phân tích vi sinh thực phẩm tìm hiểu phương pháp pcr

• Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb.. - Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và không tr

MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

ĐỀ TÀI: TÌM HiỂU PHƯƠNG PHÁP PCR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

THÀNH VIÊN NHÓM

1 Định nghĩa

khuếch đại gen".

đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống.

2.Lịch sử

enzyme polymerase chịu nhiệt mà phương pháp này trở nên đơn giản, chính xác và

rẻ tiền hơn.

Nước:

Dung dịch đệm

5

6

7

1 DNA mẫu làm khuôn:

• Đây là mẫu DNA sinh học mà chúng ta muốn khuếch đại

• Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb

• Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt, tuy nhiên, kỹ thuật chuẩn đoán bằng phương pháp này vẫn đạt kết quả tốt trong trường hợp mẫu DNA không có độ tinh sạch cao

+ không tổng hợp được trình tự DNA dài quá 3kb

+ enzyme này không có khả năng sửa sai trong quá trình sao chép

3 Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi

- Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản.

- Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao

* Chọn mồi phải tuân theo nguyên tắc sau đây:

- Trình tự của mồi được chọn không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, và cũng không tạo những cấu trúc kẹp tóc

- Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

- Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (1kb)

- Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 đến 30 nucleotide, nếu mồi nhỏ hơn 10 nucleotide, mồi bám không đặc hiệu Còn mồi dài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng ở bước 3

- Tm mồi xuôi và mồi ngược không cách nhau quá xa, thông thưòng trong khoảng từ 4÷5°C, và nhiệt độ nóng chảy của mồi khoảng 72°C

- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 1.5mM.

- Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide.

6 Nước:

- Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải là nước tinh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào Không được chứa các enzyme cắt hạn chế và các enzyme phân hủy axit nucleic.

7 Dung dịch đệm:

- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 1.5mM.

- Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide.

1) Nhiệt độ tăng lên 94 - 96°C để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA

và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút

2) Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45 - 60°C) Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thờigian: 1-2 phút.

3)DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài.Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA- polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Như một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút.

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3

bước:

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Hỗn hợp PCR được chuẩn bị trên khay lạnh Quần áo bảo hộ là không cần thiết, nhưng nếu bảo hộ tốt thì phản ứng sẽ diễn ra trong

điều kiện vô trùng

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Các phản ứng PCR được nạp vào máy luân nhiệt

Các máy luân nhiệt bị khóa đóng và được lập trình

Máy luân nhiệt gồm 2 phận:

+ phần màu đen là một bộ bốn, trong đó có 4 bộ 96 mẫu có thể được chạy đồng thời

+ phần màu trắng gồm 4 màu trắng nhỏ hơn, mỗi cái có thể chứa 96 giếng

Tùy thuộc vào kích thước của các sản phẩm PCR ta sẽ phân loại bằng trực quan theo 2 cách thường dùng: + ngang - agarose gel

+ dọc - acrylamide trình tự gel

Ở đây, các sản phẩm đang được chạy trên một gel agarose- ngang.

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Gel acrylamide có thể được chạy trong một trong hai đơn vị: độc lập hoặc một trình tự tự động.

(Trong cả 2 hai trường hợp việc chuẩn bị gel phải theo trình tự và khá phức tạp để thiết lập )

Ở đây, kính đang được làm sạch và lau trước khi chuẩn bị gel cho một trình tự tự động.

Kính thủy tinh đang được đưa vào khung và được kẹp lại

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Các kính thủy tinh được kẹp vào vị trí, và toàn bộ tấm kính được chuẩn bị sẵn sàng cho việc đổ gel

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Gel acrylamide lỏng được đổ vào khuôn Vì acrylamide là một chất gây ung thư nên cần phải mặc quần áo bảo hộ.

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Kẹp chặt phía dưới của tấm thuỷ tinh để ngăn chặn sự rò rỉ gel

Một vật dụng giống chiếc lược được đưa vào phía trên của gel để tạo ra các giếng vào đó các mẫu sẽ được nạp vào.

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Sau khi mẫu được nạp, tấm kính chứa mẫu được đặt vào máy giải trình tự

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Lấy mẫu với một đa pipet

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

… và nạp vào các giếng của gel

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Đây là một cận cảnh từ các bức ảnh trước đó Lưu ý kích thước vô cùng nhỏ của giếng và đa pipet, làm cho nó có thể nạp một số lượng lớn các mẫu vào mỗi gel

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Một bộ phận gia nhiệt được đặt ngang với gel để đảm bảo nhiệt độ ổn định

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Gel đệm được nạp vào bể trên

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

….và vào bể dưới

III.Các giai đoạn trong một chu kì PCR

Kiểm tra lần cuối , sau đó đóng cửa và chương trình bắt đầu

IV Các thiết bị trong phản ứng PCR

IV Các thiết bị trong phản ứng PCR

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao.

Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao

Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt

Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt

Qua nghiên cứu cho thấy: tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau

Qua nghiên cứu cho thấy: tổng thời gian cho mỗi bước của một chu kỳ và của chu kỳ đầu với các chu kỳ tiếp theo là khác nhau

Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP để bổ sung với mạch khuôn

Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP để bổ sung với mạch khuôn

5 Các yếu tố ảnh hưởng

7 Thiết bị và dụng cụ Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác Tránh tối đa sự bốc hơi

nước trong quá trình phản ứng

Thiết bị cần đáp ứng yêu cầu thay đổi được nhiệt độ nhanh và chính xác Tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng

5 Ứng dụng

Thank You !