Đề tài Enzym thực vật

Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụphải được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên phần sẽ được loại bỏ lấy đi khoảng 10% enzym và sau khi thu nhữn

MỤC LỤC

PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT

1.1 TỔNG QUAN 5

1.2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT 5

1.2.1 Quy trình công nghệ 5

1.2.2 Thuyết minh quy trình công nghệ 6

1.2.2.1 Phá vỡ tế bào 6

1.2.2.2 Thu dịch enzym thô 6

1.2.2.3 Tách enzyme 8

1.2.2.4 Tinh sạch 13

1.2.2.5 Kết tinh 14

1.3 NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM 14

1.4 ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT 14

1.4.1 Bromelin 14

1.4.1.1 Đặc điểm 14

1.4.1.2 Sản xuất 18

1.4.1.3 Ứng dụng 21

1.4.1.4 Sản phẩm thương mại 24

1.4.1.5 Hướng nghiên cứu 27

1.4.2 Papain 29

1.4.2.1 Đặc điểm 29

1.4.2.2 Sản xuất 33

1.4.2.3 Ứng dụng 34

1.4.2.4 Sản phẩm thương mại 37

1.4.3 Ficin 39

1.4.3.1 Đặc điểm 39

1.4.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzym ficin 41

PHẦN 2 : ENZYM ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2.1 ENZYM PECTINASE 44

2.1.1 Phân loại 46

2.1.2 Đặc điểm enzym pectinase 46

2.1.2.1 Enzym pectinase từ thực vật 46

2.1.2.2 Enzym pectinase từ vi sinh vật 50

2.1.3 Ứng dụng enzym pectinase trong thực phẩm 52

2.1.4 Ứng dụng enzym pectinase trong sản xuất nước dứa 55

2.2 ENZYM AMYLASELASE 57

2.2.1 Phân loại 58

2.2.2 Đặc điểm 58

2.2.2.1 Enzym amylase từ thực vật 58

2.2.2.2 Enzym amylase từ vi sinh vật 60

2.2.3 Ứng dụng amylase trong thực phẩm 61

2.2.4 Một số chế phẩm thương mại 64

2.3 ENZYM CENLLULASE 64

2.3.1 Phân loại 65

2.3.2 Đặc điểm 65

2.4 ENZYM OXY HÓA – KHỬ 67

2.4.1 Enzym peroxydase 67

2.4.2 Enzym polyphenoloxydase 67

2.4.3 Enzym glucooxydase 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin

15

Bảng 1.2: Những tính chất vật lý của protein thân 16

Bảng 1.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin 16

Bảng 1.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin 17

Bảng 1.5: Hằng số Michaelis với các cơ chất tổng hợp khác nhau của bromelin thân 17

Bảng 1.6: Ảnh hưởng trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của bromelin 18

Bảng 1.7: Tính chất vật lý của papain 30

Bảng 1.8: Giá trị dinh dưỡng trên100 g chất quả 33

Bảng 1.9: %RDI 34

Bảng 1.10: Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng thái cơ chất của papain 38

Bảng 1.11: Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin 40

Bảng 1.12: Tính chất vật lí của ficin 41

Bảng 2.1 : Phân loại enzym pectinase 53

Bảng 2.2 : Hàm lượng pectin của một số quả và dịch quả 53

Bảng 2.3 : Một số tính chất của amylase từ các nguồn khác nhau 59

Bảng 2.4 : Ứng dụng enzym amylase 61

Bảng 2.5 : hiệu suất chuyển hóa tinh bột bằng enzym cố định trong sản xuất syro fructose 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 : Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin 14

Hình 1.2 : Chất chiết từ lá và thân dứa (Ananas comosus) với hàm lượng bromelain cao, được sản xuất dưới dạng viên nén, chứa 200mg bromelin/viên 24

Hình 1.3 : Chế phẩm bromelin có hoạt lực cao (1200gdu/g hay 1800mcu/g)

25

Hình 1.4: Bột bromelin bổ sung vào thức ăn cho gia súc 25

Hình 1.5: Quercetin & Bromelain - Thuốc giúp bệnh thống phong 25

Hình 1.6: Bromelain - Tinh chất quả dứa trị viêm mũi 26

Hình 1.7: Tâm hoạt động của papain 30

Hình 1.8: Cơ chế ảnh hưởng của pH 32

Hình 1.9: Cơ chế hoạt động 33

Hình 1.10: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa 34

Hình 1.11: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ 35

Hình 1.12: Papain ứng dụng trong mỹ phẩm 39

Hình 1.13: Papain trongcác loại dược phẩm 39

Hình 2.1 : Cấu trúc của pectinase từ carrot 47

Hình 2.2 : Polygalacturonase từ erwinia carotovora ssp carotovora 49

Hình 2.3 : Ảnh hường của pectinase đến hiệu suất trích ly nước dứa 56

Hình 2.4 :Ảnh hưởng của pectinase Ultra SP-L đến hiệu suất trích ly dứa

57

Hình 2.5: Ảnh hường pectinase 3XL đến quá trình làm trong dịch dứa

57

PHẦN 1: NHỮNG ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT

1.1 TỔNG QUAN [3]:

Enzym là những chất không thể tổng hợp bằng phương pháp hoá học, chỉ

có thể thu nhận chúng từ các nguồn sinh học Mặc dù enzym có trong tất cả các

cơ quan, mô của động vật, thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việctách enzyme gặp rất nhiều khó khăn, nhất là tách với quy mô công nghiệp mộtcách thuận lợi về kinh tế chỉ có thể tiến hành đối với nguyên liệu có chứa hàmlượng lớn enzym Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quanđộng vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

Từ thực vật người ta cũng thu được một số chế phẩm enzym thuỷ phân nhưpapain, bromelin, ficin, amylase, urease, …

Người ta thu papain từ nhựa (mủ) đu đủ xanh bằng cáchkhuấy nhựa một thời gian và sau đó tách lấy kết tủa protein và đem sấykhô nghiền nhỏ

Bromelin thu từ thân dứa Sau khi hái quả người ta bỏ lá và

ép thân lấy dịch rồi dùng dung môi hữu cơ kết tủa enzym trong dịch ép

Ficin được tách từ dịch ép thân và lá giống Ficus

Amylase được thu nhận từ nguồn malt đại mạch và các hạtnảy mầm khác, được sử dụng chủ yếu trong công nghệ sản xuất rượu bia,bánh kẹo

Urease từ hạt đậu tương, lipase từ hạt thầu dầu, _amylaseamylase

từ củ khoai lang, saccharase từ lá củ cải đường …

1.2 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYM TỪ THỰC VẬT [3],[4]:

1.2.1 Quy trình công nghệ:

1.2.2 Thuyết minh quy trình công nghệ:

1.2.2.1 Phá vỡ tế bào:

Trong cơ thể sinh vật, enzym có trong tế bào chất và các cấu tử (nhânmicroxom, mitochrondri …) của tế bào Các phân tử enzym không có khả năng điqua màng của tế bào và màng của các cấu tử (mitochrondri) của tế bào Do đó, để

có thể chiết rút các enzym nội bào cần phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào

Có thể phá vỡ cấu trúc của tế bào bằng các biện pháp:

Xay nhuyễnNghiền: nghiền với bột thủy tinh hoặc cát sạch

Đồng hóa: dùng áp lực cao để phá vỡ tế bào mô thực vật, từ

đó làm giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzym nội bào màkhông làm biến tính chúng Điều này cũng tạo thuận lợi khi ta sử dụngphương pháp siêu lọc để làm tinh sạch enzym

Sử dụng sóng siêu âm

Sử dụng dung môi hữu cơ: rượu butylic, aceton, glycerine

1.2.2.2.Thu dịch enzym thô:

Sau khi đã phá vỡ cấu trúc tế bào, enzym được chiết bằng nước, bằng cácdung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính

Có thể sử dụng các phương pháp lắng, lọc, ly tâm, trích ly

1.2.2.3.Tách enzym:

Có thể sử dụng nhiều phương pháp như:

Phương pháp kết tủa enzym:

Nguyên tắc:

Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn 7, do đó trong điều kiện sinh lý,các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kếthợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước cũng như các ion dương.Điều này làm cản trở sự kết tủa của chúng Enzym có bản chất protein, do đó đểkết tủa được enzym phải phá vỡ lớp nước xung quanh bằng cách bổ sung vào dungdịch enzym các dung môi hoặc các hóa chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơnprotein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein, giúp protein tủa xuống

Các dung môi thường sử dụng là acetone, ethanol, các muối trung tính ởnồng độ cao như ammonium sulphate

Những yếu tố chính ảnh hưởng hiệu suất và chất lượng chế phẩm enzym là:

- Nồng độ của ammonium sulphate

Màng siêu lọc: được cấu tạo bằng các sợi rỗng Trong mỗi sợi rỗng lại cóchứa nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ

để các chất thấm qua Các sợi này được chế tạo từ các loại polymer bền như fluoropolymer (FS), cellulose acetate (CA), polysulphone(GR)… Tùy theo mục đích cụthể mà người ta sử dụng loại màng thích hợp

Ví dụ:

 Cô đặc protein dùng màng FS, GR

 Cô đặc enzym dùng màng GR

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc:

- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với loại sản phẩm và loại màng sửdụng Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sựtăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng

- Áp suất: thường áp suất của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng ápsuất cho đến khi đạt giá trị cực đại Nếu áp suất tăng cao hơn nữa thì tốc độdòng chảy sẽ giảm

Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc:

- Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể

- Đối với enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính

- Siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym Trong quá trìnhthực hiện, nếu cho thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzym càng cao

- Trong quá trình siêu lọc, nếu nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính củaenzym, do đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợpnhất cho năng suất mà không làm mất hoạt tính enzym càng cao Trongquá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp (5oC).

Phương pháp hấp phụ:

Hấp phụ “trong thể tích” (thêm chất hấp phụ trực tiếp vào trong dịchenzym) hoặc trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùng phổ biến trong việc tách và làmsạch enzym Hấp phụ chọn lọc enzym có thể thực hiện bằng một trong hai cách:chất hấp phụ protein tạp hoặc chất hấp phụ enzym Quá trình hấp phụ thường đượctiến hành ở 0oC Enzym sau đó được chiết bằng các dung môi thích hợp

1.2.2.4.Tinh sạch

Enzym rất dễ bị giảm hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhânbên ngoài Do đó khi tinh chế enzym, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởngxấu đến hoạt tính enzym, cần tiến hành nhanh ở điều kiện nhiệt độ thấp, thời gianngắn, môi trường có pH thích hợp và không có mặt các tác nhân gây biến tính

Các phương pháp thường được áp dụng khi tinh chế enzym là:

- Hấp phụ trên gel

- Phương pháp thẩm tích

- Cột sắc kí (ví dụ: DEAE –cellulose)

- Kết tủa phân đoạn hay bằng dung môi hữu cơ

Để tinh chế enzym hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau

Có thể hấp phụ chọn lọc enzym theo hai cách:

Để hấp phụ enzym tốt nhất, cần tuân theo những nguyên tắc chung sau:

- Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%

- Tỷ lệ của gel (trọng lượng khô) đối với protein thường là 20:1

- Nồng độ chất điện ly (muối) thấp trong dung dịch Sự tồn tại của bất kìmột lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ Vì thếmột lượng lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quảmong muốn.

- Sự hấp phụ enzym hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 0oC trong lúc trộndung dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng Đây là mộtphương pháp nhanh, sự cân bằng giữa các chất hấp phụ và dung dịchhình thành rất sớm và chỉ sau vài phút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ.Quá trình được tiến hành tuần tự như sau:

- Cho vào dung dịch enzym liên tiếp những lượng gel thích hợp

- Trộn đều

- Quay lắng

- Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào

Để mức độ tinh khiết của enzym thu được cao nhất, lượng chất hấp phụphải được điều chỉnh sao cho những phân đoạn đầu tiên (phần sẽ được loại bỏ) lấy

đi khoảng 10% enzym và sau khi thu những phân đoạn hoạt động, phải còn lại10% enzym trong dung dịch

Để thu nhận enzym ta sẽ tiến hành rửa giải từ chất hấp phụ Nếu enzymkhông được rửa hấp bằng nước thì cần phân tán phần hấp phụ vào nước và ly tâmlại Trong sản xuất, để gel phân tán tốt trong nước rửa hoặc chất giải hấp cần phải

có cánh khuấy với tốc độ cao Giải hấp enzym sẽ hiệu quả hơn trong dung dịchđệm base nhẹ (pH = 7,6) Quá trình càng hiệu quả với dung dịch (NH4)2SO4 10%.Thể tích dung dịch rửa giải không nên quá lớn, thường là ít hơn thể tích gel ly tâm.Nên tiến hành rửa giải nhiều lần với thể tích nhỏ hơn là một lần với thể tích lớn

Phương pháp thẩm tích

Lấy enzym thô pha trong dung dịch đệm thích hợp, sau khi tất cả enzym đãhòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa dung dịchđệm ban đầu Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được trángđầy bằng dung dịch đệm trên Tiến hành thẩm tích trong thời gian thích hợp, nếu

có thể thì nên thay dung dịch đệm bên ngoài nhiều lần để đạt tinh sạch cao Dungdịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ

Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhấtđịnh thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ Nhưng nếu sự giatăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì protein enzym sẽ bị biến tính do nhiệt độcao làm ảnh hưởng đến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzym.Chính vì vậy, để làm giảm sự biến tính của enzym do nhiệt, người ta thường tiếnhành tinh sạch enzym ở nhiệt độ thấp

Cột sắc ký:

Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzym tinhkhiết Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng

rây phân tử Nhưng trên thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnhhưởng của cả ba quá trình trên

Nguyên tắc: cho dung dịch chế phẩm enzym vào trong dung dịch đệm vớicột trao đổi ion đã được cân bằng, tiến hành giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải(gradient muối) với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa

sẽ đẩy ra khỏi cột các enzym vừa liên kết với nhựa Khi đó enzym nào có ái lựcvới nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất, lần lượt các enzym khác nhau

sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó có phần chứaenzym cần thu với nồng độ cao nhất

Các chất trao đổi ion có thể được sử dụng là nhựa resin trao đổi ion (đặcbiệt là amberlite IRC-50, XE-64), những dẫn xuất khác nhau của cellulose nhưdiethylaminoethyl cellulose (DEAE-cellulose), carboxymethyl cellulose (CMC).Dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu được hiệu quả tốt đối với những enzym có trọnglượng phân tử tương đối nhỏ, có điểm đẳng điện trong vùng kiềm, đồng thời việcrửa giải những enzym phân tử lớn ra khỏi cột cũng gặp không ít khó khăn Vì thếDEAE-cellulose và CMC thường được sử dụng rộng rãi hơn do có khả năng loại

bỏ được các tạp chất acid nucleic

Quá trình phân tách được tiến hành tuần tự như sau:

- Lấy một thể tích V dung dịch (không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy mộtlần qua cột để loại muối ra khỏi dung dịch protein

- Protein chảy ra khỏi cột với một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so vớithể tích của nó lúc đưa vào cột

- Trên các cột chứa sephadex G-75, G-100, G-200 đồng thời xảy ra sựphân tách từng phần các protein tùy theo phân tử lượng của chúng

- Ngoài sephadex, tất cả các cột đều cần gradient muối cho việc rửa giải.Các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kếtvới nhựa Đẩy protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau:

o Tăng nồng độ các dung dịch đệm

o Tăng nồng độ dung dịch NaCl hay KCl thêm vào dung dịch

o Thay đổi pH của dung dịch tách

Các phân đoạn có chứa enzym với hoạt tính riêng lớn nhất (là phân đoạnchứa enzym cần thu) được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc (hoặc làmkhô) bằng cách loại hơi ẩm trong chân không ở nhiệt độ thấp

Phương pháp sắc kí trao đổi ion được áp dụng rộng rãi khi phân tách hỗn hợpprotein và trong tách riêng những enzym và hormone tinh khiết tới mức tối đa.Nhờ đó, người ta đã loại được những tạp chất protein nhỏ ra khỏi những chế phẩmenzym thuần nhất về điện ly

Điện di:

Là phương pháp vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzym

và cũng là phương pháp để xác định sự tinh khiết của các chế phẩm protein Gần

Nguyên tắc:

Phân tử protein có điện tích tự do chứa nhóm acid, base Nếu các phân tửprotein enzym không đặt ở những điểm đẳng điện (ở đó tổng điện tích âm bằngtổng điện tích dương) thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyểntrong điện trường ở những điều kiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũngkhác nhau Do đó, hỗn hợp protein được phân tách ra thành một số vùng riêng biệthoặc những phân đoạn riêng biệt

Những phân đoạn enzym thu được sẽ được xác định hàm lượng protein,hoạt độ enzym và biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ

1.2.2.5.Kết tinh:

Khi enzym đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh Tuy nhiên,kết tinh không có nghĩa là chế phẩm enzym tinh khiết Hoạt độ riêng của tinh thểtăng khi các enzym tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần lặp lại nhiều lần chođến khi hoạt độ riêng tăng đến một giá trị cao nhất, không tăng được nữa

Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzym như

là một phương pháp phân đoạn protein có giá trị Vì thế, tốt nhất nên xem quátrình kết tinh như là một phương pháp cụ thể của quá trình phân đoạn, và được sửdụng ở những giai đoạn tinh thể cuối cùng

Sự kết tinh enzym thường được tiến hành từ các dung dịch ammoniumsulfat Để thu được những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ quanhiều ngày hoặc tuần Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dungdịch enzym đậm đặc cho đến khi bắt đầu thấy đục rõ Có thể thêm dung dịch muốinồng độ cao từng giọt, từng giọt hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩmtích ( trong một số trường hợp dung dịch enzym được thẩm tích đối với dung dịchammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hoặc dung dịch đơn giản được làmbay hơi chậm Sau đó, người ta để yên các dung dịch, không khuấy trộn trong vàingày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể enzym sẽ xuất hiện như ý muốn Khithêm nồng độ muối cao, thường enzym kết tủa dưới dạng vô định hình Ngoài racần thử thực nghiệm nhiều giá trị pH và nhiệt độ để đạt hiệu quả kết tinh Thayvào đó, quá trình kết tinh được tiến hành ở những nồng độ muối xác định bằngcách thay đổi đều đặn và từ từ pH hoặc nhiệt độ Nếu trước khi kết tinh mà thấydung dịch enzym loãng thì cần cô đặc dung dịch trước

Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó làquá trình phân đoạn với dung môi hữu cơ Những tinh thể lắng xuống đựơc táchriêng và tái kết tinh nhiều lần, mỗi lần lại đo hoạt độ riêng Sự tái kết tinh làm đilàm lại nhiều lần cho tới khi hoạt độ riêng của chế phẩm không tăng lên nữa

Phối hợp những phương pháp phân đoạn khác nhau khi tinh chế:

Khi tiến hành tinh chế các enzym, trình tự áp dụng các phương pháp phânđoạn khác nhau phải được xác định Trình tự hiệu quả nhất được xác định thôngqua thực nghiệm, nhưng cần lưu ý một số điểm sau:

- Quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng.

- Quá trình đun nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêngmột phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoánhững lượng lớn dịch chiết ban đầu

- Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulphate hoặckết tủa bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên,khi đó ta có những thể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chóng táchriêng protein tủa xuống

- Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trênaluminum hydroxide hoặc calcium phosphate Những tủa thu được khi

đó dễ tách bằng cách để lắng cặn hay ly tâm ở tốc độ nhỏ

- Hoạt tính của enzym có thể giảm trong suốt quá trình thẩm tích doenzym rất kém bền, các chất bổ trợ bị loại bỏ nhưng nguyên nhân thôngthường nhất (trừ khi sử dụng nước tinh khiết) là do các kim loại ức chế

có trong nước như Cu

Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích.Cột chứa jela sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn toànkhỏi những thể tích dung dịch lớn Các phương pháp sử dụng cột thường khôngtiện lợi khi áp dụng trong phạm vi sản xuất lớn vì thế nó thích hợp hơn cho nhữnggiai đoạn sau của quá trình tinh chế So với các phương pháp khác, những phươngpháp sử dụng cột tiêu hao một không gian đáng kể cho việc lắp cột, rửa và rửa giảicột, đồng thời sự hoà tan enzym trong quá trình rửa giải có thể xảy ra

Sự đun nóng thường đưa lại kết quả tốt đẹp khi kết tủa những enzym không

có hoạt tính Tuy nhiên nó lại ức chế đáng kể một số enzym, do đó hoạt tính củaenzym chỉ tăng lên rất ít

Những phương pháp làm đặc dung dịch protein như thổi không khí từ quạtmáy vào dung dịch đựng trong các túi cellophane, làm đông đặc bằng cách làmbốc hơi chân không, làm đông khô,… thường gây biến tính enzym Tốt nhất để côđặc dung dịch protein-enzym, ta tiến hành siêu ly tâm hoặc xử lý bằng huyền phùdextran sephadex khô

Nếu chế phẩm enzym đã được tinh chế tương đối tốt và chỉ còn chứa mộtlượng nhỏ protein không hoạt động thì điện di có thể đưa lại những kết quả mỹmãn về mặt làm giàu enzym Muốn vậy ta cần có enzym với thể tích nhỏ

Phương pháp sắc kí trao đổi ion trên các ionit cellulose có thể được sử dụng

để chiết xuất sơ bộ các enzym Từ hỗn hợp protein phức tạp, ta có thể tách riêngtừng phân đoạn protein enzym Vì thế phương pháp này cùng với sự sử dụng cácchất trao đổi ion khác nhau có thể được sử dụng trước hoặc sau khi điện di

Ở bất kì giai đoạn tinh chế nào, enzym đều có thể được chiết ra dưới dạngkhô bằng cách đông khô Thế nhưng, cùng với việc tinh chế loại trừ những chấtlẫn theo, tính dễ hỏng của enzym cũng tăng lên Các chế phẩm enzym thô có thểđược duy trì khá lâu ở 40oC

Các phương pháp khác:

Ngoài những phương chính kể trên còn có một số phương pháp khác sửdụng cho từng trường hợp riêng cụ thể và được áp dụng khi các phương pháp nêutrên không đem lại hiệu quả cao Có thể kể đến ba phương pháp sau:

+Làm biến tính bởi chloroform: lắc dung dịch enzym với hỗn hợp cồn vàchloroform để tách các protein không hoạt động ra trước

+Sử dụng các chất gây tủa khác: thêm vào thận trọng một lượng xác địnhmuối kim loại nặng (Pb) ở giai đoạn đầu để loại bỏ những protein không mongmuốn mà không làm giảm hoạt độ enzym

+Cô đặc: đối với những trường hợp chất hấp phụ có ái lực cao với enzymthì nước giải hấp phụ chỉ chứa enzym với nồng độ thấp, do đó nếu ta cô đặc dungdịch enzym tới một lượng nhỏ hơn sẽ đạt được hiệu quả tinh chế cao hơn Có thể

sử dụng các cách sau:

- Đông lạnh dung dịch enzym và tách bỏ đá

- Đặt dung dịch enzym vào ống thẩm tích và để trong dòng không khí ấm

- Làm đông khô (thường được sử dụng, cô đặc cả enzym và muối)

- Cô đặc dung dịch bằng siêu lọc: muối và nước chảy qua màng lọc, cònenzym bị giữ lại, sau đó rửa màng lọc thu nhận enzym

- Thêm sephadex khô vào giúp giữ lại cả muối và nước và làm tăng nồng

độ enzym trong dung dịch

Trong tất cả các phương pháp phân đoạn enzym (điện di, sắc kí…), cầnphải loại trừ những ion kim loại nặng, chất oxi hóa… độc đối với enzym có trongdung dịch muối trong nước hoặc những pha rắn bất động bằng cách dùng thuốcthử tiolic, các chất khử thích hợp (EDTA, mercaptoethanol, unitiol), complexon…

1.3 NHỮNG TIÊU CHUẨN TINH KHIẾT CỦA ENZYM [3]:

Để xác định xem enzym được chiết ra có phải là tinh khiết không hay cònlẫn các protein không hoạt động khác, ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựatrên tính chất vật lý của protein

- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máysiêu ly tâm: nếu phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuầnnhất, tuy nhiên kết quả không chính xác lắm vì những protein có phân

tử lượng bằng nhau sẽ lắng với tốc độ như nhau và cho cùng một đỉnh

- Điện di: dung dịch enzym khi được điện di khu vực trong jella tinh bộthoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối là enzym thuần khiết, tuy nhiên khihàm lượng những protein tạp nhỏ (<1%) thì khó phát hiện ra đúng

- Xác định hoạt độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quangphổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngoại đặc hiệu

- Kết hợp phân tích điện di và những phản ứng miễn dịch hóa học đặchiệu, đặc biệt điện di trên thạch theo grabar Phương pháp này khá nhạy

- Định độ hòa tan của enzym theo norchrop: ít nhạy nhưng có triển vọng

- Thường để xét độ thuần nhất của enzym thì phải dựa trên sự so sánh cáckết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau.

- Cần lưu ý rằng, những chế phẩm enzym càng tinh khiết thì càng dễhỏng và khi bảo quản các dung dịch ở 4oC đều nhanh chóng mất hoạttính Vì thế, khi tái kết tinh enzym lặp lại, ta thường thấy có sự giảmhoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzym bị ức chế

1.4 ENZYM SẢN XUẤT TỪ THỰC VẬT [3]:

1.4.1.Bromelin [3]:

1.4.1.1.Đặc điểm:

Cấu tạo enzym bromelin: Bromelin là một glycoprotein, mỗi phân tử glycan

gồm 3 manose, 2 glucoamin, 1 xylose và 1 fructose Sợi hydrate cacbonnày liên kết hoán vị với sợi polypeptide Trọng lượng phân tử khoảng

33000 Da (lớn gấp 1,5 lần so với papain)

Hình 1.1 : Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelin

Khi phân tích thành phần amino acid ở bromelin thân và bromelin quả thìtuỳ theo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần aminoacid thay đổi khác nhau Bromelin thân có thành phần amino acid thay đổi trongkhoảng 321-144 amino acid và bromelin quả là 283-161 amino acid Bromelinthân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amine là valine và ở đầucacbonhydrate là glycin, còn bromelin quả có amino acid ở đầu amine là alanin

Bảng 1.1: Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelin.(mg/100g

Cấu trúc không gian của bromelin:

Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấy cáchsắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

-Gly – Cys – Lys - Bromelin là một protease trong tâm hoạt hoạt động có chứa cysteine và haisợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hình cầu do

có cách sắp xếp phức tạp

Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếutrong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra,trong phân tử còn có Zn2  có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzym

Tính chất vật lý:

Bromelin tan ít trong nước và glycerine, nhưng không tan trong dung môihữu cơ Bromelin hoạt động tốt nhất ở vùng pH trung tính, nhiệt độ 700C Vì tâmhoạt động của bromelin có chứa nhóm -SH nên dễ dàng bị ức chế bởi chất oxi hóa

như H2O2, metyl bromua, ion kim loại …và được hoạt hóa bởi chất khử (cystein,sunfit, bisunfit, cyanid…).

Các nghiên cứu về tính chất vật lý của bromelin thân dứa được Murachi vàcộng sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau:

Bảng 1.2: Những tính chất vật lý của protein thân:

a Hoạt tính của bromelin:

Hoạt tính phân giải của bromelin:

Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase.Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiện và có thể thuỷ phân cả cơ chất tự nhiênlẫn cơ chất tổng hợp

Bảng 1.3 : Hoạt tính phân giải casein của bromelin

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelin thân cao hơnbromelin quả xanh và bromelin quả chín

Bảng 1.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelin

Cơ chất Hoạt tính phân giải casein (UI/mg)

Bromelin thân Bromelin quả xanh Bromelin quả chín

BAA: Benzoyl-L-Arginine amide

BAEE : Benzoyl-L-Arginine ethyl ester

BAEM : Benzoyl-L-Arginine methyl ester

Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân vàbromelin quả chín

So với BAA, hằng số xúc tác của bromelin thân trên BAEE cao gấp 140 lần

b Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin

Giống như các chất xúc tác sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi cácyếu tố như cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,một số nhóm chức, phương pháp trích ly, phương pháp tinh sạch

o Ảnh hưởng bởi cơ chất :

Trên những loại cơ chất khác nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau.Nếu cơ chất là hemoglobin thì bromelin mạnh gấp 4 lần papain, với casein tươngđương, với cơ chất như BAA, BAEE thì thấp hơn

o Ảnh hưởng bởi nhiệt độ:

Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời giantác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tínhcủa enzym, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym

Ở dịch chiết quả (pH 3,5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫncòn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ Ở 5oC, pH 6,1 thìenzym bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút

Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính

o Ảnh hưởng của pH:

pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym

pH tối thích của bromelin không ổn định mà tuỳ thuộc nhiệt độ, thời gian phản

ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất dung dịchđệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt.

Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là amonium sulfatehoặc molypdenum carbonate thì enzym có hoạt tính cao nhất ở pH 4,8 và ổn định

ở pH 4,6 – 5,4 Bromelin thân đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở

pH 6,0 và pH 8,0 ổn định ở pH 3,5 – 5,6 với nhiệt độ 63oC Enzym bromelin đã

tinh sạch chỉ còn lại 60-70% hoạt tính Enzym bromelin có biên độ pH rộng (3-10)nhưng pH tối thích của enzym là 5-8 tuỳ thuộc vào cơ chất

o Ảnh hưởng bởi ion kim loại:

Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính enzym do chúng thường gắnvào trung tâm hoạt động của enzyme Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọngđến hoạt tính của enzym bromelin và mức độ kiềm hãm thay đổi tuỳ thuộc nồng

độ muối Ngoài ra còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kếthợp với nhóm -SH của trung tâm phản ứng của enzyme

o Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản:

Bảng 1.6: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của

bromelin

Điều kiện bảo quản Hoạt tính (UI/mg protein)

1.4.1.2.Sản xuất:

a Nguồn nguyên liệu :

Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromecliaceae cónguồn gốc từ Nam Mỹ

Dứa là một cây thảo lâu năm sau khi thu hoạch quả, các mầm nách ở thântiếp tục phát triển nhưng cho quả bé hơn quả trước

Các bộ phận của cây gồm có:

- Thân, trục của cây; thường gọi là gốc

- Lá xếp hình hoa thị trên thân theo một kiểu phân bố nhất định

- Rễ thường là rễ bất định và mọc ngang mặt đất

- Cán quả hay cuống mang quả kép bên trên có một phần chồi ngọn

- Chồi có nhiều kiểu kèm theo vị trí đính trên cây:

+ Chồi ngọn+ Chồi thân: phát triển từ mầm nách trên thân

+ Chồi ngầm: phát sinh từ phần dưới đất của thân hoặc của cổ rễ.+ Chồi cuống: phát triển từ mầm nách trên cuống.

+ Chồi nách: là chồi trung gian giữa chồi thân và chồi cuống

Dứa là một loại quả rất được ưa thích ở tất cả các nước nhiệt đới, thịt nhiềunước, vị thơm ngon, hơi chua, giải khát rất tốt Dứa thường được dùng dưới dạngnước uống, thức ăn tráng miệng hoặc ăn trộn với các loại rau quả khác Một cốcnước dứa ( khoảng 150ml) đem lại cho cơ thể trung bình 150 calo

Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comususđược sử dụng như thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzym và ngoài racòn được sử dụng trong một số lĩnh vực khác như dược phẩm, mỹ phẩm, … Phầnthân, chồi và lá sau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng để thu nhận enzymbromelin, làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón

Theo các tài liệu nghiên cứu khoa học, cho kết luận chính xác rằng hàmlượng bromelin chứa trong thân và chồi dứa lớn hơn nhiều so với trong quả Do

đó, xu hướng hiện nay là nghiên cứu thu nhận bromelin từ đọt dứa

b Quy trình sản xuất:

o Phá vỡ tế bào

- Quả, thân hoặc chồi dứa được xay nhuyễn để phá vỡ tế bào mô dứa

- Ta có thể dùng phương pháp đồng hóa để vừa phá vỡ tế bào vừa giảm

độ nhớt của dịch chiết

o Thu dịch enzym thô

Tiến hành: quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thudịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất

xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin

5 phút, loại bỏ tủa Thêm hai thể tích acetone lạnh vào, để 1 giờ ở 0-4oC, ly tâmthu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh

Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 960vào theo tỷ lệ nước dứa : cồn = 4:1, trộn đều, để ở nhiệt độ 0oC trong 3-4 giờ Lytâm hỗn hợp ở 6000 vòng/phút trong 5 phút Rửa tủa bằng acetone và thu tủa

Tủa bằng ammonium sulphate: chuẩn bị 1 lít dung dịch nước dứa sau ly

tâm, cho từ từ 532g ammonium sulphate vào và khuấy đều (dung dịch đạt bão hòa

là 70%) Để yên ở nhiệt độ phòng 10-15 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa

Phương pháp hấp phụ:

Có thể sử dung kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin

Cấu tạo kaolin: kaolin có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do

đó chúng có tính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo hình kết dính Một tính chất quan

trọng là kaolin có độ phân tán cao nên có tính hấp phụ tốt Kích thước hạt nhỏ hơn1m do đó diện tích tiếp xúc tăng lên rất nhiều Một lý do khác dẫn đến khả nănghấp phụ của kaolin cao là do trên bề mặt kaolin có chứa rất nhiều ion OH- và O2-,những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với các chất bị hấp phụ.

Tiến hành: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịchnước dứa sau ly tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa Khuấy đềubằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa Tủa thu được gọi là bromelin-kaolin

Phương pháp siêu lọc:

Dung dịch sau ly tâm được cho qua màng siêu lọc có kích thước 0,45m,trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc.Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc

Để tăng khả năng tinh sạch, ta có thể tiến hành theo kiểu lọc lô và lọc thểtích không đổi

và NaCl 0,5M khuấy trộn 3-4 lần Sau hai giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dungdịch đậm đặc chứa bromelin Tiếp tục hấp phụ lần thứ 2 như lần thứ nhất Sau đógộp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzym

Với phương pháp này hiệu suất thu đạt 0,1% so với chồi dứa tươi và cóhoạt tính 24nk/mg chế phẩm enzym So với tủa (NH4)2SO4 thì độ sạch của chếphẩm enzym cao gấp 2 lần, thời gian nhanh hơn và tiến hành thuận lợi

Tủa thu được sau đó đem sấy chân không ở nhiệt độ 40oC để thu nhận chếphẩm enzym

o Phương Pháp Tinh Sạch Bromelin :

Enzym bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc quasephadex, phương pháp sắc kí

Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích:

Tiến hành:

+ Cân 1g protein thô

+ Dung dịch đệm: 10ml dung dịch sodium phosphate 0,03M, pH 7,2

+ Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau 2 giờ thay dung dịch đệm bênngoài 1 lần Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng máykhuấy từ Enzym sẽ bị giữ lại trong túi cellophane

Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex:

Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50:

Cân 100 mg enzym thô hòa tan vào trong 1mL dung dịch đệm sodiumphosphate 0,03M, pH 7,2 Khi enzym đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzym

từ từ vào cột Cho dung môi phân ly enzym qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy

khoảng 2mL trong 7 phút Loại bỏ 5 mL đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzym.Dịch enzym được thu đến khi dùng Ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 và thấy có xuấthiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzym Dịch enzym thu nhận được làm đông khô Quá trình lọc enzym nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độthấp để giảm thiểu sự biến tính protein Thời gian tiến hành khoảng 1 giờ.

Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100:

Cân 100 gam enzym thô hòa vào 1mL dung dịch đệm như trên rồi cho vàocột Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzym là 1mL/phút Thu từng phânđoạn enzym (mỗi phân đoạn là 3mL) và đo độ hấp thu OD ở bước sóng 280nm.Tính trọng lượng phân tử bromelin theo công thức:

Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khácnhau về thành phần amino acid Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhậnđược 5 thành phần có hoạt tính enzym

Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trên sephadexG-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfoethyl sephadexchỉ cho một phân đoạn đơn có hoạt tính phân giải protein Còn nếu sắc ký hoán vịgel ở pH 7 rồi sau đó sắc ký trên sulfoethyl sephadex cho thấy có sự hiện diện củahai protease riêng biệt được đặt tên là bromelin II và bromelin III, hai protease này

có tốc độ di chuyển khác nhau khi điện di trên polyacrylamide ở pH 9,5

Bromelin thân khi dùng sắc ký gel trên sephadex G-50 và sắc ký trao đổiion trên DEAE- cellulose thì thấy có 1 thành phần chính và 5 thành phần phụ

Bromelin quả khi dùng sắc ký trên DEAE–cellulose và sulfoethyl sephadexthì thấy có 1 thành phần chính và 2 thành phần phụ

1.4.1.3 Ứng dụng [2],[3],[4]:

a Thủy phân Protein:

Các enzym thương mại có mức độ ứng dụng rất đa dạng và hiệu quả tronglĩnh vực y dược và công nghiệp Trong công nghệ thực phẩm, protease là công cụxác định cấu tạo, khả năng hòa tan và những tính chất khác của thịt cá Bromelincòn dùng để biến đổi protein thịt cá thành dịch thủy phân giàu acid amin phù hợpcho sự tiêu hóa của người hay làm thức ăn cho gia súc

Protease thương mại được sử dụng để làm mềm thịt, sản xuất chế phẩmprotein cá bằng protease hòa tan và sản xuất enzym cố định Hiện nay việc nghiêncứu triển khai quá trình sản xuất các chế phẩm thủy phân cá bằng enzym là mối

quan tâm chung nhằm tận dụng được nhiều hơn những thủy hải sản chưa được sửdụng trực tiếp làm thức ăn cho người.

Việc sản xuất chế phẩm protease dùng trực tiếp cho người cho người còngặp khó khăn do:

a) Sự phân giải nhanh của enzym đưa đến sự hình thành các peptid có vịđắng trong dịch thủy phân

b) Protease sấy khô mất nhiều tính chất, chức năng

c) Sự tạo nhũ tương của sản phẩm có giá trị dinh dưỡng nhưng mùi vịkhông hợp

Tuy vậy thủy phân protein bằng enzym có một triển vọng lớn Nhiều vấn đềđang tiếp tục được nghiên cứu giải quyết và người ta có nhiều căn cứ để tin tưởngrằng quá trình sinh học này sẽ đưa đến những thành công trong việc chế tạo cácsản phẩm protein từ phế liệu thịt cá

Việc lựa chọn enzym và các điều kiện thủy phân thích hợp là vấn đề cầnthiết Việc xử lí protease cho thịt cá có liên quan một phần đến bản chất phức tạpcủa cơ chất Tiến trình của phản ứng enzym không phải luôn dễ điều khiển để cho

ra sản phẩm với tính chất đặc biệt mà ta đang đợi Hiện nay các protease đangđược chú ý sử dụng là papain, bromelin, ficin và enzym có nguồn gốc vi sinh vật

Enzym bromelin thương mại là hỗn hợp gồm các protease và một lượngnhỏ photphatase, cellulase Vì bromelin có phổ tác dụng rộng như papain nên ngàycàng được sử dụng nhiều thay cho papain Trong chế biến thủy sản và trong ydược, đặc biệt trong thủy phân protein cá, sự làm mềm thịt, thủy phân gan bò

Thủy phân protein cá Việc sử dụng protease để sản xuất chế phẩm cá đậm đặc là phương phápbiến đổi những loại cá rẻ tiền, những thành phần không ngon của cá thành chếphẩm đậm đặc có tính chất chức năng tốt hơn bột cá cổ truyền

Trong những quá trình cổ điển, người ta lợi dụng enzym vi sinh vật thủyphân có sẵn trong cá để phân giải protein một cách chậm chạp trong thời gian dài

và nhiệt độ thích hợp

Ngày nay enzym được sử dụng trong quá trình thủy phân với những đặcđiểm thỏa mãn cho sản xuất công nghiệp Cần phải lựa chọn những điều kiện đểngăn ngừa hoạt động của vi khuẩn phân giải Enzym bromelin có top = 700C, ởnhiệt độ này loại trừ sự tồn tại của hầu hết vi khuẩn phân giải

Sản phẩm phân giải có phân tử lượng trung bình tương đối thấp Tùy theođiều kiện thủy phân mà sử dụng một hay nhiều loại enzym Sản xuất dịch thủyphân protein cá bằng enzym thực vật để thêm vào nước mắm cổ truyền có những

ưu điểm to lớn:

+ Cho phép tăng thể tích thu hồi mà không làm thay đổi giá trị dinh dưỡng

+ Thay thế các loại cá được dùng trong sản xuất nước mắm hiện nay bằng các loại

cá có giá trị thương phẩm kém hơn

+ Rút ngắn được quy trình sản xuất cổ truyền để rút ngắn quá trình lên men, người

ta cho bromelin vào khối chượp, nhờ hoạt động của bromelin protein của cá đượcthủy phân nhanh hơn, để tránh biến tính bromelin, thay vì cho muối một lần trong lên men, người ta cho muối vào nhiều lần Theo cách này ta có thể sản xuất nướcmắm khoảng từ 5 – 7 tháng thay vì chín tháng hay hơn một năm

+ Gia tăng sự chuyển lượng protein không hòa tan thành protein hòa tan

Sự làm mềm thịt Chỉ cần một phần bromelin là có khả năng thủy phân 1.000 phần thịt, tương

tự như papain Các enzym được rải lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trongdung dịch enzym hoặc tiêm dung dịch enzym vào thịt

Thủy phân gan bò: bromelin dùng để thủy phân gan bò làm cao gan, thuốc

bổ Gan bò được xử lí bằng chế phẩm bromelin trong thời gian 10 giờ ở nhiệt độ

550C, sau đó xử lí nhiệt 100oC trong vòng 3 - 5 phút Dịch thủy phân được tách lọc

và đông khô

b Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa:

Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta dùng renin Renin

là loại enzym được sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống Tuy nhiên lượng reninsản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế Gần đây sử dụng enzym thực vật trongchế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelin chồi dứa đang được quantâm sử dụng vào mục đích này

c Sử dụng bromelin thu nhận chất ức chế protease:

Trong tế bào cơ quan động thực vật tồn tại các chất ức chế enzym, trong đó

có các chất ức chế protease Các chất ức chế trong tế bào thường có bản chấtprotein như enzym Hiện nay trong công nghiệp và y tế thường sử dụng rộng rãicác chất ức chế này Chế phẩm bromelin được sử dụng để thu nhận các chất ứcchế các chất ức chế protein có chứa nhóm –SH Bromelin được tinh sạch sau đóđược cố định trong gel sepharose Dịch nghiền đầu và lõi dứa sau khi lọc và li tâmđược cho qua cột chứa bromelin cố định, trước tiên trong dung dịch đệm phosphat,

pH = 4,6 sau đó pH = 7,6 - 7,8, khi đó xảy ra quá trình liên kết giữa bromelin vàchất ức chế của chúng có mặt trong dịch nghiền nói trên , sau đó thu hồi chất ứcchế bằng dung dịch 0,01M NaOH có chứa 0,1M NaCl, pH = 11,5 - 12 Bằngphương pháp này sẽ thu được chất ức chế protein ở dạng tinh sạch, chất ức chếnày tác động mạnh lên enzym như papain, ficin

d Các lĩnh vực ứng dụng khác:

Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hóa protein, bromelin được điều chế với vài chấtkhác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hóa tự nhiên Những dượcphẩm này chứa bromelin và các enzym khác như lipase, amilase, những chất bổhay vitamin

Bromelin cũng có thể giúp giảm triệu chứng của bệnh hen, đau thắt ngực,viêm phế quản Bromelin làm tăng hệ miễn dịch, ức chế quá trình viêm, làm giảmphù nề và tụ huyết, bôi lên nơi tổn thương (vết thương, vết bỏng, vết mổ) làm sạchcác mô hoại tử, mau lành sẹo Những nghiên cứu mới gần đây cho thấy, bromelin

có tác dụng làm giảm hiện tượng sưng phồng, bầm giập và đau đớn đối với nhữngsản phụ trải qua các phẩu thuật nhỏ trong khi sinh Bromelin phối hợp với thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả khángsinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophylllin, ephedrine…) làm tăngtác dụng chống hen Mới đây, một nghiên cứu đăng trên tạp chí Anh cho biết, quathử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng bromelin làm giảmhơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen, hàm lượng càng cao thì hiệu quảcàng được cải thiện.

Ngoài ra, bromelin còn giúp giảm triệu chứng sổ mũi, giúp mau lành nhữngvết thương nhỏ, đặc biệt là căng nhức cơ, bong gân

Bromelin còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200– 300 mg/kg thể trọng kết hợp với hóa trị hay xạ trị Trong công nghiệp dượcphẩm, nhiều hãng dược phẩm ở châu Âu đã đưa bromelin vào trong thành phầnthuốc, nó thường được bào chế chung với nhiều chất khác Ở Mỹ, MỹLatinh vàAnh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế tại Philadel

Từ thịt quả dứa xay hoặc giã nát, người ta còn dùng làm mặt nạ (đắp lênmặt) nhằm lột nhẹ lớp tế bào sừng phía ngoài, bộc lộ lớp da non bên trong mịnmàng hơn và trắng hơn

1.4.1.4 Sản phẩm thương mại:

Hình 1.2: Chất chiết từ lá và thân dứa (Ananas comosus) với hàm lượng bromelain cao, được sản xuất dưới dạng viên nén, chứa 200mg bromelin/viên.

Hình 1.3 : Chế phẩm bromelin có hoạt lực cao (1200gdu/g hay 1800mcu/g)

Hình 1.4: Bột bromelin bổ sung vào thức ăn cho gia súc

Hình 1.5: Quercetin & Bromelain - Thuốc giúp bệnh thống phong

Dược phẩm này bao gồm tinh chất quả dứa Bromelain và dược thảoQuercetin, một chất “flavonoid” có công dụng chống oxít hóa rất mạnh, giúp bồi

bổ tim, phòng ngừa tai biến mạch máu não, phòng ngừa ung thư Quercetin cónhiều trong rượu vang đỏ, quả bưởi, hành tây, quả táo và trà đen

Thuốc có thể giúp các bệnh sau đây:

• Bệnh thống phong (Gout): giúp ngăn ngừa cơ thể sản xuất ra uric acid,giảm đau và chống viêm

• Bệnh viêm nhiếp hộ tuyến (Prostatitis): một thử nghiệm cho thấy saumột tháng dùng Quercetin & Bromelain thì những triệu chứng của bệnhviêm nhiếp hộ tuyến đã giảm đi rất nhiều

• Bệnh dị ứng (Allergy): dược phẩm này rất công hiệu cho các bệnh dịứng, hắt hơi, chảy nước mắt, nước mũi do dị ứng gây nên

• Bệnh ung thư: Quercetin & Bromelain có công dụng làm giảm bớt sự

sản xuất của chất “mutantap53 protein”, một chất xấu giúp các tế bào

ung thư sinh sôi nẩy nở nhanh Ngoài ra, Quercetin & Bromelain còn

giúp làm chậm sự phát triển của bứu ung thư bằng cách ngăn chặn sựhoạt động của các enzyme có tên là “tyrosine kinases” (các enzymesnày có công dụng giúp tế bào ung thư sinh sôi nẩy nở nhanh hơn)

Hình 1.6: Bromelain - Tinh chất quả dứa trị viêm mũi

Tinh chất quả dứa, hay đúng hơn từ cuống của quả dứa, một dược thảo vớinhiều tác dụng đối với một số các căn bệnh như:

• Bệnh viêm xoang mũi (sinusitis): Tốt nhất là dùng thuốc Bromelain tinhchất quả dứa cộng với thuốc có tinh chất củ nghệ để giúp căn bệnh viêm xoangmũi Rất nhiều khách hàng bị viêm xoang mũi kinh niên đã dùng qua nhiều loạithuốc tây lẫn dược thảo bao năm nay mà vẫn không khỏi bệnh Thế mà họ chỉdùng tinh chất quả dứa cộng với tinh chất củ nghệ chưa đầy một tháng mà đã cóhiệu quả rất cao (dùng cả hai loại chung nhau, uống lúc bụng đói)

• Ung thư: Theo các cuộc nghiên cứu khoa học về dược thảo giúp chữa trịung thư, tinh chất quả dứa có công dụng tăng cường hệ thống miễn dịch và giúpphá vỡ các lớp vỏ bao bọc tế bào ung thư và nhờ vậy, tế bào của hệ thống miễndịch sẽ dễ dàng giết chết tế bào ung thư hơn

• Chống viêm: Tinh chất quả dứa giúp giảm viêm và giảm đau của bệnh viêm khớp, viêm nhiếp hộ tuyến, trị bong gân, trặc gân, giúp làm tan máu bầm, rấthiệu quả để làm bớt đau lưng

1.4.1.5.Hướng nghiên cứu:

a Tạo chế phẩm Bromelain để phối hợp và tăng cường độ bền với chymotropsin dược dụng:

Đề tài do các tác giả Nguyễn Văn Rư, Nguyễn Ích Tuấn, Nguyễn Bá

Huynh (Đại học Dược Hà Nội) thực hiện nghiên cứu tạo chế phẩm enzym có tácdụng điều trị nhưng có độ bền hoạt tính enzym cao để sử dụng thay thế phối hợpđồng thời tiến hành nhiệt đới hoá các chế phẩm enzym cho phù hợp với điều kiệnkhí hậu Việt Nam

Viên α-chymotropsin (ACT) là một dạng thuốc enzym được sản xuất dướidạng tiêm và uống, có tác dụng chữa viêm, chống phù nề và bổ trợ tiêu hoá Tuyvậy, với điều kiện nước ta thì giá thuốc còn cao và việc bảo quản (đòi hỏi ở lạnhdưới 150C) còn nhiều khó khăn

Nghiên cứu tiến hành với nguyên liệu là chế phẩm enzym ACT USP 24GMBH 1100 USP/1mg, quả dứa Ananas comusus L họ dứa Bromeliaceae, cáchoá chất… và phương pháp chiết tách cơ học, hoá học, lọc gel

Kết quả cho thấy, tạo được chế phẩm bromelain từ lõi và vỏ quả dứa ở 3cấp độ tinh chế khác nhau: BRO1, BRO2, BRO3, lựa chọn BRO3 có độ tinh chếcao nhất để phối hợp thay thế một phần chế phẩm ACT Đã xác định được hoạt độriêng của BRO3 bằng ¼ của ACT (1,25/5Nk) Trên cơ sở đó đã xác định được tỉ lệcủa BRO3 phối hợp với ACT theo khối lượng chế phẩm là 4/1 và đề nghị thaycông thức viên ACT 5 mcg bằng viên ACT-BRO3E có hàm lượng 2,5 mcg ACT

và 10,0 mcg BRO3, hai công thức viên này có hoạt độ riêng tương đương

Kết quả này cũng đánh giá được độ bền hoạt tính của hỗn hợp enzym trong

2 điều kiện bảo quản: điều kiện nhân tạo (450C, độ ẩm 60-70%) hoạt độ riêng củahỗn hợp ACT-BRO3 có độ ổn định cao hơn của ACT là 1,5 lần và hỗn hợp cóthêm PEG còn có độ ổn định cao hơn hỗn hợp của nó 1,2 lần và cao hơn ACT tới1,8-2,9 lần, đó là cơ sở quan trọng để tính tuổi thọ cũng như độ ổn định của sảnphẩm thuốc ở điều kiện tự nhiên của Việt Nam (30 ± 200C, độ ẩm 75-85%), tuythời gian thử mới có 2 tháng nhưng kết quả bước đầu cho thấy hoạt độ riêng của 2hỗn hợp có độ ổn định cao, có ý nghĩa thiết lập công thức bào chế, pha chế viên cóchứa CPE

Việc phối hợp chế phẩm BRO3 với ACT để sản xuất thuốc chữa viêm,chống phù nề mang lại hiệu quả về kinh tế, giảm được chi phí cho sản xuất, tăngtính khả thi để ứng dụng vào thực tế sản xuất, giúp giảm giá thành, ổn định giá bánsản phẩm và tăng độ ổn định của chế phẩm

b Enzym và bệnh nhân HIV/AIDS:

Trong quá trình sinh sản trong tế bào người bệnh, virus suy giảm miễn dịch(HIV) cần một enzym hoạt hóa protease (protein - digesting enzym) để sao chépngược nhằm cô đọng nhân protein để nhân bội virus Thuốc điều trị HIV/AIDStheo cơ chế ức chế protein - digesting enzym này gọi là protease inhibitor hay anti-protease khá hữu hiệu nhưng rất đắt tiền và cũng gây nhiều phản ứng phụ

Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khảnăng ngăn ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất có tác dụng tương tựthuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và cóthể ăn, uống để trị HIV/AIDS Thuốc cô đọng, bào chế từ enzym bromelain dứanày cũng rất đắt, nhưng người bệnh có thể dùng trực tiếp quả thơm, đọt thơm(phần trắng, mềm sau khi lột bỏ vỏ ngoài của chồi bên hoặc chồi ngọn quả thơmchứa enzym đậm đặc nhất) Các nhà bào chế chiết xuất enzym từ thân cây thơm.Enzym bromelain sẽ bị phân hủy khi đun nóng trên 600C

c Nghiên cứu chế tạo thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu trong nước :

Đây là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học của Dự án hoạt chất sinh họcViệt - Bỉ do Viện Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) tiến hành.Theo PGS-TS Dương Anh Tuấn, Giám đốc Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ,bromelain là hoạt chất có hàng loạt tính năng như trị chứng khó tiêu, phòng cácbệnh viêm phế quản, viêm khớp xương mãn tính, viêm xoang, làm sạch bên trongđộng mạch vành Ngoài ra, bromelain còn có tác dụng chống viêm đường ruột vàlàm tăng khả năng đề kháng của cơ thể

Trên cơ sở nghiên cứu chiết, tách, tinh chế thành công bromelain, nhómnghiên cứu đã bổ sung hoạt chất curcumin được chiết, tách từ củ nghệ để sản xuấtthực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa Cùng với tác dụng của curcumin

là điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật , sựkết hợp giữa curcumin và bromelain cho phép tinh nghệ - dứa có khả năng tăngcường miễn dịch và khả năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một sốbệnh, đồng thời hỗ trợ điều trị các bệnh nan y nhờ hoạt tính sinh học cộng hưởngcủa curcumin và bromelain cùng các chất dinh dưỡng thiên nhiên

Nhằm làm tăng giá trị sử dụng và tác dụng sinh học của curcumin trongcác sản phẩm từ nghệ và bromelain từ quả dứa, nhóm nghiên cứu khoa học củaGS.TSKH Trần Đình Toại và PGS.TS Dương Anh Tuấn thuộc Viện Hóa học,Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hợp tác với TS Lục Văn Puyvelde(Vương Quốc Bỉ) đã thành công trong việc nghiên cứu qui trình công nghệ chiết,tách, tinh chế bromelain từ quả dứa, đồng thời bổ sung vào sản phẩm curcuminlàm thực phẩm chức năng đó là tinh nghệ - dứa

Qui trình công nghệ chiết, tách, tinh chế bromelain từ quả dứa được thựchiện trên các thiết bị của Viện Hóa học Đây là lần đầu tiên sản phẩm thực phẩmchức năng này được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta từ nguồn nguyên liệu nghệ

và dứa sẵn có trong nước

Sản phẩm ở dạng bột, sử dụng đơn giản, thuận tiện và an toàn Sản phẩmgồm có bột nghệ tinh (đã được chiết, tách loại bỏ tinh dầu, sáp và các chất nhựa)chứa hoạt chất chính curcumin và hoạt chất bromelain chiết từ quả dứa được phốitrộn với nhau ở tỷ lệ thích hợp Ngoài việc làm tăng tác dụng của curcumin, bảnthân chất bromelain có khả năng làm tan biến các nội chất gây ra chứng nhồi máu

cơ tim, tăng khả năng tiêu hóa và trị chứng khó tiêu, chống viêm đường ruột

dịch và khả năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh, đồngthời hỗ trợ trong điều trị các bệnh nan y, hiểm nghèo.

Sản phẩm tinh nghệ - dứa nói trên đã được gần 100 bệnh nhân khác nhau

sử dụng và đều cho kết quả rất tốt Hiện nay Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y

tế đã cấp giấy chứng nhận sản phẩm thực phẩm chức năng “tinh nghệ - dứa” nêutrên đạt tiêu chuẩn chất lượng, vệ sinh, an toàn thực phẩm và được phép lưu hành Hiện nay, dựa trên các kết quả nghiên cứu đã đạt được và được sự đầu tưkinh phí của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhóm các cán bộ nghiên cứunày đang mở rộng hợp tác với các doanh nghiệp trong nước và quốc tế, để đẩymạnh sản xuất sản phẩm tinh nghệ - dứa phục vụ tiêu dùng trong nước cũng nhưxuất khẩu, góp phần tích cực vào công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng

1.4.2.Papain [3]:

1.4.2.1.Đặc điểm:

Cấu tạo :

+ Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S

+ Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm

212 amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C làasparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-

95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vữngcủa cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí cysteine 25

+ Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine

o Cấu trúc không gian:

Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệtbởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH củacysteine 25 ở bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử

Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain

và cả hai nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn  Ngoài ra trong phân tử còn chứamột số cầu nối nội phân tử

o Cấu trúc tâm hoạt động của papain:

Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc

3 của histidine 159 Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết vớiAsp 175 bởi liên kết hydrogen

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với amino acid là:

Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys

Hình 1.7: Tâm hoạt động của papain

o Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai

trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid:

Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid

So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có

khả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có

khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các

glutamic acid có nhóm carboxyl tự do Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7

amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên

một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là

các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có

dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được

thủy phân bởi papain

Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase

o Hoạt hoá papain:

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do

Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động

sang trạng thái hoạt động Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các

chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glutation acid, hydrocyanic…

Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH

của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Để thu được hoạt tính cao

nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng

vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với

ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

o Bất hoạt:

Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hoá như: O2,

O3, H2O2, iodua acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác Các chất này phản

ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm

hoạt động của nó

Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp

Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt

tính Tuy nhiên, papain rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ

quay cực hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M)

o Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (-NH-CH(R)-COOH)i + (H2N-CH(R)-CO-)k

i + k = n

(H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (H2N-CH(R)-COOH)n’ + (H2N-CH(R)-CO-)k’ n’ + k’ = n

Nhiệt độ:

Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô papainkhông bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tínhsau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ trên 100oC thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch vì cấu trúc tâm hoạtđộng của enzym đã bị phá hủy hoàn toàn

Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơnpapain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụngbảo vệ nó Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng Trongdung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng,trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá Papaindạng ổn định (có cấu trúc không gian ổn định) ở trạng thái khô có thể chịu đượcnhiệt độ sấy ở 115oC trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%

Hình 1.9: Cơ chế hoạt động

Dung môi:

Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bịgiảm hoạt tính trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M,nhưng trong dung dịch TCA 10% papain bị biến đổi bất thuận nghịch

1.4.2.2.Sản xuất [3]:

a Nguồn nguyên liệu:

Quả đu đủ có tên khoa học là Carica Papaya Linn Ðu đủ thuộc họ nhỏCaricaceae có hai giống: họ Caricaceae, thường xếp chung vào họ Passifloraceae,người ta còn gọi Papaya theo tiếng Anh là Paw-paw

Ðu đủ là một loại quả nhiệt đới, được trồng nhiều ở các nước Nam Mỹ,châu Phi, Ấn Ðộ, Ðông Nam Á Các nước có sản lượng thu hoạch đu đủ cao nhấtthế giới là Brazil, kế đến là Nigeria, Ấn Ðộ

Bảng 1.8: Giá trị dinh dưỡng trên100 g chất quả

-* RDI, recommended daily intake: nhu cầu tiêu thụ trong 1 ngày do FDA

Mỹ đề xuất, thiết lập dựa trên nhu cầu trung bình của một người nam, nặng 70kg, mức năng lượng tiêu thụ 2700kcal/ngày

Khoảng 1500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650 gram papain: Theo các nghiên cứu khoa học, papain có nhiều nhất chủ yếu trong nhựacây và quả đu đủ xanh Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộngkhắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau:papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong

đó papain chiếm tới 95%

Điều kiện lấy nhựa:

+ Cây đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều.+ Quả: lấy ở những quả xanh, vỏ mịn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt nhất.+ Thời gian lấy nhựa: sáng sớm

Hình 1.10: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa

Cách tiến hành:

+ Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đườngdọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (khôngrạch sâu quá 2cm để dịch nước và tinh bột từ quả không bị trộn lẫn vào nhựa làmgiảm chất lượng nhựa)

+ Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấynhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ cáccông đoạn xử lý tiếp theo Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựatiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa Khi lấy nhựacần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào

Hình 1.11: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ

Lưu ý:

- Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa

- Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần mộtrạch là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạchtrước đó

- Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, khôngnên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng…

vì sẽ làm biến màu và giảm hoạt tính enzym Lọ, dao, muỗng… phải đượclàm bằng nhựa hoặc thép không rỉ

- Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm