Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học dựa trên Transistor hiệu ứng trường sợi silic và ứng dụng ban đầu trong phát hiện tế bào lưu chuyển của ung thư vú

Hệ giữ chíp có chứa các kênh dẫn vi chất lỏng microfluidics và hệ hỗ trợ để tích hợp SiNW FET với thiết bị đo điện bên ngoài, sử dụng để thực hiện các thí nghiệm trong phát hiện tế bào u

iii

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SiNW FET 1

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CTC TRONG UNG THƯ VÚ 1

1.1.1 Khái niệm về CTC 1

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu CTC: 1

1.1.3 Các phương pháp phát hiện CTC 2

1.1.4 Ý nghĩa lâm sàng của CTC 6

1.2 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CẢM BIẾN SINH HỌC SiNW FET 8

1.3 PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO SiNW FET 10

1.3.1 Chế tạo sợi nano Silic bằng phương pháp Top Down (TD) 10

1.3.2 Chế tạo sợi nano bằng phương pháp Bottom Up (BU) 15

1.4 ỨNG DỤNG CỦA CẢM BIẾN SiNW FET 16

CHƯƠNG 2: CHẾ TẠO CẢM BIẾN SiNW FET 17

2.1 CHẾ TẠO SiNW FET 17

2.1.1 Wafer: 21

2.1.2 Oxy hóa tạo màng SiO2 21

2.1.3 Tạo màng Si3N4 21

2.1.4 Quang khắc (photolithography) 22

2.1.5 Ăn mòn khô lớp Si3N4 22

2.1.6 Tẩy lớp photoresist 23

2.1.7 Ăn mòn ướt lớp SiO2 23

2.1.8 Ăn mòn dị hướng tạo sợi Silic 23

2.1.9 Tẩy lớp Si3N4 24

2.1.10 Ăn mòn SiO2 hình thành sợi Silic 24

2.1.11 Chế tạo điện cực 24

2.1.12 Thụ động bề mặt điện cực 25

2.2 CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT SỢI NANO 28

2.2.1 Biomarkers 28

2.2.2 Thụ thể 29

2.2.3 Chất kết nối (Linker) 29

CHƯƠNG 3: ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CẢM BIẾN SAU KHI CHẾ TẠO 34

3.1 TÍNH CHẤT HÌNH THÁI 34

3.2 TÍNH CHẤT ĐIỆN: 35

iv

CHƯƠNG 4: ỨNG DỤNG BAN ĐẦU CỦA SiNW FET TRONG PHÁT HIỆN TẾ

BÀO LƯU CHUYỂN CỦA UNG THƯ VÚ 41

4.1 CHUẨN BỊ TẾ BÀO 41

4.2 CHUẨN BỊ HỆ ĐO 42

4.3 KẾT QUẢ ĐO PHÁT HIỆN TBUTV TRONG DUNG DỊCH ĐỆM 44

4.4 NGHIÊN CỨU, SOI TẾ BÀO BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG 47

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN 50

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1-1.(a) Cấu tạo của một cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc transistor hiệu ứng trường sợi Silic Hai điện cực nguồn và máng được nối với nhau qua kênh dẫn sợi Silic kích thước nanomét Độ dẫn qua sợi được điều chỉnh bằng thế điện áp vào cực cổng ở

đế Silic (b) Sự thay đổi tính cường độ dòng điện chạy qua sợi Si loại P khi có các phần

tử bị bắt lại trên sợi Dòng điện giảm khi đối tượng mang điện tích dương, cùng dấu với điện tích hạt tải chính trong sợi, làm dòng điện qua sợi giảm Trong khi đối tượng mang điện tích âm bị bắt làm dòng điện tăng lên 8 Hình 1-2 Chíp SiNW FET gồm nhiều sợi Si đặt song song nhau, mỗi sợi được gắng một phần tử khác nhau nhằm phát hiện những đối tượng khác nhau, nên cảm biên có thể đo đồng thời nhiều thông số khác nhau 9 Hình 1-3 Độ dài sợi Silic và độ rộng của vùng chứa sợi và chất làm thụ động hóa bề mặt

là những thông số cần quan tâm khi chế tạo SiNW FET 10 Hình 1-4 Ba quá trình của cơ chế ăn mòn là quá trình khuếch tán, quá trình ăn mòn, và quá trình thải sản phẩm của quá trình ăn mòn ra ngoài 11Hình 1-5 Ba cơ chế ăn mòn: a- đẳng hướng, b- dị hướng, c- siêu dị hướng 12 Hình 1-6 Quy trình lithography dùng trong phương pháp chế tạo sợi Silic 13 Hình 1-7 Quy trình chế tạo sợi nano Silic bằng kỹ thuật SNAP (a) cấu trúc siêu mạng GaAs/AlxGa1-xAs (b) các cạnh của siêu mạng được ăn mòn khác nhau (c) kim loại bạch kim (Pt) được phủ lên các cạnh của siêu mạng (d) chập các cạnh có kim loại đã phủ của siêu mạng lên wafer SOI đã có trước lớp polyme, khi đó lớp kim loại đơn tinh thể sẽ gắn với lớp Silic đơn tinh thể của wafer (e) ăn mòn siêu mạng, chỉ còn lại lớp kim loại trên đế wafer (f) lớp kim loại đóng vai trò là mặt nạ khi ăn mòn khô hình thành cấu trúc sợi.(g) cuối cùng các sợi kim loại bị tẩy đi, hiện ra các sợi Silic đồng đều

và định hướng cao 15 Hình 2-1 Wafer SOI có cấu trúc 3 lớp, đế là lớp bán dẫn Silic, giữa là lớp cách điện SiO2, trên cùng là lớp Silic - lớp này dùng đề chế tạo sợi SiNW FET 18 Hình 2-2 Lớp SiO2 được tạo trên lớp Silic ban đầu có chiều dày 40nm 18 Hình 2-3 Lớp Si3N4 25nm được hình thành trên cầu trúc lớp SiO2 18 Hình 2-4 Quá trình quang khắc (a) khi lớp photoresit được phủ trên lớp Si3N4;(b) là những nơi photoresist bị chiếu sáng sẽ có màu tím; (c) những phần màu tím bị rửa trôi trong dung dịch thuốc hiện (developer) 19

Hình 2-5 Lớp Si3N4 bị ăn mòn tại những vùng lớp photoresist đã được tẩy trong khi những vùng không bị tầy lớp Si3N4 vẫn còn giữ lại 19 Hình 2-6 Cấu trúc sau khi rửa bỏ lớp photoresist 19 Hình 2-7 Ăn mòn lớp SiO2 40nm, sau quá trình ăn mòn thu được cấu trúc hình bên phải 20 Hình 2-8 (a) cơ chế ăn mòn dị hướng wafer Silic <100> trong dung dịch bazơ của kim loại kiềm; (b) kết quả sau khi ăn mòn dị hướng tạo sợi Silic 20 Hình 2-9 Sau khi tầy lớp Si3N4 phía trên 20

vi Hình 2-10 (a) mặt cắt sợi chế tạo được, ( b) nhìn nghiêng từ trên cao với nhiều sợi song

song nhau, hai đầu sợi là vùng sẽ phủ làm điện cực 21

Hình 2-11 Bước chế tạo điện cực gồm sáu bước nhỏ: (a) bước phủ photoresist, (b) chiếu ánh sáng làm thay đổi tính chất của photoresist, (c) development rửa trôi những phần photoresist bị chiếu, (d) phủ lớp đệm điện cực bằng kim loại Ti mục đích tạo tiếp xúc ohmic, (e) phủ kim loại Platin làm điện cực, (f) liff off-tẩy kim loại trên lớp photoresist và photoresist đó 25

Hình 2-12 Các bước thực hiện khi chế tạo lớp cách điện thụ động điện cực (a) mặt bên của sợi đã chế tạo, (b) phủ photoresist, (c) chiếu ánh sáng lên vùng photoresist cần tẩy đi, (d) development tẩy lớp photoresist bị chiếu, (e) phủ lớp cách điện SiO2 bằng phương pháp e-beam, (f) liff off hình thành cầu trúc có vách ngăn cách điện giữa hai điện cực 26

Hình 2-13 Transistor được chế tạo có dạng như hình vẽ Vùng chính giữa sợi Silic có chiều dài 10µm, chiều rộng 2µm là vùng sẽ được chức năng bề mặt làm cảm biến Hai đầu điện cực lộ ra để cắm nguồn điện, hai lớp cách điện hai bên điện cực ngăn chặn dòng rò 27

Hình 2-14 Quy trình thực hiện chức năng hóa bề mặt sợi Si bằng phương pháp xử lý trực tiếp trên bề mặt Si tinh khiết 31

Hình 3-1 Hình ảnh của SiNW FET chế tao được (a) Hình tổng thể với độ phóng đại 5000 lần Chíp có 8 transistor, mỗi bên có 4 transistor, bao gồm các loại chứa 8 sợi, 4 sợi, 2 sợi và 1 sợi Silic (b) Transistor có 8 sợi, (c) Transistor có 4 sợi Silic, (d) Transistor có 2 sợi Silic, và (e) Transistor có 1 sợi Silic Chiều dài của các sợi trong khoảng 9 ± 0.5 µm và chiều rộng trong khoảng 1.5 ±0.15 µm, khoảng cách các sợi trong một transistor là 2µm 34

Hình 3-2 Hệ đo đặc trưng điện Aligent 4155C Hình bên trái là hệ probstation (Suss , Germany) là nơi đặt mẫu cần đo Hệ này gồm mâm để đặc mẫu, bốn SMU, kính hiển vi và các probe để nối các điện cực của sợi nano Bên phải là giao diện làm việc trang bị phần mềm kết nối Labview Dòng điện chạy qua soi nano Si được ghi lại bằng máy tính thông qua phần mềm Agilent Desktop EasyEXPERT 35

Hình 3-3 Đặc trưng I- V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 1 sợi Si 36

Hình 3-4 Đặc trưng I-V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 2 sợi Silic 37

Hình 3-5 Đặc trưng I- V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 4 sợi Silic 37

Hình 3-6 Đặc trưng I- V của cảm biến SiNW FET với kênh dẫn là 8 sợi Silic 38

Hình 3-7 Đặc trưng bias của các SiNW FET vời (a) là kênh dẫn một sợi, (b) là kênh dẫn hai sợi, (c) kênh dẫn bốn sợi, (d) kênh dẫn 8 sợi 39

Hình 4-1 Hệ giữ chíp có chứa các kênh dẫn vi chất lỏng (microfluidics) và hệ hỗ trợ để tích hợp SiNW FET với thiết bị đo điện bên ngoài, sử dụng để thực hiện các thí nghiệm trong phát hiện tế bào ung thư vú bằng cảm biến SiNW FET 42

Hình 4-2 Sự phụ thuộc dòng điện của SiNW FET (loại chứa tám sợi SiNW) vào thời gian thí nghiệm, trong quá trình đó dung dịch chứa TBUTV được bơm vào 44

vii Hình 4-3 Cường độ dòng điện của SiNW FET thay đổi từ 9nA lên 25nA khi cho dung dịch chứa tế bào UTV Dòng điện sau đó đạt giá trị bão hòa xấp xỉ 30nA 45 Hình 4-4 Kết quả lăp lại trong phép đo phát hiện TBUTV Dòng điện qua SiNW FET trong thời gian chưa có dung dịch chứa tế bào ổn định ở mức thấp, khi cho dung dịch vào dòng tăng lên khoảng 20nA sau đó giảm nhẹ và đều về khoảng 30nA 46 Hình 4-5 Sự thay đổi dòng điện của SiNW FET khi đo trong môi trường buffer PBS 0.1M 47 Hình 4-6 Hình ảnh tế bào phân bố trên bề mặt chíp SiNW FET được nhìn qua KHV huỳnh quang độ phóng đại 5000 lần Các đốm sáng là các tế bào UTV phát sáng, các đốm nhỏ trong hình vuông trắng là sợi Silic Với thiết kế và kích thước đang được sử dụng của sợi Silic như quan sát được trên hình cho ta thấy xác suất để tế bào nằm vào vùng làm việc (vùng có khả năng kết cặp với các kháng thể trên sợi SiNW) là không lớn 48

viii

MỞ ĐẦU

Cảm biến sinh học là một lĩnh vực đã được nghiên cứu từ lâu và hiện vẫn đang được quan tâm đầu tư nghiên cứu để phát triển do có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực quan trọng Ví dụ, riêng cảm biến sinh học đo glucose trong máu đã có thị trường khoảng 6 tỷ USD/năm Mục đích của mọi hệ cảm biến sinh học nhằm phát hiện được một đối tượng sinh học cần phân tích nào đó Quá trình cảm biến dựa trên một sự gắn kết đặc hiệu với độ chọn lọc cao hoặc phản ứng của chất cần phân tích với một phần tử nhận diện đã được biết trước Trong các phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, phép phân tích dựa chủ yếu vào sự thay đổi tính chất vật

lý của cảm biến khi có sự bắt cặp giữa chất phân tích và chất thử hoặc có sản phẩm mới tạo thành Nhu cầu khoa học ngày nay, không những cần phát hiện một chất

mà đòi hỏi phân tích tổng hợp cùng lúc nhiều chất khác nhau Vì thế yêu cầu tích hợp một lượng lớn các cảm biến trong một quy trình phân tích tối ưu là một đòi hỏi thiết thực

Trong nền công nghệ máy vi tính, một thành tựu đột phá là sự chế tạo thành công mạch tích hợp, gồm các transistor được chế tạo đồng thời và kết hợp lại với nhau thành một chíp duy nhất Tương tự với mô hình trong công nghệ máy tính, nhiều cảm biến sinh học khác nhau dựa trên cấu trúc transistor của sợi bán dẫn Silic (Si), có khả năng phát hiện đồng thời nhiều chất phân tích khác nhau, được chế tạo đồng thời với nhiều transistor tích hợp thành một đơn chíp có thể phát hiện đồng thời nhiều thông số mong muốn Để thực hiện quá trình cảm biến, các transistor trong một chíp cần một bộ phận chuyển đổi tín hiệu từ các quá trình phản ứng sinh hóa, các quá trình bắt cặp đặc biệt của chất phân tích thành tín hiệu điện có thể ghi nhận được

Chính vì có mối liên hệ này đòi hỏi ta phải nghiên cứu sự đáp ứng của chất bán dẫn Si, chất đang được sử dụng chủ yếu để chế tạo các linh kiện trong công nghệ máy tính, với môi trường sinh hóa xung quanh nó Tại bề mặt của chất bán dẫn, điện tích xuất hiện do thế điện của các phân tử sinh học bắt cặp trên bề mặt hay môi trường lận cận gây ra Điện tích này ảnh hưởng đến độ dẫn của chất bán dẫn Sự thay đổi về độ dẫn có thể dễ dàng đo được bằng cách bố trí hợp lý các hệ

đo có độ chính xác cao

Transistor có cấu tạo gồm ba điện cực: cực nguồn, cực máng và cực cổng Bằng cách thay đổi điện thế cực cổng có thể tăng hoặc giảm điện tích chạy qua cực nguồn và cực máng Transistor với tính chất như thế gọi là transistor hiệu ứng trường (Field Effect Transistor-FET) Dòng điện trong transistor với một hiệu điện

ix

thế không đổi có thể được điều khiển bằng cách thay đổi điện thế tại cực cổng, ngoài ra nó còn có thể thay đổi bởi các điện tích của các thành phần hóa học xung quanh bề mặt chất bán dẫn (tính chất này được ứng dụng để làm cảm biến) Những yêu cầu của loại transistor làm cảm biến sinh học khác so với loại dùng trong các mạch logic của máy tính Chất bán dẫn, làm bộ phận cảm biến của transistor, phải được lộ ra để tiếp xúc với môi trường chứa chất phân tích Bộ phận cảm biến này phải đủ nhỏ và phải có diện tích bề mặt lớn để làm tăng độ nhạy của cảm biến Vì

độ nhạy phụ thuộc nhiều vào tỉ lệ điện tích bề mặt so với tổng điện tích

Dựa trên các yêu cầu đó, transistor hiệu ứng trường dùng sợi Silic là một lựa chọn tốt nhất, vì công nghệ chế tạo mạch tích hợp làm các transistor trong công nghệ máy tính có từ lâu, nên ta có thể áp dụng công nghệ này làm transistor cảm biến

Kể từ khi transistor hiệu ứng trường sợi Silic (SiNW FET) được chế tạo và

(http://cmliris.harvard.edu/), SiNW FET đã thu hút nhiều nhóm và viện nghiên cứu

http://www.its.caltech.edu/~heathgrp/Publications.html#; Viện Công Nghệ Nano MESA http://www.mesaplus.utwente.nl/; Viện nghiên cứu A-star Singapore:

(http://www.materials.com.au/); Đại học KTH Thụy Điển http://www.kth.se; Nanosens: http://www.nanosens.nl/product.htm

Transistor hiệu ứng trường dựa trên sợi Silic kích thước nano là thiết bị hứa hẹn nhiều ứng dụng tìm năng trong y dược học Thực tế những thiết bị này cho thấy khả năng ghi nhận được nhiều chất phân tích như chuỗi DNA, dấu hiệu sinh học (biomarker), và các đối tượng lớn hơn như virus… Có nhiều loại cảm biến sinh học khác nhau đã được thiết kế và chế tạo trong suốt thập kỷ vừa qua, sử dụng nhiều vật liệu nano khác nhau để làm thành phần cảm biến như: Thanh dao động, chấm lượng

tử, thanh nano, sợi nano, dây nano, nanogap và màng kích thướt nano Một số thiết

bị cảm biến này như loại dựa trên thanh dao động (cantilevers) và chấm lượng

tử-quantum dot, có nhiều ưu điểm như: siêu nhạy, thời gian đáp ứng nhanh Nhưng nó

đòi hỏi kết hợp với những thành phần quang học để có thể chuyển các hiện tượng gắn kết bề mặt thành các tính hiệu có thể ghi nhân nên chí phí hoạt động rất cao Ngược lại, các cảm biến hoạt động trên nguyên tắc hiệu ứng trường (FET) cho ngay tín hiệu dựa trên sự tương tác bề mặt chất phân tích mà không cần kết hợp với bất

x

kỳ thành phần quang học nào khác Những cảm biến này dựa trên tính chất điện của vật liệu bán dẫn làm cảm biến, chẳng hạn độ dẫn điện của nó để cho tín hiệu đầu ra Cảm biến dựa trên cấu trúc FET hứa hẹn là cảm biến có tính cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu phân tích sinh học bằng cách cung cấp thông tin trực tiếp, cụ thể, tức thì, siêu nhạy và có tính linh hoạt cao để ghi nhận được phân tử sinh học mong muốn

Bên cạnh đó, SiNW FET cũng được dùng kiểm soát hoạt tính các enzyme và nghiên cứu cơ chế của các phân tử thuốc tiềm năng Phát hiện các chất phân tích với độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong một thời gian hợp lý là một lợi thế đang dần thành hiện thực của SiNW FET

Ung thư vú (UTV) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới, và là ung thư có tỉ lệ tử vong cao nhất ở phụ nữ1 Do chưa có kháng nguyên đặc hiệu nên việc phát hiện ung thư vú tiền di căn là việc nhiều khó khăn Trong khi

đó các tế bào ung thư dịch chuyển trong máu (circulating tumor cells - CTC) tuy mới thu hút được sự quan tâm của giới khoa học trong thời gian gần đây, nhưng việc định tính và định lượng CTC có ý nghĩa quan trọng trong quá trình phát hiện sớm ung thư, cũng như đánh giá kết quả của phương pháp điều trị và tiên lượng thời gian sống của bệnh nhân.2

Chính vì thế, chúng tôi chọn đề tài chế tạo cảm biến dựa trên cấu trúc SiNW FET để ứng dụng phát hiện tế bào ung thư vú dịch chuyển trong máu Đây là một

đề tài có liên quan đến rất nhiều lĩnh vực khác nhau từ vật liệu nano và chế tạo linh kiện kích thước nano, vật lý, hóa học, sinh học và y học Đồng thời sử dụng cảm biến SiNW FET để phát hiện CTC vẫn là lĩnh vực còn hoàn toàn mới trên thế giới nên cũng chưa có kết quả để tham khảo, đối chiếu với kết quả chúng tôi đạt được

Do đó nhiệm vụ đặt ra trong đề tài này là: chế tạo thành công chíp SiNW FET, sau

đó ứng dụng phát hiện tế bào dịch chuyển (CTC) của ung thư vú trong dung dịch nuôi cấy với nồng độ tế bào cao Từ đó đánh giá tính chất, khả năng phát hiện của chíp cảm biến chế tạo được Các kết quả ban đầu này là tiền đề quan trọng cho những bước tiếp theo nhằm hoàn thiện hướng nghiên cứu còn rất mới và nhiều tiềm năng này, tiến tới việc sử dụng cảm biến SiNW FET trong phát hiện CTC trong mẫu máu thực sau

Nội dung đề tài gồm hai phần chính [1] Chế tạo chíp cảm biến dựa trên cấu trúc SiNW FET; [2] Ứng dụng ban đầu trong phát hiện tế bào CTC của ung thư vú trong dung dịch nuôi cấy

1

CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN VỀ CẢM BIẾN SiNW FET

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CTC TRONG UNG THƯ VÚ

1.1.1 Khái niệm về CTC

Năm 1869 Thomas Ashworth lần đầu tiên phát hiện ra tế bào ung thư dịch chuyển trong máu (circulating tumor cells-CTC) CTC là các tế bào ung thư lưu chuyển trong quá trình tuần hoàn máu, nó xuất phát ra từ các khối u sơ khởi hoặc từ các tế bào di căn ban đầu Nó biểu hiện khi bệnh nhân bị các loại ung thư di căn khác nhau như ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến và ung thư đại trực tràng CTC di chuyển trong máu, quá trình phát tán của CTC tới các cơ quan trong cơ thể được xem là mầm móng phát sinh các khối u mới cũng như nguyên nhân gây di căn3 CTC tồn tại trong máu đã được biết từ lâu nhưng thời gian gần đây, với sự phát triển của công nghệ micro và nano, phát triển các thiết bị phân tích tương thích về kích thước và với độ nhạy, chúng ta mới có thể nghiên cứu về CTC hiệu quả Nhiều công trình chứng minh rằng nồng độ CTC trong máu có liên quan mật thiết tới tình trạng ung thư, các giai đoạn ung thư, các thông tin liên quan khác đến ung thư Số lượng CTC đóng vai trò là các dấu hiệu sinh học quan trọng, là một trong các yếu tố tiên lượng chính xác quá trinh di căn…

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu CTC:

Năm 1869 Thomas Ashworth phát hiện ra tế bào ung thư dịch chuyển trong máu (circulating tumor cells-CTC) của một bệnh nhân nam bị ung thư di căn4 Ông

khẳng định rẳng: “những tế bào giống hệt các tế bào ung thư của nó đang tồn tại

trong máu có thể là tín hiệu cho biết trạng thái, nguồn gốc của nhiều khối u tồn tại trong một bệnh nhân” Đến những năm 1990 các bác sĩ mới nhận thấy được lợi ích

của CTC trong chẩn đoán nhờ những nghiên cứu chứng tỏ các tế bào ung thư mẹ đã xuất hiện trong tủy xương trước khi di căn xuất hiện

Tuy nhiên phát hiện CTC trong máu là một việc rất khó khăn và nhiều thách thức, đặc biệt chỉ dùng những thiết bị truyền thống như kính hiển vi, vì kích thước CTC tương đương với kích thước các tế bào bạch cầu, nhưng nộng độ thì của nó lại rất thấp, thường từ khoảng 1-10 tế bào/mL Bênh cạnh đó sự biểu hiện của CTC trong máu là một quá trình gián đoạn, nên việc ghi nhận CTC sẽ không đồng nhất Tất cả các CTC di chuyển trong máu không cùng định sứ tại một cơ quan nào vì phần lớn CTC sẽ bị chết trong quá trình tuần hoàn máu

Tuy vậy vẫn có một hoặc một số rất ít các tế bào này sống sót, khi gặp điều kiện thuận lợi nó phát triển và sinh sôi để hình thành các khồi u mới Trong ung thư, có các tế bào khối u cứng, xuất phát từ các tế bào biểu mô chiếm tới 80% các ca ung thư được chẩn đoán, CTC thường được phân biệt bằng các dấu hiệu liên quan đến biểu

2

mô của chính nó Các dấu hiệu này có thể dùng để phát hiện CTC và có thể nghiên cứu cơ chế di căn ung thư thậm chí ở mức độ tế bào, đặc biệt trong máu và trong tủy xương của bệnh nhân Phát hiện sự tồn tại của CTC trong máu giúp phát hiện sớm ung thư vài năm trước khi ung thư khởi phát di căn, và tăng khả năng đánh giá rủi ro

và giúp đưa ra những y lệnh điều trị thích hợp cho bệnh nhân Những tế bào này có rất nhiều tiềm năng cho ta một phương pháp mới để điều trị ung thư, đó là can thiệp

và tiêu diệt các tế bào CTC Để phản ánh sự phát triển của lĩnh vực nghiên cứu về CTC, phát hiện CTC đã được giới thiệu trong hệ thống phân chia giai đoạn ung thư quốc tế và năm 2007 Hiệp Hội Ung Thư Lâm Sàn Hoa Kỳ khuyến cáo biểu hiện CTC là một dấu hiệu phát hiện ung thư vú

Những hiểu biết về CTC giúp kiểm soát quá trình di căn do CTC phát tán, nên

sẽ có ảnh hưởng tích cực đến sự của bệnh nhân và quá trình theo dõi lâm sàn Hiện tại, các dữ liệu chứng tỏ có thể dùng CTC như yếu tố theo dõi bệnh nhân mắc ung thư vú, trong khi những khía cạnh khác của bệnh học có liên quan đến CTC đang được nghiên cứu nhờ những công nghệ mới5 Kiểm tra CTC trong máu là phương pháp ít xâm lấn so với các phương pháp lấy sinh thiết, đồng thời có thể thực hiện nhiều lần từ một mẫu máu được lấy ra

Với sự phát triển của công nghệ micro-nano, cho phép tạo ra những vật liệu mới, những linh kiện, thiết bị mới và các hệ thống mới ở kích thước tế bào, phân tử, nguyên tử giúp phát hiện CTC hiệu quả Nhiều loại thiết bị cảm biến sử dụng vật liệu cấu trúc micro-nano khác nhau đã và đang phát triển để ứng dụng phát hiện CTC Đó

là một lĩnh vực nghiên cứu mới và nhiều hứa hẹn

1.1.3 Các phương pháp phát hiện CTC

Phương pháp ly tâm

Có nhiều công nghệ khác nhau để phát hiện CTC trong máu người, phương pháp truyền thống phổ biến nhất là phương pháp ly tâm Các thành phần nặng hơn trong mẫu máu sẽ lắng xuống dưới đáy, trong khi các thành phần nhẹ hơn gồm các tế bào dịch chuyển CTC sẽ nổi lên trên Các tế bào này sau đó được nhuộm và soi dưới kính hiển vi để phát hiện CTC Quá trình này đòi hỏi nhiều thời gian và công sức, trong khi độ chính xác phụ thuộc nhiều vào kỹ năng của kỹ thuật viên Ngoài ra, tỉ lệ thu hồi tế bào cao nhất chỉ 70% Tỉ lệ thu hồi thấp là do máu có xu hướng trộn lẫn với dung dịch pha loãng nếu chưa được ly tâm ngay

Màng Lọc

Màng lọc được dùng lần đầu tiên là màng polycabonate Đây là phương pháp đơn giản và rẻ tiền để làm giàu và bắt các CTC Nguyên lý phát hiện CTC của màng lọc dựa trên sự khác nhau về kích thước của các tế bào dịch chuyển, CTC lớn hơn các

3

loại tế bào khác trong máu, nên khi đi qua màng lọc với kích thước thích hợp nó sẽ bị giữ lại, trong khi các tế bào khác vẫn chui qua được Màng polycacbonate này được khoét lỗ ngẫu nhiên bằng phương pháp ăn mòn tạo ra cấu trúc xốp Theo cách này mật độ các lỗ thấp và thường phân bố thành cụm, và không đều Mặc dù hiệu quả bắt

tế bào khoảng 50-60%, nhưng khi bắt CTC trong hỗn hợp với tế bào bạch cầu, cần tính toán độ nhiễu của kết quả do tế bào bạch cầu có kích thước tương đương với kích thước CTC Độ nhạy của phương pháp khoảng 1 CTC/mL

Kích thước CTC không đồng nhất lớn hơn 8-10µm, do đó có thể cho kết quả dương tính giả và âm tính giả khi dùng phương pháp màng lọc Một trong những màng lọc cải tiến của màng polycabonate là màng lọc kích thước micro paralyne

C6(Zheng et al 2007) Màng paralyne dựa trên nhiều tính chất khác nhau để phát

hiện CTC Màng lọc này có khả năng khắc phục các lỗi do sự ô nhiễm sinh học trong mẫu phân tích Nó có tính chất cơ học tuyệt vời như có khả năng kéo giãn hai lần, trong suốt với ánh sáng UV và ánh sáng nhìn thấy nên dễ dàng phân tích, quan sát và nhuộm màu CTC trực tiếp trên màng lọc mà không cần chuyển CTC sang lam kính, nhờ đó làm giảm sự mất mát CTC Thực nghiệm cho thấy tỉ lệ thu hồi CTC lên đến 90% khi dùng màng paralyne, thế nhưng cũng giống như những thiết bị dựa trên màng polycabonate, liệu kích thước CTC có thực sự lớn hơn đáng kể so với tế bào hồng cầu? Đó vẫn đang là một câu hỏi Vì thế kỹ thuật này bị những hạn chế tương

tự như màng polycacbonate, làm cho nó dễ gây ra các kết quả dương tính, âm tính giả

Cellsearch

Nguyên lý: Cellsearch là thiết bị duy nhất được cơ quan quản lý thuốc Hoa Kỳ

(FDA) cấp phép và cũng là sản phẩm thương mại duy nhất trong phát hiện CTC7(Cristofanilli et al 2004) Đó là phương pháp pháp hiện CTC dựa trên hướng

tiếp cận gắn miễn dịch: khi một kháng thể đặc hiệu liên kết với các kháng nguyên tương ứng của tế bào biểu mô đi kèm CTC để phân tách các tế bào này Các kháng nguyên này thường là các phân tử bám dính tế bào biểu mô EpCAM (Epithelial Cell ahhesion molecule) Phương pháp Cellsearch đã được áp dụng phát hiện CTC của nhiều loại ung thư di căn khác nhau như: ung thư vú, ung thư đại tràng, và ung thư tiền liệt tuyến Một mẫu máu 10mL lấy ra từ cơ thể chứa nhiều tế bào bạch cầu và một số ít hoặc rất ít các CTC khác nhau Sau đó mẫu máu được bảo quản trong môi trường chống độc để giữ tế bào Mẫu máu được giữ ở nhiệt độ phòng và phân tích trong thời gian 72 giờ Một bộ kit chứa các kháng thể đặc hiệu với các EpCAM nhằm làm giàu CTC và các chất đánh dấu tế bào bạch cầu và tế bào biểu mô Các kháng thể này có gắn các hạt nano có từ tính Khi kháng thể EpCAM bắt cặp với kháng nguyên của CTC, sau đó dưới tác dụng của một từ trường mạnh các CTC này sẽ tách

ra khỏi máu theo các hạt nano từ Các tế bào không liên kết được hút ra, còn các tế

4

bào đã được tách bằng từ trường sẽ được ủ nhuộm trong một khoảng thời gian, khi đó

từ trường phân tách được lập lại để gom các CTC đã nhuộm hoặc được đánh dấu Cuối cùng chất nhuộm dư sẽ được hút ra Các CTC này được xác định thông qua kính hiển vi huỳnh quang bán tự động dưới sự hỗ trợ của máy tính để tái tạo lại hình ảnh của tế bào Nó là các tế bào có bề mặt gồ ghề, dương tính với anti cytokeratin và

âm tính với anti CD45

Nhược điểm: Những hệ thống như Cellsearch có các nhược điểm như: [1] cần

nhiều bước thực hiện để làm tinh khiết và làm giàu CTC nên dễ gây thất thoát tế bào [2] Khó áp dụng với những CTC không chứa các phân tử biểu mô EpCAM, khi tế bào đang trong trạng thái chuyển dịch trung gian biểu mô (Epithelial to Mesenchimal Transition-EMT), lúc đó làm cho tế bào giảm khả năng bám dính với kháng thể khi chúng ngẫu nhiên tách ra và đi vào tuần hoàn máu Phương pháp phát hiện thông qua các phân tử bám dính tế bào biểu mô (EpCAM) không thể áp dụng với những ung thư không có EpCAM như sarcomas Chưa có kết luận phương pháp Cellsearch có thể ghi nhận được tất cả các nhóm các tế bào ung thư của ung thư vú như: loại bình thường (normal like), basal, dương tính HER2, loại tế bào luminal A, loại luminal B FDA khuyến cáo Cellsearch chỉ áp dụng cho phát hiện CTC của ung thư di căn, nên với những ung thư chưa di căn thì kết quả chưa được kiểm chứng Mặt khác Cellsearch là một hệ kín, không có tính kết nối với các thiết bị khác, và chi phí cho một lần kiểm tra thường tốn kém

1281 CTC/mL Thí nghiệm cho thấy hiệu quả của thiết bị phụ thuộc nhiều vào vận tốc bơm máu qua các đường dẫn vì tốc độ chảy quyết định thời gian tiếp xúc của CTC với các thanh Silic và lực liên kết của nó khi bị bắt lại tại các thanh Silic này Vận tốc phải đảm bảo đủ nhỏ khoảng 1ml/h để sự gắn kết CTC và thanh micro Silic bền nhất Với tốc độ đó, CTC chip đòi hỏi từ 6-8h để xử lý xong một mẫu 10ml máu bệnh nhân Năng suất của CTC chip giảm 20% khi tăng tốc độ chảy lên 3ml/h Một nhược điểm khác là CTC chip chỉ bắt các EpCAM vì thế không phát hiện được các tế bào ở thời kỳ EMT cũng như những ung thư sarcomas vì sarcomas không biểu hiện EpCAM Khi giảm kích thước các thanh Silic về kích thước nano thì tỉ lệ bắt CTC tăng lên 65% 9

và thời gian cần thiết cũng mất hàng giờ để thực hiện một mẫu phân

Ngoài ra Silic là chất bán dẫn và nồng độ hạt tải được kiểm soát nhờ quá trình

pha tạp thành bán dẫn loại N hoặc loại P, cho phép chế tạo được cảm biến với cường

độ dòng điện thích hợp để có độ nhạy cao nhất - tức là khả năng can thiệp các tham

số của cảm biến dễ dàng để có được tính chất mong muốn Việc kết hợp SiNW FET với các mồi sinh học tạo nên cảm biến nano sinh học thế hệ mới Các khả năng làm

việc ưu việt của cảm biến sợi nano sinh học có thể được trình bày vắn tắt dưới đây:

 Chỉ cần một vài phân tử sinh học (từ dung dịch hoặc không khí) bám lên bề mặt

sợi nano Silic cũng đủ làm thay đổi đáng kể điện trở của sợi - tính siêu nhạy

của cảm biến

 Vì các cặp mồi sinh học được thiết kế để sử dụng có tính kết cặp siêu chọn lọc,

cho phép cảm biến có độ chọn lọc rất cao với chất cần phát hiện - tính chọn lọc

đặc trưng rất cao của cảm biến Tính kết cặp chọn lọc cao của các cặp mồi

sinh học là một tính chất phức tạp, nhưng tuyệt vời của tự nhiên, cho phép phân biệt từng cá thể riêng biệt trong một quần thể phức tạp, phong phú Ví dụ trong khi trái đất có trên 6 tỉ người với từng ấy phân tử DNA khác biệt, nhưng một phân tử DNA sẽ chỉ kết cặp duy nhất với một DNA khác được thiết kế tương thích)

 Một cảm biến sinh học có thể được chế tạo bao gồm nhiều sợi nano (array of nanowires) mà mỗi sợi được gắn kết với một mồi sinh học đặc trưng Cảm biến

 Tính tự do chức năng bề mặt: Lĩnh vực nghiên cứu về Silic có từ rất lâu đời

nên bản chất của vật liệu Silic cũng như các quá trình hóa học liên quan trong quá trình chức năng bề mặt sợi Silic trên đế SiO2 là một thuận lợi rất lớn trong quá trình chế tạo đảm bảo tính chính xác và tính ưu việt Dễ dàng gắn các thụ thể khác nhau để phát hiện các biomaker khác nhau trong từng mục đích nhất định

 Tính tích hợp: Trong cùng một dụng cụ, với nhiều cảm biến có cấu trúc

SiNWs được chế tạo trên một diện tích rất nhỏ, chứa trong một thiết bị duy nhất Mỗi một sợi Silic được chức năng với một phân tử sinh học cụ thể khác nhau để phát hiện một phân tử sinh học đặc hiệu với nó Như vậy với nhiều sợi được chức năng khác nhau có thể phát hiện đồng thời các biomaker trong cùng một thiết bị (lab on chip)11

 Tính tương thích: Thừa hưởng thành tựu của công nghệ máy tính nên cảm

biến SiNWs FET có tính tương thích cao với các thiết bị ngoại vi Nhờ tính tương thích với việc chế tạo các thiết bị công nghệ micro điện tử nên chỉ cần áp dụng công nghệ micro để giảm kích thước thiết bị và sẽ cho ta một thiết bị ở kích thước nano, nhạy hơn, chi phí thấp và khả thi12

 Tính tức thời: Vì cảm biến hoạt động thông qua sự đo đạc trực tiếp, liên tục

của tín hiệu điện, cho phép các phân tích được phát hiện nhanh, rút ngắn đáng kể thời gian thực hiện một mẫu phân tích 13

Với các ưu việt nói trên SiNWs FET hứa hẹn là một trong những công nghệ hiệu quả trong việc phát hiên CTC ứng dụng cho nhiều mục tiêu khác nhau như chẩn đoán, tiên lượng, đánh giá kết quả điều trị, tầm soát các bệnh ung thư Chính vì thế, năm 2011 nhóm các nhà khoa học Thụy Điển đã đề xuất một dự án nghiên cứu chế

tạo thiết bị phát hiện CTC trong máu với kinh phí lên tới 64 triệu Korana (tương

đương 10 triệu USD)14

1.1.4 Ý nghĩa lâm sàng của CTC

Số lượng CTC được ghi nhận có một ý nghĩa quan trọng: đánh giá hiệu quả điều trị: theo dõi số lượng CTC trước và sau khi áp dụng một phương pháp điều trị mới để kết luận phương pháp điều trị tốt nếu lượng CTC giảm, và ngược lại thì cần phải đổi phương pháp điều trị, thuốc điều trị khi lượng CTC không giảm Nghiên cứu của công ty Varidex trên 177 bệnh nhân bị ung thư vú cho thấy rằng tỉ lệ sống sót trung bình rất thấp với những bệnh nhân biểu hiện số lượng CTC cao trong lần thăm

7

khám đầu tiên Số lượng CTC trong ung thư vú di căn trước khi áp dụng một phương pháp điều trị, có giá trị đánh giá hiệu quả của phương pháp điều trị đó thông qua tỉ lệ bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng không nguy hiểm hơn và đánh giá kết quả điều trị sau một thời gian nhất định thông qua yếu tố tỉ lệ sống của bệnh nhân15

Tiên lượng thời kỳ bệnh: mức độ nguy hiểm của giai đoạn bệnh có liên quan

mật thiết với hàm lượng CTC Phát hiện CTC ở nồng độ thấp là yếu tố tiên lượng thời kỳ bệnh hiệu quả Lúc đó áp dụng phương pháp phẫu thuật hoặc một phương pháp điều trị thích hợp có thể ngăn chặn sự phát triển của bệnh CTC có thể chỉ ra giai đoạn sớm hay muộn của bệnh và tương quan đến khả năng sống sót của bệnh nhân CTC có giá trị tiên lượng cao và là yếu tố độc lập trong ung thư vú khi so sách với các các yếu tố tiên lượng đang được dùng như kích thước khối u, hình thái, chi tiết của khối u đối với những bệnh khác nhau (phenotypic subtype of disease) và CTC có thể là dấu hiệu quan trọng trong sinh học ung thư trong ung thư vú di căn16 Thực tế cho thấy những bệnh nhân được phát hiện có CTC ở tình trạng nguy hiểm hơn bệnh nhân không biểu hiện CTC17

Khía cạnh sinh học của CTC: Về khía cạnh sinh học tế bào, thông tin về CTC

vẫn còn nhiều hạn chế Nên cần nhiều nghiên cứu để có một tập hợp thông tin sinh học đầy đủ của nó kèm theo đó là cơ sở phân loại CTC dựa trên các biểu hiện bề mặt khác nhau, cũng như xác định hàm lượng ngưỡng nguy hiểm của từng loại là một nhiệm vụ quan trọng giúp cung cấp một số chỉ dẫn điều trị ung thư hiệu quả hơn Những thiết bị ghi nhận các tín hiệu về điện, từ, quang dựa trên công nghệ nano có thể được dùng để phát triển thiết bị phân tích cầm tay, chúng có thể phân loại bệnh nhân dựa trên các tín hiệu miễn dịch học Ngoài ra nó còn kích thích phát triển các loại thuốc đặc biệt nhằm cắt đứt quá trình di căn dựa trên các thông tin về tế bào của bênh nhân

Thông tin di truyền: Thông tin di truyền ẩn chứa trong CTC vẫn còn là hiện

tượng chưa được hiểu thấu đáo và nếu nghiên cứu thông tin di truyền này có thể mang lại những tín hiệu mới cho quá trình nghiên cứu quá trình chuyển dịch trung gian biểu mô (Epithelial to Mesan Transformation-EMT) CTC gần đây thể hiện những tính chất giống với tính chất của tế bào gốc18(Mark 2007) CTC giúp biết được

vị trí nguồn gốc của khối u thông qua quá trình tự gieo mầm ung thư

Sinh học ung thư - Cơ chế của quá trình di căn: nghiên cứu CTC có thể giúp

chúng ta khám phá cơ chế quá trình di căn để có thể can thiệp, ngăn chặn quá trình di căn, từ đó phát triển các loại thuốc thích hợp nhằm ngăn chặn quá trình phát tán di căn

8

1.2 NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CẢM BIẾN SINH HỌC SiNW FET

Một FET cảm biến có cấu trúc là một transistor có ba điện cực, trong đó cực nguồn và máng nối với nhau qua một kênh chất bán dẫn và cực cổng có khả năng điều khiển sự dẫn điện của kênh này Một FET cảm biến nano, kênh dẫn được làm từ vật liệu nano Silic Để phát hiện một đối tượng sinh học nào đó, ta cần gắn các chất nhận biết nó lên trên bề mặt sợi Silic để khi có phản ứng xảy ra, hoặc quá trình bắt cặp của chúng xảy ra sẽ làm ảnh hưởng đến độ dẫn điện của sợi Silic, kênh dẫn của transistor Chất nhận biết này được chọn tiên quyết để có thể bắt được phân tử mục tiêu (chất cần phân tích) với tính chuyên biệt duy nhất và ái lực càng mạnh càng tốt Nếu sợi Silic là chất bán dẫn loại P thì khi có phần tử tích điện âm bị bắt lại trên

bề mặt sợi sẽ làm tăng dòng điện chạy qua sợi, ngươc lại nếu chất cần phân tích mang điện tích dương, khi bị bắt tại sợi Silic loại P sẽ làm giảm dòng điện Ngược lại, với sợi Silic là bán dẫn loại N, thì khi phần tử mang điện tích âm bị bắt lại trên bề mặt sẽ làm giảm dòng điện qua sợi và trường hợp phần tử mang điện dương bị bắt sẽ làm tăng cường độ dòng điện qua sợi Biên độ thay đổi dòng điện mang ý nghĩa định lượng các chất cần phân tích

Hiện tượng trên gọi là hiệu ứng trường Hiện tượng đó có thể giải thích bằng cơ chế tiếp xúc P-N như sau: Khi đối tượng mang điện tích dương bị bắt lại trên bề mặt sợi Silic loại P, với thành phần hạt tải chính là lổ trống mang điện dương, do thế tĩnh điện nên chúng đẩy nhau tạo ra một vùng không gian ở giữa không mang điện nên làm giảm độ dẫn điện chạy qua sợi Trong khi đó nếu đối tượng bị bắt lại mang điện

Hình 1-1.(a) Cấu tạo của một cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc transistor hiệu

ứng trường sợi Silic Hai điện cực nguồn và máng được nối với nhau qua kênh dẫn sợi Silic kích thước nanomet Độ dẫn qua sợi được điều chỉnh bằng thế điện áp vào cực cổng ở đế Silic (b) Sự thay đổi tính cường độ dòng điện chạy qua sợi Si loại P khi có các phần tử bị bắt lại trên sợi Dòng điện giảm khi đối tượng mang điện tích dương, cùng dấu với điện tích hạt tải chính trong sợi, làm dòng điện qua sợi giảm Trong khi đối tượng mang điện tích âm bị bắt làm dòng điện tăng lên

miễn dịch, và dựa trên tế bào

Ưu điểm của SiNWs FET là khả năng chuyển đổi tín hiệu trực tiếp từ sự tương tác của các phần tử sinh học xảy ra trên bề mặt sợi Silic thành tín hiệu điện mà không cần qua bất kỳ một quá trình trung gian nào Công nghệ xử lý bề mặt vật liệu Silic có

từ lâu đời và quy củ nên việc chức năng hóa bề mặt sợi Silic để hình thành các loại cảm biến khác nhau, mang lại sự thuận tiện trong chế tạo Chính vì quá trình chuyển đổi tín hiệu trực tiếp nên thời gian đáp ứng nhanh Đồng thời các cảm biến này có thể tái sử dụng bằng phương pháp tái chức năng bề mặt Trong quá trình chế tạo, độ dẫn điện của sợi Silic có thể đươc kiểm soát nhờ kiểm soát tỉ lệ pha tạp Môi trường để đưa chất cần phân tích vào cảm biến SiNW FET ảnh hưởng rất lớn đến sự hoạt động của cảm biến: nồng độ ion, độ tinh khiết của nước, độ pH chính vì thế với các nhóm nghiên cứu khác nhau trên thế giới khi thực hiện đo trong môi trường khác nhau thì khó mà so sánh được nên cần có một môi trường chuẩn cho tất cả các nghiên cứu sau này Các thông số quan trọng cần quan tâm khi chế tạo SiNW FET là: [1] Độ dài kênh dẫn, chiều dài sợi Silic; [2] độ rộng kênh dẫn, là độ rộng của điện cực; [3] loại chất thụ động điện cực

Với SiNW FET, chế tạo trong luận văn này, thì đế Silic có vai trò làm điện cực cổng, kích thước của linh kiện sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới thời gian đáp ứng của nó

Độ dài kênh dẫn là khoảng cách giữa điện cực nguồn và điện cực máng

Hình 1-2 Chíp SiNW FET gồm nhiều sợi Si đặt song

song nhau, mỗi sợi được gắng một phần tử khác nhau nhằm phát hiện những đối tượng khác nhau, nên cảm biên có thể đo đồng thời nhiều thông số khác nhau

10

Độ rộng kênh dẫn: là độ rộng của điện cực nguồn và điện cực máng 19

(Sheehan &

Whitnan) khi mô phỏng cho thấy rằng độ rộng này ảnh hưởng trực tiếp và lớn đến số

lượng chất phân tích bị bắt lại trên bề mặt sợi nano Si, vì độ nhạy phụ thuộc vào dòng các chất phản ứng đi qua sợi cảm biến Khi kênh dẫn rộng hơn thì thời gian để cho được một tín hiệu ra sẽ nhỏ hơn nhiều đối với cùng một nồng độ chất phân tích cho trước Độ rộng kênh dẫn tính theo lý thuyết tối ưu là 2-10µm Điện cực: thường đươc làm từ Au, Pt, Ni có độ dày khoảng 50-100nm Lớp vật liệu bám dính cho điện cực thường là: Ti, Cr, Al (5-50nm), có chức năng tạo tiếp xúc thuần trở giữa sợi Silic và các kim loại làm điện cực Ngoài ra phần điện cực còn được phủ một lớp cách điện thường là Si3N4 để ngăn chặn quá trình bị ăn mòn, phản ứng điện hóa hoặc sự thay đổi công thoát khi có những chất lạ bám lên bề mặt nó

1.3 PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO SiNW FET

Có hai phương pháp chính (top down và bottom up) được sử dụng để chế tạo SiNW FET làm cảm biến sinh học Trong đó sợi Silic có thể được chế tạo với nhiều kích thước khác nhau, mật độ hạt tải khác nhau, và độ linh động của hạt tải khác nhau Tất cả các yếu tố đó ảnh hưởng đến sự hoạt động của thiết bị cảm biến Có nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm làm rõ sự phụ thuộc của đặc tính cảm biến vào kích thước của sợi nano và nộng độ pha tạp Khi so sánh tính chất điện của FET dùng sợi nano trong môi trường có độ pH khác nhau, kích thướt sợi nano thay đổi trong khoảng 50-170nm, cho thấy rằng sự ảnh hưởng của môi trường giảm dần theo chiều tăng dần kích thước đường kính sợi20 và khi đường kính lớn hơn 150nm, nó thể hiện tính chất như sợi có kích thước micro Từ thực nghiệm cũng cho thấy sợi nano pha tạp với nồng độ hạt tải thấp sẽ nhạy hơn khi pha tạp cao hoặc không pha tạp21

1.3.1 Chế tạo sợi nano Silic bằng phương pháp Top Down (TD)

Top down là phương pháp chế tạo SiNW FET từ đế Silic loại SOI (Semiconductor On Insulator-SOI) dựa trên các kỹ thuật chủ yếu bao gồm quang

Hình 1-3 Độ dài sợi Silic và độ rộng của vùng chứa sợi và chất làm thụ động hóa

bề mặt là những thông số cần quan tâm khi chế tạo SiNW FET

11

khắc nano (nanolithography), ăn mòn (etching), tạo đường dẫn (metallization) để có được cấu trúc SiNW FET mong muốn Wafer sử dụng chế tạo sợi Silic trong phương háp TD là loại đế SOI có ba lớp: (1) lớp đế là lớp Si đã được pha tạp nhiều, có chức năng đóng vai trò là cực cổng của FET, (2) lớp giữa là lớp điện môi SiO2 có kích thước 50-200nm, (3) lớp trên cùng là lớp đơn tinh thể Si (20-300 nm), sợi Silic nano

sẽ được chế tạo ở lớp trên cùng này Kỹ thuật dùng trong TD để định dạng sợi nano

có thể là các kỹ thuật ăn mòn ướt, ăn mòn khô, quang khắc, khắc bằng chùm tia điện tử, hoặc phương pháp dịch chuyển về kích thước nano như phương pháp dịch chuyển thành cấu trúc sợi nano trong siêu mạng Sợi nano được chế tạo từ TD có tính đồng nhất và định hướng cao, kích thước sợi thường được chế tạo trong khoảng 30-100nm Sợi nano được chế tạo bằng TD có hiệu suất cao theo một hướng và vị trí cho trước, như thế dễ dàng chế tạo thành những thiết bị có chức năng mong muốn

1.3.1.1 Ăn mòn

Có hai kỹ thuật ăn mòn là: ăn mòn ướt là quá trình ăn mòn xảy ra ở pha lỏng và

ăn mòn khô là quá trình ăn mòn xảy ra ở pha khí Trong quy trình chế tạo SiNW FET bằng kỹ thuật ăn mòn ướt, cần chú ý nhất là hướng ưu tiên của quá trình ăn mòn Si (anisotropic etching), vì quá trình này kiểm soát kích thước sợi Si Ngoài ra kỹ thuật

ăn mòn lớp SiO2 cũng là một điều cần quan tâm lưu ý Cơ chế quá trình ăn mòn gồm

ba bước: quá trình khuyếch tán chất ăn mòn (chất phản ứng) lên lớp bề mặt màng, quá trình ăn mòn màng mỏng (phản ứng xảy ra giữa chất ăn mòn và màng mỏng làm cho màng mỏng bị ăn mòn), cuối cùng là quá trình khuếch tán ngược của sản phẩm của quá trình ăn mòn ra ngoài

Hình 1-4 Ba quá trình của cơ chế ăn mòn là quá trình khuếch tán, quá trình ăn mòn,

và quá trình thải sản phẩm của quá trình ăn mòn ra ngoài

12

Ăn mòn SiO2: Khi ăn mòn lớp SiO2 yêu cầu phải chọn chất ăn mòn sao cho chỉ

ăn mòn SiO2 mà không ăn mòn Si Axít flohiđric (HF) là thường dùng trong quá trình

ăn mòn này Nhưng khi dùng trực tiếp HF thì phản ứng xảy ra rất nhanh, HF 1% đã

có tốc độ ăn mòn SiO2 5nm/phút, nên rất khó kiểm soát, đặt biệt khi cần kiềm soát ở

độ chính xác từng nano mét Tuy nhiên nồng độ dung dịch HF bị giảm rất nhanh trong quá trình ăn mòn làm thay đổi tốc độ ăn mòn trong quá trình sử dụng Vì thế trong thực tế, HF được pha loãng trong dung dịch đệm (buffer solution) để có tốc độ

ăn mòn thấp và ổn định trong suốt quá trình ăn mòn, cho phép kiểm soát được chiều dày của lớp bị ăn mòn tương ứng với thời gian ăn mòn

Ăn mòn ướt Si: Chất ăn mòn thường dùng là dung dich KOH nồng độ thấp Trong cơ chế ăn mòn ướt màng Silic để hình thành cấu trúc sợi nano, ta cần biết cơ chế ăn mòn ướt có thể giống nhau về mọi hướng, có khi ưu tiên một hướng nào đó Xét về hình thái vật liệu khi bị ăn mòn có thể chia ra làm ba loại: ăn mòn đẳng hướng, ăn mòn dị hướng và ăn mòn siêu dị hướng

Hình 1-5 Ba cơ chế ăn mòn: a- đẳng hướng, b- dị hướng, c- siêu dị hướng

[Hình 1-5a] ăn mòn đẳng hướng (Isotropic): Tốc độ ăn mòn là như nhau theo mọi hướng, thường chỉ phụ thuộc vào tính chất hóa học của các chất

[Hình 1-5b] ăn mòn dị hướng (Anisotropic): Tốc độ ăn mòn theo một hướng nào đó nhanh hơn các hướng khac (ưu tiên một hướng nhất định)

[Hình 1-5c] ăn mòn siêu dị hướng (compeletely anisotropic): Tốc độ ăn mòn chỉ thẳng theo một hướng duy nhất

Trong phương pháp TD, nanolithography là một trong các kỹ thuật chủ yếu nhất được sử dụng kết hợp với quá trình ăn mòn để chế tạo sợi nano Silic Nanolithography có hai loại: photolithography dùng tác nhân là photon và e_beam lithography dùng tác nhân là chùm điện tử Trong quy trình này chất cảm quang (photoresist) được phủ lên vật liệu mong muốn, khi nó bị chiếu sáng hoặc chiếu chùm electron (theo các định dạng định sẵn) thì tính chất hóa học của nó thay đổi, tạo nên những cấu trúc mong muốn [Hình 1-6]

• Làm sạch bề mặt wafer

• Phủ (Coating): là quá trình phủ chất cảm quang (photoresist) lên bề mặt wafer

• Pre-Bake (Soft Bake): là quá trình nung tại nhiệt độ thấp làm bay hơi các thành

phần dung môi trong lớp chất cảm quang nhằm mục đích:

- Tránh các bụi bẩn bám trên mặt nạ

- Tránh cấu trúc xốp và bọt trong photoresist khi bơm khí N2 trong suốt quá trình chiếu

- Tăng độ kết dính của photoresist với đế

- Tránh quá trình xói mòm khi đưa qua bước hiện cấu trúc (development)

- Tránh sự phân lớp trong một lớp photoresist khi thực hiện nhiều bước phủ đồng thời

- Tránh bị rỗ cho những quá trình xử lý nhiệt tiếp theo (coating, ăn mòn khô…)

Hình 1-6 Quy trình lithography dùng trong phương pháp chế tạo sợi Silic

14

• Bước tiếp theo trong quá trình lithography là bước sắp xếp mặt nạ và wafer cho đúng vị trí trước khi chiếu sáng hoặc chiếu bằng chùm tia electron

• Exposure: Chiếu ánh sáng hoặc chiếu chùm electron lên lớp chất cảm quang

• Development: quá trình hiện cấu trúc mong muốn qua bước rửa wafer Với những

vị trí chất cảm quang bị chiếu sáng hoặc không chiếu sáng sẽ bị rửa đi tùy theo loại photoresist dương hay âm

• Post-Bake (Hard Bake): Là bước nung nhiệt sau quá trình development nhằm làm

tăng độ bền nhiệt, hóa, và vật lý của cấu trúc chất cảm quang đã được hình thành để dùng cho những quá trình tiếp theo như mạ điện, ăn mòn

1.3.1.2 Chế tạo sợi nano bằng kỹ thuật E-beam

Là kỹ thuật dùng chùm electron để tạo khuôn trên mặt của đế wafer Chiều rộng của sợi nano thường 50nm và chiều dài là 20µm-1mm Phương pháp quang khắc dùng tia UV kết hợp với chiến lược suy giảm kích thước có thể tạo ra nhiều sợi nano (NWs) có chiều rộng từ 5-50nm, nhỏ hơn khi dùng phương pháp E-beam

1.3.1.3 Chế tạo sợi nano bằng phương pháp siêu mạng (Superlattice nanowire

pattern transfer-SNAP)

Kỹ thuật molecular beam epitaxy được sử dụng để tạo ra một khuôn trên một lớp siêu mạng từ đó các sợi nano sẽ được chế tạo thông qua kỹ thuật phún xạ (sputtering) lên trên cấu trúc siêu mạng Sau đó các sợi nano tạo ra trên khuôn này sẽ được chuyển lên đế SOI đã pha tạp thành bán dẫn loại P hoặc N trước đó Sau đó dùng kỹ thuật ăn mòn để tạo ra các sợi nano Silic, sử dụng các sợi nano kim loai làm vật đinh dạng

15

Hình 1-7 Quy trình chế tạo sợi nano Silic bằng kỹ thuật SNAP (a) cấu trúc siêu

mạng GaAs/Al x Ga 1-x As (b) các cạnh của siêu mạng được ăn mòn khác nhau (c) kim loại bạch kim (Pt) được phủ lên các cạnh của siêu mạng (d) chập các cạnh có kim loại đã phủ của siêu mạng lên wafer SOI đã có trước lớp polyme, khi đó lớp kim loại đơn tinh thể sẽ gắn với lớp Silic đơn tinh thể của wafer (e) ăn mòn siêu mạng, chỉ còn lại lớp kim loại trên đế wafer (f) lớp kim loại đóng vai trò là mặt nạ khi ăn mòn khô hình thành cấu trúc sợi.(g) cuối cùng các sợi kim loại bị tẩy đi, hiện ra các sợi Silic đồng đều và định hướng cao

Phương pháp này có ưu điểm như: chế tạo đươc sợi nano đồng nhất có tính định hướng cao, và có thể kiểm soát chiều dài của sợi Tuy nhiên nó cũng gặp phải nhiều nhược điểm, đặc biệt là chi phí chế tạo rất cao để tạo khuôn có các siêu mạng

1.3.2 Chế tạo sợi nano bằng phương pháp Bottom Up (BU)

Là phương pháp tạo sợi Silic từ các các nguyên tử, phân tử ban đầu Phương pháp này thường dùng để chế tạo các sợi nano bán dẫn của các nguyên tố nhóm 4 và sợi nano của các oxít kim loại Phương pháp BU có thể tạo các sợi nano chất lượng cao, tuy nhiên hình dáng các sợi này mọc ngẫu nhiên theo nhiều hướng khác nhau và được đặc trưng bởi sự phân bố độ dài và đường kính sợi nano Sự thay đổi về hình thái học (tính định hướng thấp) của các sợi nano so với các sợi nano được chế tạo bằng phương pháp Top down (có tính định hướng cao) làm giảm tính năng hoạt động SiNW FET khi so sánh với SiNW FET có sợi nano được chế tạo bằng phương pháp

TD Phương pháp BU cho phép chế tạo sợi nano trên một diện tích đế rộng, nó chỉ bị giới hạn bởi nhiệt độ của quá trình dùng để tạo sợi nano 800-10000C Trong phương

Có hai hướng tiếp cận chính để chế tạo sợi nano theo phương pháp BU là:

phương pháp lắng đọng hơi hóa học (chemical vapor deposition- CVD) dựa trên cơ

chế chuyển từ trạng thái hơi sang trạng thái lỏng rồi cuối cùng ổn định ở trạng thái

rắn (vapor liquid solid- VLS); Bốc bay laser trong đó nguồn laser được hội tụ tại

một vùng không gian nhỏ với năng lượng cao làm bay hơi chất bán dẫn ban đầu đang

ở thể rắn Khí kim loại này được mang vào buồng lắng đọng bằng dòng khí mang Tương tự cơ chế VLS, đế Silic cũng cần có trước các hạt kim loại làm mồi xúc tác để mọc sợi

1.4 ỨNG DỤNG CỦA CẢM BIẾN SiNW FET

SiNW FET có nhiều ứng dụng khác nhau như: Phát hiện loại protein dựa trên

sự tương tác protein-protein Phát hiện DNA dựa trên quá trình lai hóa chuỗi DNA Phát hiện sớm các bệnh ung thư thông qua phát hiện các biomarker Giám sát nhiễm virus bằng cách phát hiện loại virus đó Nghiên cứu quá trình tương tác của các phân

tử nhỏ có các liên kết peptide Ghi nhận tín hiệu và chuyển đổi tín hiệu đó từ tế bào

17

2.1 CHẾ TẠO SiNW FET

Như đã trình bày ở Chương I, việc nghiên cứu để đưa ra công nghệ chế tạo được các sợi nano, và sau đó là linh kiện nano, trong điều kiện còn hạn chế nhiều về

cơ sở vật chất, kiến thức chuyên ngành là một nhiệm vụ khó khăn, nhưng cấp thiết và mang nhiều ý nghĩa và ích lợi quan trọng Để giải quyết được nhiệm vụ này, chúng tôi đã chọn các phương pháp nghiên cứu sau :

 Nghiên cứu, phân tích các tài liệu, bài báo chuyên ngành, về chế tạo nano nói chung và chế tạo sợi nano nói riêng Từ đó tìm cách học hỏi các điểm mạnh, cũng như chỉ ra các điểm hạn chế của mỗi phương pháp chế tạo, đúc rút ra phương pháp khả thi để chế tạo sợi nano Si

 Để phát hiện được các biomakers sợi nano Si sử dụng phải là các sợi đơn tinh thể (single crsytalline Silicon) có chất lượng cao Và thường được chế tạo từ các

đế Silic đặc biệt loại semiconductor on insulator (SOI) Do đó trong quá trình tìm hiểu tài liệu, các công nghệ liên quan đến việc chế tạo sợi nano từ đế SOI được quan tâm đặc biệt

 Trao đổi kiến thức với các chuyên gia hàng đầu trong lĩnh vực chế tạo nano và sợi nano Tìm hiểu khả năng chế tạo của các thiết bị và cơ sở vật chất hiện có của Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano (PTN CNNN) ĐHQG TPHCM và các đơn vị trong nước

Sau quá trình trên chúng tôi đã đưa ra quy trình công nghệ để chế tạo SiNWs FET và quy trình đó gồm các bước chính sau đây [Hình 2-1…10]

18

7 Ăn mòn ướt lớp SiO2

8 Ăn mòn dị hướng tạo sợi Si

9 Tẩy lớp Si3N4

10 Ăn mòn lớp SiO2 hình thành sợi Silic

11 Chế tạo điện cực kim loại để kết nối sợi Si ra mạch ngoài-hình thành cấu trúc transistor hiệu ứng trường sợi Si (SiNW FET)

12 Tạo lớp cách điện, bảo vệ bề mặt điện cực

Hình 2-1 Wafer SOI có cấu trúc 3 lớp, đế là lớp bán dẫn Silic, giữa là lớp cách điện

SiO 2 , trên cùng là lớp Silic - lớp này dùng đề chế tạo sợi SiNW FET

Hình 2-2 Lớp SiO 2 được tạo trên lớp Silic ban đầu có chiều dày 40nm

Hình 2-3 Lớp Si 3 N 4 40 nm được hình thành trên cầu trúc lớp SiO 2

19

Hình 2-4 Quá trình quang khắc (a) khi lớp photoresit được phủ trên lớp Si 3 N 4 ;(b) là những nơi photoresist bị chiếu sáng sẽ có màu tím; (c) những phần màu tím bị

rửa trôi trong dung dịch thuốc hiện (developer)

Hình 2-5 Lớp Si 3 N 4 bị ăn mòn tại những vùng lớp photoresist đã được tẩy trong khi

những vùng không bị tầy lớp Si 3 N 4 vẫn còn giữ lại

Hình 2-6 Cấu trúc sau khi rửa bỏ lớp photoresist

20

Hình 2-7. Ăn mòn lớp SiO2 40nm, sau quá trình ăn mòn thu được cấu trúc hình bên phải

Hình 2-8.(a) cơ chế ăn mòn dị hướng wafer Silic <100> trong dung dịch bazơ của

kim loại kiềm; (b) kết quả sau khi ăn mòn dị hướng tạo sợi Silic

Hình 2-9 Sau khi tầy lớp Si 3 N 4 phía trên

21

Hình 2-10 (a) mặt cắt sợi chế tạo được, ( b) nhìn nghiêng từ trên cao với nhiều sợi

song song nhau, hai đầu sợi là vùng sẽ phủ làm điện cực

Hình 2 (1-10): Sơ đồ khối các bước công nghệ chế tạo sợi Silic trên đế SOI

2.1.1.1 Wafer:

Wafer sử dụng để chế tạo sợi Silic là loại đế đặc biệt Semiconductor on insulator (SOI), có định hướng <100>, kích thước 4-inch (100 mm) Độ dày: 525 µm

của hãng Soitec – Pháp Lớp đơn tính thể trên cùng được pha tạp Bo với nồng độ

1015/cm3 để trở thành chất bán dẫn loại P Với nồng độ pha tạp như thế lớp này có điện trở bề mặt là 1-10 Ωcm-2

Trước khi đưa đi chế tạo, wafer được rửa bằng dung dich aceton sau đó đến ethanol

và nước khử ion (DI water) Tiếp theo wafer được nung tại 1200C trong 5 phút nhằm làm bay hết hơi nước Sau cùng ngâm wafer trong dung dịch piranha (H2SO4 + H2O2) nhằm tẩy hết chất hữu cơ bám trên wafer

2.1.1.2 Oxy hóa tạo màng SiO 2

Màng SiO2 được tạo thành theo phản ứng oxy hóa sau:

Si + O 2 SiO 2

Điều kiện: tại nhiệt độ 10000C – áp suất 760mmHg- trong thời gian 3 phút Khi

đó lớp SiO2 hình thành có độ dày là 40nm Lớp Silic còn lại chưa bị oxy hóa ở phía dưới là 50nm Sau này sợi Silic sẽ được chế tạo trên lớp dày 50nm này, và như thế các sợi sẽ có độ dày 50nm

2.1.1.3 Tạo màng Si 3 N 4

Sau khi tạo màng SiO2 chúng ta tiếp tục tạo màng Si3N4 40nm bằng kỹ thuật lắng đọng hơi hóa học áp suất thấp (Low pressure chemical vapor deposition- LPCVD): màng Si3N4 tạo ra trong trường hợp này có mục đích là tạo lớp bảo vệ trong các quá trình ăn mòn Silic để tạo sợi nano Silic Trong trường hợp này chúng tôi sử dụng thêm lớp Si3N4 vì lớp này được chế tạo trong điều kiện nhiệt độ cao và áp

3 SiH 4 (gas) + 4 NH 3 (gas) → Si 3 N 4 (solid) + 12 H 2 (gas)

Tốc độ tạo màng Si3N4 6nm/phút - Thời gian: 7 phút - Nhiệt độ 650 0C Khi đó ta được cấu trúc như [Hình 2-3]

ta sẽ chế tạo sợi SiNWs

Sau quá trình quang khắc là bước soft bake, wafer được nung trên đế nhiệt tại nhiệt độ 90oC trong thời gian 1 phút nhằm làm cho bay hơi dung môi, tăng độ bám dính lớp photoresist lên đế Tiếp theo là bước development, mục đích của bước này làm hiện ra cấu trúc mong muốn khi rửa đi những vị trí nào của chất cảm quang bị chiếu sáng, ngược lại những chỗ không bị chiếu sáng sẽ còn lại Chất làm cấu trúc trong trường hợp này là dung dich NaOH loãng có nồng độ 2,5% cùng một số chất phụ gia Thời gian ngâm wafer trong trong dung dịch developer là 55 ± 5 giây Sau khi đó lấy ra ngay rồi rửa lại bằng nước khử ion (DI water) Sau quá trình rửa là quá trình hard bake, wafer được ủ nhiệt wafer tại nhiệt độ 120oC trong thời gian 25 ± 5 phút nhằm làm tăng độ bền nhiệt, hóa và vật lý của lớp photoresist

2.1.2 Ăn mòn khô lớp Si 3 N 4

Tiếp theo là quá trình ăn mòn lớp Si3N4

Chất khí dùng trong ăn mòn khô này là hỗn hợp khí CHF 3 + Ar

Điều kiện ăn mòn: công suất 100 W; tốc độ ăn mòn: 25 nm/phút; thời gian: 2 phút; áp suất: 10 mTorr Đến lúc này ta có cấu trúc như sau [Hình 2-5]:

SiN 40nm/SiO 2 40nm/ Si 50nm/ Si 140nm/ wafer

23

2.1.2.1 Tẩy lớp photoresist

Tiếp theo bước ăn mòn Si3N4 là bước tẩy lớp photoresist bằng cách ngâm wafer trong dung dịch acetone trong 5 phút, và ngâm trong dung dịch Piranha 15 phút để rửa hết lớp photoresist còn lại trên bề mặt lớp Si3N4 Kết quả ta được cầu trúc như

ăn mòn xong lớp SiO2 dung dịch BHF tiếp tục ăn mòn lớp SiO2 ở bên dưới lớp Si3N4 Nên sau một thời gian ăn mòn ta có cấu trúc vùng SiO2 bị ăn mòn sâu vào trong lớp

Si3N4 [Hình 2-7]

2.1.2.3 Ăn mòn dị hướng tạo sợi Silic

Ăn mòn dị hướng lớp Si (50nm) là một bước quan trọng nhằm kiểm soát kích thước sợi Si được tạo ra Bởi vì mặt mạng <100> có ít các nguyên tử Silic hơn so với mặt mạng <111> (mặt có các nguyên tử xếp chặt) nên khi ăn mòn theo hướng <100> nhanh hơn ăn mòn theo hướng <111> 400 lần Kết quả có thể hình thành những cấu trúc mong muốn

Chất ăn mòn: dung dịch KOH (2,5%);

Si + OH - + 2H 2 O  SiO 2 (OH) 2 2- + 2H 2

Điều kiện ăn mòn: Tốc độ ăn mòn theo hướng <100> lớn hơn 400 lần so với hướng

<111> Đồng thời khi ăn mòn sẽ tạo ra mặt bên có góc hợp với mặt phẳng nằm ngang một góc 54,7 độ trong và góc 35,3 độ so với phương thẳng đứng

Tốc độ: 1nm/phút; nhiệt độ phòng; thời gian 50 phút

Tới thời điểm này ta có cấu trúc như sau [Hình 2-8]:

SiN 40nm/SiO2 40nm/ Si 50nm/ Si 140nm/ wafer