bià giảng công nghệ gen

Vector chuyển gen Một số đặc tính bổ sung  Chứa gen vô hiệu hóa sự gắn vào của các DNA không mong muốn  Có nhiều bản sao  Là phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập tron

CÔNG NGHỆ GEN

Bài giảng

GV: Nguyễn Thị Kim Cúc

Vật liệu cho công nghệ gen

Chủ đề 1

Các loại vật chủ thu nhận

 Tế bào nhân sơ (vi khuẩn)

 Escherichia coli và các vi khuẩn khác (Bacillus

subtilis, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas spp Streptomyces spp.…)

 Tế bào nhân thật

 Nấm men (Saccharomyces cerevisiae), nấm

mốc (Aspergillus nidulans)

 Sinh vật bậc cao: thực vật bậc cao, tế bào

động vật (tế bào côn trùng, tế bào trứng, tế

bào động vật có vú…)

Vector chuyển gen

 Một số đặc tính bổ sung

 Chứa gen vô hiệu hóa sự gắn vào của các DNA không mong muốn

 Có nhiều bản sao

 Là phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong

tế bào và mang được các gen cần chuyển

 Yêu cầu tối thiểu:

 Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)

 Có các vị trí cắt giới hạn nằm xa điểm ori

 Có trình tự khởi động promoter

 Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp

 Có các gen chỉ thị (marker genes)

Ứng dụng của vector chuyển gen

 Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) một đoạn trình tự DNA

 Nghiên cứu biểu hiện của một đoạn trình tự

Các loại vector tách dòng gen

 YAC vector (Yeast Artificial Chromosome)

và các vector ở sinh vật nhân chuẩn khác

 Thế hệ 3: là các plasmid đa năng (polycloning

plasmid) và chuyên dụng có vùng polylinkers

hoặc vùng multiple cloning sites (pUC19, pGEM, pBluescript…)

Plasmid vector pBR322

Plasmid vector pUC 19

Phage λ và phage M13

Bản đồ hệ gen của phage λ

Cosmid vector pWEB-TNC

Phagemid (vector M13mp18)

 Thuận lợi trong việc

xây dựng thư viện,

lập bản đồ và phân

tích genome

So sánh một số đặc điểm của

vector tạo dòng

Ứng dụng của vector chuyển gen

 Tách dòng nhằm khuếch đại một số lượng lớn các bản sao DNA xác định

 Nghiên cứu biểu hiện của một đoạn DNA chưa

biết

 Đưa gen cần nghiên cứu vào tế bào chủ

 Sản xuất protein từ gen được tạo dòng

 Sản xuất RNA với lượng lớn từ DNA tạo dòng

Các enzyme tách dòng gen

 Enzyme giới hạn (Restriction enzymes)

 Các enzyme biến đổi DNA

 Nuclease:Exonuclease III, DNase I, nuclease S1

Enzyme giới hạn (Restriction enzymes)

 Thí nghiệm: cho phage xâm nhiễm hai chủng

vi khuẩn A và B, các vi khuẩn này được nuôi

cấy trong môi trường thích hợp Sau khi thu hồi

và phân tích DNA của phage người ta nhận

thấy:

 Chủng A: xuất hiện nhiều DNA của phage còn

nguyên vẹn, nhưng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ

 Chủng B: DNA của phage bị cắt thành các đoạn có

kích thước xác định, tế bào vi khuẩn không bị phá vỡ

Restriction enzymes (RE)

 Được phát hiện đầu tiên bởi Werner Arber (1962)

 Là các enzyme được tìm thấy ở các loài vi khuẩn,

có khả năng thủy giải DNA mạch đôi ở những vị trí xác định

 Vi khuẩn sử dụng các RE để bảo vệ chúng khỏi các DNA ngoại lai

 Các RE hợp thành hệ thống bảo vệ ở prokaryote, chưa có hệ thống tương tự nào được phát hiện ở eukaryote

Vai trò sinh học của RE

 Hệ thống RE được hoạt động cùng với hệ thống methylase

 Methylase là enzyme thêm nhóm methyl vào

nucleotide chuyên biệt (A hoặc C) trong trình tự nhận biết (recognition sequence)

 Sự methyl hóa ngăn chặn sự nhận biết của RE

 Do đó, RE trong tế bào không phân cắt DNA của chính nó

Đặc điểm của RE

 Các RE gắn vào các trình tự ngắn đặc hiệu (4-6 nucleotides) của DNA.

 Các RE có thể tạo đầu bằng (blunt ends) hoặc đầu dính (sticky ends).

 Các đoạn được nối lại với nhau nhờ DNA ligase

 Các RE khác nhau cắt DNA theo những cách khác nhau

Đặc điểm của các RE

Đặc điểm của các RE

 Các RE cắt DNA ở

các vùng được gọi

là “palindromes”

Tên gọi các enzym giới hạn

g

Thứ tự dòng

Escherichia coli Ry13

Các loại enzyme cắt giới hạn

Loại I

nhận biết được trình tự đặc hiệu, cắt cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotid cắt tại đó

và phóng thích độ vài chục nucleotid.

Loại II nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.

Loại III nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó

khoảng 20 nucleotid về phía trước.

Các kiểu cắt của các enzym RE loại II

Cắt tạo đầu bằng (blunt ends)

Các kiểu cắt của các enzym RE loại II

Cắt tạo đầu dính (sticky ends)

Các kiểu cắt của các enzym RE

Trình tự nhận biết của một số

enzyme cắt giới hạn

Một số RE sử dụng phổ biến

Một số RE sử dụng phổ biến

Một số điều kiện cần lưu ý khi thực

hiện một phản ứng thủy giải bởi RE

 Chú ý đến điều kiện nhiệt độ, pH và dung dịch đệm

thích hợp

 Bảo quản ở -20 o C RE sẽ giữ được hoạt tính

 Thể tích RE = 1/10 thể tích phản ứng

Một số điều kiện cần lưu ý khi thực

hiện một phản ứng thủy giải bởi RE

Component Stock Concentration

Volume stock/reaction DNA (0.5 - 1 µg) up to 16 µL

10X Buffer 2 µL = 1/10 total

volume

nanopure water

as needed to bring total reaction volume

to 20 µL

Restriction Enzyme

(=>0.5 U) 5-50 Units

up to 2 µL <= 1/10 total volume Total = 20 µL

 Tạo dòng gen (Cloning)

 Thiết lập thư viện cDNA/genomic

 DNA mapping

Một số enzyme khác thường sử dụng

trong Công nghệ gen

 Các enzym polymerase

 Bao gồm: các DNA polymerase, các RNA

polymerase, Reverse transcriptase, Taq

polymerase…

 Các ligase

 Các nuclease

Ligation by T4 DNA ligase

 T4 DNA ligase A typical reaction for

inserting a fragment into a plasmid vector

(subcloning) would utilize about 0.01 (sticky

ends) to 1 (blunt ends) units of ligase

T4 RNA ligase

 Trích từ phage T4 xâm nhiễm E.coli

 Có khả năng nối 2 trình tự RNA bằng các

liên kết phosphodieste

Các nuclease

 Là enzym cắt DNA (DNase) và enzym cắt RNA (RNase) Các RE: cũng là những nuclease nhưng mang tính chuyên biệt trình tự cao hơn.

DNase I

 Enzym được tách chiết từ tụy bò

 Xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết nằm ngay sau

một base pyrimidin (G, C)

Nuclease S1

 Được ly trích từ nấm Aspergillus oryzae, có khả năng phân cắt DNA mạch đơn, không có khả năng phân cắt phân tử lai DNA – RNA.

Các nuclease

RNase A

 Được ly trích từ tụy bò, có hoạt tính rất cao, hiện diện ở

mọi nơi và cực kỳ bền vững (không mất hoạt tính khi bị xử

lý ở 90 o C trong một giờ), có khả năng cắt đặc hiệu liên kết phosphodieste nằm ngay sau một base pyrimidin (C và U) của RNA.

RNase H

 Có tác dụng loại bỏ RNA trong các phân tử lai DNA – RNA

Một số enzym RNase khác:

 RNase III và VI cắt RNA mạch đôi

 RNase T1 cắt ngay sau G

RNase U2 cắt ngay sau A

Bản đồ giới hạn (Restriction maps)

 Cho thấy độ dài các

Restriction

maps

A restriction map shows the lengths of DNA fragments between restriction sites

Linker: chuyển đầu bằng thành đầu dính (converting a blunt end to a sticky end)

 Linker là 2 đoạn

oligonucleotide có trình

tự bổ sung với nhau, có

chứa vị trí nhận biết của

Linkers

Adaptor: chuyển đầu bằng thành đầu

dính (converting a blunt end to a sticky end)

 Adaptor là đoạn

oligonucleotide mạch đôi

ngắn, không có phosphate

ở đầu 5’, có vị trí nhận biết

của enzyme giới hạn

 Cắt enzyme giới hạn trên

adaptor sẽ tạo ra 2 phân

tử adaptor đối xứng giống

nhau, có 1 đầu bằng và 1

Adaptors

Ví dụ: EcoRI-NotI-BamHI adaptor

TẠO DÒNG GEN

(GENE CLONING)

Chủ đề 2

TẠO DÒNG GENE

 Là kỹ thuật để nhân những đoạn DNA

 Nó có thể được thực hiện bởi hai phương pháp khác nhau:

▪ Dựa vào tế bào (cell based)

▪ Sử dụng phương pháp PCR

 Một vector cần thiết để mang đoạn DNA quan

tâm vào tế bào chủ

 Kỹ thuật này là bước đầu tiên của hầu hết các thí nghiệm công nghệ gen như: PCR, thiết lập thư viện DNA, giải trình tự DNA…

Quy trình tạo dòng gen

 Bước 1: Xác định, phân lập, xử lý đoạn gene

hoặc DNA cần được tạo dòng, chọn và xử lý

Phân lập các gen lạ hoặc DNA lạ cần

tạo dòng

 Cắt DNA lạ của tế bào cho bằng enzyme giới hạn

 Phân lập các đoạn DNA cần tạo dòng

 Trong trường hợp tạo dòng 1 gen chưa biết có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng dựa

vào dự đoán cấu trúc protein do gen mã hóa hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA

Phân lập các gen lạ hoặc DNA lạ cần

tạo dòng

Cloning PCR products

Cloning PCR products (tt)

Nguyên tắc chọn vector tách dòng

 Dựa vào kích thước và bản chất của DNA cần tách dòng làm căn cứ chọn vector

 Lưu ý sự tương đồng các vị trí cắt đặc hiệu của các

enzyme giới hạn giữa đoạn DNA và vector tách dòng

 Vector tách dòng phải thích hợp với tế bào chủ, có khả năng tái bản trong tế bào chủ, tạo số lượng bản sao lớn, nhưng không gây ảnh hưởng tới tế bào chủ

 Gen chỉ thị trong vector tách dòng càng dễ nhận biết

càng tốt

63

Chèn đoạn gen mục tiêu vào vector

 Vector và insert cần tạo dòng được trộn chung theo một tỷ

lệ nhất định với sự hiện diện của ligase

+

Chèn đoạn gen mục tiêu vào vector

Ví dụ: pBluescript II SK

Ví dụ: pBluescript II SK

Sự biến nạp (Transformation)

 Giới thiệu DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ thích hợp

 Nếu DNA được giới thiệu là DNA của virus thì được gọi là

sự lây nhiễm (transfection)

 Những tế bào vật chủ có khả năng thu nhận DNA đã qua

xử lý lý học và hóa học gọi là những tế bào có năng lực (competent cells)

 Kỹ thuật biến nạp:

 Xử lý với muối Calcium (CaCl2) và Sốc nhiệt

 Kích thích xung điện (electroporation)

 Kỹ thuật vi tiêm (microinjection)

 Súng bắn gene…

The binding and uptake of DNA by a

competent bacterial cell

Preparation of competent E coli

(chemical treatment)

 Culture E.coli

 Harvested in log phage

 Centrifugation and washed several times in

a chilled buffer (CaCl2)

 Suspended in a small volume of the buffer (high density)

Transformation

Phát hiện dòng cần tìm

Phát hiện dòng cần tìm

Làm thế nào để xác định tế bào nhận vector

Chiến thuật phát hiện dòng cần tìm

 Chọn lọc trực tiếp (direct selection) gen mong

muốn

 Xác định dòng cần tìm (Clone Identification)

 Phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn

 Phát hiện do thay đổi kiểu hình

 Lai acid nucleic (nucleic acid hybridization): sử dụng

Phát hiện dòng cần tìmChọn lọc trực tiếp gen mong muốn

Xác định dòng cần tìmPhương pháp phát hiện do mất hoạt

Xác định dòng cần tìmPhương pháp phát hiện do mất hoạt

Xác định dòng cần tìmPhương pháp phát hiện do mất hoạt

tính vì xen đoạn

Các bước để khẳng định gen mục

tiêu đã được tạo dòng

 Chọn và nuôi cấy các tế bào mang plasmid tái tổ hợp

 Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid (plasmid mini-prep)

 Phân tích bằng phương pháp PCR, hoặc cắt enzyme giới hạn hoặc giải trình tự

 Điện di sản phẩm PCR hoặc phản ứng cắt giới hạn

Khẳng định gen mục tiêu đã được tạo dòng

đúng bằng phương pháp PCR

Khẳng định gen mục tiêu đã được tạo dòng đúng bằng phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn

Chiến thuật tạo dòng sản phẩm PCR

 Tạo dòng vào vector bởi blunt ends ligation

 Tạo dòng vào vector bởi sticky ends

liagtion nếu sản phẩm PCR được biến đổi

từ đầu bằng sang đầu dính (gắn với linker hoặc adaptor hoặc thiết kế vị trí cắt

enzyme giới hạn trên primer

 Tạo dòng vào vector có đuôi T (T tail)

Cloning PCR products

Cloning PCR products

Ứng dụng tạo dòng gen

Tạo dòng theo phương thức khử

hoạt tính bằng chèn đoạn

Tạo dòng theo phương thức khử

hoạt tính bằng chèn đoạn (tt)

Tạo dòng định hướng

Tạo dòng định hướng (tt)

Tạo dòng trong bacteriophage λ

Tạo dòng trong bacteriophage λ (tt)

Tạo dòng trong cosmid

Tạo dòng trong

cosmid (tt)

Tạo dòng trong BAC vector

Tạo dòng trong BAC vector (tt)

Tạo dòng trong YAC vector

Tạo dòng trong YAC vector (tt)

Xây dựng thư viện DNA

Chủ đề 3

Xây dựng thư viện DNA

Thư viện

hệ gen

B4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ (Introduction of recombinant vector into the host)

B3 Chuẩn bị vector tách dòng và gắn các phân đoạn DNA vào vector (Vector preparation and

ligation)

B2 Cắt DNA bộ gen (Fragmentation of DNA)

B1 Chuẩn bị DNA bộ gen (Preparing DNA)

Quy trình xây dựng thư viện hệ gen

Phương pháp xây dựng thư viện hệ gen

Phương pháp cắt không hoàn toàn

Phương pháp cắt không hoàn toàn

Thư viện cDNA

 Thư viện cDNA là tập hợp các cDNA được tách dòng của các mRNA thu được từ một loại tế bào ở các giai đoạn phát triển khác nhau

 Thư viện cDNA phản ánh các kiểu biểu hiện

cụ thể của tế bào

Quy trình xây dựng thư viện cDNA

B1 Phân lập mRNA

B2 Tổng hợp cDNA mạch kép

từ mRNA B3 Chuẩn bị vector tách dòng

và gắn cDNA mạch kép vào

vector B4 Chuyển vector tái tổ hợp

vào tế bào chủ

Biểu hiện gen ở các tế bào khác nhau

“Not all genes are expressed

at the same time”

B1 Tinh sạch mRNA ở tế bào

eukaryote

B2 Tổng hợp cDNA (self-priming method)

B2 Tổng hợp cDNA (Phương pháp RNasH)

B2 Tổng hợp cDNA (homopolymer tailing method)

B2 Tổng hợp cDNA (homopolymer tailing + RE)

B2 Tổng hợp cDNA bằng Phương pháp 3’RACE (Rapid amplification of cDNA ends)

B2 Tổng hợp cDNA (Phương pháp 5’RACE)

Số lượng dòng cần thiết của một thư viện gen

N: số lượng dòng P: xác suất 1 gen được tạo dòng f: kích thước trung bình của các đoạn chèn g: kích thước của bộ gen

Sàng lọc thư viện DNA

nhận vector tái

tổ hợp mong

muốn ?

Sàng lọc thư viện DNA (Screening DNA libraries)

Phương pháp PCR

Phương pháp dựa trên sự biểu

hiện gen (Gene expression) Phương pháp dựa vào sự lai acid

nucleic (Nucleic acid hybridization)

1

2

3

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp PCR

Sàng lọc các dòng dựa vào biểu hiện gen

Sàng lọc các dòng dựa vào biểu hiện gen (tt)

(Ví dụ: gen kháng kháng sinh)

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp lai

acid nucleic với mẫu dò DNA

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp lai

acid nucleic với mẫu dò DNA (tt)

Bước 1: Chuyển các khuẩn lạc lên màng nitrocellulose

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp lai

acid nucleic với mẫu dò DNA (tt)

Bước 2: Phân giải tế bào, giải phóng DNA

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp lai

acid nucleic với mẫu dò DNA (tt)

Bước 3: Lai với mẫu dò DNA

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp lai

acid nucleic với mẫu dò DNA

Bước 4: Đọc kết quả

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp lai

acid nucleic với mẫu dò DNA (tt)

Sàng lọc dòng bằng phương pháp sử dụng

kháng thể

Sàng lọc thư viện DNA bằng phương pháp sử

dụng kháng thể

KỸ THUẬT CHUYỂN GENChủ đề 4

Một số khái niệm cơ bản trong kỹ

thuật chuyển gen

 Chuyển gen (transgenesis) là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể vật chủ, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau

 Khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật và

động vật Nấm men, vi khuẩn, virus và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp

(recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell).

 Gen chuyển (transgene) là gen ngoại lai được chuyển từ một

cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền

 GMO (genetically modified organism)

 GMP (genetically modified plant)

Nguyên tắc và mục đích chuyển gen

 Nguyên tắc của chuyển gen:

 Đưa một hoặc vài gen ngoại lai vào động vật hoặc thực vật

 Các gen ngoại lai này phải được truyền thông qua dòng mầm vì vậy mọi tế bào của động vật (thực vật) đều chứa vật chất di

truyền đã được sửa đổi như nhau.

 Mục đích của chuyển gen:

 Thêm một thông tin di truyền ngoại lai vào genome

 Để ức chế một gen nội sinh (sản xuất protein tái tổ hợp, tạo cây trồng và vật nuôi có đặc tính cải tiến mới, chuyển gen liệu

pháp…)

Các phương pháp chuyển gen ở vi

Chuyển gen

bằng kỹ thuật

xung điện

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Hãng Biorad)

Chuyển gen nhờ

Agrobacterium

Chuyển gen nhờ liposome

 The host cell is immobilized by applying a mild suction

with a blunt pipette The foreign gene is then injected with

a micro-injection needle

Microinjection

Ứng dụng của kỹ thuật chuyển gen

 Sản xuất protein protein tái tổ hợp

 Tạo giống mới với các đặc tính cải tiến

 Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình

nghiên cứu về y sinh học các bệnh di truyền

 Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền