quan sát quá trình biểu mô hoá

Quá trình đổi mới của biểu mô bề mặt giác mạc tuân theo phương trình X +

Y = Z (Hình 1.2) Trong đó:X là sự tăng sinh tế bào từ dưới lên Y là sự di

chuyển tế bào từ chu biên vào Z là sự mất tế bào ở lớp nông [42], [43]

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình đổi mới tế bào bề mặt giác mạc

Tseng S C G và cộng sự đã ghép màng ối chia 2 nhóm: Một nhóm chỉ ghép màng ối đơn thuần, một nhóm kết hợp ghép vùng rìa dị thân trên 31 mắt, kết quả nghiên cứu cho thấy các trường hợp có ghép vùng rìa thì thị lực tăng và biểu mô hoá bề mặt nhãn cầu tốt hơn [48] Thành công của phẫu thuật ghép vùng rìa trên những bệnh nhân tổn thương bề mặt nhãn cầu nặng một lần nữa là bằng chứng cho sự tồn tại của tế bào gốc và vai trò quan trọng trong sự hàn gắn biểu mô bề mặt nhãn cầu

Hơn nữa, các mạch máu dưới kết mạc kết thúc và đổ vào đám rối mạch vùng rìa, đám rối mạch này có vai trò quan trọng cung cấp các chất dinh dưỡng và oxy cho quá trình gián phân của các tế bào gốc Những nghiên cứu quan sát trước kia cho thấy sự biểu mô hóa luôn xuất phát từ phía chu vi giác mạc và hướng về trung tâm Trong nghiên cứu thực nghiệm trên động vật không thể tạo tổn thương biểu mô vĩnh viễn nếu không phá hủy vùng rìa Hiện nay, việc phân biệt được tế bào gốc ở biểu mô vùng rìa vẫn là vấn đề khó khăn Nhưng sự tồn tại các tế bào có khả năng gián phân tại vùng rìa và

sự phân lập các loại Keratin từ các tế bào đó đã là một bằng chứng xác đáng Hơn thế, sự thành công của các phẫu thuật ghép biểu mô vùng rìa củng giác mạc và các phẫu thuật ghép tổ chức có nuôi cấy tế bào lấy từ vùng rìa đã chứng minh sự tồn tại của tế bào gốc biểu mô giác mạc người

Tế bào gốc giác mạc cùng lúc có thể biệt hóa theo hai con đường Con đường thứ nhất để bù lại về mặt số lượng tế bào biểu mô giác mạc, quá trình này bắt đầu bằng việc di chuyển hướng tâm và theo chiều ngang của các tế bào gốc Các tế bào này nhanh chóng tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào sau gián phân và di chuyển dần lên phía trên, cuối cùng biệt hóa thành tế bào trưởng thành và tróc ra ở bề mặt biểu mô giác mạc Liên tiếp nhiều quá trình gián phân, biệt hóa và tăng sinh của tế bào gốc sẽ làm đổi mới liên tục các lớp tế bào biểu mô giác mạc Con đường biệt hóa tế bào thứ hai của tế bào gốc đó là biệt hóa và tăng sinh tế bào theo chiều đứng ngay tại biểu mô vùng

rìa Các nhà nghiên cứu cho rằng con đường này đóng một vai trò quan trọng như một rào chắn để tách biệt biểu mô kết mạc và biểu mô giác mạc

Chức năng của các tế bào gốc ở vùng rìa đã được nhiều nhà nhãn khoa nghiên cứu và kết luận có 3 chức năng cơ bản: (1) Bù đắp về mặt số lượng tế bào biểu mô giác mạc; (2) Biệt hóa thành tế bào biểu mô giác mạc với chức năng và cấu trúc của tế bào biểu mô trưởng thành; (3) Ngăn chặn không cho biểu mô kết mạc xâm lấn lên bề mặt giác mạc

Tóm lại BMVR có chứa tế bào gốc của biểu mô giác mạc đã được nhiều công trình khoa học chứng minh Những tế bào đó đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình tái tạo sinh lý và trong quá trình tái tạo hồi phục sau tổn thương biểu mô giác mạc

1.1.4 Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36]

1.1.4.1 Mi mắt

Mi mắt có tác dụng bảo vệ BMNC khỏi các sang chấn về mặt cơ học

từ môi trường bên ngoài Quan trọng hơn nữa cấu trúc mềm mại của bờ tự do

mi mắt giúp cho sự dàn trải của phim nước mắt trên BMNC giúp cho BMNC luôn nhẵn bóng và đủ độ ẩm cần thiết Bệnh nhân bỏng mắt, bờ tự do của mi hay bị tổn thương ở nhiều mức độ khác nhau Nhẹ nhất có thể mất sự mềm mại của bờ tự do, nặng hơn có thể có biến dạng toàn bộ bờ mi gây nên hở mi, trễ mi Do đó, ảnh hưởng đến sự bền vững của phim nước mắt và gây ảnh hưởng đến sự toàn vẹn của BMNC

1.1.4.2 Màng phim nước mắt

Sự toàn vẹn của bề mặt nhãn cầu cũng được đảm bảo bởi mối quan hệ mật thiết giữa biểu mô bề mặt nhãn cầu và màng phim nước mắt Các rối loạn bề mặt nhãn cầu làm màng phim nước mắt kém bền vững và ngược lại, màng phim nước mắt kém bền vững sẽ góp phần làm các rối loạn bề mặt nhãn cầu nặng hơn Những tế bào hình đài thuộc bề mặt nhãn cầu tiết ra mucin, là thành phần quan trọng của màng phim nước mắt Hai đặc tính cơ

bản của biểu mô bề mặt nhãn cầu là biểu mô không sừng hoá và tiết mucin, đóng vai trò quan trọng để đảm bảo sự bền vững của màng phim nước mắt Mặt khác, bề mặt nhãn cầu được hỗ trợ bởi các thành phần có trong nước mắt như vitamin A, yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal Growth Factor-EGF), các yếu tố phát triển chuyển dạng ß1, ß2 (Transforming Growth Factor-TGF- ß1, ß2), yếu tố phát triển nguyên bào sợi (basic Fibroblast Growth Factor-FGFb)

1.1.4.3 Các tuyến lệ

Thành phần không kém quan trọng của màng phim nước mắt là nước mắt cùng các chất điện phân và các loại protein do tuyến lệ chính và tuyến lệ phụ tiết ra Nước mắt không những quan trọng về mặt chất lượng mà còn quan trọng cả về số lượng Trong các trường hợp bỏng mắt toàn bộ hệ thống tuyến lệ phụ đều bị tổn hại cùng với biểu mô bề mặt nhãn cầu, do đó màng phim nước mắt bị phá huỷ hoàn toàn, gây tình trạng khô mắt nặng nề

1.1.4.4 Sự toàn vẹn của hai cung phản xạ điều tiết nước mắt

Sự khởi phát hai cung phản xạ điều tiết nước mắt đều bắt nguồn từ những cảm giác của bề mặt nhãn cầu, gây ảnh hưởng tới quá trình điều tiết nước mắt và chớp mi mắt Trên những mắt bị bỏng, toàn bộ bề mặt nhãn cầu

bị tổn thương kèm theo các nhánh thần kinh cảm giác cho bề mặt nhãn cầu cũng bị tổn thương Do vậy, tình trạng khô mắt ngày càng nặng nề hơn do giảm sút trầm trọng về số lượng cũng như chất lượng nước mắt và tần số chớp mắt

1.1.4.5 Chức năng của tế bào biểu mô BMNC được hỗ trợ bởi nguyên

bào sợi nhu mô và chất cơ bản

Sự trong suốt của giác mạc phụ thuộc vào sự sắp xếp của các sợi collagen và sự đồng nhất về kích thước sợi cũng như khoảng cách giữa các sợi Trong quá trình hàn gắn biểu mô giác mạc, chất căn bản ngoại bào có chứa các thành phần như Fibronectin, enzym protease, các yếu tố phát triển

có vai trò quyết định trong sự kết dính và di chuyển trên bề mặt chân bì giác mạc của các tế bào biểu mô

1.2 Màng ối và các phương pháp xử lý màng ối làm nền nuôi cấy

1.2.1 Màng ối

Màng bọc thai gồm 3 màng liên kết với nhau: màng ối, màng đệm, màng rụng Màng ối là lớp trong cùng tiếp giáp với buồng ối và có độ dày khác nhau tuỳ theo vị trí

Màng ối gồm: Biểu mô, màng đáy và tiếp đến là tổ chức liên kết mỏng, không có mạch máu (Hình 1.3) [19]

Hình 1.3 Cấu tạo màng rau thai người

1 Biểu mô; 2 Màng đáy; 3 Lớp đặc;

4 Màng đệm nhẵn; 5 Màng rụng tử cung

Màng ối có nhiều đặc điểm vượt trội hơn so với các màng sinh học khác là: tính chun giãn, tính trong suốt, mềm mại, nhẵn bóng, mỏng, khó rách

Theo nghiên cứu của tác giả Fukuda K và cộng sự (1999), màng đáy của màng ối hoàn toàn giống với màng đáy của kết mạc vì có chứa collagen typ IV, V, fibronectin, laminin-1, laminin-5, vì thế màng ối được sử dụng để thay thế kết mạc [12] Các thành phần này đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hoá và sự tăng sinh của các tế bào biểu mô

Mặt khác, hiệu quả chống viêm và bảo vệ bề mặt nhãn cầu của màng

ối được giải thích qua sự có mặt nhiều loại cytokin chống viêm như interleukin-1α interleukin-1β

Màng ối có chức năng của một biểu mô phủ, là biểu mô chế tiết và có khả năng trao đổi chất qua đường tế bào và gian tế bào

Tế bào biểu mô màng ối có một số tính chất quan trọng là: Không biểu

lộ kháng nguyên HLA-A, B hoặc DR của β2 microglobulin trên bề mặt Vì vậy sau khi ghép vào cơ thể, hiện tượng thải loại miễn dịch không xảy ra

Qua nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy màng ối có 2 tác dụng khi cấy ghép trên kết mạc, đó là tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình biểu mô hoá và ngăn chặn quá trình viêm, tăng sinh xơ trên bề mặt nhãn cầu Bên cạnh đó, màng ối cung cấp màng cơ bản hỗ trợ sự di cư, kết dính của tế bào biểu mô, thúc đẩy sự biệt hoá tế bào, có khả năng thay thế màng cơ bản của kết mạc [20], [30], [33]

Màng ối còn có khả năng kháng khuẩn nên nguy cơ nhiễm trùng hậu phẫu ít hơn so với ghép các màng sinh học khác như niêm mạc má, niêm mạc miệng Việc bóc tách màng ối ra khỏi màng đệm rất dễ dàng, cùng với tính chun giãn tốt của màng ối tạo điều kiện cho các thao tác dàn trải trong quá trình phẫu thuật được dễ dàng

Màng ối là một nguyên liệu sẵn có, dễ lấy, dễ xử lý Màng ối được bảo quản ở nhiệt độ - 80O C có thể để được nhiều tháng [11], [26], [32]

Như vậy, màng ối là một màng sinh học có nhiều ưu điểm vượt trội, được sử dụng để che phủ trên bề mặt nhãn cầu đạt hiệu quả cao Màng ối là một chất nền lí tưởng để nuôi cấy tế bào gốc biểu mô giác mạc trên thực nghiệm [30]

1.2.2 Chuẩn bị màng ối làm nền nuôi cấy

Màng ối được sử dụng làm nền sinh học (giá đỡ sinh học) trong nuôi cấy tế bào BMVR Do tính chất của màng ối gần giống màng đáy của biểu

mô giác mạc nên tế bào biểu mô giác mạc có khả năng bám dính, phát triển, tăng sinh và di cư trên nền màng ối Mặt khác, khi tấm biểu mô đã phát triển trên màng ối thì dễ dàng được thu hoạch để cấy ghép

Chuẩn bị màng ối cho nuôi cấy là một bước quan trọng, hầu hết các tác giả đều chuẩn bị và bảo quản màng ối người theo phương pháp mà Lee S H., Tseng S C G., Prabhasawat P và cộng sự mô tả:

- Màng rau được thu nhận có chọn lọc từ những ca mổ lấy thai có kiểm soát, không mắc HIV, viêm gan và giang mai

- Làm sạch máu và rửa bằng PBS (Phosphate-Buffered Salin) có pha kháng sinh, kháng nấm

- Tách màng ối ra khỏi màng đệm và trải tấm nitrocellulose có kích thước 4 x 4 cm lên mặt tổ chức đệm của màng ối, lúc này màng ối dính chặt vào mảnh giấy với mặt biểu mô quay lên trên

- Mảnh giấy mang mảnh màng ối được cuộn cho mặt biểu mô quay ra ngoài và được bảo quản bằng hỗn hợp glycerol và môi trường DMEM với tỉ

Theo Song E và cộng sự thì loại bỏ tế bào biểu mô màng ối bằng cách

ủ với 0,25% trypsin- 0,02% EDTA ở 37o C trong 2h để làm mất sự kết dính của tế bào; sau đó dùng nạo biểu mô nạo nhẹ nhàng rồi rửa sạch bằng PBS

vô trùng [39] Cũng với nồng độ men này nhưng theo Yiqui Du, Jing Chen thì chỉ ủ trong 30 phút Jun Shimazaki và cộng sự (2002) lại loại bỏ biểu mô của màng ối bằng cách ngâm tấm màng ối vào ammonium 10%, và nạo bỏ biểu mô một cách nhẹ nhàng [18]

Koizumi N và cộng sự (2000) đã nghiên cứu so sánh sự phát triển của

tế bào biểu mô VRGM nuôi cấy trên màng ối để nguyên và loại bỏ biểu mô, tác giả thấy tế bào biểu mô phát triển trên màng ối đã loại bỏ biểu mô nhanh hơn, tế bào tầng hoá tốt hơn so với màng ối còn biểu mô, khoảng gian bào giữa các tế bào hẹp hơn, giữa các tế bào có nhiều thể liên kết hơn Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001) [23] Nhưng Fukuda K (1999) thì cho rằng biểu mô màng ối có chứa những yếu tố tăng trưởng, yếu tố phát triển biểu bì EGF, yếu tố phát triển giác mạc bào KGF, yếu tố phát triển thần kinh NGF Chính những yếu tố này sẽ giúp TBBM phát triển và phân chia [13]

Về vấn đề rã đông màng ối sau bảo quản lạnh hiện cũng có sự khác nhau giữa các tác giả: Theo Lee S H và Tseng S C G thì màng ối sau bảo quản lạnh sẽ được để trong tủ nuôi cấy 37o C, 5% CO2 qua đêm trước khi sử dụng [26], [43], [47] Đa số các tác giả khác chỉ để ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng từ 15- 30 phút [15], [21], [44]

Nhiều tác giả đã nghiên cứu xem có sự khác nhau giữa việc sử dụng màng ối tươi và sử dụng màng ối bảo quản? Theo Sato H và cộng sự (1998) thì các yếu tố tăng trưởng tồn tại trên màng ối bảo quản giảm 50% so với màng ối tươi Tác giả cho rằng sử dụng màng ối tươi tốt hơn sử dụng màng

ối bảo quản vì các yếu tố sinh học sẽ phát huy tác dụng trong quá trình hàn gắn biểu mô bề mặt nhãn cầu Mặc dù vậy nhưng màng ối bảo quản hiện nay

được sử dụng phổ biến vỡ tớnh tiện lợi, trước khi nuụi cấy hay phẫu thuật khụng mất nhiều thời gian để chuẩn bị [35]

Như vậy, vẫn chưa cú sựthống nhất giữa cỏc tỏc giả về vấn đề chuẩn

bị màng ối phục vụ nuụi cấy : để nguyờn hay loại bỏ biểu mụ

1.3 Nuụi tạo tấm biểu mụ giỏc mạc từ tế bào gốc vựng rỡa giỏc mạc

Trong những năm gần đõy, cụng nghệ nuụi cấy tế bào gốc để điều trị cỏc bệnh nan y đang rất phỏt triển Nuụi cấy tế bào gốc VRGM để tạo thành tấm biểu mụ giỏc mạc rồi ghộp điều trị cỏc tổn thương BMNC cũng đó được nhiều tỏc giả tiến hành thành cụng trờn thực nghiệm và trờn người.(5,12,19)

1.3.1 Chuẩn bị mẫu mụ vựng rỡa để nuụi cấy

Mẫu mụ vựng rỡa được lấy trờn mắt lành, vựng rỡa cũn lành trờn mắt tổn thương hoặc vựng rỡa từ người hiến giỏc mạc Kớch thước của mảnh biểu

mụ vựng rỡa khỏc nhau dao động từ 1 mm² đến 6 mm², chiều rộng của mẫu

mụ vựng rỡa khoảng 1 – 2 mm về phớa kết mạc và khoảng 1 mm về phớa giỏc mạc Vị trớ lấy mẫu mụ vựng rỡa thường ở vựng rỡa phớa trờn, nơi hàng rào Vogt được nhỡn thấy Mảnh mô vùng rìa sau khi được lấy khỏi mắt sẽ được làm sạch 2 lần với PBS có chứa kháng sinh, kháng nấm (dung dịch để rửa màng ối) và được loại bỏ củng mạc, mống mắt, nội mô giác mạc, màng tiếp hợp và bao tenon Phần mô còn lại được xử lý để nuụi cấy.Việc xử lý mảnh vựng rỡa để nuụi cấy khỏc nhau trong nghiờn cứu của cỏc tỏc giả Liu S và cộng sự (2006) đã xử lý mảnh bằng dispase II (1,2 UI/ml trong dung dịch muối đẳng trương của Hank không có Mg2+ và Ca2+) ở 37o , 5% CO2 trong 10 phút [28] Nakamura.T và cộng sự (2004) lại xử lý mảnh mô vựng rỡa bằng 0,25% trypsin và 0,02% EDTA trong 5 phút [ 32] Nồng độ của dispase hoặc trypsin cú thể khỏc nhau trong cỏc nghiờn cứu Một số tỏc giả

ỏp dụng nuụi cấy bằng dịch treo TBBMVR: Cỏc tế bào biểu mụ vựng rỡa được tỏch riờng rẽ thành dạng dịch treo; sau đú được nuụi cấy trờn nền màng

ối [21], [28]

1.3.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường thông dụng nhất sử dụng cho nuôi cấy tế bào gốc là môi trường Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) có nồng độ glucose cao DMEM là môi trường nuôi cấy đệm bicarbonate được thiết kế để duy trì

pH từ 7,2 đến 7,4 với nồng độ CO2 là 5% và 95% không khí Do vậy, điều khiển nồng độ CO2 trong tủ ấm để đảm bảo nồng độ CO2 bình thường xung quanh tế bào và độ pH chính xác cho tế bào là một điều rất quan trọng Môi trường nuôi cấy cũng có thời hạn sử dụng nhất định, đặc biệt khi chúng đã được bổ sung thêm huyết thanh hoặc L- glutamin Điều kiện bảo quản môi trường thích hợp nhất là trong tối ở 4oC Huyết thanh bổ sung vào môi trường nuôi cấy thường được dùng là huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovine Serum- FBS) hoặc huyết thanh bò (Bovine Serum - BS) [7]

FBS được nhiều tác giả sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy

tế bào gốc FBS đóng vai trò cung cấp năng lượng cho tế bào nuôi cấy và cung cấp các yếu tố kích thích tăng sinh như yêú tố kích thích sinh trưởng tiểu cầu (PDGF), yếu tố tế bào gốc (stem cell factor) Bên cạnh đó FBS còn làm tăng độ nhớt trong môi trường và duy trì một áp suất thẩm thấu thích hợp cho các tế bào được nuôi cấy Tuy nhiên giá thành của FBS rất cao

BS là loại huyết thanh cũng thường được dùng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy Vai trò của BS cũng tương tự như FBS Một số tác giả cho rằng hiệu quả nuôi cấy tế bào trong môi trường DMEM có bổ sung BS tương

tự như trong môi trường DMEM có bổ sung FBS

Ngoài FBS và BS, để nuôi cấy tế bào vùng rìa giác mạc, các tác giả còn bổ xung thêm một số thành phần: dimethyl sulfoxide, yếu tố tăng trưởng biểu mô (Epithelial Growth Factor - EGF), insulin, hydrocortison, choleratoxin, tranferrin, kháng sinh, kháng nấm Nồng độ của các yếu tố bổ xung khác nhau tuỳ từng tác giả

1.3.3 Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc VRGM

Có hai phương pháp đang được sử dụng để nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc: Tạo tấm tế bào biểu mô giác mạc từ mảnh vùng rìa và tạo tấm biểu mô giác mạc từ dịch treo các tế bào biểu mô vùng rìa Năm 2007, Alex

J và cộng sự đã tổng kết 17 báo cáo nuôi và ghép vùng rìa cho bệnh nhân, thấy có tới 11 báo cáo đã dùng phương pháp thứ nhất [6] Mảnh tổ chức lấy

từ vùng rìa đặt lên trên mặt màng đáy của màng ối, và được ngâm trong dung dịch nuôi cấy Dung dịch bao gồm chất dinh dưỡng và các chất kích thích tăng sinh và di chuyển của tế bào biểu mô vùng rìa trên bề mặt của màng ối, quá trình này diễn ra trong khoảng từ 14 đến 28 ngày Kỹ thuật “air lifting” được một số tác giả sử dụng nhằm tạo điều kiện cho cho lớp tế bào nuôi cấy tiếp xúc với không khí và kích thích sự tăng sinh và biệt hóa tế bào biểu mô thành nhiều lớp Một số tác giả khác cũng sử dụng thêm một lớp ở dưới đáy của hệ thông nuôi cấy trên, lớp này có 3T3 fibroblasts 3T3 fibroblasts là các

tế bào được tách ra từ bào thai của chuột, chúng có khả năng tăng sinh mạnh,

có vai trò thúc đẩy sự phát triển và di cư tế bào biểu mô nuôi cấy, đặc biệt cho tổ chức da và giác mạc Phương pháp tạo tấm biểu mô giác mạc từ dịch treo các tế bào biểu mô vùng rìa được sử dụng trong 6 nghiên cứu Từ mảnh

mô vùng rìa giác mạc , dùng enzym tách lấy các tế bào biểu mô, dịch treo gồm các tế bào biểu mô vùng rìa riêng lẻ hoặc thành từng đám tế bào và nuôi cấy trên các chất liệu khác nhau như kính tiếp xúc, mảnh collagen hay paraffin, hoặc tấm fibrin hoặc màng ối Quá trình nuôi cấy cũng mất khoảng

từ 14 đến 21 ngày Năm 2000, Koizumi N và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào biểu mô VRGM trên màng ối để nguyên biểu mô

và màng ối loại bỏ biểu mô Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy cho thấy các tế bào biểu mô phân chia, phát triển và tăng nhanh về số lượng Các tế bào BMGM phát triển lên bề mặt biểu mô của màng ối Sau 28 ngày nuôi cấy thì các tế bào biểu mô đã phát triển tầng hoá [23]

1.3.4 Định danh tế bào của tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy

Sau khi đã nuôi tạo được tấm biểu mô từ mảnh mô vùng rìa, một vấn

đề đặt ra là: những tế bào của tấm biểu mô có đặc tính của tế bào biểu mô giác mạc hay không? Để giải đáp vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp đánh giá khác nhau: đánh giá cấu trúc vi thể qua các tiêu bản vi thể nhuộm bề mặt hoặc cắt lát mỏng, đánh giá cấu trúc siêu vi thể qua các tiêu bản hiển vi điện tử quét và xuyên, đánh giá cấu trúc hóa học qua các tiêu bản nhuộm hóa mô hoặc hóa mô miễn dịch D.Meller , RTF Pies, SCG Tseng (2002), đã định danh tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy từ mảnh mô vùng rìa của chuột và của người bằng kính hiển vi điện tử và hóa mô miễn dịch, thấy: tấm biểu mô gồm 2-4 hàng tế bào, các tế bào liên kết với nhau chặt chẽ bằng các mộng bào tương và các thể liên kết, các tế bào lớp đáy liên kết với nhau lỏng lẻo và được gắn vào màng ối bằng các thể bán liên kết, dấu

ấn K3 và K12 được thể hiện rõ [31] Jun Shimazaki và cs ( 2002) nuôi cấy

13 mảnh vùng rìa để ghép cho bệnh nhân, sau 12-20 ngày nuôi cấy, quan sát dưới kính hiển vi soi nổi thấy biểu mô gồm 2-3 lớp và gắn chặt vào màng ối [18]

1.4 Điều trị tổn thương bề mặt nhãn cầu bằng phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy

1.4.1 Hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [24, 42, 46, 48]

Hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM có thể là nguyên phát, thường

do suy giảm chức năng của vi môi trường xung quanh tế bào gốc Sự suy giảm nguyên phát của tế bào gốc có thể thấy trong các bệnh aniridia, erythrokeratodermia, viêm giác mạc trên những bệnh nhân suy giảm nhiều yếu tố nội tiết tố, bệnh giác mạc do yếu tố thần kinh hoặc viêm vùng rìa kéo dài Sự suy giảm tế bào gốc cũng có thể xảy ra thứ phát do các yếu tố bên ngoài cơ thể gây nên và thường gặp hơn do nguyên nhân nguyên phát Các trường hợp do tác động bên ngoài gây nên phá hủy vùng rìa, cũng như tế bào

gốc như bỏng mắt do hóa chất hoặc nhiệt, hội chứng Stevens- Johnson, OCP, nhiều phẫu thuật thực hiện trên cùng một mắt, bệnh nhân đeo kính tiếp xúc hoặc nhiễm khuẩn giác mạc nặng

1.4.2 Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM

Triệu chứng chủ quan của người bệnh: Nhìn mờ, cộm chói, chảy nước mắt, co quắp mi mắt và có thể có những đợt đau đỏ mắt tái phát Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm vùng rìa có thể phân loại theo mức độ tổn thương vùng rìa hoặc nguyên nhân Nhưng để chỉ định phương pháp phẫu thuật và theo dõi sau phẫu thuật, hội chứng này thường dựa trên phân loại suy giảm tế bào gốc toàn bộ hay một phần

Trong suy giảm tế bào gốc một phần, sự xâm nhập tổ chức xơ mạch ở vùng rìa biểu hiện ở nhiều mức độ khác nhau, trong khi biểu mô giác mạc ở trung tâm vẫn còn bình thường Ở mức độ nhẹ vùng rìa có những thớ xơ nhỏ xâm lấn nhưng cấu trúc bình thường của vùng rìa vẫn còn tồn tại Nếu nặng hơn, các dải xơ xuất hiện và vượt qua vùng rìa, tạo thành màng xơ mạch xâm lấn lên bề mặt giác mạc Màng xơ này có thể dày hay mỏng và sẽ phát triển dần về phía trung tâm giác mạc Một số trường hợp có thể kèm theo tổn thương biểu mô giác mạc Một số vị trí hàng rào Vogt vẫn còn được nhìn thấy

Suy giảm tế bào gốc toàn bộ mức độ tổn thương phụ thuộc vào nguyên nhân do thứ phát hay nguyên phát Biểu hiện lâm sàng thường thấy là biểu

mô giác mạc mờ đục, bề mặt gồ ghề không đều, có tân mạch nông hoặc sâu trong bề dày giác mạc hoặc kết mạc hóa giác mạc Nặng hơn nữa có thể là ổ loét giác mạc khó hàn gắn, bờ ổ loét ranh giới rõ và gồ lên, xung quanh ổ loét có thể tồn tại tổ chức xơ tân mạch, BMNC gồ ghề với biểu hiện của một quá trình viêm mãn tính Ổ loét này nếu không được giải quyết sẽ kêu gọi rất nhiều tân mạch và vấn đề sẽ càng khó giải quyết hơn Trợt biểu mô tái phát cũng là một biểu hiện thường gặp trong hội chứng suy giảm vùng rìa, nhất là

do nguyên nhân nguyên phát Hội chứng suy giảm vùng rìa sau bỏng hoặc hội chứng Stevens-Johnson thường là nguyên nhân gây nhuyễn giác mạc, mỏng hoặc thủng giác mạc

1.4.3 Chẩn đoán xác định hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM

Chẩn đoán xác định hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM là sự có mặt của tế bào hình đài trên bề mặt của giác mạc Để chứng minh sự có mặt của các tế bào tiết nhày người ta có thể dùng các phương pháp can thiệp như sinh thiết tổ chức BMNC hoặc phương pháp không can thiệp phẫu thuật là nhuộm

tế bào ở BMNC [12, 34] Tuy nhiên, nếu BMNC bị tổn thương nặng nề, bản thân biểu mô kết mạc cũng có tăng sinh xơ mạch thì tế bào hình đài không được nhìn thấy ở lớp biểu mô kết mạc do đó cũng khó có thể thấy được trên

bề mặt giác mạc Tuy nhiên, bằng các phương pháp nhuộm tế bào trên các lát cắt từ màng xơ mạch lấy ra sau phẫu thuật, có thể chẩn đoán được hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM Trên các tiêu bản cho thấy lớp biểu mô giác mạc có độ dày không đều, ít hàng tế bào hơn và xen kẽ những vùng tăng sinh xơ, có tế bào biểu mô của kết mạc, có thể thấy các tế bào hình đài Ngoài ra, bằng phương pháp hóa mô miễn dịch sẽ thấy đồng thời sự vắng mặt của một số loại keratin đặc trưng cho tế bào biểu mô giác mạc và sự có mặt của mucin do tế bào nhày tiết ra trên các lát cắt này Tuy nhiên, việc chẩn đoán hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM chủ yếu dựa vào lâm sàng

1.4.4 Phân loại mức độ tổn thương của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [17]

Việc đánh giá và phân loại mức độ tổn thương của hội chứng suy giảm

tế bào gốc VRGM có vai trò quan trọng trong việc tiên lượng về thị lực, lựa chọn phương pháp điều trị cũng như tiên lượng sự thành công của phẫu thuật Bệnh của BMNC phụ thuộc vào nhiều yếu tố và biểu hiện ở rất nhiều mức độ khác nhau Các yếu tố được dùng trong việc đánh giá mức độ tổn

thương của BMNC như: tổn thương của tế bào gốc chiếm bao nhiêu độ tính theo chu vi giác mạc ở vùng rìa, sự tăng sinh xơ mạc dưới kết mạc và kết mạc, tình trạng viêm BMNC Bên cạnh đó , các yếu tố như sự bất thường của màng phim nước mắt, mi mắt, có hay không có hiện tượng sừng hóa trên BMNC, một hay hai mắt bị bệnh, tuổi của bệnh nhân hay tình trạng sức khỏe toàn thân Holland E.J (2000), dựa trên mức độ suy giảm của tế bào gốc VRGM và sự có hoặc không có hiện tượng viêm của kết mạc để phân loại đánh giá mức độ tổn thương của rối loạn bề mặt nhãn cầu: (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Phân loại mức độ tổn thương của rối loạn bề mặt nhãn cầu

Kết mạc bình thường (Mức độ a)

Tiền sử có viêm kết mạc (Mức độ b)

Có viêm kết mạc (Mức độ c) Suy giảm tế bào

gốc một phần

(Mức độ I)

Nguyên phát, CIN, KTX (Mức độ Ia)

Tiền sử bỏng mắt

do hóa chất hoặc nhiệt (Mức độ Ib)

H/cStevens-Johnson, OCP, hiện tại đang

bị bỏng mắt (Mức

độ Ic) Suy giảm tế bào

góc toàn bộ

(Mức độ II)

Aniridia, bệnh nặng hơn ở trên (Mức độ IIa)

Tiền sử bỏng mắt ở mức độ nặng (Mức độ IIb)

H/cStevens-Johnson, OCP, hiện tại đang

bị bỏng mắt nặng (Mức độ IIc)

1.4.5 Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM bằng ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy

Lần đầu tiên phương pháp này được Pellegrini mô tả vào năm 1997

Tế bào biểu mô vùng rìa được lấy từ mắt bên lành nếu một mắt bị tổn thương, hoặc lấy ở vùng rìa còn bình thường trên mắt bị tổn thương tế bào gốc một phần hoặc từ người thân hoặc từ vùng rìa của người mới tử vong nếu bệnh nhân bị tổn thương 2 mắt Mảnh vùng rìa mang tế bào gốc của biểu

mô được nuôi cấy, nhân lên và tạo nên tấm tế bào biểu mô giác mạc Sau khi

phẫu tích hết tổ chức xơ mạch không bình thường trên bề mặt giác mạc và vùng rìa, tấm tế bào biểu mô được cố định trên bề mặt giác mạc [6, 12, 18, 19] Về mặt lý thuyết, kỹ thuật này có một vài ưu điểm vượt trội hơn các phương pháp khác đã được áp dụng từ trước Mảnh vùng rìa cần cho quá trình nuôi cấy nhỏ hơn gấp nhiều lần so với mảnh vùng rìa sử dụng trong phẫu thuật ghép biểu mô vùng rìa khác Quá trình nuôi cấy đã giảm thiểu số lượng tế bào không có chức năng bình thường nằm trong mô của người cho Việc sinh thiết các tế bào gốc ở vùng rìa có thể nhắc lại nếu cần thiết Một ưu điểm vượt trội khác của kỹ thuật này so với kỹ thuật ghép rìa kinh điển đó là giảm nguy cơ thải loại mảnh ghép vì không có mặt của các tế bào Langerhan đóng vai trò trình diện kháng nguyên [22, 24] Cho tới nay, đã có nhiều báo cáo công bố kết quả của phẫu thuật điều trị di chứng bỏng do hóa chất hoặc nhiệt, hội chứng Stevens-Johnson, viêm BMNC mãn tính ( viêm kết mạc mùa xuân, bệnh trứng cá đỏ, viêm giác mạc do nguyên nhân thần kinh…)đều cho những kết quả và tỷ lệ thành công tương tự nhau Tsai R J F và cộng sự (2000) đã nuôi cấy tự thân tế bào BMVR của người trên màng ối để ghép cho những bệnh nhân suy giảm tế bào gốc VRGM một bên Nhóm nghiên cứu tiến hành lấy mẫu VRGM từ những mắt khoẻ mạnh còn lại của 6 bệnh nhân để nuôi cấy trên màng ối Sau 2- 3 tuần nuôi cấy, TBBM đã phát triển thành tấm hình tròn đường kính khoảng 2-3 cm và được ghép cho mắt tổn thương Kết quả cho thấy: ghép tế bào BMVR tự thân nuôi cấy trên màng ối

là một phương pháp đơn giản và có hiệu quả trong việc tái tạo lại bề mặt giác mạc và phục hồi thị lực cho những bệnh nhân suy giảm tế bào gốc BMVR một bên [45] Năm 2002, Shimazaki J và cộng sự nuôi cấy tế bào BMVR trên màng ối để ghép cho những bệnh nhân tổn thương nặng bề mặt nhãn cầu, kết quả cũng cho thấy: không những bề mặt nhãn cầu được cải thiện tốt

mà thị lực cũng tăng [49]

Tóm lại, nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc để ghép điều trị cho các bệnh nhân bị hội chứng suy giảm vùng rìa do các nguyên nhân khác nhau là một phương pháp hiện đại và hiệu quả Tuy nhiên, xung quanh phương pháp này còn nhiều vấn đề cần nghiên cứu

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

* Màng ối người

* Đối tượng nghiên cứu thực nghiệm: Thỏ chủng Orytolagus Cuniculus

cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 2 kg ± 0,2 kg do trung tâm nghiên cứu

dê và thỏ Sơn tây cung cấp.Thỏ được nuôi trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm từ 5 ngày trước khi làm thực nghiệm và trong suốt thời gian thực nghiệm

* Mảnh mô vùng rìa giác mạc lấy từ mắt lành, từ vùng rìa còn bình thường của mắt bệnh hoặc từ vùng rìa giác mạc hiến

2.2 Mô hình nghiên cứu

MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu qui trìng tạo tấm

màng ối làm nền nuôi cấy Nghiên cứu qui trình trích thủ và xử lý vùng rìa

Nuôi cấy

Nghiên cứu môi trường phù hợp

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối

người làm nền nuôi cấy

- Bánh rau và màng bọc thai của các sản phụ mổ đẻ tại bệnh viện Phụ - Sản Hà nội Các sản phụ khoẻ mạnh và đã được sàng lọc các bệnh lây truyền: (HIV, HbsAg, giang mai), không có nhiễm trùng toàn thân, chưa vỡ

ối hoặc vỡ ối trước 6 giờ

- Tách màng ối rời khỏi màng bọc thai

- Định khu màng ối sẽ lấy để làm nền nuôi cấy bằng cách: Lấy màng

ối ở 3 vị trí khác nhau: trên bề mặt bánh rau (1), vùng 10 cm kể từ rìa bánh rau (2), vùng ngoài 10cm kể từ rìa bánh rau (3) (Hình 2.2), làm tiêu bản vi thể, đánh giá cấu trúc hình thái 3 vùng của màng ối và quyết định vùng sẽ lấy

để làm nền nuôi cấy Cắt màng ối ở vùng đạt tiêu chuẩn thành các mảnh có diện tích 3x3 cm

Hình 2.2: Bánh rau và màng rau

- Xử lý các mảnh màng ối theo 3 cách:

+ Để nguyên lớp biểu mô của màng ối

+ Nạo vỏ lớp biểu mô bằng cơ học: Dùng nạo biểu mô nạo nhẹ nhàng nhiều lần mặt biểu mô của tấm màng ối, rửa lại bằng PBS có bổ xung penicilin, streptomycin và amphotericin B

D©y rèn

B¸nh rau

Mµng rau

Vïng lÊy 1

2 3

+ Nạo bỏ lớp biểu mô bằng ammonium 10% và cơ học:

• Các tấm màng ối rửa trong DMSO với các nồng độ khác nhau

• Rửa bằng PBS

• Ngâm trong Ammonium 10%

• Nạo bỏ lớp biểu mô và trung mô

• Rửa lại bằng PBS

- Bảo quản màng ối đã xử lý trong dung dịch DMSO 15% ở nhiệt độ -800C (sử dụng trong 6 tháng)

- Khi sử dụng, rã đông ở nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS

- Căng màng ối lên phiến hoặc lồng nuôi cấy

- Làm tiêu bản vi thể 3 loại màng ối đã xử lý

- Nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc: Chỉ tiêu nghiên cứu:

+ Đánh giá sự phát triển của tế bào gốc VRGM trên các loại màng ối

+ Đánh giá chất lượng của tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy trên màng ối xử lý theo phương pháp khác nhau

2.3.2.Xây dựng qui trình trích thủ và xử lý mẫu vùng rìa giác mạc

2 3.2.1 Thực nghiệm trên thỏ:

*Nuôi cấy bằng mảnh mô:

- Giết thỏ hoặc gây mê thỏ

- Trích thủ vùng rìa giác mạc:

+ Vị trí: 11h – 1h

+ Kích thước: rộng 0,5-1mm, dài 2-3 mm, sâu 0,2mm

+ Kiểm tra cấu trúc vi thể của mảnh VRGM

+ Mảnh vùng rìa giác mạc được rửa bằng PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm

+ Cắt nhỏ thành các mảnh 1x1mm

- Mảnh mô vùng rìa được xử lý theo 3 phương pháp:

+Không xử lý enzym

+Ủ trong dung dịch trypsin 0,1% + EDTA 0,1%

trong tủ ấm 370, thời gian: 7 phút

+Ủ trong dung dịch dispase II 2,4 UI/ml trong tủ ấm 370 Dừng tác động của dispase bằng EDTA 0,02% ở nhiệt độ phòng, thời gian 2-

3 phút

- Nuôi cấy các mảnh mô đã được xử lý trên nền màng ối Đánh giá sự phát triển của tế bào gốc VRGM và chất lượng của tấm BMGM nuôi cấy

- Theo dõi quá trình hồi phục của vùng rìa bị trích thủ

*Nuôi cấy bằng dịch treo:

- Giết thỏ, lấy toàn bộ giác mạc và VRGM

- Nạo lấy lớp biểu mô

- Ly tâm lấy các tế bào biểu mô

- Tạo dịch treo có mật độ tế bào 1x105 tế bào/ml

-Nuôi cấy trong lồng nuôi cấy

2.3.2.2 Thử nghiệm trên bệnh nhân tự nguyện Tiến hành sau khi có kết quả định hướng của thực nghiệm trên thỏ

- Gây tê góc mắt cho bệnh nhân

- Trích thủ mảnh vùng rìa trên mắt lành nếu bệnh nhân bị tổn thương 1 bên hoặc phần vùng rìa bình thường nếu bệnh nhân bị tổn thương 2 mắt

- Vị trí: 11h – 1 h

- Kích thước: rộng 1,5mm, dài 3mm, sâu 0,2mm

- Rửa bằng PBS có pha kháng sinh, kháng nấm

- Cắt nhỏ thành các mảnh 1x1mm

- Nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy

*Mảnh vùng rìa cũng có thể lấy từ vùng rìa của giác mạc hiến

2.3.2.3 Chỉ tiêu nghiên cứu:

- Tốc độ phát triển của các tế bào biểu mô

- Chất lượng của tấm biểu mô

2.3.3 Lựa chọn môi trường nuôi cấy:

*Các loại môi trường

- Môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagles medium) do viện Vaccin Trung ương (Poliovac) cung cấp, bổ sung: SHB (Sodium Hydrogen Bicarbonate) và 10% huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovine Serum – FBS)

- Môi trường DMEM do Poliovac cung cấp, bổ sung SHB và 10% huyết thanh bò (Bovine Serum-BS)

- Môi trường SHEM (Supplemental Hormonal Epithelial Medium) gồm: DMEM/F12 tỉ lệ 1:1 của Gibco, bổ xung: peniciline 100UI/ml Streptomycin 100µg/ml, Amphotericin B 200 µg/ml, Insulin 5µg/ml, 5% FBS, EGF (Epithelial growth factor)

* Nuôi cấy mảnh mô hoặc dịch treo của biểu mô vùng rìa giác mạc trong

tủ 370C, 5% CO2 Thay môi trường 2 ngày 1 lần Theo dõi sự phát triển của các tế bào biểu mô giác mạc bằng kính hiển vi soi nổi Khi các tế bào

đã phủ kín đáy của lồng nuôi cấy, sử dụng kỹ thuật tạo tầng (air lifting) để tăng số hàng cho tấm biểu mô nuôi cấy trong thời gian 2-4 ngày

* Lấy tấm biểu mô nuôi cấy để định danh hoặc ghép lại cho thỏ (trong thực nghiệm) hoặc cho bệnh nhân (trên thử nghiệm lâm sàng)

2.3.4 Ghép thực nghiệm trên thỏ

2.3.4.1 Xây dựng mô hình gây bỏng giác mạc cho thỏ:

• Gây mê tĩnh mạch cho thỏ bằng thiopentan với liều 10mg/kg qua đường tĩnh mạch tai

• Gây bỏng bằng phương pháp “in dấu” dung dịch NaOH 3% trong 7 giây trên giác mạc và vùng rìa giác mạc

• Rửa mắt bằng nước muối sinh lý sau gây bỏng 1 phút

• Giết thỏ lấy mắt làm tiêu bản vi thể để kiểm tra kỹ thuật gây bỏng vào các thời điểm: 1 tuần, 2 tuần, 1,5 tháng sau khi gây bỏng

2.3.4.2 Ghép thực nghiệm cho thỏ

a) Mô hình nghiên cứu thực nghiệm (Hình 2.3)

Hình 2.3: Mô hình nghiên cứu thực nghiệm

Thỏ

TN

30 ngày

Gây bỏng (MP)

Lấy mảnh

VR (MT)

Ghép tấm biểu mô

Nuôi cấy tạo tấm BM trên màng ối

Lấy mắt làm t/bản mô học

Xử lý màng ối

Màng ối bảo quản lạnh

Đánh giá các chỉ tiêu

mô học

Nhận định kết quả

Theo dõi dọc Theo dõi

dọc

b) Phân nhóm thực nghiệm và qui trình nghiên cứu thực nghiệm (Hình 2.4)

bỏng

15 ngày sau bỏng

45 ngày sau bỏng

7 ngày sau ghép

15 ngày sau ghép

1 tháng sau ghép

3 thàng sau ghép

c) Cách thức tiến hành phẫu thuật thực nghiệm

- Gây mê thỏ đường tĩnh mạch bằng thiopentan

- Mở kết mạc rìa 360°

- Phẫu tích tổ chức màng xơ mạch trên giác mạc và củng mạc

- Chuẩn bị diện ghép, bao gồm bề mặt giác mạc, vùng rìa và củng mạc quanh rìa, cách rìa giác- củng mạc khoảng 5-7 mm

- Trải tấm tế bào biểu mô giác mạc vùng rìa nuôi cấy trên bề mặt nhãn cầu

- Dùng chỉ 9-0 để khâu cố định tấm tế bào biểu mô trên bề mặt nhãn cầu bằng mũi chỉ rời

d) Theo dõi đánh giá tổn thương trên mắt thỏ

- Khám đánh giá tổn thương trên lâm sàng hội chứng suy giảm tế bào gốc trước phẫu thuật và sau phẫu thuật

- Tiến hành test nhuộm màu trên BMNC bằng Fluorescein

- Tra nhỏ thuốc tại mắt phẫu thuật hàng ngày bằng dung dịch kháng sinh ofloxacin 4 lần/ngày, polydexa 4 lần/ngày

e) Các chỉ tiêu nghiên cứu trên thực nghiệm

-Toàn trạng của thỏ thực nghiệm

- Tình trạng mắt thỏ

- Cấu trúc vi thể và siêu vi thể của giác mạc ghép tấm biểu mô nuôi cấy

2.3.5 Ghép trên bệnh nhân tình nguyện

2.3.5.1 Lựa chọn bệnh nhân:

* Bỏng kiềm một mắt ở giai đoạn mạn tính

* Có hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM:

- Loét giác mạc khó hàn gắn

- Xơ mạch xâm lấn từ kết mạc qua rìa lên bề mặt giác mạc

- Tróc biểu mô tái phát

2.3 5.2 Qui trình khám và phẫu thuật ghép tấm biểu mô

` a) Đánh giá tình trạng tổn thương BMNC trước phẫu thuật

- Đo thị lực của bệnh nhân, nhãn áp (nếu có thể được)

- Khám đánh giá tổn thương trên lâm sàng hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM

- Tiến hành các test nhuộm màu trên BMNC Fluorescein

- Tiến hành các test Schimer đánh giá màng phim nước mắt

- Tiến hành phương pháp nhuộm tế bào trên bề mặt giác mạc trước phẫu thuật

b) Chuẩn bị bệnh nhân

- Điều trị hiện tượng viêm của bề mặt nhãn cầu: Tra mắt bằng Prednisolone acetate 1% từ 4 – 8 lần/ngày (tăng giảm liều và thời gian điều trị tùy mức độ viêm), dung dịch kháng sinh ofloxacine 0,5% 2 – 4 lần/ngày

- Tăng cường dinh dưỡng bề mặt nhãn cầu, củng cố chất lượng và số lượng màng phim nước mắt: Nước mắt nhân tạo dạng dung dịch 8

lần/ngày, dinh dưỡng, tăng cường độ ẩm cho bề mặt nhãn cầu dạng keo 3 lần/ngày

- Điều trị viêm hoặc các tổn thương khác của bờ mi:Tra mắt mỡ oflovid 1% 1 lần/ngày, chườm nóng khô và mat-xa da mi Tạo hình bờ mi mắt bằng phương pháp ghép niêm mạc môi (phẫu thuật Sapejko)

c) Sinh thiết mảnh mô vùng rìa giác mạc bệnh nhân

d) Nuôi cấy tạo tấm biểu mô giác mạc

e) Cách thức tiến hành phẫu thuật trên bệnh nhân

- Gây mê, theo dõi, hồi sức trong suốt quá trình phẫu thuật

- Mở kết mạc rìa 360°

- Phẫu tích tổ chức xơ dưới kết mạc, giữ tối đa tổ chức kết mạc lành

- Phẫu tích tổ chức màng xơ mạch trên giác mạc và củng mạc

- Chuẩn bị diện ghép, bao gồm bề mặt giác mạc, vùng rìa và củng mạc quanh rìa, cách rìa giác- củng mạc khoảng 5-7 mm

- Trải tấm tế bào biểu mô giác mạc vùng rìa nuôi cấy trên bề mặt nhãn cầu

- Dùng chỉ 9-0 để khâu cố định tấm tế bào biểu mô trên bề mặt nhãn cầu bằng mũi chỉ liên tục phối hợp với mũi rời

- Đặt kính tiếp xúc

- Mảnh tổ chức màng xơ mạch phẫu tích từ bề mặt giác mạc người gửi làm giải phẫu bệnh để nghiên cứu cấu trúc mô học của màng xơ mạch trên giác mạc

f) Theo dõi bệnh nhân sau phẫu thuật

*Các mốc thời gian theo dõi:

- Hàng ngày trong 2 tuần sau phẫu thuật

- Sau phẫu thuật 3 tuần

- 2 tuần/lần trong 2 tháng tiếp theo

- 1 tháng/lần trong thời gian tiếp theo *Đánh giá mắt sau phẫu thuật