Nghiên cứu quy trình sản xuất giấm từ vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục

Bên cạnh quá trình lên men tạo acid acetic còn có quá trình chuyển hóa các thành phần khác trong môi trường tạo nên các sản phẩm phụ như các acid hữu cơ, vitamin,…rất tốt cho sức khỏe..

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập em đã hoàn thành đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất giấm ăn bằng vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục” Trong thời gian nghiên cứu và thực tập tại phòng thí nghiệm, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy, cô trong khoa để em thực hiện đề tài này Qua đây, em bày

- Gia đình đã tại điều kiện cho em trong suốt thời gian học và cảm ơn tất cả bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha trang, tháng 6 năm 2011

Sinh viên

Võ Thị Thu Hoài

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

CÁC KÍ HIỆU vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về giấm 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Các phương pháp sản xuất acid acetic 2

1.1.4 Tình hình sản xuất giấm ở Việt Nam và các nước trên thế giới 4

1.2 Tổng quan về quá trình lên men 5

1.2.1 Khái quát chung 5

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 6

1.3 Tổng quan quá trình lên men giấm 8

1.3.1 Bản chất của quá trình 8

1.3.2 Cơ chế tạo axit axetic trong tế bào vi khuẩn 9

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men giấm: 10

1.3.4 Các phương pháp lên men tạo axit axetic 12

1.3.5 Phương pháp nâng cao nồng độ acid acetic trong dịch lên men 15

1.3.6 Sự sinh trưởng và phát triển của VSV trong quá trình lên men 17

1.3.7 Thành phần hóa học của giấm nuôi 19

1.3.8 Một số hư hỏng giấm và nguyên nhân 20

1.4 Hệ VSV sử dụng trong lên men giấm 21

1.4.1 Đặc điểm hình thái 21

1.4.2 Đặc điểm sinh trưởng 22

1.4.3 Một số vi khuẩn thường gặp trong lên men giấm 23

1.5 Một số ứng dụng của acid acetic 26

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Vi khuẩn acetobacter pasteurianum 28

2.1.2 Cơ chất 28

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nhgiệm 30

2.1.4 Bao bì thủy tinh 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Nội dung nghiên cứu: 30

2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 31

2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định các thông số dịch lên men 33

2.3.1 Bố trí thí nghiêm xác định nồng độ rượu dịch lên men 33

2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đường thích hợp 33

2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định pH thích hợp 34

2.4 Tiến hành nhân giống và xác định tỷ lệ bổ sung giống vi khuẩn acetobater pasteurianum vào dịch lên men 35

2.4.1 Quy trình nhân giống dự kiến 35

2.4.2 Thuyết minh quy trình nhân giống thuần chủng 35

2.4.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung giống vào dịch lên men 36

2.5 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men 37

2.6 Nghiên cứu quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục 38

2.6.1 Thiết bị lên men liên tục 38

2.6.2 Xác định thời gian tạo màng VSV trên chất mang 39

2.6.3 Xác định thông số quá trình lên men liên tục: 40

2.7 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thanh trùng sản phẩm 42

2.5 Phương pháp phân tích đánh giá cảm quan, chất lượng sản phẩm 43

2.5.1 Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan 43

2.5.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa học 45

2.5.3 Phân tích các chỉ tiêu vi sinh của giấm ăn theo TCVN 45

2.5.4 Xử lý số liệu thực nghiệm, vẽ đồ thị biểu diễn quy luật biến đổi các thông số 45

Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Kết quả nghiên cứu xác định thông số dịch lên men 46

3.1.1 Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ rượu thích hợp 46

3.1.2 Kết quả xác định hàm lượng đường bổ sung vào dịch lên men 48

3.1.3 Kết quả thí nghiệm xác định pH dịch lên men thích hợp 50

3.2 Tiến hành nhân giống và kết quả thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung giống vi khuẩn Acetobater pasteurianum vào dịch lên men 52

3.3 Kết quả thí nghiệm xác định thời gian lên men 54

3.4 Kết quả nghiên cứu quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục 56

3.4.1 Kết quả xác định thời gian tạo màng VSV trên vật liệu chất mang 56

3.5 Kết quả TN xác đinh thời gian lên men liên tục 59

3.6 Kết quả xác định chế độ thanh trùng sản phẩm 61

3.7 Quy trình sản xuất hoàn thiện 63

3.8 Kết quả sản xuất thực nghiệm 65

3.9 Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm giấm 66

3.9.1 Tiêu chuẩn chất lượng cảm quan 66

3.9.2 Tiêu chuẩn hóa học 66

3.9.2 Tiêu chuẩn về vi sinh vật 66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic trong tế bào vi khuẩn .9

Hình 1.2 Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh 17

Hình 1.3 Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục 19

Hình 1.4 Acetobacter pasteurianum 24

Hình 2.1 Công thức hóa học của đường saccarose 29

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình dự kiến 31

Hình 2.3 Sơ đồ nhân giống thuần chủng 35

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV 36

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men 37

Hình 2.6 Thiết bị lên men liên tục………38

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí xác định thời gian tạo màng VSV trên vật liệu chất mang 39

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí xác định vận tốc dòng môi trường 41

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí TN xác định thời gian lên men 42

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định chế độ thanh trùng 43

Hình 3.1 Hàm lượng acid, rượu dư của mẫu TN xác định nồng độ rượu thích hợp46 Hình 3.2 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định nồng độ rượu dịch lên men 47

Hình 3.3 Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định hàm lượng đường thích hợp sau lên men 48

Hình 3.4 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định hàm lượng đường dịch lên men 49

Hình 3.5 Hàm lượng acid, nồng độ rượu dư của các mẫu TN xác định pH dịch lên men 50

Hình 3.6 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men 51

Hình 3.7 Kết quả hàm lượng acid, nồng độ rượu dư các mẫu TN xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV 52

Hình 3.8 Kết quả điểm cảm quan các mẫu TN xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV 53 Hình 3.9 Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định thời gian lên men 54

Hình 3.10 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men 55

Bảng 3.17 Kết quả hàm lượng acid thu được các mẫu TN xác định thời gian tạo màng VSV 56

Hình 3.11 Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định vận tốc dòng môi trường 57

Hình 3.12 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men 58

Hình 3.13 Hàm lượng acid, nồng độ rượu dư các mẫu TN xác định thời gian lên men liên tục 59

Hình 3.14 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định thời gian lên men liên tục 60

Hình 3.15 Điểm cảm quan xác định chế độ thanh trùng 61

Hình 3.9 Sơ đồ quy trình sản xuất sản phẩm hoàn chỉnh 63

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men 33

Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men 34

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ rượu đến quá trình lên men 34

Bảng 2.4 Bảng đánh giá sản phẩm qua hệ số quan trọng 44

Bảng 2.5 Bảng cơ sở chấm điểm cảm quan các chỉ tiêu sản phẩm giấm 44

Bảng 3.1 Điểm cảm quan của hội đồng cảm quan của sảm phẩm 65

Bảng 3.2 Tiêu chuẩn chất lượng cảm quan sản phẩm giấm 66

Bảng 3.3 Chỉ tiêu hóa học sản phẩm giấm 66

CÁC KÍ HIỆU

TN: thí nghiệm

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

ĐCQ: Điểm cảm quan

h: giờ

tb: tế bào

VSV: vi sinh vật

NADP: nicotinamide adennine dinucleotide

NADPH2:nicotinamide adennine dinucleotide dihidro

LỜI MỞ ĐẦU

Từ xưa, giấm đã được sử dụng như một gia vị trong ẩm thực và ngày nay giấm đã đuợc ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống Nó không chỉ được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm mà còn được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp nhẹ, y học và còn như một loại mỹ phẩm dành cho phái đẹp

Trong quá trình lên men, rượu, đường bị oxy hóa không hoàn toàn tạo acid acetic Bên cạnh quá trình lên men tạo acid acetic còn có quá trình chuyển hóa các thành phần khác trong môi trường tạo nên các sản phẩm phụ như các acid hữu cơ, vitamin,…rất tốt cho sức khỏe Các sản phẩm phụ này đã làm cho giấm lên men có

vị chua thanh, dịu ngọt, mà giấm hóa học không có được

Nguyên liệu chính sản xuất giấm là rượu gạo, đường và có thể một số loại trái cây Trong sản xuất rượu gạo, rượu có nồng độ cồn thấp (rượu bào) hầu như không có giá trị kinh tế Để tận dụng nguyên liệu thừa này, từ lâu con người đã sử dụng nó để lên men giấm phục vụ cho những bữa ăn gia đình Tuy nhiên quá trình sản xuất giấm vẫn còn ở quy mô nhỏ, hộ gia đình và bằng phương pháp thủ công

Vì vậy tôi đề xuất “Nghiên cứu quy trình sản xuất giấm từ vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục” ở phòng thí nghiệm

Do kiến thức bản thân còn hạn chế, bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu thực tế còn gặp nhiều khó khăn, cùng với thời gian thực hiện có hạn nên nội dung không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo và các bạn để nội dung đề tài được tốt hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về giấm [4]

1.1.1 Khái niệm: Giấm là dung dịch acetic loãng có nồng độ ≤8%

1.1.2 Phân loại [9]

Tùy theo nguyên liệu sản xuất giấm mà người ta phân giấm ra 2 loại:

- Giấm gạo: Hay còn gọi là giấm cất, đó là quá trình sản xuất mà dùng lương thực, ngũ quả, đường và rượu gạo làm nguyên liệu chính nhờ quá trình lên men của

vi khuẩn acetic Loại giấm này có nhiều hương vị khác nhau, thành phần dinh dưỡng cũng phong phú nhờ quá trình thủy phân các thành phần dinh dưỡng được dùng chế biến thực phẩm và mục đích nội trợ

- Giấm pha chế: Hay còn gọi là giấm hóa học được sản xuất dựa trên nguyên liệu chính là acid acetic tinh luyện pha thêm nước mà thành, không có thêm thành phần dinh dưỡng khác Lọai này thường dùng trong công nghiệp luyện kim hoặc sát khuẩn hoặc trong ngành công nghiệp nhẹ…

1.1.3 Các phương pháp sản xuất acid acetic [3]

Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và từ lâu Do đó, loài người đã phát minh ra nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất acid acetic Những phương pháp sản xuất cid acetic bao gồm:

Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men, người ta thu được một hỗn hợp nhiều chất khác nhau, trong đó acid acetic với hàm lượng rất lớn Hiện nay phương pháp này đã không còn được ứng dụng

b- Phương pháp hóa học

Phương pháp này dựa trên quá trình oxy hóa axetaldehyd thành acid acetic,

có xúc tác của mangan rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50-80oC

Phản ứng oxy hóa xảy ra như sau:

CH≡ CH + H2O

CH2≡CH2 +O2

Hiện nay, người ta tổng hợp acid acetic từ methanol và CO bằng phản ứng carbonyl hóa Trong quy trình này, metanol và cacbon monoxit phản ứng với nhau tạo ra acid acetic theo phương trình:

CH3OH + CO → CH3COOH

c- Phương pháp hỗn hợp

Trước tiên, người ta tiến hành quá trình oxy hóa hydrat cacbon có mạch cacbon ngắn như propan hay butan để tạo thành acid acetal dehyt, formaldehyde methanol và acetone

Sau đó acetaldehyd được oxy hóa để tạo thành acid acetic

Rồi người ta trung hòa khối thủy phân này và tiến hành lên men để thu nhận được dung dịch chứa acid acetic

d- Phương pháp sinh học: Hiện nay, người ta sản xuất acid acetic chủ yếu bằng

phương pháp lên men So với những phương pháp khác thì phương pháp này có nhiều ưu điểm:

a Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm

Có thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước trái dừa, nước ép mía…) có thể sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và có thể sử dụng cồn công nghiệp

- Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua 3 giai đoạn chuyển hóa

CH3CHO +O2 CH3COOH

Giai đoạn chuyển tinh bột thành đừờng (đường hóa)

Giai đoạn chuyển đường thành cồn (rượu hóa)

Giai đoạn chuyển rượu thành acid acetic

- Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì qua 2 giai đoạn

Giai đoạn chuyển đường thành cồn

Giai đoạn chuyển cồn thành acid acetic

- Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa cồn thì chỉ cần tạo điều kiện thuận lợi để vi khuẩn acid acetic chuyển cồn thành acid acetic

b Quá trình chuyển hóa hay quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện rất

ôn hòa, không cần ở nhiệt độ cao, áp suất cao hay máy móc, thiết bị phức tạp Mặt khác, lên men theo phương pháp sinh học tạo ra một số sản phẩm phụ làm cho hương vị sản phẩm rất đặc trưng

1.1.4 Tình hình sản xuất giấm ở Việt Nam và các nước trên thế giới:

Công nghệ sản xuất giấm đã có từ lâu Công nghệ sản xuất ban đầu chỉ mang tính chất thủ công Mãi cuối thế kỷ XIX và đầu thế kỷ XX công nghệ thủ công mới được thay thế bằng công nghệ sản xuất theo quy mô công nghiệp

a Tình hình trên thế giới [1]

Các tài liệu nghiên cứu trước đây đã cho thấy giấm xuất hiện từ khoảng 5000 năm trước công nguyên , khi người Babilon đã sử dụng nước quả chà là để làm rượu vang và giấm Họ sử dụng nó như là một loại thực phẩm và dùng để bảo quản hoặc làm tác nhân acid (để tẩy rửa) Các vết tích còn sót lại của giấm đã được tìm thấy trong các cái vại của người Ai Cập cổ xưa có niên đại từ khoảng 3000 năm trước công nguyên

Tương tự, giấm được phát hiện ở Trung Quốc từ các tài liệu cổ ghi lại là khoảng 1200 năm trước công nguyên

Ở Ai Cập cổ đại khoảng 400 năm trước công nguyên , Hippocrates, cha đẻ của ngành y học hiện đại , đã sớm biết công dụng của giấm táo kết hợp với mật ong để chữa trị bệnh cúm bao gồm cả ho và cảm lạnh

Từ thời kỳ phục hưng, làm giấm là nghề đem lại lợi nhuận ở Pháp Nước này

đã sản xuất gần 150 loại giấm có mùi vị khác nhau từ việc bổ sung tiêu, cỏ ba lá, hoa hồng, mâm xôi

Sản xuất giấm cũng được phát triển ở Anh, sinh lời đến nỗi năm 1693 Nghị viện thiết lập thuế trên giấm – bia

Vào thời kỳ đầu ở Mỹ, sản xuất giấm rượu táo là nền tảng của nông nghiệp và kinh tế hộ gia đình, được đánh giá là gấp 3 lần rượu táo thô truyền thống Ngày nay thì sản xuất giấm đã phát triển mạnh và sản xuất với quy mô công nghiệp Hàng năm sản xuất hàng triệu lít giấm để cung cấp cho nhu cầu sử dụng của con người Chiếm thị trường phần lớn tại Đức là dòng giấm làm từ rượu chưng cất Đó là loại giấm công nghiệp, làm từ gỗ cặn bã Một sản phẩm không có chút hương thơm, thêm vào đó còn được nhuộm màu, thêm chút muối hoặc có trộn lẫn chút dấm làm từ rượu nho thật để tăng thêm hương vị

b Tình hình trong nước

Quá trình sản xuất giấm ở Việt Nam vẫn ở quy mô nhỏ lẻ theo từng hộ gia đình bằng phương pháp thủ công Sản phẩm tạo ra chỉ để mục đích sử dụng trong gia đình mà chưa có sản phẩm trên thị trường nhiều Tùy vào mùa vụ mà người ta

có thể tạo giấm từ xoài, chuối hay từ hồng xiêm…nhu cầu sử dụng ngày càng nhiều trong khi đó việc sản xuất acid hữu cơ bằng công nghệ lên men không đủ đáp ứng những nhu cầu trên

Hiện nay, đã có một số doanh nghiệp nhỏ lẻ sản xuất giấm bán ra trên thị trường nhưng chất lượng và số lượng chưa ổn định Hoặc có một số doanh nghiệp

đã dùng giấm được pha chế từ axit vô cơ để bán ra trên thị trường (doanh nghiệp giấm ăn Trung Thành số 2, Lĩnh Nam, Q.Hoàng Mai, Hà Nội)

1.2 Tổng quan về quá trình lên men

1.2.1 Khái quát chung [5]

1.2.1.1 Khái niệm chung

- Sự lên men theo nghĩa rộng là quá trình trao đổi chất, qua đó các chất hữu cơ

mà trước tiên là đường bị biến đổi dưới tác dụng của các enzyme của vi sinh vật

Dựa vào cơ chế của quá trình lên men có thể chia ra: lên men yếm khí và lên men hiếu khí Lên men yếm khí là quá trình phân giải bằng enzyme các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản mà không có sự tham gia của oxy phân tử Ví

dụ lên men rượu, lên men axetonbutylic, lên men lactic… Lên men hiếu khí cũng

là quá trình phân giải đường thành các hợp chất đơn giản nhưng cần phải có oxy tự

do Ví dụ lên men axetic, lên men xitric

- Trong sản xuất lên men, người ta dùng các vi sinh vật khác nhau như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn

- Các sản phẩm thu được của các quá trình lên men cũng khác nhau và rất đa dạng Dựa vào tính chất của các sản phẩm lên men người ta chia ra: công nghiệp lên men cổ điển và công nghiệp lên men hiện đại

- Công nghiệp lên men cổ điển là những ngành lên men qua đó người ta thu được những sản phẩm có phân tử lượng nhỏ hơn chất “khởi thủy” trong nguyên liệu Một đặc điểm nữa là có thể thay thế bằng phương pháp hóa học Ví dụ sản xuất rượu, sản xuất lactic, axit axetic…

- Công nghệ lên men hiện đại là các sản phẩm thu được phức tạp hơn, khác xa

về bản chất của các chất “khởi thủy” ban đầu trong nguyên liệu và không thể thay thế bằng phương pháp hóa học Ví dụ như sản xuất vitamin, kháng sinh…

1.2.1.2 Bản chất của các quá trình lên men

- Lên men thực chất là quá trình oxy hóa – khử sinh học (có sự tham gia của enzyme xúc tác) để thu năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật hoạt động

- Lên men là quá trình để thu năng lượng, qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ được khử đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó Tùy thuộc vào sản phẩm cuối cùng được tích tụ chiếm ưu thế hoặc sản phẩm nào đặc trưng mà người ta phân ra lên men rượu, lên men lactic hay lên men butilic,…

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [5]

1.2.2.1 Các cấu tử của môi trường

a Nguồn gluxit

Một trong những thành phần chủ yếu của quá trình lên men đó là gluxit Nó không những là nguồn cung cấp năng lượng mà còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng cần thiết để sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào Trong điều kiện thí nghiệm các chất này có thể cho vào hợp chất thuần khiết đặc biệt là glucose Trong công nghiệp thì đa dạng hơn

b Phosphat vô cơ

Phosphat có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học

c Nitơ

Nitơ là hợp phần quan trọng protein, axit nucleic và phần lớn các hợp chất phức tạp của chất sống Nhiều vi sinh vật có thể đồng hóa nitơ dưới dạng ion amoni, một số dưới dạng nitrat, …

d Các nguyên tố vi lượng

Ngoài các nguyên tố trên, các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết Các nguyên tố vi lượng có thể hiệu quả ở nồng độ cực kỳ nhỏ  - analin có hiệu quả khi nồng độ là 1:108

Các nguyên tố vi lượng cũng như các chất khác ở dạng vết là những yếu tố sinh trưởng thường chứa trong các nguyên liệu ban đầu khi dùng để chuẩn bị các

cơ chất hay được chúng ta bổ sung vào trong quá trình lên men

e Vitamin

1.2.2.2 Các nhân tố bên ngoài

a Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Do đó người

ta sử dụng nhân tố này để điều chỉnh quá trình lên men Nhiệt độ có vai trò thực sự đến một số khía cạnh khác của quá trình sinh tổng hợp như: chất lượng sản phẩm tạo thành, vận tốc tạo thành và giải phóng sản phẩm…

b Ảnh hưởng của pH

Các vi sinh vật có vận tốc sinh trưởng cực đại trong một khoảng pH nhất định

và có thể bị chết hoặc vô hoạt ở pH giới hạn Các vi sinh vật khác nhau tồn tại ở những pH tối ưu khác nhau Vì vậy cần dựa vào từng loại vi sinh vật mà điều chỉnh

pH thích hợp cho loại vi sinh vật đó

c Ảnh hưởng của hàm lượng O 2

Tùy vào bản chất của quá trình lên men hiếu khí hay lên men kỵ khí mà ta cung cấp lượng oxy cho phù hợp Có những quá trình lên men cần cung cấp oxy trong suốt quá trình lên men (lên men axetic), hay chỉ cần cung cấp oxy trong giai đoạn đầu của quá trình lên men (lên men rượu), hay không cần cung cấp oxy trong suốt quá trình lên men

d Các yếu tố khác

Tùy thuộc mỗi quá trình lên men khác nhau nên sẽ có các yếu tố ảnh hưởng khác nhau, như điều kiện để yên hay khuấy đảo khác nhau sẽ có những ảnh hưởng khác nhau tới quá trình các quá trình lên men khác nhau

1.3 Tổng quan quá trình lên men giấm

1.3.1 Bản chất của quá trình [5]

Lên men giấm là quá trình oxy hóa không hoàn toàn trong đó etanol bị oxy hóa tạo thành acid acetic trong điều kiện hiếu khí nhờ enzyme oxy hóa của vi khuẩn acetic Đồng thời, hidro được vận chuyển nhờ sự xuất hiện của NADP tạo thành NADPH2 và được chuyển qua chuỗi hô hấp để sinh năng lượng Tuy nhiên,

cơ chất không bị oxy hóa hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa không hòan toàn

Tất cả các hoạt động sống đều cần phải có năng lượng để thực hiện các hoạt động sống, sinh trưởng phát triển Quá trình lên men giấm là quá trình oxy hóa không hoàn toàn sinh năng lượng và tổng hợp các hợp chất trung gian cho VSV hoạt động

Các rượu khác nhau, đường và một số axit cũng có thể bị vi khuẩn axetic oxy hóa Chẳng hạn nó có thể oxy hóa rượu butylic thành axit butyric, rượu propylic thành axit propionic, glixerin thành dioxyaxeton…

1.3.2 Cơ chế tạo axit axetic trong tế bào vi khuẩn [5]

Phản ứng tạo axit axetic xảy ra trong tế bào của vi khuẩn Muốn phản ứng

xảy ra thì đường, C2H5OH và O2 phải được thẩm thấu vào trong tế bào Khi đó các enzyme oxy hóa có trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxy hóa rượu tạo thành

CH3COOH CH3COOH được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan vô hạn trong

dung dịch của môi trường

Phương trình phản ứng tổng quát của sự lên men giấm:

Tinh bột đường đường rượu acid acetic

Sau khi tạo thành rượu tiếp tục thực hiện quá trình lên men giấm, là quá trình oxy hóa tuần tự etanol → axetaldehyde → acid acetic Đầu tiên từ ruợu etylic tạo

thành axetaldehyde rồi được chuyển thành hydrat của axetaldehyde và sau cùng hydrat axetaldehyde bị oxy hóa thành acid acetic

Hydrat axetaldehyde acid acetic

Quá trình lên men giấm sẽ kết thúc khi hàm lượng acid acetic đạt yêu cầu Điều lưu ý là, trong môi trường lên men hết rượu, vi khuẩn acetic sẽ tham gia quá trình oxy hóa axit axetic thành CO2 và H2O để nhận năng lượng dùng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng

CH3COOH + 2O2 CO2 + H2O

Chính vì thế, sau khi lên men, bao giờ người ta cũng để lại một lượng etanol khoảng 0,3 – 0,5 % để vi khuẩn có thể sử dụng cồn mà không sử dụng acid acetic như một nguồn năng lượng

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men giấm:

1.3.3.1 Chủng vi sinh vật

Chủng VSV có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên men Hoạt lực của VSV

trong quá trình lên men quyết định tới hiệu suất chuyển hóa các chất tạo ra sản phẩm Vì vậy, để quá trình lên men giấm đạt hiệu quả cao yêu cầu chủng VSV sử dụng trong quá trình lên men đáp ứng một số yêu cầu:

1 Chủng có khả năng chuyển hóa ethylic tốt và tạo acid acetic với hiệu suất cao

2 Chủng có khả năng chịu được độ cồn và acid cao

Vi khuẩn

Vi khuẩn

3 Các tính chất ban đầu được giữ nguyên trong suốt quá trình lên men

4 Các điều kiện phân lập, nuôi cấy, bảo quản giống đơn giản không tốn kém nhiều phù hợp với điều kiện Việt Nam

1.3.3.2 Ảnh hưởng của sự thoáng khí [4]

Sự chuyển hóa etanol thành axit axetic do phản ứng oxy hóa trong đó oxy khí quyển là chất tiếp nhận hydro Do vậy, trong sản xuất sự oxy hóa rượu chỉ xảy ra trong trường hợp nếu vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với oxy không khí Trong điều kiện yếm khí thì vi khuẩn lên men giấm sẽ sử dụng cơ chất dinh dưỡng mà không tạo thành axit axetic Như vậy, chế độ cung cấp oxy là nhân tố điều chỉnh quá trình lên men

1.3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ

Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho chúng là từ 25-32oC Nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm, nhiệt độ cao ức chế hoạt động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất của vi khuẩn

và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acetic và etylic Nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản xuất giấm 22-35oC, nhiệt độ tối ưu là 23-27oC

1.3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ etylic trong dịch lên men [4]

Etylic được sử dụng như là cơ chất chủ yếu của quá trình lên men giấm với hàm lượng thích hợp là 5-12% thể tích

Nồng độ rượu quá cao sẽ ức chế hoạt động của hệ vi khuẩn dẫn tới làm giảm hiệu suất lên men

Khi không có etylic để làm cơ chất vi khuẩn acetic lại sử dụng acid acetic trong môi trường để tiếp tục oxy hóa tạo năng lượng cung cấp cho hoạt động của chúng, vì vậy làm cho hàm lượng acetic giảm đi Để tránh hiện tượng oxy hoá tiếp tục acid acetic thành CO2 và H2O thì cần có 1 lượng rượu còn lại trong sản phẩm khoảng 0.3-0.5% so với yêu cầu

1.3.3.5 Ảnh hưởng của nồng độ acetic và pH [4]

Trong sản xuất giấm người ta thường cho vào cơ chất ban đầu 1 lượng acid acetic nhất định để axit hóa môi trường nhằm:

 Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật các loại

 Đưa về pH thích hợp cho vi khuẩn hoạt động

Môi trường pH= 3 là thích hợp nhất cho vi khuẩn acetic Khi nồng độ acetic tăng dần làm cho pH giảm sẽ hạn chế hoạt động của vi khuẩn

Nồng độ acid ban đầu khoảng 2-6% Hàm lượng cao hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và giảm khả năng lên men Nồng độ acid acetic 8% ức chế hoạt động của vi khuẩn rất lớn Nồng độ 12-14% thì vi khuẩn ngừng hoạt động

1.3.3.6 Các chất C, N, P và nguyên tố vi lượng [8]

Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh trong dịch lên men cần bổ sung 1 số muối khoáng (NH4)2SO4, KH2PO4, CaHPO4, FeCl3… tùy theo nhu cầu cụ thể từng loài Các chất này cung cấp năng lượng cho sự phát triển của tế bào và giữ vai trò như những khối xây dựng nên tế bào VSV

Ngoài ra trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung vitamin, chất kích thích sinh trưởng như pepton, cao nấm men…

1.3.4 Các phương pháp lên men tạo axit axetic [3]

Bản chất của quá trình lên men là hiếu khí,vì thế phải tạo điều kiện tối đa để

vi khuẩn tiếp xúc với oxy và cơ chất

Để giải quyết tối đa vấn đề này, người ta đã đưa ra 4 phương pháp khác nhau: Phương pháp lên men chậm

Phương pháp lên men nhanh

Phương pháp lên men chìm

Phương pháp lên men kết hợp

1.3.4.1 Phương pháp lên men chậm

Phương pháp này được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là

phương pháp truyền thống của người Pháp

Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho Giống vi khuẩn axetic

được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse

Người ta thường cho vào thùng lên men bằng gỗ có dung tích 250-300 lít bằng gỗ sồi hình tank trống 1/5 thể tích lượng acid acetic và sau đó cho vào thùng dung dịch nước ép nho sao cho toàn bộ khối lượng đạt ½ thể tích thùng lên men ( hoặc 2/3 thể tích thùng lên men) Sở dĩ người ta cho acid acetic trước để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, tránh bị nhiễm

Tiến hành quá trình lên men ở nhiệt độ thường Sau một thời gian, trên bề mặt

sẽ tạo thành váng chứa nhiều vi khuẩn acetic và có sự tích lũy acid acetic trong dịch lên men Vì thế mà quá trình oxy hóa xảy ra chậm và kéo dài rồi kết thúc sau vài tuần sau đó Sau khi họ kiểm tra hàm lượng acit đạt tiêu chuẩn, chỉ tiêu cảm quan rồi kết thúc quá trình lên men giấm, họ lấy giấm ra, cho dịch dinh dưỡng mới vào Nếu để lâu, chất lượng giấm bị giảm nhanh do quá trình oxy hóa giấm xảy ra tiếp tục Giấm thu đuợc thường có hàm lượng axit 5-6% Muốn để lâu phải đem thanh trùng Pasteur

1.3.4.2 Phương pháp lên men nhanh

Phương pháp này do người Đức thực hiện theo qui mô công nghiệp đã khắc phục được những nhược điểm của phương pháp lên men chậm của người Pháp Thiết bị lên men là một thùng gỗ cao 2,5-6m, có đường kính 1,2 - 3m Tỷ lệ

đường kính đáy so với chiều cao khoảng ½ là thích hợp nhất Trong thùng được

chất đầy phoi bào hay lõi bắp Phoi bào hay lõi bắp được xem như chất mang, giữ

vi sinh vật trong quá trình lên men, nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng Ngoài ra, ở đáy thiết bị, người ta cho lắp một hệ thống phân phối, không khí đưa từ dưới lên Môi trường được đưa vào từ trên xuống

Đầu tiên, người ta dùng acid acetic có nồng độ 3-5% chảy qua lớp phoi bào hay lõi bắp để vừa có mục đích thanh trùng vừa có tác dụng acit hóa vật liệu chất mang để vi sinh vật giống dễ thích nghi trong quá trình lên men Sau đó, dùng nước

vô trùng rửa qua và nạp giống vi khuẩn acetic vào Vi khuẩn acetic sẽ bám vào phoi bào hay lõi bắp Tiếp đó người ta cho dòng môi trường từ trên xuống qua hệ thống phân phối như một vòi hoa sen trong buồng tắm Môi trường sẽ được phân phối đều khắp vật liệu phoi bào hay lõi bắp Cùng lúc, người ta thổi khí từ dưới lên Môi trường được đưa từ trên xuống, chảy qua lớp chất mang có chứa các tế bào vi khuẩn Cồn sẽ thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn, không khí được đưa từ dưới đáy thiết bị lên trên, thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn Vi khuẩn tiến hành quá trình oxy hóa rượu thành CH3COOH sẽ thẩm thấu qua màng tế bào ra ngoài và theo dung dịch xuống đáy thiết bị lên men Người ta thu nhận từ đáy thiết bị lên men

Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24-37oC Trong trường hợp dịch lên men cuối cùng chứa lượng acid acetic thấp, người ta tiến hành tái lên men bằng cách bơm chúng ngược lại từ trên xuống

Ưu điểm: Thời gian lên men nhanh

Thiết bị đơn giản và không cần nhiều thiết bị cho quá trình lên men

Hàm lượng axit axetic cao (8 – 10%)

Nhược điểm: vì quá trình thổi không khí từ dưới lên nên xảy ra quá trình bay hơi C2H5OH hoặc CH3COOH

Ngoài ra còn có những phương pháp lên men nhanh khác:

+ Phương pháp nhúng: người ta thiết kế thùng lên men hình trụ, bên trong lắp nhiều giỏ chứa đầy chất mang( mạt cưa, lõi bắp, than củi hay các vật liệu cellulose

có khả năng giữ vi sinh vật trên đó) Các giỏ này có thể nâng lên hoặc hạ xuống được

Người ta chuẩn bị môi trường và đổ môi trường váo thùng lên men Vi sinh vật sẽ được làm bám dính vào các vật liệu đựng trong giỏ Giỏ chứa vật liệu có vi sinh vật sẽ được nhúng xuống dung dịch lên men rồi lại nhấc chúng lên khỏi dung

dịch Khi chiếc giỏ chứa chất mang có vi sinh vật thấm đầy môi trường và được nhấc lên không khí, quá trình oxy hóa rượu được xảy ra Thao tác này được lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ có tác dụng oxy hóa hết lượng cồn có trong dung dịch

Ưu điểm: Dễ thực hiện,thiết bị đơn giản, lên men nhanh

Nhược điểm: Năng suất thấp, dễ bị nhiễm vi sinh vật lạ

+ Phương pháp hình trống quay: người ta thiết kế thiết bị lên men có hình trụ nằm ngang bên trong một thùng chứa dung dịch lên men hở nắp Thiết bị hình trụ này được bọc một lớp vật liệu có khả năng thấm nước và có khả năng giữ vi sinh vật Một nửa thiết bị này nằm trong lòng dung dịch lên men, một nửa nằm trên dung dịch lên men và được tiếp xúc với không khí Khi vận hành, một nửa thiết bị luôn luôn được tiếp xúc với không khí Người ta thiết kế hệ thống quay này với vận tốc rất chậm để đủ thời gian cho quá trình oxy hóa cồn thành acid acetic

Ưu điểm: Đơn giản, dễ vận hành

Nhược điểm lớn nhất là thời gian lên men kéo dài và hiệu suất oxy hóa không cao

1.3.4.3 Phương pháp lên men chìm

Người ta thiết kế hệ thống lên men acetic được gọi là acetator Người ta cho dung dịch lên men vào thiết bị và tiến hành thổi khí rất mạnh Khi đó trong dung dịch lên men sẽ tạo ra thể huyền phù và dung dịch lên men Hai thể này luôn luôn được trộn lẫn nhau và như vậy, quá trình oxy hóa xảy ra rất mãnh liệt

1.3.4.4 Phương pháp kết hợp

Người ta thiết kế hệ thống lên men bao gồm hai phần: phần trên là lớp đệm hay lớp chất mang chứa vi sinh vật ( giống phương pháp nhanh), lớp giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống Dưới cùng là

hệ thống thổi khí mạnh, khí sẽ được thổi qua phần dung dịch này rồi chuyển ngược lên phần trên( giống thiết bị lên men chìm)

Ưu điểm: hiệu suất lên men cao, nồng độ acid acetic thu được trong khoảng 10 – 13%

1.3.5 Phương pháp nâng cao nồng độ acid acetic trong dịch lên men [3]

Hàm lượng acid acetic có trong dịch lên men thường không cao, trong khoảng 5-10% Acid acetic có trong dịch lên men thường lẫn với các chất khác, do

đó, dịch sau lên men chỉ có thể sử dụng để chế biến thực phẩm Trong nhiều nghành cần sử dụng acid acetic, người ta yêu cầu hàm lượng acid acetic trong dung dịch phải cao và có độ tinh khiết Chính vì thế việc nâng cao hàm lượng acid acetic trong dung dịch lên men và làm sạch acid acetic là việc làm rất cần thiết

Những phương pháp để nâng cao hàm lượng và tinh chế acid acetic

1.3.5.1 Phương pháp chưng cất

Mục đích sử dụng phương pháp này để nhận acid acetic có hàm lượng cao hơn Phương pháp này rất đơn giản và dễ thực hiện Tuy nhiên, phương pháp này thường tiêu hao nhiều năng lượng và hàm lượng acid acetic thường không cao

1.3.5.2 Phương pháp chưng cất bằng muối:

Người ta sử dụng một cấu tử có khả năng phân ly mạnh làm thay đổi trạng thái cân bằng lỏng-hơi Trong chưng cất có sự tham gia của muối CaCl2 hoặc

CH3COONa, hiệu suất thu nhận acid acetic thường rất cao

Phương pháp này có ưu điểm:

 Tốn ít năng lượng

 Sản phẩm đạt độ tinh khiết cao

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những nhược điểm:

 Phải hoàn nguyên cấu tử phân ly nên tốn thiết bị và năng lượng cho quá trình này

 Gây ăn mòn thiết bị

1.3.5.3 Phương pháp chưng cất- trích ly:

Phương pháp này được thực hiện trên cơ sở những cấu tử phân ly có độ bay hơi nhỏ hơn cấu tử đã có trong hỗn hợp Cấu tử phân ly này sẽ kết hợp với một cấu

tử có trong dung dịch tạo ra một hỗn hợp khó bay hơi và thoát ra ở dưới đáy tháp chưng cất Cấu tử phân ly cần có tính chất hòa tan chọn lọc và không được hòa tan cấu tử cần tách Đặc điểm của phương pháp này như sau:

- Sử dụng một cấu tử trung gian để làm thay đổi độ bay hơi tương đối của các cấu

tử trong hỗn hợp

- Người ta thường thu hồi cấu tử phân ly để sử dụng lại

- Các cấu tử phân ly có tính chọn lọc cao, nên trong quá trình chưng cất cần chọn đúng chất phân ly

1.3.5.4 Phương pháp chưng cất chân không:

Phương pháp này rất phức tạp Tuy nhiên, phương pháp này có ưu điểm là thu nhận được sản phẩm có chất lượng

1.3.6 Sự sinh trưởng và phát triển của VSV trong quá trình lên men

1.3.6.1 Sự sinh trưởng và phát triển của VSV trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [8]

Sự phát triển của quần thể VSV xảy ra theo các giai đoạn tách biệt gọi là đường cong phát triển quần thể Trong hệ thống nuôi cấy tĩnh, đường cong phát triển chia làm 4 phase: phase lag, phase mũ (phase log), phase ổn định và pha tử vong

Hình 1.2 Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

a Pha tiềm phát (Pha Lag)

Đây là thời gian tính từ khi VK được cấy vào môi trường cho đến khi chúng bắt đầu sinh trưởng Trong pha này VK phải thích ứng với môi trường mới, chúng

tổng hợp mạnh mẽ các enzim trong điều kiện mới và chuẩn bị cho sự phân bào Trong giai đoạn này không có sự gia tăng số lượng tế bào

Chiều dài phase lag tùy thuộc vào trang thái sinh lý của hệ VSV với thành phần dinh dưỡng của môi trường Thành phần dinh dưỡng càng khác xa so với môi trường nhân giống thì phase lag càng kéo dài

b Pha lũy thừa (Pha Log)

Trong pha này, vi khuẩn bắt đầu phân chia, số lượng TB tăng theo lũy thừa, thời gian thế hệ đạt tới hằng số, quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ nhất đồng thời sản phẩm chính của quá trình lên men tạo ra lớn nhất (acid acetic) Trên đường cong sinh trưởng phase mũ có dạng là đường thẳng đi lên Phase mũ không thể tiếp tục vô tận vì như thế số lượng tế bào VSV quá lớn sẽ phá vỡ thế cân bằng của quần thể VSV

c Pha ổn định

Trong pha này tốc độ sinh trưởng cũng như trao đổi chất của quần thể VSV giảm so với pha log Sản phẩm sinh ra ở trạng thái ổn định đồng thời số lượng TB chết cân bằng với số TB sinh ra Một số nguyên nhân khiến quần thể VSV chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm (đối với vi khuẩn hiếu khí), các chất độc tích lũy, pH giảm do hàm lượng acid tăng làm ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào VSV

d Pha tử vong

Trong giai đoạn này, số TB chết đi nhiều hơn số TB sinh ra và có một

sự giảm thực sự về số lượng TB sống Một số VSV chứa các enzim tự phân giải

TB Số khác có hình dạng TB thay đổi do thành TB bị hư hại Trong lên men acetic thì acid sinh ra không tăng lên mà còn bị giảm đi do VSV sử dụng tạo năng lượng duy trì hoạt động sống Đường cong phát triển trực tiếp ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường và thành phần môi trường Sự phát triển của VSV bị giới hạn bởi

sự cung cấp dinh dưỡng bị hạn chế và sự tích lũy các sản phẩm độc

1.3.6.2 Sinh trưởng và phát triển của VSV trong điều kiện nuôi cấy liên tục

Trong các mẻ cấy, sự phát triển pha mũ xảy ra tiếp tục ở một số thế hệ cho đến khi chất dinh dưỡng bị cạn kiệt hay có bất lợi cho hoạt động của hệ VSV Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, pha log chỉ kéo dài được vài thế hệ Trong phương pháp nuôi cấy liên tục, có sự bổ sung môi trường mới, và rút bớt chất thải

ra ngoài, khi đó VK có thể sinh trưởng trong pha log một thời gian dài Trong hệ thống nuôi cấy liên tục, môi trường mới được đưa vào thiết bị nuôi cấy có thể tích

cố định một cách liên tục và có kiểm soát, môi trường đã sử dụng (sản phẩm lên men) được loại ra thông qua hệ thống vòi chảy có kiểm soát vận tốc đạt yêu cầu

Hệ VSV trong thiết bị nuôi cấy liên tục được duy trì ở mức hằng định Sản phẩm thu được luôn được kiển soát ở nồng độ nhất định

Hình 1.3 Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục

1.3.7 Thành phần hóa học của giấm nuôi

Trong quá trình lên men giấm bên cạnh quá trình chính là tạo acid acetic còn có các quá trình thủy phân các hợp chất khác tạo ra một số chất dinh dưỡng bao gồm nhiều loại acid amin cơ thể người không tổng hợp được trong giấm đều có (valine; leucine; iso leucine; threonine; lizine )

Hàm lượng axit hữu cơ trong giấm khá nhiều, axit hữu cơ ngoài acid acetic là thành phần chính còn có hơn 10 loại acid: acid lactic, acid gốc xeton, acid citric, …

Trong giấm có vitamin B1, B2, C … là sản phẩm quá trình trao đổi chất cuả vi sinh vật trong quá trình lên men

Muối vô cơ trong giấm vô cùng phong phú Na, K, Ca, Fe, Cu, Zn, P…

Nguyên tố vi lượng Ca, Fe, Cu, P… giúp quá trình sinh lý chống già yếu

và quá trình sinh trưởng ở tuổi dậy thì hoặc là thành phần không thể thiếu trong

việc trao đổi chất

1.3.8 Một số hư hỏng giấm và nguyên nhân

1.3.8.1 Giấm bị đục và giảm độ chua

Trong sản xuất giấm, thường xảy ra hai quá trình oxy hóa:

Quá trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH là quá trình có lợi cho sản xuất Quá trình oxy hóa CH3COOH thành CO2 và H2O là quá trình có hại cho sản xuất Trong quá trình oxy hóa này có thể xảy ra hai hướng: oxy hóa hóa học và oxy hóa sinh học Oxy hóa hóa học chuyển CH3COOH thành CO2 và H2O theo phản

ứng:

CH3COOH + O2 = 2CO2 + H2O Oxy hóa sinh học chuyển CH3COOH thành CO2 và H2O xảy ra do nấm men

Candida mycoderma) Các giống nấm men này có khả năng tạo màng nhầy làm

cho giấm đục và tạo cặn Và ngay cả hệ vi khuẩn acetic tham gia quá trình lên men

giấm cũng tham gia vào quá trình oxy hóa sinh học này khi trong dịch lên men

thiếu cơ chất cho chúng sử dụng

1.3.8.2 Hiện tượng lươn giấm

- Lươn giấm có tên khoa học là Angiullula aceti Chúng thuộc loại động vật

như giun tròn, rất nhỏ, có màu hồng Con đực ở tuổi trưởng thành có kích thước 1mm, con cái ở tuổi trưởng thành có kích thước 1-2 mm

- Nếu nồng độ giấm < 5%, lươn giấm rất dễ phát triển Nồng độ giấm cao

khoảng > 9%, chúng bị ức chế và không thể phát triển được

- Lươn giấm thường sử dụng vi khuẩn acetic như nguồn dinh dưỡng Tuy nhiên, chúng cũng có khả năng sử dụng C2H5OH, CH3COOH, đường, các chất hữu

cơ chứa nito để phát triển Chúng thường không gây độc cho người mà chỉ gây đục giấm và làm giảm hiệu suất lên men, giảm chất lượng sản phẩm

1.3.7.3 Bọ giấm

- Trong sản xuất giấm, người ta thường thấy hai loại bọ giấm

Loại to, màu trắng, có kích thước 0,8-1,5 mm

Loại nhỏ, màu nâu, có kích thước 0,3-0,4 mm

- Bọ giấm làm thay đổi chất lượng của giấm Nhiều khi bọ giấm xuất hiện với một lượng rất lớn và ăn lươn giấm

1.3.7.4 Ruồi giấm

Ở những cơ sở sản xuất giấm, người ta thường thấy có rất nhiều ruồi giấm Ruồi giấm thường có màu nâu đỏ, có kích thước khoảng 2,5-3 mm Ruồi giấm thường phát triển ở phần trên, phần dưới của thiết bị lên men

Chúng làm giảm hàm lượng acid acetic, sinh ra những ấu trùng ăn vi khuẩn lactic và thường là vật trung gian lây nhiễm các vi sinh vật gây hại giấm

1.4 Hệ VSV sử dụng trong lên men giấm

Vi khuẩn acetic là tác nhân chính của quá trình lên men acetic nên còn được gọi chung là vi khuẩn acetic Đây là những vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, có trên bề mặt lá, quả, hoa và trong không khí tạo acid acetic từ rượu etylic Trong môi trường đầy đủ oxy và chất dinh dưỡng chúng có thể tăng sinh khối rất nhanh

1.4.1 Đặc điểm hình thái [1]

- Đa số vi khuẩn acetic là vi khuẩn gram âm

- Về hình dạng tế bào vi khuẩn acetic là trực khuẩn hình que tới elip, kích thước tế bào 0.6-0.8 mm/ 1-3 mm Các tế bào đứng tách riêng rẽ, 1 số xếp 2 tế

bào, 1 số khác xếp thành chuỗi dài (A.aceti) Một số loại đặc biệt có tế bào

hình cầu, có loại hình chỉ Tùy điều kiện pH môi trường, nhiệt độ nuôi 1 số loài có thể có dạng hình bán nguyệt Nhiều loài vi khuẩn acetic khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hay môi trường đã nuôi cấy lâu (môi trường già)

dễ sinh ra hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài ra) có thể phân nhánh

- Một số vi khuẩn acetic không có khả năng tạo bào tử (A.aceti, A.schiitzenbachii) và đa số có thể tạo màng nhầy, một số có khả năng di động nhờ tiên mao, 1 số không có khả năng này (Acetobacter schiitzenbachii)

- Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, đều đặn, đường kính trung bình 3 nm

- Trên môi trường lỏng vi khuẩn acetic chỉ phát triển trên môi trường tạo thành những lớp màng dày mỏng khác nhau Một số loại tạo thành màng dày như sứa (0.5mm), nhẵn và trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó

1 lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt Khi nuôi cấy màng người ta thấy có sợi cellulose giống như ở trong sợi bông Một số loại có màng mỏng như giấy celophan, 1 số khác trên

bề mặt của màng không nhẵn mà nhăn nheo (A.aceti), 1 số nữa tạo màng

mỏng dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong

1.4.2 Đặc điểm sinh trưởng [1]

 Vi khuẩn acetic phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường

có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay manitol

 Phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-30oC, pH 3 – 4.5

 Ngoài ra còn thực hiện quá trình oxy hóa lactate, chuyển glucose thành gluconate, oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất ketone, hay các acid hữu cơ tương ứng

 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn Cacbon, Nito và chất sinh trưởng cũng rất đa dạng Vi khuẩn acetic sử dụng đường, etylic

và các acid hữu cơ làm nguồn Cacbon, muối amon làm nguồn Nito

Trong quá trình phát triển vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với 1 số acid amin như valin, alanin, prolin

 Một số chất kích thích sinh trưởng như acid nicotine, acid amin, và

biotin… có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn acetic

 Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp poly saccaride phân tử lớn như cellulose, tinh bột, dextran… và người ta ứng dụng khả năng này trong sản xuất công nghiệp Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose

giống như bông A xylimum, acetigenum, viizingianum

1.4.3 Một số vi khuẩn thường gặp trong lên men giấm [3]

Có rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng lên men để tạo ra acid acetic Tất cả

các vi khuẩn có khả năng lên men tạo acid acetic được gọi chung là vi khuẩn acetic Các loại VSV acetic không chỉ có khả năng lên men etylic để tạo thành axit acetic mà còn có khả năng chuyển hóa được rượu propionic thành acit propionic và chuyển hóa rượu butylic thành acit butyric

Trong số 20 loài đã được nghiên cứu kỹ, cho thấy khả năng áp dụng vào thực

tế sản xuất, các giống sau đây được xem như có nhiều ưu điểm hơn cả

Người ta thường sử dụng những giống sau:

- Acetobacter aceti

Trực khuẩn ngắn có dạng hình que kích thước 0,4-0,8 và 1-1,2 mm, không di

động thường xếp thành chuỗi dài Gram âm, màu vàng với thuốc nhuộm iod Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên gellatin với dịch lên men chứa 10% đường saccharose, tạo thành màng dày nhẵn, không được nâng lên theo thành bình, có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu khá cao (11%), có khả năng tích lũy 6% acid acetic Nhiệt độ thích hợp phát triển 34oC Nếu nhiệt độ cao quá 43o C

sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê

- Acetobacter xylinum

Trực khuẩn dạng hình que 2 mm, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi không

di động Các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy, tạo váng nhẵn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iod và H2SO4 (phản ứng của hemicellulose) vì váng có chứa hemicellulose, có thể oxy hóa rượu tạo 4.5% acid acetic trong môi trường, ngoài ra chúng còn có khả năng oxy hóa tiếp acid acetic thành CO2 và H2O

- Acetobacter pasteurianum

Hình 1.4 Acetobacter pasteurianum

Trực khuẩn ngắn, hình thái gần giống A aceti, nhưng khi ta nhuộm chúng với

iot, tế bào sẽ cho màu xanh

Khả năng chịu nổng độ cồn của chúng thấp hơn của A aceti (khoảng 10%) Trong

điều kiện môi trường phát triển chúng có khả năng tạo được 5-6% axit axetic

Các nhà nghiên cứu ở Nhật kết luận trong tổng cộng 178 mẫu phân lập chia thành các nhóm A và B trên cơ sở phân tích PCR lặp đi lặp lại và khuếch đại AND đa

hình phân tích ngẫu nhiên cho thấy sự tương đồng tới hơn 99% là A.pastuerianum

trong tất cả các giai đoạn của quá trình lên men của 2 loại rượu gạo(homesu và

kusrosu) Điều này chứng tỏ trong quá trình sản xuất giấm bằng phương pháp lên

men truyền thống, các chủng vi khuẩn thích hợp đã được lựa chọn một cách tự nhiên để sử dụng cho quá trình lên men giấm mà không có bất cứ sự can thiệp khử trùng hay chống tạp nhiễm nào trong suốt thời gian dài Ngay cả khi trong điều kiện

pH thấp của quá trình lên men acid acetic, họ đã rất ngạc nhiên khi thấy rằng hàm lượng gần như nguyên chất của vi khuẩn acid acetic đã được lưu giữ trong một thời gian dài [10]

Mặt khác, giấm gạo (vinegars) từ lâu đã được sử dụng rất nhiều ở Nhật và Trung Quốc do giấm trong suốt, không màu và nó có hương vị rất tự nhiên đặc

trưng, và có chứa nhiều acid amin và các vitamine nên nó được sử dụng như một thứ nước uống bồi bổ sức khỏe rất hiệu quả [10]

- Acetobacter orleaneuse

Hình thái vi khuẩn này giống hai vi khuẩn trên, nhưng lại có kích thước nhỏ hơn nhiều Đặc biệt hai đầu của tế bào thường nhỏ lại Nhiều trường hợp người ta lẫn lộn vi khuẩn này với vi khuẩn kỵ khí Clostridium Trong dịch nước cấy, chúng thường tạo ra một váng rất mỏng trên bề mặt Váng vi khuẩn thường rất chắc, khi nhuộm với iot, tế bào sẽ chuyển sang màu vàng

- Acetobacter schiitzenbachii

Vi khuẩn này thuộc vi khuẩn hình que, nhưng kích thước của chúng dài hơn các giống đã trình bày ở trên Chúng không tạo bào tử, không có khả năng chuyển động và thuộc vi khuẩn gram (-) Khi phát triển ở môi trường lỏng, chúng tạo ra lớp màng dày nhưng không chắc Ở các nước trên thế giới, người ta thường sử dụng chúng để sản xuất giấm theo phương pháp chìm Trong điều kiện môi trường thuận lợi, chúng có khả năng tạo được 11-12% axit axetic

- Acetobacter curvum

Về cơ bản vi khuẩn này giống A schiitzenbachii Trong môi trường lên men

thuận lợi, vi khuẩn này có thể tạo ra được 10-11% axit axetic Vi khuẩn A curvum

tạo váng rất chắc trên bề mặt môi trường Nhiệt độ lên men tối ưu của vi khuẩn này

là 35-37oC

- Acetobacter suboxydans

Vi khuẩn A.suboxydans được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất vitamin

C Chúng có khả năng chịu đựng được nồng độ cồn rất cao Lượng axit axetic tạo được từ quá trình lên men khá cao Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này tiến hành lên men là 28-30oC Trong quá trình lên men cần phải thông khí liên tục vì vi khuẩn này cần lượng oxy rất nhiều cho quá trình chuyển hóa cồn thành axit axetic

và cho quá trình phát triển

1.5 Một số ứng dụng của acid acetic[3]

Acid acetic là một loạt acit hữu cơ ứng dụng rộng rãi trong đời sống và trong công nghiệp, bao gồm những ứng dụng quan trọng sau:

1.5.1 Ứng dụng trong chế biến mủ cao su

Trong sản xuất mủ cao su, người ta rất sợ hiện tượng đông đặc của mủ trước khi đưa đi chế biến Để tránh hiện tượng đông đặc của mủ cao su người ta cho NH3

3% Lượng NH3 dùng tùy thuộc vào loại mủ đem đi sơ chế

Sau khi pha loãng và khuấy trộn mủ với NH3, lúc sơ chế các sản phẩm tiếp theo người ta cho thêm vào dung dịch acid acetic 2,5% với lượng là 3,5- 10kg/tấn dung dịch mủ cao su, khi cho acit vào người ta khuấy liên tục Acid acetic thúc đẩy quá trình keo tụ, dung dịch mủ cao su tách thành 2 pha và dễ dàng tách ra theo yêu cầu của công nghệ chế biến từng mặt hàng

Nhu cầu về acid acetic trong chế biến mủ cao su là hết sức lớn Hiện nay, nước

ta vẫn phải nhập acid acetic từ bên ngoài

1.5.2 Ứng dụng acid acetic trong ẩm thực và đời sống

Việc tổng hợp các acid hữu cơ trong quá trình lên men làm giấm càng có vị tươi và ngon Hơn nữa giấm mà có nhiều acid hữu cơ có thể tăng sự ngon miệng, giúp tiêu hóa Trong nấu nướng thêm 1 chút giấm, trong giấm có acid hữu cơ có thể làm thành phần dinh dưỡng trong thức ăn được chế biến làm cơ thể càng dễ hấp thụ

Thay cho chanh trong thực đơn các món trộn, salad và còn sử dụng để tẩy rửa một số vết bẩn cứng đầu bám trên đồ dùng gia đình

Phòng trị cao huyết áp và sơ cứng động mạch [10]: Các nhà nghiên cứu nhật

đã nghiên cứu ra trong giấm gạo có chất ngăn một loại hoocmon làm tác nghẽn mạch máu

Làm đẹp da : Không những ức chế sắc tố da, giảm vết nhăn ở người già mà có thể tăng tuần hoàn máu cho da, thay tế bào già, co rút lỗ chân lông lại, làm cho da vừa mịn vừa láng

1.5.3 Ứng dụng trong công nghiệp khác

Acid acetic còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ, tổng hợp chất dẻo tơ sợi Những ngành sản xuất này đòi hỏi lượng acid acetic nhiều và có chất lượng cao hơn dung dịch acid acetic dùng trong công nghệ thực phẩm và trong công nghệ chế biến mủ cao su

Và acid acetic còn được ứng dụng như chất tẩy rửa, sát trùng diệt khuẩn trong

y tế

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vi khuẩn acetobacter pasteurianum

Để nghiên cứu quy trình sản xuất giấm đề tài sử dụng giống chủng Acetobacter pasteurianum Chủng Acetobacter pasteurianum được mua ở trường

đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Chủng được giữ trong môi trường lỏng, tiến hành phân lập rồi cấy vào ống nghiêm thạch nghiêng để giữ giống

Acetobacter pasteurianum, có hình dạng là trực khuẩn ngắn có dạng hình que, có

màu xanh khi nhuộm chúng với thuốc nhuộm iod, có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu khá cao (khoảng 11%), có khả năng tích lũy 6% acid acetic

2.1.2 Cơ chất

2.1.2.1 Rượu

Etanol được biết đến như là rượu êtylic hay rượu ngũ cốc hay cồn, là một hợp chất hữu cơ, nằm trong dãy đồng đẳng của rượu metylic, dễ cháy, không màu, là một trong các rượu thông thường có trong thành phần của đồ uống chứa cồn Trong cách nói dân dã, thông thường nó được nhắc đến một cách đơn giản là rượu Công thức hóa học của nó là C2H5OH, hay CH3-CH2-OH, viết tóm tắt là C2H6O

Rượu được dùng như là nguồn nguyên liệu chính cho quá trình lên men giấm

Hệ vi sinh vật axetic thực hiện quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic trong điều

kiện hiếu khí bắt buộc Khi có mặt rượu trong môi trường, rượu sẽ là cơ chất cho chủng vi khuẩn sử dụng chuyển hóa tạo acid acetic đồng thời cung cấp năng lượng cho chủng vi khuẩn hoạt động Lúc trong môi trường lên men hết cơ chất (rượu) thì chúng sẽ oxy hóa acid acetic để tạo ra năng lượng cung cấp cho hoạt động của chúng làm giảm hàm lượng acid acetic trong dịch lên men

Để tiến hành thí nghiệm sử dụng rượu gạo chưng cất, trong suốt được mua ở Ninh Đa – Ninh Hòa Sau đó tiến hành chưng cất lại và đo độ rượu bằng tỷ trọng kế (xem phụ lục 1)

Tiến hành pha loãng theo công thức C1V1= C2V2 tới 5; 6; 7; 8% tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo

2.1.2.2 Đường Saccarose C 6 H 12 O 5

Hình 2.1 Công thức hóa học của đường saccarose

Đường là cơ chất đầu tiên đi vào các chu trình chuyển hóa cung cấp năng lượng cũng như cung cấp nguồn các chất vật liệu cần thiết để sinh tổng hợp các cấu

tử cần thiết tạo nên tế bào Trong quá trình lên men giấm, đường là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng, năng lượng cho hệ vi khuẩn hoạt động trong giai đoạn đầu của quá trình lên men Ngoài ra đường còn đóng vai trò tăng vị hài hòa của giấm, làm cho giấm không bị chua gắt như các sản phẩm giấm hóa học

2.1.2.3 Một số chất khác:

Để quá trình lên men diễn ra nhanh và đạt hiệu quả cao thì ngoài các chất trên còn cần một số muối khoáng và nguồn cung cấp nitơ để duy trì hoạt động sống bình thường của hệ vi khuẩn Nguồn cung cấp nitơ là các muối amoni, các muối khoáng

có trong dịch lên men Trong môi trường nhân giống còn sử dụng các thành phần sau:

- Diamoni photphat (NH4)2HPO4 nguồn cung cấp nito cho chủng VSV hoạt động

Thiết bị lên men liên tục Thiết bị chưng cất rượu Pipet 2ml; 10ml

2.1.4 Bao bì thủy tinh

Trong điều kiện thí nghiệm sử dụng loại bao bì thủy tinh miệng hẹp, nắp vừa miệng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu:

 Xác định tỷ lệ một số thành phần của dịch lên men: nồng độ rượu, nồng độ đường, pH

 Xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV (vi khuẩn Acetic pasteurianum) vào dịch

lên men

 Xác định thời gian lên men, chế độ thanh trùng sản phẩm

 Sơ bộ ứng dụng quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục

 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm

 Xây dựng quy trình sản xuất giấm

2.2.2.2 Thuyết minh quy trình:

 Chuẩn bị dịch lên men:

Nguyên liệu chuẩn bị dịch lên men bao gồm có : đường, rượu, acid acetic và nước vô trùng

- Rượu để lên men giấm là từ rượu gạo đã chưng cất, đo độ rượu và pha loãng

- Dùng acid acetic với mục đích chống nhiễm tạp và đưa về pH thích hợp cho quá trình lên men

- Nước sử dụng cho quá trình lên men là nước vô trùng tránh các hiện tượng nhiễm tạp trong quá trình lên men

 Bổ sung chủng VSV: Trước khi tiến hành lên men cần nghiên cứu tỷ lệ bổ sung

chủng VSV Số lượng, hoạt lực của chủng VSV trong quá trình lên men có ảnh hưởng quyết định tới thời gian lên men nhanh hay chậm Vì vậy cần nghiên cứu phương pháp nhân giống và tỷ lệ bổ sung chủng vi khuẩn

 Lên men: Sau khi chuẩn bị dịch lên men hoàn chỉnh cho quá trình lên men tiến

hành lên men ở nhiệt độ phòng Thời gian lên men khoảng 15-30 ngày đối với phương pháp lên men truyền thống và 1 – 4 ngày đối với lên men liên tục Trong quá trình lên men thường xuyên kiểm tra sự thay đổi hàm lượng acid của sản phẩm, hàm lượng rượu dư để xác định kết thúc quá trình lên men giấm

 Xử lý sau lên men: Sau khi lên men sản phẩm còn lẫn VSV, cũng như các thành

phần thủy phân khác do đó cần tiến hành loại bỏ chúng bằng cách lọc và lắng gặn

để làm trong giấm

 Thanh trùng: Sau khi lên men tạo giấm, kiểm tra các chỉ tiêu như nồng độ

acetic, chỉ tiêu cảm quan rồi tiến hành thanh trùng sản phẩm Vì sản phẩm có nông

độ acid acetic cao, pH thấp nên chỉ cần thanh trùng ở nhiệt độ 100oC trong thời gian

5 – 10 phút

2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định các thông số dịch lên men

2.3.1 Bố trí thí nghiêm xác định nồng độ rượu dịch lên men

Nồng độ rượu là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng tới quá trình lên men acid acetic rất lớn Vì vậy để tìm ra nồng độ rượu tại đó hiệu quả hoạt động của hệ vi khuẩn là tốt nhất TN tiến hành làm 4 mẫu thí nhằm với mục đích tìm giá trị nồng độ rượu thích hợp cho quá trình lên men Cố định các yếu tố còn lại và chạy nồng độ rượu lần lượt ở 5, 6, 7 ,8 (%)

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ rượu đến quá trình lên men

Điều kiện ban đầu Mẫu

pH (NH4)2HPO4

(%)

Nồng độ rượu (%)

Hàm lượng đường(%)

Lượng men giống (%)