công nghệ chuyển gene thực vật

Biến nạp gene vào thực vậtTế bào vi khuẩn được nhân lên theo công thức nhị phân Fission Binary Fission 16 • Tế bào vi khuẩn sản xuất polypeptide • Mã hóa các gen hoặc protein từ DNA cử

Công nghệ chuyển gene thực vật

NGUYỄN QUỐC ANH

2.3.1 THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN (GMP)

Gạo vàng giàu vitamin A

(gạo có chứa

beta-carotene)

Hoa hồng màu xanh ( được tạo ra

bằng cách thêm vào gene Iris cho

cây hồng)

2.3.1 THỰC VẬT BIẾN ĐỔI GEN (GMP)

GMP ( Genetically Modified Plant)

GMP : Là thực vật mà vật liệu di truyền của chúng bị biến đổi thông qua việc can thiệp bằng các kỹ thuật di truyền

4

Khái quát về quá trình

Vi khuẩn

NST của vi khuẩn

2.3.2 Các bước của quá trình biến nạp gene

4 Biến nạp gene vào thực vật

6

1 Chọn lựa gene, đoạn gene cần thiết

2 Cắt đoạn gene cần thiết

3 Chuyển đoạn gene cần thiết đó vào sinh vật khác

Gene dò tìm Genetic probe

1 Chọn đoạn gene cần thiết

(a) Cô lập gene cụ thể từ những sinh vật cho gene

• Phá vỡ tế bào

• Bổ sung những đoạn gen dò tìm (Genetic probe)

• Phát hiện vị trí của các gene cần quan tâm

Vị trí của

gen quan

tâm

1 Chọn đoạn gene cần thiết

2 Cắt đoạn gene cần thiết

Enzyme cắt giới hạn hoạt động như những cây kéo phân tử và cắt DNA ở những vị trí cụ thể được gọi

là vị trí cắt giới hạn (restriction sites)

Vị trí cắt giới hạn

Vị trí cắt

giới hạn

2 Cắt đoạn gene cần thiết

10

Vị trí cắt giới hạn

2 Cắt đoạn gene cần thiết

DNA cho gene

Điểm kết thúc

Plasmid

3 Chuyển gene vào tế bào vi khuẩn

12

Enzyme DNA ligase nối những điểm kết thúc lại với nhau

Plasmid DNA với những điểm kết thúc

3 Chuyển gen vào tế bào vi khuẩn

Plasmid

DNA

DNA cho gen

Enzyme DNA Ligase

nối những điểm kết

thúc lại với nhau

Next slide DNA tái tổ hợp

DNA Ligase

14

3 Chuyển gen vào tế bào vi khuẩn

DNA tái tổ hợp được đưa vào tế bào vi khuẩn

Nhiễm sắc

thể của vi

khuẩn

Tế bào vi khuẩn

DNA tái tổ hợp

Gen được khép kín

4 Biến nạp gene vào thực vật

Tế bào vi khuẩn được nhân lên theo công thức nhị phân

Fission (Binary Fission)

16

• Tế bào vi khuẩn sản xuất polypeptide

• Mã hóa các gen hoặc protein từ DNA cử sinh vật

cho gen

Tóm tắt các bước

DNA cho gene

Plasmid

1 Cắt với enzyme cắt giới hạn

DNA cho gene

Điểm kết thúc

2.3.3 Một số phương pháp chuyển gen

• 2.3.3.1 Chuyển gen gián tiếp

• a Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

có khả năng xâm nhập vào DNA thực vật.

Vùng vir làm tăng tần số biến nạp.

•

18

Tạo cà chua biến đổi gen

( 1) Sao chép một đoạn gen từ cà rốt

(2)Chèn đoạn gen vào một plasmid

(3) Plasmid này lại được đưa vào Agrobacterium

(4) Agrobacterium chuyển đoạn gen của cà rốt vào các TB

cà chua nằm trên đĩa petri.

(5)TB cà chua này tiếp tục sinh trưởng và chuyển sang môi trường có chứa hormone kích thích sự mọc rễ và chồi

(6) Gen từ cà rốt đã làm biến đổi sắc tố của cà chua thành

Nguyên lý

 Hệ gen của virus phải là DNA.

 Virus có khả năng di chuyển từ TB này sang

Chuyển gen bằng phương pháp hóa học

Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm

Chuyển gen bằng vi tiêm

Chuyển gen bằng xung điện

Chuyển gen bằng súng bắn gen

Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

2.3.3.2 Phương pháp chuyển gen trực

tiếp

• a Chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun)

Súng bắn gen Sơ đồ nguyên lý hoạt động

của súng bắn gen

24

Xuất hiện lỗ

chui vào trong TB

Sau khi biến nạp, tách những enzym phân giải và để cho TB phát triển, thành TB mới được tạo nên.

Các TB này được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp kích thích sinh trưởng tạo nên cây hoàn chỉnh.

Sau đó sử dụng các phương pháp phân tích genome

để tìm ra chính xác những cây biến đổi gen

Nhược điểm: chưa chắc chắn có sự biến nạp

c Chuyển gen bằng vi tiêm

Sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đưa DNA những TB nhất định nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast (TB trần) và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn.

Nguyên lý

Tối ưu lượng DNA đưa vào TB.

Quyết định được đưa DNA vào

tiêm và biến nạp được vào mọi

Mỗi lần tiêm chỉ được một phát và một TB.

Thao tác đòi hỏi độ chính xác cao

Ưu điểm

Nhược điểm

Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù khoảng 3mm.

Đem TB trần nuôi cấy trong môi trường

thích hợp và chọn ra TB trần được chuyển gen.

28

Tạo TB

trần

Plasmid tái tổ hợp (mang gen mong muốn)

d Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm

Nguyên lý

Dung dịch huyền phù

Nguyên lý

e Chuyển gen bằng phương pháp hóa học

Polyethylen glycol (PEG).

Khi có mặt PEG màng của TB trần bị thay đổi

và TB trần có thể thu nhận DNA ngoại lai.

Nguyên lý

30

Ưu điểm

 Tần số chuyển gen cao

DNA ngoại lai Đầu ống phấn Bầu nhụy

Thời gian chuyển gen tốt nhất khi quá trình thụ tinh xảy ra ở noãn và cho hợp tử chưa phân chia.

Phân tích và xác định kết quả chuyển gen ở thế hệ sau.

Hợp tử

Nhược điểm

 Khó xác định được thời điểm chuyển gen

f Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

• 2.3.4.1 Các hướng nghiên cứu

a Chuyển gen kháng nấm gây bệnh

thoái hóa các thành phần chính của vỏ TB

Thuốc lá

Cà chua

2.3.4 Các hướng nghiên cứu và thành tựu trong GMP

Gen mã hóa α- thionin – cystein được chuyển vào cây thuốc lá cũng phòng trừ

được VK Pseudomonas syringae

Dùng gen mã hóa enzym làm thoái hóa thành TB VK

Chuyển gen sản xuất protein làm giảm độc tố của VK

lá và khoai tây => Phòng trừ VK

Erwina carotovora

Lá cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV và đối chứng

Cây thuốc lá chuyển gen kháng virus CMV và đối

chứng

Đu đủ chuyển gen

kháng virus

Đu đủ đối chứng

Cà chua chuyển gen kháng vật kí sinh (phải)

c Chuyển gen kháng côn trùng phá hoại

các receptor

đặc trưng

Chết

Các cây trồng như bông, ngô, khoai tây

đã được chuyển gen này để tạo ra tính kháng với côn trùng loại nhai – nghiền

Ngô (Bt corn) mang gen Bt

(chống sâu hại)

–Thuốc diệt cỏ glyphosat là thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt nhất và ít gây ô nhiễm môi trường Thuốc kìm hãm sự hoạt động của enzym enol pyruvat sikimat phosphat

(EPSPS)

–Enzym này chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành

acid sikimic

–Acid sikimic không được hình thành sẽ làm rối loạn

toàn bộ quá trình trao đổi chất của cỏ và làm cỏ chết

–Cây trồng được tạo ra có hàm lượng và hoạt tính của enzym EPSPS cao gấp 4 lần so với cây trồng bình thường

và cây hoàn toàn chống chịu được với thuốc diệt cỏ

glyphosat

38

d Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

EPSPS Acid sikimic Cỏ

–Tạo ra các dòng gen ở cây đậu tương hoặc ngô mà các gen này mã hóa cho protein giàu các acid amin

(lysine, methionine, threonine và tryptophan)

–VD: chuyển gen mã hóa cho một loại protein chứa các acid amin có lưu huỳnh cao bất thường vào cây

đậu lupin với mục đích biểu hiện ở hạt Kết quả làm tăng 100% hàm lượng protein trong hạt Hạt này dùng

để nuôi cừu tăng trọng 7% và sản lượng lông tăng 8%

so với cừu nuôi bằng loại hạt bình thường

40

e Chuyển gen cải tiến các protein hạt

–Những gen mã hóa cho protein được gắn với một promotor và đảm bảo cho protein chỉ được tổng hợp

ở rễ Tiếp theo, protein tạo thành có một hệ thống tín hiệu đảm bảo cho nó được vận chuyển vào một vị trí xác định trong TB Trong trường hợp đặc biệt, protein được vận chuyển vào mạng lưới nội chất (ER)

–Protein đi vào có thể được thải ra bên ngoài và chỉ

ở vùng rễ, vì promoter chỉ đặc hiệu cho vùng này

Người ta dùng một số dung dịch muối để tách protein một cách dễ dàng với giá thành hợp lý

f Chuyển gen sản xuất các loại protein mới

–Chuyển gen mã hóa protein động vật vào thực vật để sản xuất protein thực vật.

–VD: chuyển gen tổng hợp lactoferrin (protein trong sữa động vật) vào khoai tây, lúa làm chúng có khả năng tổng hợp lactoferrin.

–Chuyển gen để sản xuất “thực phẩm chức năng”:

chuyển các gen tổng hợp các protein có tác dụng như các kháng nguyên vào cây trồng (rau, đậu, cây ăn quả) => Các cây này tạo được vaccin

–=> Ăn cây trồng chuyển gen tạo vaccin thay thế cho việc tiêm vaccine phòng bệnh.

42

f Chuyển gen sản xuất các loại protein mới

Thực phẩm chức năng

–Chuyển một phức hợp gồm gen rolC của A

tumefaciens và promoter CaMV 35S (cauliflower mosaic

virus: virus gây bệnh khảm ở súp – lơ) vào cây thuốc lá và

đã thu được cây chuyển gen bất thụ

–Kết quả này đang được nghiên cứu và áp dụng trên nhiều cây khác

44

g Chuyển gen mang tính bất thụ đực

–Gần đây, các nhà nghiên cứu của ĐH Bristol (Anh) đã thông báo về việc sản xuất hai chuỗi dài acid béo không tạo cholesterol với số lượng lớn ở thực vật bậc cao.

–VD: chuyển gen vào cây Arapidopsis thaliana tạo ra

được các acid béo thiết yếu như arachidonic acid và

eiconsapentaenoic acid

h Chuyển gen để sản xuất các acid béo thiết yếu

–Cây mù tạt Ấn Độ (Brassica juncea) vốn có khả năng

kháng và hấp thụ selen (độc với thực vật ở hàm lượng cao) Khi chuyển thêm gen tạo enzym đói selen vào làm cây này hấp thụ selen cao 3,4 lần

–Tuy nhiên, khả năng cây chuyển gen này sẽ lai với các loại hoa màu khác là một điều đáng lo ngại

46

i Làm sạch đất ô nhiễm

–Chuyển gen vào đậu tương và ngô làm cây có:

Hàm lượng dầu cao hơn, cung cấp nhiều năng lượng hơn cho bò, lợn và gia cầm

Hàm lượng các loại amino acid không thay thế cao hơn

Tăng hàm lượng phosphore trong thức ăn chăn nuôi

k Làm thức ăn chăn nuôi

–Các sắc tố tạo màu sắc hoa được chứa trong mô của cánh hoa nhất là TB biểu bì.

–Có 3 nhóm anthocyanin cơ bản tạo ra màu sắc hoa: dẫn xuất của các chất pelargonidin, cyanidin và

delphinidin

–Trên cơ sở biết gen mã hóa cho các enzym tham gia vào biến đổi sắc tố, người ta đã chuyển gen mã hóa hoặc gen ức chế hoạt động của các enzym nhằm điều khiển hướng chuyển hóa sắc tố tạo ra hoa có nhiều màu sắc

khác nhau

48

l Chuyển gen tạo giống hoa có nhiều màu sắc

Đa dạng màu hoa

Bông cải chuyển gen

• Ngoài ra, còn có các hướng khác:

Chuyển gen chịu lạnh

• Một loại gen chống giá rét lấy từ cá nước lạnh đã được cấy vào một số cây trồng.

• => cây trồng có thể chịu được nhiệt độ thấp.

50

Bông chuyển gen

chống lạnh

Chuyển gen chịu hạn/chịu mặn

• Tạo ra cây trồng có khả năng chịu đựng thời kỳ hạn hán dài ngày hoặc lượng muối cao trong đất

và nước ngầm sẽ giúp ích rất nhiều cho nông dân.

Lúa biến đổi gen trồng trên đất mặn

2 Một số thành tựu

• a Các cây trồng quan trọng đã được phát triển

laurate, oleic acid cao

52

Giống lúa vàng giàu vitamin

A

Đu đủ chuyển gen kháng

virus

“ Siêu cà chua” đẩy lùi ung

• Ở Việt Nam hiện có 3 cây biến đổi gen đang tồn tại là lúa, ngô, bông Từ năm 2002 đã

chuyển hướng sang cải tạo những cây lấy củ

(khoai, sắn) Đi xa hơn có các công trình như cây bông kháng sâu, cây đu đủ kháng bệnh đốm vòng, chuyển gen tổng hợp carotene vào cây lúa hay

công trình lúa kháng sâu

56

• b Các loại cây trồng đang được phát triển

Nguy cơ tiềm ẩn của thực vật chuyển gen

58

Môi

trường

Hủy hoại môi trường

Đe dọa thế giới sinh vật.

Giảm hiệu quả thuốc trừ sâu.

Chuyển gen sai mục đích.