CÔNG NGHỆ SINH học THỰC vật TRONG y dược

 Công nghệ sinh học thực vật hiện nay được phát triển và ứng dụng rộng rãi, giải quyết tốt các vấn đề trong y dược.. CÁC HƯỚNG ỨNG DỤNG CHÍNH CỦA CNSHTV TRONG Y DƯỢC Tạo và nhân phôi

Trường Đại học Nha Trang Viện Công nghệ sinh học và Môi trường

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT TRONG Y DƯỢC

GVHD: PHẠM THỊ MINH THU

Lớp: 6SH1

THỰC VẬT (CNSHTV)

Y DƯỢC

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THỰC VẬT (CNSHTV)

Y DƯỢC

I • • Tổng quan Tổng quan II.

• Các hướng ứng dụng chính

• Các hướng ứng dụng chính

III • • Ứng dụng cụ thể Ứng dụng cụ thể

- Y dược là ngành quan trọng đối với đời sống

- Mục tiêu nâng cao chất lượng cuộc sống, trong

đó SỨC KHỎE là luôn lĩnh vực quan trọng

nhất.

- Các công trình nghiên cứu khoa học - công

nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học

thực vật nói riêng áp dụng trong y dược vào

thời gian gần đây đã góp phần đưa y học Việt

Nam phát triển lên một tầm cao mới .

I TỔNG QUAN CNSHTV VÀ Y DƯỢC

1

 Công nghệ sinh học thực vật

hiện nay được phát triển và

ứng dụng rộng rãi, giải quyết

tốt các vấn đề trong y dược Sử dụng tài nguyên thiên nhiên

và các hợp chất tổng hợp một

cách có hiệu quả nhất.

Giúp nghiên cứu, phát triển

các loại thuốc và các dạng bào

1 Nuôi cấy mô, cơ quan tế bào thực vật trong y dược:

Thực phẩm chức năng

có tính điều trị và phòng bệnh ra đời mang lại hiệu quả kinh tế cao .

Giá thành rẻ nhưng chất lượng tốt, góp phần chăm sóc sức khỏe người dân.

 Đây là lĩnh vực kinh tế lớn rất được xã

hội quan tâm phát triển trong tương lai.

 Nhân giống và phát triển những dược liệu quý trên diện rộng.

II CÁC HƯỚNG ỨNG DỤNG CHÍNH CỦA CNSHTV TRONG Y DƯỢC

3

Sâm Ngọc Linh

Vàng đắng

Hoàng

liên

 Bảo tồn và lưu trữ những nguồn gen của cây

dược liệu quý.

 Việc chọn lựa cây dược liệu quý, có tính chữa

bệnh rõ ràng, và có tính kinh tế cao cần được

ưu tiên

 Việc ứng dụng dược liệu cần được đánh giá

bằng nghiên cứu khoa học.

 Vấn đề bảo tồn các cây giống và nghiên cứu

tạo giống mới có hàm lượng hoạt chất cao hơn

cần phải được quan tâm

 CNSHTV còn góp phần duy trì và mở rộng sự

đa dạng sinh học thực vật dược liệu.

II CÁC HƯỚNG ỨNG DỤNG CHÍNH CỦA CNSHTV TRONG Y DƯỢC

Tạo và nhân phôi soma trong sâm ngọc linh

trong môi trường lỏng

Nuôi cấy phôi in vitro

Nuôi cấy mô lá đinh lăng tạo rễ tơ

Nuôi cấy mô cơ quan

tách rời

Nuôi cấy

mô phân sinh

4

1 Nuôi cấy mô, cơ quan tế bào thực vật trong y dược:

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất hóa học dùng làm dược liệu rất có

giá trị.

 Những sản phẩm này, được biết như là các chất trao đổi thứ cấp.

Để sản xuất các sản phẩm thứ cấp từ thực vật, các mô thực vật ngoại sinh từ

cây hoàn chỉnh được nuôi cấy dịch huyền phù trong điều kiện vô trùng

Cơ sở của kỹ thuật: dựa trên tính toàn thể hóa duy nhất của tế bào thực vật.

 Nhiều sản phẩm trao đổi chất có thể được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền

phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh

Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có thể xếp trong ba

nhóm chính: alkaloid, tinh dầu và glycoside.

2 Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào:

II CÁC HƯỚNG ỨNG DỤNG CHÍNH CỦA CNSHTV TRONG Y DƯỢC

5

- Là một loại chất lỏng chứa các hợp chất thơm dễ bay hơi được chiết xuất bằng cách chưng cất hơi nước hoặc ép lạnh từ những

bộ phận của thực vật (lá, rễ, thân, hoa )

- Theo dòng lịch sử cũng từng được sử dụng trong lĩnh vực y học.

+ Phương pháp trị liệu, chăm sóc sức khỏe, làm đẹp trên toàn thế giới.

+ Tinh dầu dùng trong sản xuất thuốc.

- An toàn trong sử dụng và gần như không

có tác dụng phụ.

a Tinh dầu

6

b Các alkaloid:

Alkaloid có hoạt tính sinh lý trên tất cả

động vật và được sử dụng trong công

nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm:

codein, nicotine, caffeine, morphine

scopolamine

Hyoscyanus aegypticus

Chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ các

kỹ thuật tăng được sản lượng

scopolamine lên gấp hàng ngàn lần

Chọn lọc các dòng tế bào cao sản nhờ các

kỹ thuật tăng được sản lượng

scopolamine lên gấp hàng ngàn lần

NCTB trong 30 ngày trong hệ lên men quy mô lớn sản xuất được 3.500

kg reserpine = lượng hàng năm của cả thế giới thu được từ rễ cây đó.

NCTB trong 30 ngày trong hệ lên men quy mô lớn sản xuất được 3.500

kg reserpine = lượng hàng năm của cả thế giới thu được từ rễ cây đó.

Rauwolfia serpentina

reserpine

7

 Quá trình chuyển hóa các hợp chất

glycoside tim (cardiac) bằng nuôi cấy

tế bào của cây Digitalis lanata cũng

đã được nghiên cứu

 Sau 12 ngày, người ta đã thu được 4

g β-methyl-digitoxin trong một bình nuôi dung tích 20 L.

d Một số chất khác

Lithospermum erythrorhizon

Coleus blumei

rosmarinic acid

chiếm 13-15% trọng lượng khô trong chu kỳ nuôi 13 ngày, lớn gấp 5 lần so với hàm lượng trong cây trồng ở điều kiện tự nhiên.

9

phẩm tự nhiên quan trọng có ở vi khuẩn,

nấm, địa y và thực vật bậc cao có các họat

tính sinh học như: kháng khuẩn, kháng

nấm, giảm huyết áp, giảm đau, chống sốt

rét chống oxy hóa, kháng bệnh bạch cầu và

các chức năng đột biến

Rubiaceae

Rhamnaceae Rhamnaceae Polygonaceae Polygonaceae

Leguminosae

10

 Protein tái tổ hợp (protein ngoại lai) là protein tự nhiên được cải

biến bằng công nghệ DNA tái tổ hợp nhằm nâng cao hoặc thay đổi hoạt tính của chúng

 NCTBTV đã được sử dụng để sản xuất các sản phẩm tự nhiên

cách đây hơn 20 năm và gần đây hơn chúng được dùng để sản xuất các protein tái tổ hợp.

 Các protein có nguồn gốc thực vật an toàn cho người hơn các

protein có nguồn gốc từ tế bào động vật

 Ngoài ra, NCTBTV cũng là một công cụ thực nghiệm thuận lợi

cho việc khảo sát sự sản xuất protein ngoại lai trong cây hoàn chỉnh.

3 Các protein tái tổ hợp

11

3 Các protein tái tổ hợp

12

Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium

III Ứng dụng cụ thể của CNSHTV trong y dược

TẠO VÀ NHÂN PHÔI SOMA SÂM NGỌC LINH TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG

l 2,4 – D + 0,2 mg/l kinetin) + 500mg/l casein hydrolysate

Tạo huyền phù phôi cầu (B5 + 3mg/l IBA)

Nuôi lỏng phôi cấu tạo cụm phôi trưởng thành trong bình tam giác 250ml (SH + 1-2 mg/l NAA/IBA

Nuôi lỏng cụm phôi trưởng thành

trong bioreactor 3l

và 5l (SH + 1-2 mg/l IBA)

Tạo mô sẹo có khả

năng sinh phôi từ lá

Nuôi lỏng mô sẹo có khả năng sinh phôi trong bình

tam giác 250ml (1/2SH có và không có

10% nước dừa)13

Ghi nhận kết quả thí nghiệm sau khoảng 1,5 tháng nuôi Sau

đó, cấy chuyển mô sẹo trong khoảng 4 tháng (1 lần/tháng)

trên cùng môi trường để tạo mô sẹo xốp.

Cồn 70%: 1 phút Nước Javel thương mại 20%

(v/v, có bổ sung Tween 20 - hai giọt/100ml dung dịch):

10 phút Dung dịch HgCl 2 0,1%

(w/v): 5 phút

Cồn 70%: 1 phút Nước Javel thương mại 20%

(v/v, có bổ sung Tween 20 - hai giọt/100ml dung dịch):

10 phút Dung dịch HgCl 2 0,1%

(w/v): 5 phút

môi trường thạch MS có 1 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l kinetin

các mảnh kích thước 0,5 x 0,5cm

các mảnh kích thước 0,5 x 0,5cm

Lá chét 6 tháng tuổi

Lá chét 6 tháng tuổi

2 Quy trình cụ thể

a Khử trùng mẫu, chuẩn bị mẫu cấy và tạo mô sẹo xốp

từ lá cây in vivo

14

b Tạo huyền phù tế bào và huyền

phù phôi dạng cầu (phôi sơ cấp)

b Tạo huyền phù tế bào và huyền

phù phôi dạng cầu (phôi sơ cấp)

Ghi nhận sự hình thành phôi cầu Loại bỏ dần tế bào/cụm tế bào không sinh phôi theo thời gian từ

2 tháng nuôi cấy trở đi.

1/2MS có bổ sung 0,5 mg/l

BA, 1 mg/l IBA và 500 mg/l than hoạt tính

môi trường B5 (Gamborg,

1968) lỏng lắc

có 3 mg/l IBA

để tạo và nhân huyền phù phôi cầu

mô rã và treo vào môi trường thành huyền phù (suspension) tế bào khởi nguyên15

  Huyền phù tế bào 

đã được nuôi nhân 

ổn định (trong bình  tam giác 500ml)

 phù tế bào

Huyền phù tế bào sau 1 tháng nuôi cấy

16

Thể phôi soma dạng cầu (C) và dạng tim (T)  gần hoàn chỉnh hình thành sau 4 tháng nuôi cấy 

huyền phù tế bào

Cận cảnh cụm đa bào trong nuôi cấy

Quần thể  phôi soma  chủ yếu  dạng cầu  hình  thành sau 

5 tháng  nuôi cấy

17

rễ phát triển  trong môi trường 

1mm)

18

c Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ nuôi cấy lá mầm (cotyledon) và phôi non:

‐ Tạo nguồn vật liệu mô sẹo sinh phôi cho nghiên cứu nuôi nhân

bằng môi trường lỏng.

‐ Cấy các mảnh lá mầm (dài khoảng 0,8cm) từ cây mầm (phôi có

đầy đủ chồi và rễ) và phôi non in vitro (dài khoảng 1cm, có rễ nhưng chưa có lá mầm) trên môi trường thạch MS có 10% nước dừa, có và không có 0,2 mg/l IBA

‐ Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mô sẹo sinh phôi và phôi (có

hai lá mầm) sau 3 tháng nuôi.

19

và phôi có lá  mầm ở mẫu  nuôi cấy trên  môi trường có 

IBA

Sự phát triển theo thời gian tạo quần thể lớn 

phôi có lá mầm trên môi trường không có IBA

Sự hình thành phôi đơn và cụm phôi trên bề mặt lá mầm  (quan sát dưới kính hiển vi soi nổi dùng vật kính 4X

Lá mầm sau 15 ngày nuôi cấy

20

Sự hình  thành phôi 

ở vị trí đầu  phôi và 

d Nuôi phôi dạng cầu trong môi trường lỏng tạo sinh khối cụm phôi trưởng thành (có lá mầm và rễ mầm):

‐ Cấy 2 g mô phôi cầu vào bình tam giác 250ml chứa 50ml

môi trường SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) có NAA (1

và 2 mg/l) và IBA (1 và 2 mg/l)

‐ Ghi nhận kết quả sau 2,5 tháng nuôi Cụm mô phôi có rễ

tạo được dùng làm vật liệu nuôi cấy bằng bioreactor

22

không có   IBA (đối  chứng ) 

23

e Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi trong bình tam giác và bằng bioreactor

- Cấy nuôi 5g (5% - w/v) mô sẹo sinh phôi vào bình tam giác 250ml

chứa 100ml môi trường 1/2SH không có và có 10% nước dừa

- Cấy nuôi 50g mô vào bioreactor dạng cầu/trụ (3 và 10 lít) với dung

tích (2 lít và 5,5 lít, theo thứ tự) môi trường 1/2SH có 10% nước dừa.

- Ghi nhận kết quả sau 1 tháng nuôi trong bioreactor bằng cách cân

trọng lượng tươi (g).

24

a Mô sẹo sinh phôi dùng nuôi cấy.

b Mô sẹo sinh phôi nuôi cấy trong môi trường

1/2SH, sau 2 tháng.

c Mô sẹo sinh phôi nuôi cấy trong môi trường

1/2SH có 10% nước dừa, sau 2 tháng.

d Mô phôi giai đoạn có lá mầm dùng nuôi cấy.

e Mô phôi giai đoạn tạo lá mầm nuôi cấy

trong môi trường 1/2SH, sau 2 tháng.

f Mô phôi giai đoạn tạo lá mầm nuôi cấy trong

môi trường 1/2SH có 10% nước dừa, sau 2

tháng.

và phôi có rễ trong quá trình nuôi cấy lỏng (vị trí mũi tên)

f e

f Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor

- Cấy 50 g mô cụm phôi trưởng thành vào bioreactor dạng cầu (3 và 5 lít) chứa

2 lít - 2,5% (w/v) và 3,5 lít - 1,5% (w/v), theo thứ tự, môi trường SH có 1 mg/l

và 2 mg/l IBA Ghi nhận kết quả sau 1 tháng nuôi cấy.

g Điều kiện nuôi cấy

‐ Để ở điều kiện sáng (10 giờ chiếu sáng/ngày; cường độ ánh sáng 2.000 - 3.000lux tùy trường hợp), nhiệt độ 25 – 28 0 C đối với nuôi mô sẹo sinh phôi, cụm phôi có rễ, chồi và cây.

‐ Để tối ở nhiệt độ 24 0 C trong tủ nuôi đối với nuôi tạo và nhân mô sẹo.

‐ Nuôi lắc được thực hiện ở tốc độ 110 vòng/phút Nuôi bioreactor dùng tốc độ thổi khí 0,1vvm.

26

bằng  bioreactor  dạng cầu   5  lít, sau 1 tháng  nuôi cấy trong  môi trường có 

2 mg/l IBA.

Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng  bioreactor dạng trụ 3 lít, sau 1 tháng nuôi  cấy trong môi trường SH có 1 mg/l IBA.

Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi  bằng bioreactor dạng cầu 3 lít, 

sau 1 tháng nuôi cấy .

27

I Tài liệu tham khảo

- Mai Trường1 , Trần Thị Ngọc Hà 1 , Trần Trọng Tuấn 1 , Phan Tường Lộc 1 , Đỗ Đăng Giáp 1 , Bùi Đình Thạch 1 , Nguyễn Thị Ngọc Hân 1 , Phạm Đức Trí 1 , Lê Tấn Đức 1 , Nguyễn Đức Minh Hùng 1 , Nguyễn Văn Kết 2 , Nguyễn Hữu Hổ - TẠO VÀ NHÂN PHÔI SOMA SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.) TRONG MÔI TRƯỜNG LỎNG.

- Phạm Thị Minh Thu – Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật.

CÁM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE