nghiên cứu kết hợp khử protein trong công đoạn khử khoáng của quy trình sản xuất chitin từ vỏ, đầu tôm thẻ chân trắng bằng pepsin và hcl

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐÀO THỊ TUYẾT MAI NGHIÊN CỨU KẾT HỢP KHỬ PROTEIN TRONG CÔNG ĐOẠN KHỬ KHOÁNG CỦA QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN TỪ VỎ, ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG PEPSIN VÀ HCl LUẬN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐÀO THỊ TUYẾT MAI

NGHIÊN CỨU KẾT HỢP KHỬ PROTEIN TRONG CÔNG ĐOẠN KHỬ KHOÁNG CỦA QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN TỪ VỎ, ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

BẰNG PEPSIN VÀ HCl

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nha Trang - 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

ĐÀO THỊ TUYẾT MAI

NGHIÊN CỨU KẾT HỢP KHỬ PROTEIN TRONG CÔNG ĐOẠN KHỬ KHOÁNG CỦA QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITIN TỪ VỎ, ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác

ĐÀO THỊ TUYẾT MAI

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và Th.S Ngô Thị Hoài Dương đã trực tiếp và tận tình hướng dẫn khoa học giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin được gửi lời cám ơn đến các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Khoa Sau Đại học, Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trung tâm Thí nghiệm thực hành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô đã dày công dạy dỗ chỉ bảo chúng tôi trong những năm học tập tại trường

Xin gửi lời biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về NLCL trong chế biến tôm đông lạnh 3

1.1.1 Tình hình xuất khẩu tôm đông lạnh ở Việt Nam 3

1.1.2 Thành phần tính chất của NLCL sau quá trình chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu 3

1.1.2.1 Thành phần NLCL sau chế biến tôm đông lạnh 3

1.1.2.2 Thành phần hóa học của đầu tôm 4

1.1.2.3 Thành phần hóa học của vỏ tôm 5

1.1.2.4 Một số nghiên cứu xác định thành phần hóa học của NLCL trong chế biến tôm đông lạnh 5

1.1.3 Tận dụng NLCL của quá trình chế biến tôm đông lạnh 6

1.1.3.1 Sử dụng NLCL trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 6

1.1.3.2 Sử dụng NLCL tách chiết protease bổ sung vào thực phẩm 7

1.1.3.3 Sử dụng NLCL tách chiết astaxanthin 7

1.1.3.4 Tận thu protein, peptid từ NLCL tôm sử dụng trong thực phẩm 7

1.1.3.5 Sử dụng sản xuất chitin, chitosan 8

1.2 Tổng quan về enzyme protease 9

1.2.1 Enzyme protease 9

1.2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme protease 9

1.2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme protease 9

1.2.1.3 Ứng dụng của enzyme protease 12

1.2.2 Enzyme Pepsin 15

1.3 Tổng quan về chitin và công nghệ sản xuất chitin 16

1.3.1 Chitin 16

1.3.2 Ứng dụng của chitin 17

1.3.3 Công nghệ sản xuất chitin 17

1.3.3.1 Sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học 17

1.3.3.2 Sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học 18

1.3.3.3 Sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học kết hợp sinh học 19

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất thiết bị 22

2.1.1 Đầu và vỏ tôm 22

2.1.2 Enzyme Pepsin 22

2.1.3 Hóa chất, thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23

2.3.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát 23

2.3.2 Xác định ảnh hưởng của việc xử lý cơ học bằng phương pháp ép đến hàm lượng protein, khoáng của nguyên liệu đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 25

2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý với HCl đến hàm lượng protein, khoáng trên đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 26

2.3.4 Nghiên cứu chế độ xử lý đầu, vỏ tôm với Pepsin 27

2.3.5 Nghiên cứu chế độ xử lý NaOH trên đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 37

2.3.6 So sánh chất lượng chitin của quy trình sản xuất chitin thu được với quy trình tham khảo 40

2.4 Phương pháp phân tích 40

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 40

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý cơ học bằng phương pháp ép đến hàm lượng protein, khoáng của nguyên liệu đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 41

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý với HCl đến hàm lượng protein, khoáng trên vỏ, đầu tôm thẻ chân trắng 41

3.3 Kết quả nghiên cứu chế độ xử lý đầu, vỏ tôm thẻ bằng enzyme Pepsin 44

3.3.1 Kết quả nghiên cứu chế độ xử lý vỏ tôm thẻ chân trắng bằng Pepsin 44

3.3.1.1 Kết quả khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng 44

3.3.1.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKP và HQKK 46

3.3.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý với Pepsin đến HQKP và HQKK 48

3.3.1.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý với Pepsin đến HQKP và HQKK 49

3.3.1.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng và tương tác của các yếu tố đến HQKP và HQKK của Pepsin 51

3.3.1.6 Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng enzyme Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng 52

3.3.2 Kết quả nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin trên bã đầu tôm thẻ chân trắng 58

3.3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên bã đầu tôm thẻ chân trắng 58

3.3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKP và HQKK 59

3.3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng và tương tác của các yếu tố đến HQKP của Pepsin trên bã đầu tôm thẻ chân trắng 60

3.3.2.4 Tối ưu hóa quá trình khử protein bằng Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng 61

3.4 Kết quả khảo sát chế độ xử lý đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng bằng NaOH 66

3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 66

3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin thô 67

3.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin thô 68

3.4.4 Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 70

3.5 Kết quả đánh giá chất lượng chitin đầu, vỏ tôm thu được từ quy trình đề xuất 71

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

PHỤ LỤC 78

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng mã hóa các nhân tố nghiên cứu 32

Bảng 2.2 Bảng mã hóa các nhân tố nghiên cứu 36

Bảng 3.1 Thành phần hóa học vỏ, đầu tôm thẻ trước và sau khi ép 41

Bảng 3.2 Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình khử protein bằng Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng 51

Bảng 3.3 Giá trị các thông số tối ưu cho quá trình khử protein bằng enzyme Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng 52

Bảng 3.4 Phân tích chọn mô hình 52

Bảng 3.5 Bảng phân tích tính phù hợp của mô hình tối ưu đã chọn 53

Bảng 3.6 Kết quả phân tích các chỉ số thống kê tương ứng với mô hình tối ưu 54

Bảng 3.7 Chế độ tối ưu đề xuất từ phần mềm 57

Bảng 3.8 Kết quả kiểm định sự chính xác của phương trình hồi quy 57

Bảng 3.9 Đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình khử protein bằng Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng 61

Bảng 3.10 Giá trị các thông số tối ưu cho quá trình khử protein bằng Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng 62

Bảng 3.11 Phân tích chọn mô hình 62

Bảng 3.12 Bảng phân tích tính phù hợp của mô hình tối ưu đã chọn 63

Bảng 3.13 Kết quả phân tích các chỉ số thống kê tương ứng với mô hình tối ưu 64

Bảng 3.14 Chế độ tối ưu đề xuất 65

Bảng 3.15 Kiểm định sự chính xác của phương trình hồi quy 66

Bảng 3.16 Kết quả so sánh chitin theo quy trình (*) và quy trình tham khảo 71 Bảng 3.17 Kết quả so sánh chitosan sản xuất theo qui trình (*) và qui trình tham khảo71

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sự sắp xếp các chuỗi polyme của α-chitin, β-chitin, γ-chitin 16 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 23 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học cơ bản của đầu, vỏ tôm nguyên liệu, bã ép đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 25 Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý với HCl đến hàm lượng protein, khoáng trên vỏ tôm thẻ chân trắng 26 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng 27 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng 28 Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme đến HQKK và HQKP của enzyme Pepsin 29 Hình 2.7 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử khoáng, khử protein trong vỏ tôm khi kết hợp xử lý bằng HCl và Pepsin 30 Hình 2.8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng khử khoáng, khử protein trong vỏ tôm khi kết hợp xử lý bằng HCl và Pepsin 31 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chế độ xử lý với Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng 33 Hình 2.10 Sơ đồ khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên đầu tôm thẻ chân trắng 34 Hình 2.11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến khả năng tách protein, khoáng trên vỏ tôm thẻ 35 Hình 2.12 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 37 Hình 2.13 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 38 Hình 2.14 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng 39 Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian xử lý với HCl đến HQKP 42 Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý với HCl đến HQKK 42

Hình 3.3 Ảnh hưởng của việc loại/không loại dịch sau xử lý với HCl và nồng độ

Pepsin bổ sung đến HQKP 44

Hình 3.4 Ảnh hưởng của việc loại/không loại dịch sau xử lý với HCl và nồng độ Pepsin bổ sung đến HQKK 45

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKP 46

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKK 47

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến HQKP khi xử lý với Pepsin 48

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến HQKK khi xử lý với Pepsin 49

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian xử lý với Pepsin đến HQKP 50

Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian xử lý với Pepsin đến HQKK 50

Hình 3.11 Đồ thị không gian 3D và 2D biểu diễn HQKP theo các biến khảo sát: theo nhiệt độ và nồng độ (A và B); theo thời gian và nhiệt độ (B và E); theo thời gian và nồng độ (C và F) 56

Hình 3.12 Ảnh hưởng của việc xử lý cơ học và bổ sung Pepsin đến HQKP 58

Hình 3.13 Ảnh hưởng của việc xử lý cơ học và bổ sung Pepsin đến HQKK 59

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKP, HQKK 60

Hình 3.15 Đồ thị không gian 3D và 2D biểu diễn HQKP theo nồng độ và thời gian 64

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ 67

Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian xử lý NaOH đến đến hàm lượng protein còn lại trên chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ 68

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý NaOH đến hàm lượng protein còn lại trên chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ 69

LỜI MỞ ĐẦU

Xuất khẩu tôm chiếm vị trí quan trọng trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản của

cả nước Thịt tôm chế biến xuất khẩu chiếm khoảng 25% nguyên liệu, phần còn lại chiếm đến 40% Trên thế giới ước tính hàng năm nguyên liệu còn lại (NLCL) từ các loài giáp xác khoảng 1,44 triệu tấn trọng lượng khô trong đó phần lớn là khoáng, protein, chitin…[33] Đây là nguồn nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin, chitosan và các sản phẩm giá trị khác

Chitin và các dẫn xuất được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp, phim ảnh, công nghệ in ấn, công nghệ môi trường, thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Trong đó chitin, chitosan dùng trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm yêu cầu phải có chất lượng cao an toàn đối với người sử dụng

Trong nước và trên thế giới sản xuất chitin, chitosan theo quy mô công nghiệp chủ yếu sử dụng phương pháp hóa học Những năm gần đây sử dụng enzyme trong sản xuất chitin, chitosan được đánh giá là một phương pháp thay thế phương pháp hóa học

có hiệu quả Phương pháp này giảm tổn thất protein, astaxanthin, nâng cao chất lượng chitin nhờ tăng khối lượng phân tử, nâng cao độ nhớt, hạn chế nhiễm kim loại nặng do hóa chất và được coi là công nghệ thân thiện với môi trường

Tuy nhiên, sử dụng enzyme khử protein thường tốn thời gian khá dài, ảnh hưởng lớn đến sản xuất quy mô công nghiệp Rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao chất lượng chitin là vấn đề cần được quan tâm

Enzyme Pepsin là enzyme hệ tiêu hóa, hoạt động trong môi trường acid Nghiên cứu sử dụng enzyme Pepsin trong quá trình sản xuất chitin có thể kết hợp quá trình khử protein trong quá trình khử khoáng bằng HCl

Từ thực tế trên cho thấy việc Nghiên cứu kết hợp khử protein trong công đoạn

khử khoáng của quy trình sản xuất chitin từ vỏ, đầu tôm thẻ chân trắng bằng Pepsin và HCl

mang tính cấp thiết nhằm tìm ra quy trình sản xuất chitin có chất lượng cao để

sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất, nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn NLCL sau chế biến tôm đông lạnh

 Mục tiêu của đề tài:

Nghiên cứu kết hợp khử protein bằng enzyme Pepsin trong công đoạn khử khoáng bằng HCl để rút ngắn thời gian sản xuất và giảm lượng hóa chất sử dụng trong sản xuất chitin từ đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng

 Tính khoa học và thực tiễn của đề tài:

- Ý nghĩa thực tiễn:

+ Thành công của đề tài là cơ sở khoa học để triển khai quy trình sản xuất chitin chất lượng cao

+ Rút ngắn thời gian sản xuất chitin

+ Hạn chế tác động tiêu cực của việc sử dụng hóa chất trong quá trình sản xuất chitin đến môi trường

+ Mở rộng khả năng ứng dụng của enzyme Pepsin trong xử lý NLCL sau chế biến tôm đông lạnh

- Ý nghĩa khoa học:

+ Làm phong phú thêm nguồn tài liệu khoa học về lĩnh vực ứng dụng enzyme trong sản xuất chitin từ đầu, vỏ tôm

lượng cao Rút ngắn thời gian sản xuất ở quy trình sản xuất chitin quy mô lớn

 Nội dung nghiên cứu:

- Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ, đầu tôm nguyên liệu và đầu vỏ tôm sau tách dịch ép

- Xác định thời điểm bổ sung enzyme Pepsin

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khử protein (HQKP) của enzyme Pepsin

- Tối ưu hóa quá trình khử khoáng kết hợp với khử protein bằng enzyme Pepsin

- Hoàn thiện và đề xuất quy trình sản xuất chitin kết hợp khử protein trong công đoạn khử khoáng bằng enzyme Pepsin và HCl

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về NLCL trong chế biến tôm đông lạnh

1.1.1 Tình hình xuất khẩu tôm đông lạnh ở Việt Nam

Xuất khẩu tôm có tốc độ tăng trưởng rất lớn và được xem là mặt hàng chủ lực của thủy sản Việt Nam Kể từ năm 2008, sau khi được phép nuôi tôm thẻ chân trắng đại trà trong cả nước, tôm thẻ chân trắng đã có vị trí quan trọng trong cơ cấu sản xuất

và xuất khẩu

Năm 2009 xuất khẩu gần 210 nghìn tấn tôm với kim ngạch xuất khẩu trên 1,67

tỷ USD tăng 9,4% về khối lượng và 3% về giá trị so với năm 2008

Năm 2010 xuất khẩu tôm đạt trên 2 tỷ USD chiếm hơn 1/3 tổng kim ngạch xuất khẩu (5 tỷ USD) trong đó tôm thẻ chân trắng chiếm 26% giá trị xuất khẩu [2]

Xuất khẩu tôm năm 2011 đạt 2,39 tỷ USD chiếm tỷ trọng lớn nhất trong tổng kim ngạch xuất khẩu của cả nước Mặc dù nhu cầu tôm sú giảm nhưng nhu cầu tôm thẻ chân trắng tăng nhanh ở các nước giúp kim ngạch xuất khẩu tôm vẫn tăng 14% Xuất khẩu sú đạt 1,43 tỷ USD chiếm 60% tổng giá trị, giảm 0,6% trong khi tôm thẻ chân trắng đạt 704 triệu USD chiếm 29,3% tăng 70% so với năm 2010 [40] Theo tính toán của một số tổ chức thủy sản quốc tế, tiêu thụ tôm thẻ chân trắng chiếm 2/3 sản lượng tôm tiêu thụ toàn cầu Tỷ lệ tôm thẻ chân trắng có xu hướng tăng dần trong cơ

hợp nhu cầu tiêu dùng thế giới

g các sản phẩm chế biến từ tôm thẻ chân trắng

trong quá trình chế biến tôm đông lạnh chiếm 40 – 50% tổng khối lượng tôm [27] Ước tính chỉ riêng 6 tháng đầu năm 2011 NLCL của tôm thẻ chân trắng thải ra từ các nhà máy chế biến tôm lên đến hơn 10

chitin, chitosan, astaxanthin …

1.1.2 Thành phần tính chất của NLCL sau quá trình chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu

1.1.2.1 Thành phần NLCL sau chế biến tôm đông lạnh

NLCL sau chế biến tôm đông lạnh bao gồm đầu, vỏ và đuôi tôm Ngoài ra trong quá trình sản xuất còn có các mảnh tôm đứt gãy, tôm biến đỏ, biến đen nhưng lượng ít Nguyên liệu còn lại chủ yếu là đầu tôm Đầu tôm được loại bỏ qua công đoạn sơ chế ban đầu, vỏ tôm được loại ở các công đoạn xử lý tiếp theo tùy theo từng dạng sản phẩm vì vậy chúng được thu gom riêng biệt sau đó mới nhập chung trong kho phế liệu

1.1.2.2 Thành phần hóa học của đầu tôm

Thành phần hóa học chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, khoáng, enzyme, sắc tố, lipid Trong đó hàm lượng protein chiếm trên 50%

+ Protein trong đầu tôm tồn tại ở 2 dạng:

Dạng tự do: Dạng này tồn tại trong nội tạng tôm hay trong cơ thịt

Dạng liên kết: Đây là protein không hòa tan, thường liên kết với chitin, canxi carbonate, với lipid tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoid tạo nên tính bền vững của vỏ, đầu tôm

Thành phần protein tôm chủ yếu là các acid aspartic, acid glutamic, phenylalanine, lysine và arginine [17]

+ Enzyme: Trong đầu tôm chứa một lượng đáng kể enzyme protease có hoạt độ khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/g tươi Ngoài ra còn có enzyme alkaline phosphatesa, chitinase, -N-acetyl glucosamidase Enzyme nội tại tôm hoạt động ổn định trong môi trường trung tính, môi trường kiềm, không ổn định trong môi trường acid [33]

Theo nghiên cứu của Omondi (2005) trong nội tạng tôm trưởng thành ở bờ biển Kenya chứa enzyme Chymotrypsin, Trypsin và Elastase, không có enzyme Pepsin Trong đó pH hoạt động tối ưu của Trypsin là 7,5 – 8,0 Chymotrypsin 7,2 – 7,8,

Elastase 6,8 – 8,5 [26]

+ Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu

cơ khác

+ Khoáng: Trong thành phần đầu tôm có chứa một lượng muối vô cơ, chủ yếu

là canxi carbonate Trong đầu, vỏ và đuôi tôm hồng Pandalus borealis và tôm

Trachypena curvirostris đánh bắt tại Tongyeong Hàn Quốc hàm lượng canxi chiếm

3000 mg/100g cao hơn photpho (400 mg/100 g), natri (270 mg/100 g) và magie (100 mg/100 g) trong khi mangan và sắt chỉ xuất hiện dạng vết [17]

+ Sắc tố: Sắc tố trong đầu tôm, vỏ tôm chủ yếu là astaxanthin Astaxanthin liên kết khá bền với protein, nhờ liên kết này mà astaxanthin được bảo vệ Khi liên kết giữa astaxanthin và protein không còn thì astaxanthin dễ dàng tách ra khỏi đầu tôm và bị oxy hóa thành astaxin

+ Lipid: Lipid trong đầu tôm chiếm hàm lượng nhỏ, tồn tại dưới dạng liên kết với protein

1.1.2.3 Thành phần hóa học của vỏ tôm

Thành phần hóa học của vỏ tôm bao gồm: Chitin, khoáng, protein, sắc tố và một

số thành phần khác Protein, chitin và khoáng ở vỏ tôm chiếm tới 90% khối lượng chất khô [33] Lượng protein trong vỏ tôm thấp hơn trong đầu tôm, chiếm khoảng 25 – 30%, chủ yếu là protein dạng liên kết Cũng giống như trong đầu tôm, khoáng trong vỏ

tôm chủ yếu là canxi carbonate Hàm lượng Ca, Fe, Cu và Mn trong vỏ tôm Penaeus

semisulcatus 168; 35; 58; 38; 28 và 6,72 mg/l [19]

1.1.2.4 Một số nghiên cứu xác định thành phần hóa học của NLCL trong chế biến tôm đông lạnh

Đầu chiếm khoảng 33%, thịt tôm chiếm 51% và phần NLCL là 49% tổng khối

lượng [11] Thành phần hóa học của đầu, vỏ và đuôi tôm Farfantepenaeus paulensis

được xác định bởi Camargo và cộng sự (2001) cho thấy hàm lượng protein chiếm 49%

và khoáng 27%, hàm lượng lipid 4,9% khối lượng chất khô [13, 32]

Thành phần, chất dinh dưỡng của đầu, vỏ, đuôi tôm Pandalus borealis và tôm

Trachypenacurvirostris đánh bắt gần Tongyeong, Hàn Quốc chứa 9,3 – 11,6% protein

thô, 0,7% lipid Các acid amin chủ yếu trong phần protein tôm là acid aspartic, acid glutamic, phenyl alanine, lysine, và arginine Hàm lượng canxi (3000mg/100g) cao hơn so với photpho (400mg/100g), natri (270mg/100g) và magie (100mg/100g) Hàm lượng acid amin tự do trong NLCL (2000mg/100g) cao hơn 15% so với các phần ăn

được (1700 mg/100g) Protein tôm Pandalus borealis và tôm Trachypenacurvirostris

không có các acid amin tự do taurine, threonine, leucine, tryrosine và phenylalanine [20]

Nghiên cứu trên vỏ, thịt và đầu tôm Macrobrachium rosenbergii (nước ngọt),

Palaemon serratus (nước lợ), Panaeusnotialis và Parapenaeopsis Atlantica (nước

mặn) ở Nigeria cho thấy hàm lượng protein khoảng 26,30 ± 0,34% và 22,35 ± 0,30%

trong thịt của tất cả các loài tôm; hàm lượng lipid thấp, dao động trong khoảng 0,79 ± 0,03% và 1,11 ± 0,18%; hàm lượng canxi, magiê, kali, natri, phot pho, mangan, đồng, sắt và kẽm trong đầu cao hơn so với vỏ và thịt

Thành phần hóa học của vỏ tôm Crangon crangon và tôm Pandulas borealis

được Synowiecki (2000) chỉ ra có 40,6 ± 5,43%, 41,9 ± 0,02% protein; 27,5 ± 0,13%, 29,2 ± 0,02% khoáng; 9,95 ± 0,22%, 10,23 ± 0,41% lipid; 17,8 ± 0,91%, 17,0 ± 0,25% chitin

Trong nghiên cứu khác của Trang Sĩ Trung (2010) đã chỉ ra thành phần protein của vỏ và đầu tôm thẻ chân trắng là 47,4% trong đó protein ở vỏ 25 – 28%, ở đầu tôm

50 – 53%; khoáng chiếm 24,6%; ẩm 77,5%; chitin 18,3%; lipid 4,2% và carotenoids

110 mg/kg theo hàm lượng chất khô

Từ các nghiên cứu trên cho thấy protein và khoáng là thành phần chính tồn tại trên đầu, vỏ và đuôi tôm Ngoài ra còn có một lượng đáng kể caroteinoids Vì vậy cần nghiên cứu chế độ xử lý hợp lý để khử protein, khoáng theo hướng thu hồi các thành phần hóa học có giá trị khác

1.1.3 Tận dụng NLCL của quá trình chế biến tôm đông lạnh

và vỏ chiếm 50 – 70% nguyên liệu ban đầu, trong đó phần đầu thường chiếm 34 – 45%, phần vỏ 10 – 15% trọng lượng tôm nguyên liệu [4]

1.1.3.1 Sử dụng NLCL trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Nguồn NLCL có thể tận dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Do hàm lượng protein cao, đầu vỏ tôm có thể dùng sản xuất thức ăn gia súc Trước đây chúng được sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi theo phương pháp thủ công Ở từng địa phương nguồn nguyên liệu này có thể được sản xuất từ dạng tươi hoặc khô khác nhau Đầu, vỏ tôm được nghiền nhỏ và bổ sung vào thức ăn tôm cá Phương pháp này đem lại hiệu quả kinh tế thấp và chất lượng sản phẩm không cao Hiện nay sản xuất thức ăn chăn nuôi theo phương pháp cải tiến nâng cao được chất lượng sản phẩm và hiệu quả kinh tế nhưng chưa thực sự hiệu quả và tạo ra sản phẩm có giá trị

1.1.3.2 Sử dụng NLCL tách chiết protease bổ sung vào thực phẩm

Một hướng sử dụng khác đã được nghiên cứu và áp dụng là tách chiết protease

từ đầu tôm để bổ sung vào chượp nước mắm Quy trình nước mắm truyền thống có thời gian sản xuất khá dài do chỉ sử dụng enzyme nội tại của nguyên liệu và enzyme sinh ra từ vi sinh vật Bổ sung enzyme protease giúp thúc đẩy quá trình thủy phân protein, rút ngắn thời gian sản xuất Ngoài ra phương pháp này còn giúp tăng hàm lượng đạm cho nước mắm

để loại bỏ canxi carbonat (ở giai đoạn khử khoáng) trước khi chiết xuất astaxanthin bằng dung môi thích hợp Bằng phương pháp sử dụng Alcalase thủy phân protein từ NLCL tôm Holanda và Netto (2006) đã thu được 64,6% protein và astaxanthin 5,7 mg/100g chất khô

Ở Việt Nam, Hoàng Thị Huệ An đã nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ vỏ tôm, đạt hiệu suất thu hồi trung bình là 49% hàm lượng astaxanthin có trong đầu, vỏ tôm Trong vỏ tôm tươi, hàm lượng astaxanthin chiếm 59 ± 3,4 mg astaxanthin/kg, còn trong vỏ tôm khô hàm lượng này là 19,2 ± 1,7 mg astaxanthin/kg Từ kết quả này cho thấy NLCL trước khi sản xuất chitin, chitosan cần được chiết xuất astaxanthin để cung cấp cho các ngành công nghiệp khác, nhằm nâng cao giá trị của nó

Astaxanthin từ đầu tôm được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cá hồi bước đầu

có hiệu quả Astaxanthin còn được bổ sung vào thức ăn làm tăng màu sắc của cá cảnh hay tăng sắc tố cho lòng đỏ trứng gà

1.1.3.4 Tận thu protein, peptid từ NLCL tôm sử dụng trong thực phẩm

Carotenoprotein thu hồi từ đầu, vỏ tôm chứa 58% protein, hơn 8% khoáng, 6% lipid và 70 mg/kg carotenoid (Trang Sĩ Trung, 2010) Đây là nguồn dinh dưỡng có giá

trị, có thể bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để tăng hàm lượng đạm, nâng cao giá trị sản phẩm Ngoài ra sản phẩm protein chất lượng tốt được bổ sung vào thành phần bột canh

và các sản phẩm giá trị gia tăng khác từ tôm

Các peptid thu được từ dịch thủy phân NLCL đã và đang được nghiên cứu ứng dụng bổ sung vào thực phẩm tăng khả năng chống oxy hóa Đây là một ứng dụng quan trọng có thể phát triển trong tương lai

1.1.3.5 Sử dụng sản xuất chitin, chitosan

Nghiên cứu và ứng dụng sản xuất nhiều nhất là sản xuất chitin, chitosan và các

tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và ứng dụng của chitin, chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan là Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp Trong đó Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới sản xuất 20 tấn/năm, và đến nay đã lên tới 700 tấn/ năm Đứng thứ 2 là Mỹ với sản lượng 300 tấn/năm Theo Know (1991) thị trường tiềm năng của chitin chitosan là Nhật, Mỹ, Anh, Đức Ở Việt Nam cũng đang có những nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin chitosan vào sản xuất và phục vụ đời sống

Ở Việt Nam, tháng 6 năm 2002, dự án sản xuất chitosan bắt đầu được thực hiện tại trường Đại học Thủy sản Nha Trang Đến nay đã có nhiều công ty chuyên sản xuất các sản phẩm chitin – chitosan Trong đó, công ty Phương Duy, khu công nghiệp và chế xuất Cần Thơ mỗi năm sản xuất 2000 tấn chitin, 50 tấn chitosan và 1200 tấn D-Glucosamine xuất khẩu đi thị trường Mỹ, Nhật [35] Công ty TNHH kỹ nghệ sinh hóa Quốc Thành Việt Trung - hàng năm tiêu thụ gần 30000 tấn NLCL sau chế biến tôm đông lạnh, sản xuất 2000 tấn chitin/năm, 1700 tấn D-glucosamin/năm cũng chủ yếu qua thị trường Mỹ, Nhật

Tuy nhiên các công ty sản xuất chitin hiện nay phần lớn chỉ tập trung vào sản xuất chitin theo phương pháp hóa học nên chất lượng thành phẩm chưa cao, đồng thời

phẩm này đặc biệt là protein khi thải ra ngoài cùng với các hóa chất xử lý sẽ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Vì vậy nghiên cứu phương pháp cải tiến giảm thiểu việc sử dụng hóa chất, tận thu các thành phần có giá trị khác vừa giúp tăng hiệu quả sử dụng NLCL, vừa góp phần bảo vệ môi trường tốt hơn là cần thiết

1.2 Tổng quan về enzyme protease

1.2.1 Enzyme protease

Enzyme là protein có khối lượng phân tử lớn trung bình từ 6 000 – 1 000 000

đệm, không tan trong dung môi không phân cực Các tác nhân vật lý và hóa học gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng cũng gây biến tính enzyme

1.2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme protease

Enzyme protease là protein được sinh vật sinh tổng hợp trong tế bào và tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học Mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme nhưng chủ yếu là ba nguồn chính: động vật, thực vật và vi sinh vật

− Từ động vật: Chủ yếu là các enzyme từ nội tạng, bao gồm enzyme Trypsin, Pepsin Ngoài ra trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm protease là Renin được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat

− Từ thực vật: Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ Bromelain thu

từ quả, chồi dứa, vỏ dứa Ficin thu được từ nhựa cây cọ

− Từ vi sinh vật: Vi sinh vật là nguồn sản xuất protease phong phú nhất Protease có mặt ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn gồm nhiều

loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại

nấm men [3]

1.2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme protease

Enzyme mang bản chất protein, ảnh hưởng bởi các yếu tố nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzyme, chất kìm hãm, chất hoạt hóa và nồng độ cơ chất, ánh sáng Hoạt lực của enzyme cao nhất khi tất cả các yếu tố trên là phù hợp với hoạt động của

nó và ngược lại Thay đổi một trong số các yếu tố ảnh hưởng sẽ làm giảm khả năng xúc tác hoặc bất hoạt enzyme đó

− Nhiệt độ: Enzyme hoạt động trong một vùng nhiệt độ gọi là nhiệt độ hoạt động của enzyme Giá trị nhiệt độ thấp nhất hoặc cao nhất mà tại đó enzyme mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme Giá trị nhiệt độ mà enzyme thể hiện cao nhất khả năng xúc tác của mình gọi là nhiệt độ tối thích Trong thực tế nhiệt độ tối thích của enzyme là một vùng lân cận hẹp Nhiệt độ tối thích của một enzyme không phải là một

hằng số, nó còn phụ thuộc vào pH môi trường, nồng độ cơ chất Đặc biệt enzyme xúc tác với thời gian dài nhiệt độ tối thích giảm Nhiệt độ môi trường hoạt động của enzyme quá cao enzyme biến tính không thuận nghịch Nhiệt độ thấp enzyme biến tính

những chủng ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích cao Enzyme Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin có nhiệt độ hoạt động thấp hơn, nằm trong khoảng nhiệt độ của cơ thể

− pH: Giá trị pH có vai trò tạo trạng thái ion hóa cho enzyme và cơ chất Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme, dẫn đến khả năng xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH Giá trị pH tối thích là giá trị tại đó

cả enzyme và cơ chất đạt đến trạng thái ion hóa phù hợp nhất Chúng dễ dàng tương tác với nhau nên hiệu quả xúc tác của enzyme tăng pH môi trường cũng liên quan đến

độ bền của enzyme Môi trường quá acid hay quá kiềm enzyme đều kém bền Hầu hết các enzyme hoạt động tốt ở môi trường pH xấp xỉ 7 Riêng Pepsin (enzyme tiêu hóa trong dạ dày) có pH hoạt động thấp hơn do hoạt động trong môi trường acid pH tối thích của các enzyme Pepsin… thường là 1 - 4

− Nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Nồng độ enzyme thấp tốc độ và hiệu quả thủy phân không cao Nồng độ enzyme quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm

− Thời gian xử lý: Thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của enzyme Thời gian xử lý ngắn hiệu quả thủy phân thấp do enzyme và cơ chất chưa tiếp xúc triệt để Khi hiệu quả thủy phân là cao nhất, tiếp tục tăng thời gian xử lý enzyme không làm tăng hiệu quả thủy phân

− Nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme Tại nồng độ nhất định enzyme tiếp xúc với cơ chất triệt để, tốc độ phản ứng nhanh Dưới nồng độ cơ chất đó, enzyme và cơ chất khó tiếp xúc phản ứng thủy phân xảy ra chậm chạp không hiệu quả Khi nồng độ enzyme và cơ chất bão hòa tăng nồng

độ enzyme hiệu quả thủy phân không tăng

− Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung: Nước có khả năng điều chỉnh phản ứng thủy phân, nước là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương và

là môi trường khuyếch tán enzyme và cơ chất tạo điều kiện cho phản ứng xảy ra

− Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Diện tích tiếp xúc càng lớn thì quá trình thủy phân xảy ra càng nhanh Vì vậy đối với nguyên liệu có kích thước lớn thường được làm nhỏ để hiệu quả thủy phân cao hơn

− Ảnh hưởng của chất kìm hãm: Chất kìm hãm là chất làm giảm khả năng xúc tác hoặc vô hoạt enzyme Chúng là các chất hữu cơ phân tử thấp, ion kim loại, phi kim

và có thể là chất kìm hãm thuận nghịch hay bất thuận nghịch Chất kìm hãm thuận nghịch có thể là cạnh tranh, không cạnh tranh hay hỗn tạp

+ Chất kìm hãm cạnh tranh xảy ra với enzyme thiếu tính đặc hiệu cơ chất tuyệt đối Enzyme không nhận ra chất lạ nên kết hợp với trung tâm hoạt động của chất

lạ đó chiếm chỗ cơ chất chính, sản phẩm sinh ra ít hơn Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp có thể loại bỏ tác dụng của chất kìm hãm Nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn Trường hợp đặc biệt chất kìm hãm cạnh tranh là kìm hãm bằng sản phẩm Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và chiếm vị trí hoạt động của phân tử enzyme

+ Chất kìm hãm không cạnh tranh là chất không kết hợp vào trung tâm hoạt động mà kết hợp vào các điểm dị không gian làm thay đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme không có lợi cho quá trình xúc tác Đặc trưng của kiểu kìm hãm này

là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp enzyme cơ chất mà không liên kết với enzyme tự do

+ Chất kìm hãm hỗn tạp là chất kìm hãm không những liên kết với enzyme

tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo được sản phẩm Hiện tượng kìm hãm chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất kìm hãm Trường hợp kìm hãm enzyme bằng nồng độ cao của cơ chất gọi là kìm hãm cơ chất Nhìn chung sự kìm hãm phụ thuộc nồng độ chất kìm hãm, nồng độ enzyme, thời gian tác dụng

− Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa là chất làm tăng hoạt động của enzyme, enzyme từ không hoạt động sang hoạt động hoặc hoạt động ít chuyển sang hoạt động nhiều Chất hoạt hóa có tác dụng cắt một vài đoạn peptid đang ức chế hoạt

động của enzyme để hình thành lại trung tâm hoạt động của enzyme, enzyme trở nên hoạt động Mỗi enzyme đòi hỏi một số chất hoạt hóa mang bản chất khác nhau Chất hoạt hóa có thể là các ion kim loại, phi kim làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc làm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất Chất hoạt hóa có thể kết hợp vào các điểm dị không gian giúp trung tâm hoạt động biến đổi theo hướng có lợi với chất xúc tác

− Ảnh hưởng của các yếu tố khác

+ Ánh sáng có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi tăng nhiệt độ

+ Sự chiếu điện: Điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá hủy càng mạnh Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp

+ Sóng siêu âm có tác động khác nhau đối với từng loại enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng

1.2.1.3 Ứng dụng của enzyme protease

Enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong y học, nông nghiệp, hóa học,

công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghiệp da, phim ảnh và đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm như: công nghiệp chế biến thịt, cá, sữa, bánh mì, bánh kẹo, bia, sản xuất sữa bột và bột trứng Ngoài ra enzyme protease còn được ứng dụng trong xử lý nguyên liệu còn lại để thu hồi các sản phẩm có giá trị bước đầu đem lại hiệu quả đáng kể

- Trong nông nghiệp

Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme khác nhau để chuyển hóa nguyên liệu còn lại cải tạo đất phục vụ nông nghiệp Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia

Ở nước ta việc dùng enzyme vi sinh vật trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thế cho phân hóa học

- Trong hóa học

Sử dụng chất mang để gắn enzyme xúc tác cho phản ứng trong tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuất hormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta

gắn vi sinh vật để sử dụng trong công nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid… Sử dụng enzyme protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease nghiên cứu cấu trúc acid nucleic Ngoài ra enzyme còn được dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích

- Trong công nghiệp thực phẩm:

Protease dùng làm mềm thịt nhờ thủy phân protein trong thịt; sử dụng để sản xuất nước mắm ngắn ngày rút ngắn thời gian chế biến; sử dụng trong sản xuất phomat nhờ tác dụng làm đông tụ sữa; trong sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian nhào trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và độ nở tốt hơn; trong sản xuất nước giải khát làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc; làm trong và ổn định nước quả, rượu vang; sử dụng trong sản xuất dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng Ngoài ra enzyme pectinase được ứng dụng trong chiết rút các chất màu, tanin và các chất hòa tan khác do đó làm tăng chất lượng thành phẩm và tận dụng tối đa lượng nguyên liệu trái cây sản xuất dịch quả

Trong các ngành công nghiệp khác: Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylasa tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có

ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm Protease dùng để sản xuất vaccine, kháng sinh, sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt chất bẩn protein, sản xuất

mỹ phẩm

- Trong y học

Protease dùng làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm Trong y học protease cũng dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc Ngoài

ra còn dùng để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh

- Trong xử lý nguyên liệu còn lại

Ngày nay tốc độ ô nhiễm môi trường đang gia tăng, các phương pháp xử lý hoá học và sinh học thông thường ngày càng khó đạt được mức độ cần thiết để loại bỏ các chất ô nhiễm này Do đó, những phương pháp xử lý nhanh hơn, rẻ hơn, đáng tin cậy

hơn được đưa vào áp dụng Hiện nay số lượng enzyme đã biết đạt tới con số hơn 3000 enzyme Trong đó enzyme protease là enzyme quan trọng trong xử lý protein

Protease có thể thủy phân protein có trong chất thải để sản xuất thức ăn có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi Điều này giúp xử lý protein tồn đọng trong nước thải và giảm ô nhiễm môi trường

Lông chiếm 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể được coi như là nguồn protein cao tạo nên cấu trúc keratin cứng Lông có thể được hoà tan sau khi xử lý với NaOH, xử lý bằng cơ học và bằng các enzyme thủy phân như protease kiềm từ

Bacillus subtilis Sản phẩm tạo thành có dạng bột, màu xám với hàm lượng protein cao

có thể được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Protease ngoại bào được tiết ra từ Bacillus

polymyxa, Bacillus megaterium, Pseudomonas marinoglutinosa và Acromonas hydrophila cố định trong canxi alginat để thực hiện các phản ứng liên tục thu được sản

lượng cao trong thủy phân thịt cá [6]

Enzyme protease được dùng để thủy phân protein trong sản xuất chitin, astaxanthin, bột đạm Các quy trình sản xuất chitin, chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là quy trình hóa học Việc sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến chất lượng chitin, chitosan thu được chưa tốt và nhiều tạp chất Mặt khác, các quy trình này chỉ tập trung vào việc thu nhận chitin, chitosan chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của nguyên liệu còn lại tôm như protein, chất màu Sử dụng enzyme protease trong việc thu hồi một phần protein từ nguyên liệu còn lại tôm cũng

là một hướng tận dụng được nghiên cứu rộng rãi (Simpson và Hard, 1985; Cano – Lopezandothers, 1987; Synowiecki và Al-Khateeb, 2000; Gildberg và Stenberg, 2001; Mizani và cộng sự, 2005) Enzyme Alcalase đã được sử dụng để thủy phân protein từ đầu, vỏ tôm (Chabeaud, Guerard, Laroque và Dufosse 2007; Mizani, Aminlari, 2005) Trypsin, Papain, Pepsin (Synowiecki và Al-Khateeb, 2000; Chakrabarty, 2002), enzyme Neutrase và protease ( Rutanapornvareeskul, 2006)

Enzyme protease được dùng để thủy phân nguyên liệu còn lại cá để sản xuất chế phẩm giàu đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm, cá hạn chế ô nhiễm môi trường Với công nghệ sản xuất đơn giản sử dụng enzyme từ vi khuẩn bổ sung vào đầu, xương cá tách phần thịt ra khỏi xương Phần thịt được cô đặc trộn với thức ăn cho tôm, phần xương được làm sạch, sấy khô, nghiền thành bột dùng cho chăn nuôi gia súc Biện pháp này

không những xử lý được chất thải rắn với chi phí thấp, mà còn mang lại hiệu quả kinh

tế từ việc sản xuất ra thức ăn dùng cho chăn nuôi được người tiêu dùng chấp nhận

1.2.2 Enzyme Pepsin

Enzyme Pepsin được sinh ra từ một số tế bào tìm thấy trong dạ dày Enzyme này có khả năng thủy phân các protein thực phẩm thành các peptid hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa Pepsin hoạt động bằng cách cắt mạch protein thành các đoạn khác nhau, sản phẩm thủy phân bởi enzyme Pepsin dễ dàng hấp thu bởi lớp niêm mạc ruột

Enzyme Pepsin là enzyme exoprotease, ưu tiên cắt các liên kết peptide giữa liên kết kỵ nước và các acid amin vòng thơm P1 và P1’ Cắt đứt liên kết Phe-Val, Gln-His, Ala-Leu, Leu-Tyr, Tyr-Leu, Gly-Phe, Phe-Phe và Phe-Tyr trong chuỗi β của insulin

Pepsin nên được bảo quản ở nhiệt độ rất lạnh (khoảng từ -80°C đến -20°C) để ngăn chặn tự phân cắt Sự tự cắt mạch cũng có thể được ngăn ngừa bằng cách giữ pepsin ở pH 11 Khi pH được điều chỉnh dưới 4 enzyme hoạt động trở lại

Để ức chế hoạt động của enzyme Pepsin có thể sử dụng hợp chất ức chế hoặc tăng pH vượt qua pH hoạt động của pepsin, thường pH 5

Enzyme Pepsin có vai trò quan trọng trong sản xuất Bên cạnh đó Pepsin cũng được ứng dụng thủy phân collagen sử dụng trong mỹ phẩm, trong thủy phân NLCL để thu hồi các chất có giá trị khác Các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng enzyme Pepsin trong thủy phân các đối tượng khác nhau thu được hiệu quả tốt Sitthipong Nalinanon (2010) đã nghiên cứu sử dụng enzyme Pepsin từ cá ngừ vằn để thủy phân

cơ thịt cá Ornate threadfin bream thu sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa [25] Sử

dụng enzyme Trypsin, Papain, Pepsin, thu hồi carotein từ đầu tôm cho thấy enzyme

Pepsin có khả năng thu hồi 73%, 83%, 76%, 73% carotenoids từ đầu tôm sú Penaeus

monodon, tôm thẻ Penaeus indicus, Metapenaeus monocerous và tôm sú nuôi Penaeus monodon (Babu, 2008) Cũng sử dụng enzyme Pepsin thủy phân vỏ tôm chì

Một nghiên cứu khác của Jingxuan (2012) sử dụng Pepsin khử protein vỏ tôm Các yếu tố nhiệt độ, thời gian, nồng độ, pH được thay đổi để nghiên cứu lựa chọn thông số cho quá trình tối ưu Nhiệt độ được khảo sát tại các giá trị 25, 30, 35, 40,

1,5, 2, 3, 4, 5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của từng yếu tố đến HQKP thu được ở

nhiệt độ 35oC, pH 1,5, nồng độ enzyme 500 U/g trong 4 giờ HQKP là cao nhất Dựa vào các thông số thu được tác giả tối ưu hóa quá trình khử protein trên vỏ tôm ở nồng

Trong thực vật: Chitin có trong vách tế bào của nấm và một số loài tảo chlorophyceae

Chitin gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine liên kết với nhau nhờ cầu β-1,4

đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu Đối với tôm thẻ n = 400 - 500

Cấu trúc chitin được chia thành ba dạng α-chitin, β-chitin, γ-chitin (Hình 1.1) Chitin từ tôm và cua có dạng α-chitin, còn chitin từ mực có dạng β-chitin

Hình 1.1 Sự sắp xếp các chuỗi polyme của α-chitin, β-chitin, γ-chitin

Chitin nguyên chất mềm, dẻo và có tính đàn hồi, tuy nhiên trong tự nhiên chitin thường tồn tại kết hợp với khoáng (canxi cacbonat) tạo độ cứng và giòn Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu α-chitin có tính kỵ nước cao, β-chitin có tính trương nở với nước

Chitin hòa tan được trong dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4 và dimethylacetamide chứa 5% lithium chloride Chitin tự nhiên có độ deacetyl khoảng từ

8 – 12% Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin bị khử mất gốc acetyl tạo thành chitosan Chitin bị thủy phân tạo thành các phân tử glucosamin có hoạt tính sinh học cao khi đun nóng trong dung dịch HCl đặc [7]

1.3.2 Ứng dụng của chitin

Chitin và một số dẫn xuất của nó có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tự phân hủy, không gây dị ứng và không độc hại với con người Do vậy chitin được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, y học Trong lĩnh vực nông nghiệp chitin bước đầu có ứng dụng tốt trong việc bảo vệ thiết bị máy móc trong các nhà máy Ngoài ra chitin được bổ sung vào phân bón giúp tăng năng suất cây trồng Trong lĩnh vực công nghiệp chitin được sử dụng làm chất phụ gia ổn định, làm đặc thực phẩm và dược phẩm Chitin và dẫn xuất cũng được ứng dụng trong công nghệ nhuộm giúp tăng độ liên kết thuốc nhuộm và vải, làm bền màu sản phẩm Trong y học chitin và dẫn xuất được sử dụng làm lành vết thương

và giảm di ứng

1.3.3 Công nghệ sản xuất chitin

Ngoài chitin, hai thành phần chính trong NLCL là protein và khoáng Vì vậy để sản xuất chitin cần loại bỏ protein, khoáng và một số thành phần khác Có ba phương

pháp chính được nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất chitin, chitosan

1.3.3.1 Sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học

Phương pháp hóa học là phương pháp xử lý truyền thống được nghiên cứu và

áp dụng rộng rãi Hiện nay hầu hết các nhà máy sản xuất chitin đều sử dụng phương pháp này Thông thường sử dụng NaOH để khử protein và HCl khử khoáng Ưu điểm của phương pháp là hiệu quả cao, hàm lượng protein và khoáng còn lại trong chitin thấp, thời gian khử protein, khoáng cũng được rút ngắn đáng kể

Nghiên cứu của Stevens (2002) đầu vỏ tôm được khử protein bằng NaOH 4%,

cho sản phẩm chitin có hàm lượng khoáng và protein <1% Yamashaki và cộng sự cũng nghiên cứu sản xuất chitin bằng cách xử lý HCl 2M để khử khoáng và khử

protein bằng NaOH 15M ở 120oC trong 1 giờ Quy trình có thời gian sản xuất được rút ngắn đáng kể tuy nhiên độ nhớt chitosan thu được thấp do xử lý nhiệt cao

Trần Thị Luyến (2003) đã nghiên cứu sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học, vỏ tôm được xử lý HCl 10% ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ và xử

hiệu suất thu hồi và chất lượng chitosan tương đối tốt so với các quy trình hóa học khác Tuy nhiên lượng hóa chất sử dụng trong quy trình cao, độ deacetyl và độ nhớt còn hạn chế

Phương pháp hóa học có một số hạn chế nhất định Việc sử dụng kiềm và acid

có thể thủy phân cắt mạch polyme, sản phẩm chitin thu được có chất lượng thấp Hơn nữa việc sử dụng hóa chất có thể gây độc hại, ăn mòn thiết bị và sản phẩm chitin, các dẫn xuất không thích hợp sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm Sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học không tận thu được các thành phần có giá trị khác như protein, astaxanthin Protein và sắc tố chiếm một lượng không nhỏ trong NLCL, tận thu được những thành phần này sẽ mang lại giá trị kinh tế cao Sự thải bỏ các thành phần protein, khoáng, astaxanthin cùng với hóa chất trong quá trình xử lý bằng phương pháp hóa học không chỉ lãng phí các thành phần có giá trị mà còn gây ô nhiễm môi trường

1.3.3.2 Sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học

Sản xuất bằng phương pháp sinh học đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Phương pháp sử dụng enzyme protease khử protein, sử dụng vi khuẩn lên men khử khoáng Đây là phương pháp có nhiều ưu điểm như: Giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng, mạch chitin có độ dài tối đa và trọng lượng phân tử cao (Shimahara

và Takiguchi, 1988), hạn chế sự ảnh hưởng đến môi trường đặc biệt phương pháp cho phép thu hồi các thành phần có giá trị khác như protein, astaxanthin Sử dụng acid lactic trong quá trình sản xuất chitin loại bỏ được lượng protein, khoáng đáng kể, thân thiện với môi trường Độ deacetyl của chitin và chitosan tương đương với phương pháp hóa học [12] Ngoài ra nhiều vi sinh vật sinh enzyme có khả năng sinh acid giúp kết hợp quá trình khử khoáng và khử protein trong cùng một bước

Das và cộng sự đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Lactobacillus plantarum để

sinh acid hữu cơ thay thế HCl trong quá trình khử khoáng và sử dụng enzyme protease

tổng hợp từ nấm Aspergillus niger thay thế NaOH trong khử protein Tuy nhiên

phương pháp sinh học cho hiệu quả tách protein và khoáng không triệt để Hàm lượng protein còn lại sau khi thủy phân bằng enzyme còn khá cao nên chitin thu được chưa đạt tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm

Hơn nữa sản xuất chitin theo phương pháp sinh học thời gian sản xuất thường

kéo dài Sử dụng protease từ Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis Y-108,

CCRC 10029, Pseudomonas maltophilia CCRC 10737 có thể loại bỏ được (lần lượt

72%, 88%, 84%, 73%) protein vỏ tôm, ghẹ sau 7 ngày thủy phân [27, 36];

Pseudomonas maltophilia khử được 82% protein sau 6 ngày (Bustos và Michael,

1994); Pseudomonas aeruginosa K-187 khử được 82% protein vỏ và đầu tôm sau 5 ngày thủy phân (Hall và Silva, 1998) Hay sử dụng P matophilia vào việc tách protein

từ vỏ tôm đã khử khoáng, protein còn lại 5% và 8% sau 8 ngày xử lý (Shimahara và

Takiuchi, 1998) Wang (1998) cũng nghiên cứu sử dụng protease từ Pseudomonas

aeruginosa khử protein vỏ tôm cua, vỏ tôm, đầu tôm Đối với các mẫu bột vỏ tôm cua,

vỏ tôm, đầu tôm tươi quá trình lên men sử dụng P aeruginosa khá dài, kết quả khử

protein trên dịch lên men đạt tối đa sau 7, 5, 5 ngày và đạt 48, 55, 60% tương ứng trên

ba loại nguyên liệu Trên bã lên men sử dụng P.aeruginosa khử protein bột vỏ tôm

cua, vỏ, đầu tôm tươi trong 10, 5, 5 ngày đạt hiệu quả 68, 82, 81% tương ứng [37]

Ở Việt Nam, nghiên cứu sử dụng enzyme bromelin từ dứa để kết hợp thủy phân protein và khử khoáng trong sản xuất chitin [5] cho hiệu suất thu hồi chitin đạt 10,1% cao hơn so với phương pháp hóa học 2,7% Màu sắc của chitin thu bằng phương pháp sinh học đẹp hơn, lượng hóa chất sử dụng ít hơn phương pháp hóa học, ít gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên quy trình được thực hiện trong 8 ngày, thời gian xử lý của quy trình quá dài ảnh hưởng đến năng suất sản xuất quy mô công nghiệp Thêm vào đó chi phí sản xuất do sử dụng enzyme còn cao Vì vậy trên thực tế các doanh nghiệp sản xuất chưa áp dụng phương pháp sinh học vào sản xuất Hiện nay các công trình nghiên cứu sản xuất chitin thường áp dụng kết hợp phương pháp hóa học và phương pháp sinh học để khử protein và khoáng

1.3.3.3 Sản xuất chitin bằng phương pháp hóa học kết hợp sinh học

Đây là phương pháp sản xuất chitin chitosan đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Trung và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ứng dụng enzyme

Flavourzyme trong sản xuất chitin Đầu, vỏ tôm được thủy phân bằng enzyme Flavourzyme sau đó phân riêng dịch để thu hồi protein và astaxanthin, bã lọc khử protein lần 2 bằng NaOH loãng và khử khoáng bằng HCl Quy trình có nhiều ưu điểm như thu hồi lượng chất khô trong phế liệu tăng 20%; chitin, chitosan có chất lượng cao hơn, đặc biệt là độ nhớt so với phương pháp truyền thống Hỗn hợp protein và astaxanthin thu được có chất lượng tốt, có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc Ngoài ra nước thải của quy trình cải tiến có hàm lượng chất lơ lửng thấp, giảm hơn 90%, BOD giảm 50%, COD giảm 30% so với nước thải của phương pháp hóa học không thu hồi protein

Holanda và Netto (2006) đã nghiên cứu sử dụng enzyme Alcalase và enzyme Pancreatin để thu hồi các thành phần chính của đầu, vỏ và đuôi tôm

Xiphopenaeus kroyeri – Brazil Đầu vỏ tôm được thủy phân bằng Alcalase 3% ở pH

15 phút Dịch được sấy lạnh thu dịch đạm, bã được tiến hành thu hồi lipid và chitin Kết quả cho thấy enzyme Alcalase có hiệu quả khử protein tốt, tuy nhiên sau khử protein bằng Alcalase cần khử protein bằng NaOH hoặc KOH ở nồng độ 1, 3, 5%

Quy trình sản xuất chitin kết hợp phương pháp hóa học và sinh học sử dụng enzyme Alcalase khử protein từ tôm thẻ chân trắng thu tại các công ty chế biến thuộc Khánh Hòa (Trung, 2010) Với các điều kiện nghiên cứu: Tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu là

xử lý (4, 6, 8, 10, 12 giờ) Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N Bất hoạt enzyme

caroten Sau khử protein bằng enzyme chitin tiếp tục được xử lý với NaOH 2% trong

12 giờ và khử khoáng trong 12 giờ với HCl 4% tỷ lệ 1/5 (w/v) ở nhiệt độ phòng thu được chitin có hàm lượng protein còn lại 0,99 ± 0,1%, khoáng 0,98 ± 0,2% Chất

độ NaOH 50% trong 20 giờ) có mật độ khối 0,51 g/ml, độ hòa tan 99,2%, độ deacetyl 83% và độ nhớt 1436 cps Các thông số kiểm tra nước thải so sánh giữa quy trình kết

hợp xử lý enzyme của tác giả và quy trình hóa học Sau khi thu hồi carotenoprotein giảm ô nhiễm, chỉ tiêu TSS giảm 80%, BOD giảm 50%, COD giảm 30% so với phương pháp không thu hồi carotenoprotein

Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy việc kết hợp sử dụng enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin giúp giảm lượng hóa chất sử dụng, cải thiện chất lượng chitin, thu hồi protein, astaxanthin, hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trường Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do các cơ sở chế biến chitin gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin từ NLCL thủy sản Đây là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy

mô lớn Chitin, chitosan thu được có chất lượng cao hơn so với phương pháp hóa học, đặc biệt là độ nhớt và phân tử lượng Đồng thời, giảm hơn 50% lượng hóa chất sử dụng so với phương pháp hóa học truyền thống [39] Tuy nhiên thời gian sản xuất còn tương đối dài làm giảm năng xuất sản xuất trong công nghiệp dẫn đến giảm giá trị kinh

tế

Nghiên cứu thủy phân protein bằng enzyme Pepsin giúp giải quyết được các hạn chế đó Kết hợp thủy phân protein bằng enzyme Pepsin trong quá trình khử khoáng giúp giảm thời gian sản xuất, và tận thu được sản phẩm thủy phân Đặc biệt,

xử lý bằng enzyme Pepsin là enzyme trong hệ tiêu hóa, sản phẩm protein thủy phân bởi enzyme Pepsin có hệ số tiêu hóa cao hơn so với các enzyme protease khác

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất thiết bị

1 Đầu và vỏ tôm

Các mẫu được rã đông trong thùng xốp và làm tơi trước khi thí nghiệm

2.1.3.2 Thiết bị

Bể ổn nhiệt: mô đen Memmert Wnb 29 (L1), 29 lít; Memmert, Đức Máy vortex: mô đen ZX3; Velp, Italy Thiết bị đo UV vis: mô đen Cary 100; Varian, Mỹ Máy đo pH: mô đen pH testr 30; Eutech, Singapore Cân điện tử: mô đen V11P – Ohaus; Ohaus, Mỹ Tủ nung: mô đen B150; Nabertherm, Đức Tủ sấy: mô đen UM 400; Memmert, Đức

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Bố trí thí nghiệm theo phương pháp cổ điển và quy hoạch thực nghiệm

Nguyên liệu (đầu/vỏ tôm)

Tan giá, làm tơi

Đề xuất quy trình

Nghiên cứu xử lý với

NaOH

đó lựa chọn thời gian khử khoáng thích hợp xử lý các công đoạn tiếp theo

3 Xử lý với Pepsin

Sau xử lý với HCl vắt ráo phần rắn thu được, tiến hành bổ sung nước, điều chỉnh pH 2 ± 0,2 bằng acid HCl 1% rồi bổ sung enzyme Pepsin ở các nồng độ khác nhau và tiến hành quá trình thủy phân ở các điều kiện nhiệt độ, thời gian khác nhau nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tỷ lệ enzyme, nhiệt độ và thời gian xử lý đến HQKK và HQKP của enzyme Pepsin, từ đó xác định được các yếu tố cần nghiên cứu cho việc tối ưu hóa quá trình xử lý với enzyme Pepsin Chitin thô thu được theo chế độ xử lý tối ưu với Pepsin sẽ được kiểm tra hàm lượng protein, khoáng còn lại để

lựa chọn chế độ xử lý tiếp theo, nếu cần

4 Xử lý với NaOH

Sau xử lý bằng enzyme Pepsin ở chế độ tối ưu chitin thô được xử lý với NaOH

ở các điều kiện nồng độ, thời gian, nhiệt độ khác nhau đảm bảo hàm lượng protein, khoáng còn lại trên chitin nhỏ hơn 1%

2 Xác định ảnh hưởng của việc xử lý cơ học bằng phương pháp ép đến hàm

lượng protein, khoáng của nguyên liệu đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng

Mục đích: Xác định thành phần hóa học cơ bản của đầu, vỏ tôm thẻ nguyên

liệu trước và sau khi ép để xác định biện pháp xử lý thích hợp trước khi đưa vào quá trình sản xuất chitin Ngoài ra xác định thành phần hóa học của nguyên liệu trước và sau khi ép có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các thông số cho các công đoạn

xử lý tiếp theo như khử protein, khoáng

Tiến hành: Đầu, vỏ tôm bảo quản đông được rã đông làm tơi Một phần được

ép loại dịch và tách nước, một phần nguyên liệu chưa ép và bã ép đầu vỏ tôm được kiểm tra thành phần hóa học cơ bản: độ ẩm, hàm lượng protein, khoáng theo sơ đồ

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học cơ bản của đầu, vỏ

tôm nguyên liệu, bã ép đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng

Nguyên liệu (đầu/vỏ tôm)

Tan giá, làm tơi

Xử lý cơ học

Dịch

Bã

Xác định hàm lượng khoáng

Xác định hàm lượng protein

Xác định hàm

lượng ẩm

Loại bỏ

3 Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý với HCl đến hàm lượng protein,

khoáng trên đầu, vỏ tôm thẻ chân trắng

Mục đích: Xử lý đầu vỏ tôm với HCl giúp loại một lượng khoáng đáng kể và

một phần protein trên nguyên liệu tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình khử protein tiếp theo

Tiến hành: Bã đầu tôm, vỏ tôm được bổ sung HCl 2% với tỷ lệ 1/3 và 1% với

tỷ lệ 1/4 (w/v) tương ứng Sau khi xử lý ở nhiệt độ phòng với thời gian 0,5, 1, 2, 3, 4 giờ tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lượng protein, khoáng còn lại Từ đó lựa chọn thời gian khử khoáng thích hợp xử lý các công đoạn tiếp theo

Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý với HCl đến hàm lượng

protein, khoáng trên vỏ tôm thẻ chân trắng

Nguyên liệu (đầu/vỏ tôm)

Xử lý với HCl

Vỏ tôm: HCl 1%, nhiệt độ thường, tỷ lệ 1/4 (w/v)

Đầu tôm: HCl 2%, nhiệt độ

4 Nghiên cứu chế độ xử lý đầu, vỏ tôm với Pepsin

2.3.4.1 Nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng

Bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu chế độ xử lý với Pepsin

trên vỏ tôm thẻ chân trắng

động của Pepsin Tối ƣu hóa quá trình xử lý với

enzyme Pepsin

1 Khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên vỏ tôm thẻ chân trắng

Mục đích: Xác định khoảng nồng độ Pepsin cho hiệu quả tích cực đến khả

năng khử protein và khoáng trên vỏ tôm, đồng thời đánh giá tác động của việc phân ly hoặc không phân ly dịch xử lý với HCl từ đó khảo sát khả năng sử dụng Pepsin và lựa chọn chế độ xử lý tiếp theo

Tiến hành: Bã ép vỏ tôm bảo quản đông được rã đông và làm tơi Bổ sung HCl

1% tỷ lệ nguyên liệu/acid là 1/4 (w/v) Sau xử lý bằng HCl theo thời gian đã chọn, tiến hành phân ly loại dịch hoặc không phân ly Tiếp tục bổ sung nước và điều chỉnh pH đạt 2 ± 0,2 bằng HCl 1% Bổ sung Pepsin nồng độ 10 U/g pro, thủy phân trong 6 giờ ở

lượng protein, khoáng còn lại theo sơ đồ

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sử dụng Pepsin trên vỏ tôm

thẻ chân trắng Kết luận về khả năng sử dụng Pepsin

Lọc, rửa bã, làm khô

[E]=5 U/g pro

2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời điểm bổ sung Pepsin đến HQKP và HQKK

Mục đích: Thời gian khử khoáng với HCl có ảnh hưởng đến hàm lượng

khoáng còn lại và mức độ rỗng xốp của vỏ tôm trước khi xử lý với Pepsin Điều này

có thể ảnh hưởng đến HQKP của enzyme Pepsin Do đó cần khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử khoáng để xác định thời điểm bổ sung Pepsin hợp lý để hiệu quả thủy phân protein của Pepsin là cao nhất

Tiến hành: Vỏ tôm bảo quản đông được rã đông, làm tơi Mỗi mẫu cân 100g

bổ sung HCl 1% tỷ lệ nguyên liệu/acid 1/4 (w/v) Tiến hành khử khoáng trong 0,5, 1,

2, 3, 4 giờ và mẫu đối chứng không bổ sung HCl 1% Sau đó phân ly hoặc không phân

ly theo kết quả thí nghiệm trên Bổ sung enzyme Pepsin với nồng độ 10 U/g pro và các

phân tiến hành lọc rửa thu phần rắn phơi khô và kiểm tra hàm lượng protein, khoáng

còn lại để đánh giá chọn chế độ thích hợp

Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzyme đến HQKK và

HQKP của enzyme Pepsin

Xử lý thống kê, so sánh và đưa ra kết luận

Bã, rửa, làm khô

Xử lý không bổ sung Pepsin,

pH 2 ± 0,2 thời gian 6 giờ, nhiệt độ 37 o C

Xử lý HCl 1%, tỷ lệ 1/4 (w/v)

Xử lý với Pepsin 10 U/g pro,

pH 2 ± 0,2 thời gian 6 giờ, nhiệt độ 37 o C

Vỏ tôm rã đông, làm tơi