Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm máu toàn phần để ứng dụng trong ngoại kiểm hba1c

Để kiểm soát tốt các sai sót trong quá trình thực hiện và trả kết quả xétnghiệm đảm bảo độ tin cậy cho chẩn đoán v điều trị đạt hiệu quả cho ngườibệnh thì mỗi phòng xét nghiệm cần phải t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.BS VŨ QUANG HUY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – Năm 2019

Lời cảm ơn

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS.BS Vũ Quang Huy,người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gianhọc tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô, anh chị em Trung tâmkiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh,

và Bộ môn xét nghiệm đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình họctập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, phòng Kế hoạch tổng hợp,Trung tâm truyền máu huyết học Bệnh viện Chợ Rẫy đã hết sức hợptác, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn đồngnghiệp cùng tập thể anh chị em học viên lớp cao học xét nghiệm khóa 2017 -

2019 đã động viên, ủng hộ tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận vănnày

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2019

Tác giả luận văn

BÙI MINH ĐỨC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây l công trình nghi n cứu của ri ng tôi Các sốliệu, kết quả trong luận văn n y l trung thực v chưa t ng được ai công bốhay báo cáo trong bất công trình n o hác

Tác giả

BÙI MINH ĐỨC

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cam đoan i

Mục lục ii

Danh mục các t viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

Danh mục các sơ đồ viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đại cương về Glycated Hemoglobin (HbA1c) 4

1.2 Các yếu tố li n quan đến chất lượng xét nghiệm 14

1.4 Tiêu chuẩn sản xuất mẫu ngoại kiểm HbA1c 20

1.5 Tình hình ngoại kiểm hóa sinh trên thế giới và ở Việt Nam 28

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.2 Thiết kế nghiên cứu 31

2.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu 31

2.4 Cỡ mẫu 32

2.5 Phương pháp thu thập mẫu 33

2.6 Quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm HbA1c 36

2.7 Kiểm soát sai lệch 48

2.8 Y đức và tính ứng dụng trong nghiên cứu 49

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 50

3.1 Thu thập nguyên liệu 50

3.2 Sản xuất v đánh giá chất lượng bộ mẫu máu toàn phần chứa HbA1cdùng trong ngoại kiểm 533.3 Kết quả đánh giá tính đồng nhất bộ mẫu chứa HbA1c dùng trongngoại kiểm 583.4 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chứa HbA1c dùng trong ngoại kiểm 623.5 Kết quả xây dựng quy trình sản xuất máu to n phần chứa nồng độHbA1c sử dụng trong ngoại iểm 75

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 76

4.1 Giai đoạn thu thập nguồn nguyên liệu sử dụng trong sản xuất chấtchuẩn HbA1c 764.2 Đánh giá chất lượng bộ mẫu chuẩn HbA1c 784.3 Quy trình sản xuất bộ mẫu chuẩn t máu toàn phần chứa HbA1c sửdụng trong ngoại kiểm 82

KẾT LUẬN 87 KIẾN NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ tiếng Việt

ADA : Hiệp hội đái tháo đường hoa k

CRM : Mẫu chuẩn được chứng nhận

CV : Hệ số biến thiên

DCCT : Thử nghiệm kiểm soát biến chứng đái tháo đườngEQA : Ngoại kiểm tra chất lượng

HPLC : Sắc ký lỏng cao áp

IFCC : Li n đo n hóa học lâm sàng quốc tế

ĐTĐ : Đái tháo đường

GTBĐ : Giá trị ban đầu

PXN : Phòng xét nghiệm

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

Từ tiếng Anh

ADA : American Diabetes Association

CRM : Certified Reference Material

CV : Coefficient of Variation

DCCT : Diabetes Control and Complication Trial

EQA : External Quality Assessment

HbA1c : Glycohemoglobin

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

IFCC : International Fedaration of Clinical Chemistry

NGSP : National Glycohemoglobin Standardization ProgramQMS : Quality Management System

RM : Reference Material

SD : Standard Deviation

WHO : World Health Organization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Thiết bị - Dụng cụ 35

Bảng 2.2: Hoá chất - Sinh Phẩm 35

Bảng 3.1: Kết quả đánh giá nồng độ HbA1c ban đầu bộ mẫu đông lạnh 55

Bảng 3.2: Kết quả đánh giá nồng độ HbA1c ban đầu bộ mẫu đông hô 57

Bảng 3.3: Kết quả đánh giá đồng nhất của bộ mẫu ĐL.L1 v ĐK.L2 60

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu ĐL.L3 v ĐK.L4 61

Bảng 3.5: Kết quả lô mẫu ĐL.L1 chứa HbA1c ở mức bình thường 63

Bảng 3.6: Kết quả lô mẫu ĐK.L2 chứa HbA1c ở mức bình thường 65

Bảng 3.7: Kết quả lô mẫu ĐL.L3 chứa HbA1c ở mức nồng độ cao 67

Bảng 3.8: Kết quả lô mẫu ĐK.L4 chứa HbA1c ở mức nồng độ cao 69

Bảng 3.9: Bảng phân tích ết quả lô mẫu ĐL.L1 chứa HbA1c tan đông 71

Bảng 3.10: Bảng phân tích ết quả lô mẫu ĐL.L3 chứa HbA1c tan đông 73

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Sự hình th nh HbA1c trong hồng cầu 4

Hình 1.2: Phản ứng tạo th nh HbA1c 5

Hình 1.3: Tương quan giữa chỉ số HbA1c v glucose máu trung bình 8

Hình 1.4: Biến chứng của bệnh đái tháo đường 10

Hình 1.5: Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm 17

Hình 1.6: Thiết bị đông hô mẫu EYELA FDU-2100 27

Hình 2.1: Chuẩn bị vật liệu ban đầu 36

Hình 2.2: Chuẩn bị nguy n liệu ban đầu 37

Hình 2.3: Xác định hối lượng tube chứa mẫu 37

Hình 2.4: Quá trình chia nhỏ tạo bộ mẫu 38

Hình 2.5: Quá trình calib máy v chuẩn bị nội iểm 40

Hình 2.6: QC đạt 2 điểm v đánh giá ết quả ban đầu 41

Hình 2.7: Mẫu sau hi đông hô v tiến h nh đánh giá đồng nhất 42

Hình 2.8: Sau hi đã ho n nguy n v tiến h nh ly giải hồng cầu 43

Hình 2.9: Sau hi đã chuẩn máy v tiến h nh chạy ết quả 43

Hình 2.10: Đánh giá ổn định qua 2 phương pháp HPLC v miễn dịch độ đục 45

Hình 3.1: Hệ thống máy định lượng miễn dịch độ đục 52

Hình 3.2: Hệ thống máy định lượng sắc ý lỏng trao đổi ion 53

Hình 3.3: Mẫu đông lạnh ĐL.L1 v ĐL.L3 56

Hình 3.4: Bộ mẫu đông hô ĐK.L2 v ĐK.L4 58

Hình 3.5 Kết quả theo d i độ ổn định lô mẫu ĐL.L1 64

Hình 3.6 Kết quả theo d i độ ổn định lô mẫu ĐK.L2 66

Hình 3.7 Kết quả theo d i độ ổn định lô mẫu ĐL.L3 68

Hình 3.8 Kết quả theo d i độ ổn định lô mẫu ĐK.L4 70

Hình 3.9 Kết quả theo d i độ ổn định lô mẫu ĐL.L1 tan đông 72

Hình 3.10 Kết quả theo d i độ ổn định lô mẫu ĐL.L3 tan đông 74

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1: Hệ thống tổ chức quản lý chất lượng (CLSI) 15

Sơ đồ 1.2: Các phương thức ngoại iểm 18

Sơ đồ 2.1: Quá trình thực hiện nghi n cứu 34

Sơ đồ 2.2: Quá trình đánh giá tính đồng nhất lô mẫu 44

Sơ đồ 2.3: Quá trình đánh giá độ ổn định lô mẫu 47

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực hiện nghi n cứu sản xuất bộ mẫu HbA1c 54

Sơ đồ 3.2: Quy trình sản xuất bộ mẫu chuẩn HbA1c 75

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh Hoa k (CDC:Centers for Disease Control and Prevention) công bố năm 2011 ở Mỹ: Đáitháo đường (ĐTĐ) chiếm tỉ lệ 8,3% tương đương 25,8 triệu người trong đóchỉ có 18,8 triệu người được phát hiện, có tới 7 triệu người hông được chẩnđoán Nguy cơ tử vong ở người ĐTĐ cao gấp đôi so với người cùng độ tuổikhông mắc bệnh ĐTĐ Chi phí dịch vụ chăm sóc v điều trị cho người ĐTĐcao gấp đôi so với người không mắc ĐTĐ Tổng chi phí cho người bị ĐTĐ tại

Mỹ 2007 là 174 tỷ USD, trong đó chi phí y tế trực tiếp là 116 tỷ, gián tiếp là

58 tỷ USD [5] Trên thế giới mỗi năm phải chi số tiền khổng lồ t 232 tỷ đến

430 tỷ USD cho việc phòng chống v điều trị bệnh đái tháo đường [3]

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu năm 2012 của Bệnh viện Nội tiết trungương cho thấy: tỷ lệ hiện mắc ĐTĐ tr n to n quốc ở người trưởng thành là5,42%, tỷ lệ đái tháo đường chưa được chẩn đoán trong cộng đồng là 63,6%

Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose toàn quốc 7,3%, rối loạn glucose máu lúc đóitoàn quốc 1,9% (năm 2003) Theo ết quả điều tra STEPwise về các yếu tốnguy cơ của bệnh không lây nhiễm do Bộ Y tế thực hiện năm 2015, ở nhómtuổi t 18 - 69, cho thấy tỷ lệ ĐTĐ to n quốc là 4,1%, tiền ĐTĐ l 3,6% [12]

Để kiểm soát tốt các sai sót trong quá trình thực hiện và trả kết quả xétnghiệm đảm bảo độ tin cậy cho chẩn đoán v điều trị đạt hiệu quả cho ngườibệnh thì mỗi phòng xét nghiệm cần phải tiến hành nội kiểm tra v đặc biệt làngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm Ngoại kiểm tra chất lượng (EQA)không thể thiếu trong việc kiểm soát chất lượng xét nghiệm đặc biệt giai đoạntrong xét nghiệm theo tiêu chuẩn ISO15189 [54], đồng thời EQA như l mộtcông cụ minh chứng cho sự hoàn thiện của hệ thống đánh giá mức chất lượngtheo quyết định 2429/BYT ng y 12 tháng 6 năm 2017 [13], kiểm soát chất

lượng trong phòng xét nghiệm góp phần không nhỏ trong việc giúp cho nhàlâm sàng chẩn đoán v điều trị cho người bệnh một cách có hiệu quả nhất[46] Ở Việt Nam thủ tướng và Bộ y tế đã ban h nh các thông tư, nghị định,quyết định nhằm tăng cường pháp lý trong quá trình kiểm soát quản lý chấtlượng xét nghiệm và tiến tới lộ trình liên thông kết quả xét nghiệm năm 2020

- 2025 Hướng dẫn kiểm soát chất lượng xét nghiệm theo thông tư số01/2013/TT-BYT [11], ng y 11 tháng 01 năm 2013, Quyết định số 316/QĐ-TTg [1], ngày 27 tháng 02 năm 2016 thủ tướng chính phủ giao nhiệm vụ chotrung tâm sản xuất các loại mẫu trong ngoại kiểm Tuy nhi n, để có thể kiểmtra chất lượng xét nghiệm thì cần phải có một mẫu chuẩn đạt tiêu chuẩn haymẫu được chứng nhận [15] Các mẫu chuẩn thường dùng trong ngoại kiểmhiện nay ở nước ta đa số được nhập khẩu t thị trường nước ngoài với giáthành rất cao Hiện tại ở Việt Nam chưa có bất k một bài báo hay công trình

n o được công bố về sản xuất mẫu ngoại kiểm HbA1c trong nước Ngày nayHbA1c được (WHO) khuyến cáo lựa chọn trong chẩn đoán v theo d i điềutrị bệnh ―Đái tháo đường‖ Vì HbA1c hông ảnh hưởng bởi chế độ ăn uống,không phụ thuộc vào thời điểm làm xét nghiệm Cho nên việc lựa chọn xétnghiệm này là tốt nhất [12],[ 35] Với thực trạng hiện tại như vậy, việc sảnxuất một bộ mẫu HbA1c dùng trong ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm là

điều cần thiết Vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề t i ―Nghiên cứu quy trình

sản xuất thử nghiệm máu toàn phần để ứng dụng trong ngoại kiểm HbA1c‖.

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Bộ mẫu máu to n phần chứa nồng độ HbA1c sử dụng trong ngoại iểmtra chất lượng xét nghiệm được điều chế tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn ChấtLượng Xét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh, có đạt tínhđồng nhất, độ ổn định v đáp ứng được các y u cầu trong ngoại iểm chấtlượng xét nghiệm hay hông?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục ti u tổng qu t

Nghi n cứu quy trình sản xuất mẫu máu toàn phần chứa HbA1c dùngtrong chương trình ngoại iểm tra chất lượng ở quy mô các phòng xétnghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ GLYCATED HEMOGLOBIN (HbA1c)

1.1.1 Kh i niệm HbA1c

HbA1c l thuật ngữ dùng để chỉ hemoglobin bị glycosyl hóa Hồng cầutrong quá trình lưu h nh l m chức năng hô hấp có một tỷ lệ nhỏ hemoglobin

n y sẽ gắn ết với glucose máu để tạo n n phân tử HbA1c Glucose có thể

li n ết với hemoglobin trong máu ở bất thời gian n o trong suốt quá trìnhtồn tại của nó bởi một phản ứng hông cần enzyme [27], quá trình li n ết

n y l hông thể đảo ngược v tỉ lệ Hb (Hemoglobin) bị Glycosyl hóa sẽ tăng

l n theo lượng đường trong máu

Hình 1.1: Sự hình thành HbA1c trong hồng cầu

Ở người lớn, HbA chiếm khoảng 97 - 98%, HbA2 chiếm khoảng 2,5%

và HbF khoảng 0,5% HbA gắn với glucose tại đoạn cuối với amino acidvalin của chuỗi beta Quá trình gắn này gọi là glycosyl hóa (glycosylate) vàhemoglobin bị glycosyl hóa gọi là HbA1 Mặc dù HbA1 chiếm chủ yếu trong

số hemoglobin gắn với glucose, quá trình glycosyl hóa có thể xảy ra tại các vịtrí khác trong chuỗi globin Quá trình glycosyl hóa hemoglobin xảy ra khihồng cầu tiếp xúc với glucose huyết tương

Hình 1.2: Phản ứng tạo thành HbA1c

Hemoglobin và glucose có thể tạo cầu nối ban đầu lỏng lẻo nhưng sau đóbền vững, rất hó tách được hemoglobin v glucose Đối với HbA1, phần cầunối lỏng lẻo thường chiếm 10% tổng số cầu nối HbA1-glucose Sự hình thànhHbA1 xảy ra rất chậm trong suốt đời sống hồng cầu (120 ngày), số lượngHbA bị glycosyl hóa phụ thuộc vào nồng độ glucose và thời gian tiếp xúc vớiglucose

HbA1 gồm 3 loại: A1a, A1b, v A1c, trong đó HbA1c chiếm 60 - 70%lượng HbA1 HbA1 chiếm đa số hemoglobin bị glycosyl hoá ở điều kiện bìnhthường n n HbA1c đại diện cho hemoglobin bị glycosyl hóa Loại huyết sắc

tố glycosyl hóa (HbA1c) thường chiếm 4 - 6% tổng số huyết sắc tố.Hemoglobin bị glycosyl hóa có cầu nối bền vững tăng dần khi nồng độglucose máu tăng ổn định, cầu nối này bắt đầu tăng hoảng 2 - 3 tuần (thayđổi trong 1 - 4 tuần) Thế nên, HbA1c phản ánh nồng độ glucose máu trungbình trong 2 - 3 tháng trước đó [10], [42]

1.1.2 Tính chất của HbA1c

HbA1c ổn định cao trước kiểm nghiệm (1tuần ở 4°C) trong khi quá trìnhthủy phân glucose (glycolysis) tiêu thụ glucose trong hai giờ đầu tiên bảoquản trong fluoride sau hi máu được thu thập Gần đây nhất, nhómDETECT-2 đã phân tích dữ liệu máu t 47.364 người tại 12 quốc gia và báocáo một ngưỡng HbA1c là 6,3% (45 mmol/mol) l ngưỡng cho bệnh võngmạc (một biến chứng đặc trưng của bệnh đái tháo đường), và qua một phântích hoạt động đã chỉ ra một mức tối ưu l HbA1c 6,5% (48 mmol/mol),Diabetes Care 2011 [53] Cần phải nhấn mạnh rằng HbA1c không phải là một

sự thay thế cho glucose, nhưng nó l một yếu tố sàng lọc cho các biến chứng

vi mạch

Dựa v o cơ sở trên, ADA hiện tại khuyến hích HbA1c ≥ 6,5% (48mmol/mol) thay thế cho glucose huyết làm nền tảng trong chẩn đoán Sau hiphân tích chi tiết hơn, WHO ủng hộ quan điểm này cho tiêu chuẩn chẩn đoán(World Health Organisation 2011) [43] Cả hai tổ chức này tham khảo tầmquan trọng của việc đo HbA1c ở bệnh nhân có biểu hiện li n quan đến sốlượng hồng cầu bất thường, trong đó bao gồm suy thận cũng như sự thiếumáu và tan máu Chứng nhận bởi những xét nghiệm lặp lại nên dùng cùngmột phương pháp (ví dụ: HbA1c không nên dùng lần thứ hai ở những bệnhnhân hông được chẩn đoán bằng xét nghiệm glucose ban đầu) HbA1c khôngđược khuyến cáo cho tiểu đường trong thai k Tại Anh, tuyên bố của WHO

đã ngay lập tức được ch o đón bởi Hiệp hội đái tháo đường Vương quốc Anh(Diabetes UK) v được xác nhận bởi một số chuy n gia, nhưng hông phải tất

cả họ điều công nhận Bộ Y tế Anh thiết lập đề nghị kết hợp HbA1c vào tiêuchuẩn chẩn đoán đái tháo đường hiện tại

HbA1c bây giờ được chấp nhận là một xét nghiệm chẩn đoán đái tháođường Người ta sẽ tiếp tục thảo luận về các điểm cắt tối ưu nhất, nhưngdường như điều hông thay đổi là 6,5% (48 mmol/mol).

HbA1c 5,7-6,5% (39-48 mmol/mol) đã được đề xuất bởi ADA để biểuthị khoảng giữa tăng đường huyết (Diabetes Care, 2011), [53] v WHO đã đềnghị những người có HbA1c giữa 6,0-6,5% (42-48 mmol/mol) n n được xemxét can thiệp vào phòng chống đái tháo đường (World HealthOrganisation, 2011), [43]

1.1.3 Vai trò của HbA1c

- HbA1c có thể được sử dụng để chẩn đoán đái tháo đường, phát hiệnnguy cơ, theo d i hiệu quả điều trị v giúp ngăn ng a biến chứng của bệnhđái tháo đường Ở bệnh nhân đái tháo đường nồng độ HbA1c khoảng 5 - 7%cho biết bệnh nhân đã được ổn định glucose máu tốt trong 2 - 3 tháng trước

- Xét nghiệm HbA1c là nền tảng đánh giá tình trạng sức khỏe Giá trịHbA1c ≥ 6,5% (48 mmol/mol) cho phép chẩn đoán bệnh đái tháo đường,trong khi giá trị này nằm trong khoảng 42 - 47 mmol/mol (6,1% - 6,5%) nghĩa

l có nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường Bệnh nhân đái tháo đường n n đoHbA1c ít nhất 1 lần mỗi năm Những người bệnh có chỉ số đường huyết thấtthường hoặc có đường huyết ban đầu cao nên xét nghiệm HbA1c thường xuyên

để đánh giá hiệu quả kiểm soát đường huyết và có những điều chỉnh kịp thời đểphòng ng a biến chứng

1.1.4 Tương quan giữa trị số HbA1c và glucose m u trung bình

ADA đang huyến khích sử dụng một thuật ngữ mới trong chẩn đoán vđiều trị bệnh đái tháo đường, đó l đường huyết trung bình ước tính viết tắt làeAG (estimated average glucose) Xét nghiệm HbA1c sẽ quyết định sự thayđổi điều trị, quyết định đường huyết cho đối tượng xét nghiệm có được kiểm

soát tốt hay hông vì nó tương quan với tỉ lệ biến chứng mạn tính m tươnglai có thể mắc phải Kết quả chuyển đổi ở bảng dưới đây được tính theo côngthức: 28,7 x HbA1c – 46,7 = eAG

Công thức n y được công bố công khai bởi (the A1C-Derived AverageGlucose study: ADAG)- trên Diabetes Care (2008)

HbA1c Đường huyết trung bình

Hình 1.3: Tương quan giữa chỉ số HbA1c và glucose m u trung bình [52] 1.1.5 C c yếu tố ảnh hưởng đến chỉ số HbA1c

- Sự thay đổi của quá trình glycosyl hóa do chu chuyển hồng cầu, do genảnh hưởng đến quá trình glycosylate hóa, hoặc glucose huyết tăng bất thường

- Các yếu tố li n quan đến huyết sắc tố

- Thai k : Thai k ảnh hưởng đến HbA1c, nồng độ HbA1c thường thấphơn phụ nữ không có thai do pha loãng máu chu chuyển tế b o gia tăng Tuynhiên vào quí 3 của thai k HbA1c có thể gia tăng do thiếu sắt

- Thiếu máu: Thiếu máu tán huyết, mất máu cấp thiếu máu thiếu sắt cóthể làm giảm HbA1c  xuất hiện hồng cầu non v reticulocyte chưa đủ thờigian để glycosylate hóa.

- Bệnh nhân bị cắt lách có HbA1c tăng do đời sống hồng cầu kéo dài

- Bệnh huyết sắc tố: Bệnh HbF có thể l m tăng trị số HbA1c HbC vàHbS có thể làm giảm trị số HbA1c, điều này tùy thuộc phương pháp đoHbA1c Các phương pháp đo miễn dịch có thể khắc phục tình trạng này

- Suy chức năng thận: Do sự hiện hiệu của Carbamylated Hb, HbA1c cóthể thấp do đời sống hồng cầu ngắn lại

- Các nguyên nhân khác: dùng erythropoietin tái tổ hợp, môi trường tăngurea máu, truyền máu

- Các thuốc gây tán huyết có thể làm mức HbA1c hạ thấp: Dapsone,Rabavirin, Sulfonamide

- Các thuốc thay đổi cấu trúc Hb: Hydroxyurea thay đổi HbA thành HbF,dùng thuốc phiện kéo dài có thể l m tăng HbA1c

Ngoài ra có những chênh lệch nhỏ chỉ số HbA1c giữa các phương phápxét nghiệm khác nhau

1.1.6 Kh i lượt về bệnh đ i th o đường

ĐTĐ l do sự thiếu hụt về tác động của insulin ở các tổ chức đích Sựthiếu hụt đó l do tiết insulin hông đầy đủ và/hoặc giảm đáp ứng của tổ chứcđối với insulin, ở một hoặc nhiều hâu trong tác động của nó Rối loạn quátrình tiết insulin và thiếu hụt về tác động của nó thường xảy ra trên một bệnhnhân v thường hó xác định nguyên nhân nào xảy ra trước gây nên tình trạngtăng đường huyết [10]

Những triệu chứng gây nên tình trạng tăng đường huyết bao gồm đáinhiều, uống nhiều, sụt cân, đôi hi ăn nhiều, mờ mắt, rối loạn về sự phát triển

và sức chống đỡ đối với nhiễm khuẩn gây nên nhiều biến chứng (Hình 1.3).

Hình 1.4: Biến chứng của bệnh đ i th o đường.

Năm 2000, theo WHO to n thế giới có ít nhất khoảng 171 triệu người

bị bệnh ĐTĐ tỷ lệ n y tăng rất nhanh, dự đoán tới năm 2030 con số n y tănggấp đôi ( hoảng trên 349 triệu người trên toàn cầu) Bệnh ĐTĐ xảy ra khắpcác châu lục, thường gặp nhất l ĐTĐ týp 2, đặc biệt ở các nước phát triển.Tuy nhiên tỷ lệ bệnh tăng nhanh nhất l các nước thuộc Châu Phi và Châu Á.Năm 2005 ở Mỹ đã có hoảng 20,8 triệu người bị bệnh ĐTĐ Theo Hiệp HộiĐái Tháo Đường Hoa K (ADA), có khoảng 6,2 triệu người hông được chẩnđoán v hoảng 41 triệu người trong nhóm tiền ĐTĐ [3], [12], [23]

Ở Việt Nam, theo tài liệu nghiên cứu thống kê của ba nhóm tác giảnghiên cứu trên ba vùng khác nhau của đất nước v o đầu những năm 90 thế

kỷ trước cho thấy: Ở Hà Nội tỷ lệ ĐTĐ t 15 tuổi trở lên là 1,1%, nội thành1,44% ngoại thành 0,63%, tỷ lệ giảm dung nạp glucose là 1,6% Lê Huy Liệunăm (1991) Ở Thành Phố Hồ Chí Minh theo Mai Thế Trạch năm (1993): Tỷ

lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Thành phố Hồ Chí Minh ở người t 15 tuổi: ở nội thành

2,52 ± 0,4%, tỷ lệ giảm dung nạp glucose là 0,96 ± 0,2% Tại Huế: Theo kếtquả nghiên cứu của Trần Hữu Dàng (1996) tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở người trên 15tuổi là 0,96 ± 0,14%, tỷ lệ giảm dung nạp glucose 1,45 ± 0,17% [12].

1.1.7 Nguy n nhân và cơ chế sinh bệnh ĐTĐ

1.1.7.1 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ týp 1

Vào thời điểm ĐTĐ týp 1 xuất hiện, hầu hết các tế bào bêta trong tuyếntụy đã bị thương tổn Trong quá trình gây thương tổn này, thực chất là mộtquá trình tự miễn dịch, mặc dù t ng chi tiết nhỏ còn đang được thảo luận.Nhiều ý kiến cho rằng, quá trình sinh bệnh được minh họa như sau:

- Bước 1: tính mẫn cảm di truyền (genetic susceptibility) đối với bệnh

1.1.7.2 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ týp 2

ĐTĐ týp 2 l bệnh hông đồng nhất, không phải là một bệnh duy nhất,

mà là một tập hợp các hội chứng khác nhau Bệnh có những bất thường về sựtiết và tác dụng của insulin Dù cho bản chất của sự bất thường l gì cũng đềudẫn đến kháng insulin và giảm tiết insulin, tương tác lẫn nhau trong quá trình

phát triển của bệnh, cuối cùng suy giảm tiết insulin do suy kiệt tế bào bêta làđều tất yếu xảy ra Th m v o đó, một hi đã tăng đường huyết, độc tínhglucose sẽ gây ra thêm sự bất thường về tác động và bài tiết insulin [12].

1.1.8 Chẩn đo n bệnh ĐTĐ

1.1.8.1 Các triệu chứng kinh điển: Ăn nhiều, uống nhiều, đái nhiều và sụt cân

nhiều [3], [10]

1.1.8.2 Một số yếu tố nguy cơ cho chẩn đo n: Béo phì, tiền sử gia đình có

người bị bệnh ĐTĐ, phụ nữ có thai lúc thai nghén, tiền sử đẻ con nặng trên 4kg

1.1.8.3 Dựa vào tiêu chuẩn chẩn đo n của hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ (ADA) năm 2017 thì chúng ta sử dụng 1 trong 4 tiêu chuẩn để chẩn đo n ĐTĐ [7], [12], [23], [42]

- Glucose huyết tương lúc đói (fasting plasma glucose: FPG) ≥ 126mg/dL (hay 7 mmol/L)

- Glucose huyết tương ở thời điểm sau 2 giờ làm nghiệm pháp dungnạp glucose đường uống 75g (oral glucose tolerance test: OGTT) ≥ 200mg/dL (hay 11,1 mmol/L)

- HbA1c ≥ 6,5% (48 mmol/mol) Xét nghiệm này phải được thực hiện

ở phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế

- Ở bệnh nhân có triệu chứng inh điển của tăng glucose huyết hoặcmức glucose huyết tương ở thời điểm bất k ≥ 200 mg/dL (hay 11,1 mmol/L)

Giá trị bình thường của Glucose [12]:

- Huyết tương: 60 - 110 mg/dl hay 3,36 – 6,16 mmol/L

- Máu toàn phần: 60 – 105 mg/dL hay 3,36 – 5,58 mmol/L

- Trẻ sơ sinh: 20 – 80 mg/dL hay 1,12 – 4,48 mmol/L

1.1.8.4 C c phương ph p định lượng HbA1c [2],[30],[36],[40],[41]

Trên thực tế có rất nhiều phương pháp để định lượng HbA1c nhưphương pháp miễn dịch ức chế độ đục (đo quang), sắc ký lỏng cao áp, sắc ký

trao đổi ion, điện di… nhưng hai phương pháp phổ biến nhất l phương phápmiễn dịch đo độ đục (được thực hiện trên các máy sinh hóa tự động đượckiểm soát kết quả theo hướng dẫn của DCCT/NGSP) và sắc ký lỏng trao đổiion (trên các hệ thống được kiểm soát bởi HPLC/IFCC) [39].

- Trong đó phương pháp tr n cơ sở sắc ký lỏng trao đổi ion (HPLC)

ng y nay được khuyến cáo sử dụng vì có tính chọn lọc cao Phương phápHPLC được thực hiện theo nguyên lý: Mẫu máu toàn phần được pha động(dung môi hữu cơ) dẫn qua cột sắc ký chứa pha tĩnh dưới áp suất cao Tùythuộc vào ái lực của chất phân tích mang điện tích khác nhau với pha tĩnh mthời gian lưu lại khác nhau Kết quả được xác định bằng thời gian lưu (thờigian t hi bơm mẫu v o đến khi chất phân tích ra khỏi cột pha tĩnh) v diệntích của pick tạo ra Mỗi chất khác nhau sẽ có thời gian lưu hác nhau vnồng độ khác nhau thì sẽ tạo ra pick có diện tích khác nhau Với kỹ thuật này

sẽ tách ri ng được t ng loại HbA ra v định lượng được nồng độ của chúngmột cách chính xác nhất

- Phương pháp miễn dịch đo độ đục tr n cơ sở kiểm soát bởi DCCTđược thực hiện trên các máy sinh hóa tự động Nguyên lý của phương phápnày dựa trên xét nghiệm miễn dịch ức chế đo độ đục đầu tiên dùng một hóachất để ly giải phá vỡ hồng cầu giải phóng HbA1c Sau đó mẫu thử v đệmR1 (đệm/kháng thể), glycohemoglobin (HbA1c) trong mẫu phản ứng vớikháng thể háng HbA1c để tạo thành các phức hợp kháng nguyên - kháng thểhòa tan Vì vị trí gắn kháng thể đặc hiệu HbA1c chỉ hiện diện một lần trongphân tử HbA1c, sự hình thành các phức hợp không hòa tan không xảy ra

Th m R2 (đệm/polyhapten) và bắt đầu phản ứng các polyhapten phản ứng vớikháng thể háng HbA1c dư để tạo thành phức hợp kháng thể - polyhaptenkhông tan, máy sẽ đo ri ng lẽ hai thành phần là Hb và A1c Kết quả được máytính tỉ lệ A1c trên Hb t đó tính được nồng độ HbA1c [47]

1.2 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG XÉT NGHIỆM

TCVN ISO 9000:2007 định nghĩa: ―Chất lượng là mức độ của một tậphợp các đặc tính vốn có đáp ứng các yêu cầu‖ Khái niệm ―chất lượng‖ được

sử dụng trong mọi lĩnh vực của cuộc sống Đối với phòng xét nghiệm (PXN),chất lượng được Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa l sự chính xác, tincậy và kịp thời của kết quả xét nghiệm

Nếu phòng xét nghiệm cung cấp kết quả không chính xác sẽ gây ra rấtnhiều hậu quả nghiêm trọng gây tổn thất về kinh tế và sức khỏe như:

- Hệ thống quản lý chất lượng (Quality Management System – QMS) làcác hoạt động phối hợp để chỉ đạo và kiểm soát một tổ chức về phương diện chấtlượng Hệ thống quản lý chất lượng bao gồm 12 thành tố thiết yếu, mỗi yếu tốcủa thành tố là một mắt xích quan trọng của hệ thống quản lý chất lượng [9],[11], [17], [45], [50]

Sơ đồ 1.1: Hệ thống tổ chức quản lý chất lượng (CLSI) [44]

- Đảm bảo chất lượng xét nghiệm hay còn gọi là QA (QualityAssurance) là toàn bộ các hoạt động có kế hoạch, có hệ thống đảm bảo chocác yêu cầu cung cấp chất lượng đảm bảo đủ độ tin cậy Đảm bảo chất lượngxét nghiệm li n quan đến nhiều yếu tố như: chính sách, ế hoạch tổ chức, cácquy trình thao tác chuẩn, nhân sự, cơ sở hạ tầng, trang thiết bị, quản lý hồ sơ

1.2.2 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm [6], [9]

Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm được chia thành 3 giaiđoạn:

- Giai đoạn trước xét nghiệm

Đây l giai đoạn thường xảy ra lỗi trong quy trình xét nghiệm, chiếm đến41% Giai đoạn này bao gồm các giai đoạn chuẩn bị cho quá trình xét nghiệm

t khâu thông tin bệnh nhân, điền phiếu biểu mẫu yêu cầu, các giai đoạn thu

thập và xử lý mẫu, vận chuyển và tiếp nhận mẫu cho đến khâu quản lý mẫutrước xét nghiệm, chuẩn bị và bảo quản bệnh phẩm.

- Giai đoạn trong xét nghiệm

Trong giai đoạn n y sai sót thường xảy ra chiếm 4% do kỹ thuật phântích và xử lý kết quả, phương pháp đo của máy móc thiết bị hay do trình độtay nghề, chuyên môn của nhân viên xét nghiệm Những sai sót trong quátrình n y thường gặp ở các đơn vị không thực hiện kiểm soát chất lượng,không có quy trình chuẩn và không tuân thủ các quy trình kiểm tra, bảo trì,bảo dưỡng và hiệu chuẩn máy móc h ng năm

- Giai đoạn sau xét nghiệm

Giai đoạn n y thường gây ra sai sót chiếm 55% trong quá trình xétnghiệm Sau khi hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá, ghi nhận kết quả, lưu

và trả kết quả, bảo quản hồ sơ v bảo quản mẫu bệnh phẩm là việc rất quantrọng Việc bảo quản hồ sơ, lưu giữ và trả kết quả cần nhanh chóng, chínhxác, tránh sai sót và nhầm lẫn gây ảnh hưởng đến chất lượng PXN

1.3 NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG (EQA - External Quality Assessment)

- EQA l phương pháp cho phép so sánh ết quả xét nghiệm của mộtPXN với một nhóm đơn vị các PXN tương đương hoặc PXN chuẩn bênngo i Thông tư 01/2013/TT-BYT của Bộ y tế cũng định nghĩa ―Chương trìnhngoại kiểm là kiểm soát chất lượng, đối chiếu và so sánh kết quả xét nghiệmcủa một phòng xét nghiệm với kết quả của nhiều PXN khác trên cùng mộtmẫu, so sánh kết quả của PXN tham chiếu trong nước hoặc quốc tế nhằmkhông ng ng nâng cao chất lượng xét nghiệm và góp phần cung cấp bằngchứng công nhận PXN đạt tiêu chuẩn quốc gia hoặc tiêu chuẩn quốc tế‖

Hình 1.5: Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm [45]

- EQA thường được tổ chức bởi một đơn vị được giao chức trách ngoạikiểm tra chất lượng, tổ chức này sẽ sản xuất, phân phối mẫu xét nghiệm chocác PXN thành viên cùng tham gia vào hoạt động ngoại kiểm tra, sau đó thuthập kết quả và tiến h nh so sánh, đánh giá ết quả của các thành viên thamgia Kết quả của PXN nào bị sai hoặc nằm ở ngưỡng cảnh báo sẽ được đơn vị

tổ chức thông báo, phân tích nguyên nhân gốc rễ để khắc phục và cải tiến lỗinhằm nâng cao chất lượng [9]

1.3.1 C c phương thức ngoại kiểm tra

Có 3 phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra chất lượng: Thửnghiệm thành thạo (Proficiency testing – PT); Kiểm tra lại/phân tích lại(Rechecking/Retesting) v đánh giá tại chỗ (On – site evaluation)

Sơ đồ 1.2: C c phương thức ngoại kiểm [45]

 Thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing): ISO/IEC Guide 1:1997: ―Thử nghiệm thành thạo là sự so sánh li n PXN được tổ chức thườngxuy n để đánh giá hoạt động của các PXN phân tích cũng như năng lực cán

43-bộ xét nghiệm‖ T một tổ chức Ngoại kiểm sẽ phân phối mẫu ngoại kiểmcho các PXN tham gia Các PXN phân tích mẫu ngoại kiểm và gửi kết quả vềđơn vị triển hai để phân tích thống , đánh giá ết quả thực hiện Sau đó PXNnhận bản phân tích kết quả ngoại kiểm tra t đơn vị triển hai để xem xét vàkhắc phục sai số (nếu có)

 Kiểm tra lại, phân tích lại thường được sử dụng khi tiến hành Ngoạikiểm các tiêu bản trên kính hiển vi của vi khuẩn lao (AFB), và xét nghiệmchẩn đoán nhanh virus HIV Hình thức là PXN lựa chọn mẫu nghiệm phẩmngẫu nhiên gửi đến PXN tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích vàđánh giá lại các kết quả phân tích m PXN đã thực hiện

 Đánh giá tại chỗ tức l đo n đánh giá được thành lập bởi các chuyêngia kỹ thuật, cơ quan có thẩm quyền (Bộ Y tế, Sở Y tế…) hoặc tổ chức được

công nhận của quốc gia (Văn phòng công nhận chất lượng, Trung tâm kiểmchuẩn Xét nghiệm…) sẽ đến đánh giá tại PXN định k hoặc đột xuất Việcđánh giá n y căn cứ vào bảng kiểm, những ti u chí đã được duyệt Bảng kiểm

sẽ khác nhau tùy thuộc v o lĩnh vực của xét nghiệm

Trong 3 phương pháp tr n thì thử nghiệm độ thành thạo được sử dụngphổ biến nhất, các vật liệu (mẫu ngoại kiểm) dùng phân phối cho các PXNphải đảm bảo tính đồng nhất v độ ổn định trong t ng mẫu t giai đoạn sảnxuất, lưu trữ và vận chuyển đến phòng xét nghiệm [6], [9], [33], [48], [49]

1.3.2 Lợi ích của việc thực hiện ngoại kiểm:

Cho phép so sánh việc thực hiện và các kết quả giữa các PXN khác nhau:

- Cung cấp các cảnh báo sớm về lỗi hệ thống li n quan đến sinh phẩmhoặc việc vận hành;

- Đưa ra bằng chứng khách quan về chất lượng xét nghiệm;

- Chỉ ra những lĩnh vực cần cải tiến;

- Xác định nhu cầu đ o tạo

1.3.3 C c bước thực hiện ngoại kiểm

Theo tiêu chuẩn ISO 15189 về chất lượng v năng lực đối với PXN y

tế, PXN bắt buộc phải tham gia ngoại kiểm thích hợp với xét nghiệm và diễngiải các kết quả xét nghiệm PXN phải theo dõi các kết quả đã l m v thựchiện các h nh động khắc phục khi kết quả sai lệch [17]

- Trước khi tham gia ngoại kiểm

PXN lặp kế hoạch tham gia các chương trình ngoại kiểm phù hợp vớidanh mục kỹ thuật đã ban h nh

- Trong khi tham gia ngoại kiểm

Xem tất cả các mẫu ngoại kiểm như mẫu bệnh phẩm trong PXN, thựchiện phân tích mẫu theo hướng dẫn của nhà cung cấp Trong quá trình tham

gia, nếu PXN có bất k thắc mắc nào có thể liên hệ nhà cung cấp để hỗ trợ kịpthời Phân tích kết quả và gửi kết quả phân tích cho nhà cung cấp ngoại kiểm.

- Sau khi kết thúc một chương trình ngoại kiểm

Khi nhận được bản phân tích kết quả ngoại kiểm t các nhà cung cấp, PXNthực hiện h nh động đánh giá các ết quả ngoại kiểm đã thực hiện Dựa vào cáckết quả, PXN sẽ đưa ra hướng khắc phục phù hợp để nâng cao chất lượng

1.3.4 Đặc điểm chính của một chương trình ngoại kiểm.

Các chương trình EQA có thể là miễn phí hoặc thu phí, các chươngtrình EQA miễn phí gồm các chương trình được cung cấp bởi nhà sản xuất đểđảm bảo thiết bị hoạt động đúng v do các chương trình cấp khu vực hoặcquốc gia đối với việc cải tiến chất lượng Một số chương trình l bắt buộctheo luật pháp hoặc theo cơ quan công nhận Chương trình EQA có thể được

tổ chức ở các mức độ khác nhau: vùng, quốc gia, hoặc quốc tế Các kết quảEQA của mỗi PXN được bảo mật v thường chỉ có PXN tham gia và nhàcung cấp EQA được biết Các PXN sẽ được cung cấp một bản kết quả tóm tắtkết quả so sánh giữa các PXN [51]

1.4 TIÊU CHUẨN SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM HbA1c

Tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) 7366:2011 tương ứng với ISO 34:2009quy định rất r ―y u cầu chung về năng lực của nhà sản xuất mẫu chuẩn‖[21] Ngoài ra, nhà sản xuất mẫu chuẩn phải đáp ứng các tiêu chuẩn củaTCVN 17043:2011 (tương ứng ISO/IEC 17043:2010) về ―đánh giá sự phùhợp - yêu cầu chung đối với thử nghiệm thành thạo‖ [18] Trong tiêu chuẩnnày yêu cầu nhà sản xuất bộ mẫu bắt buộc phải đảm bảo tính đồng nhất v độ

ổn định của mẫu, phải thiết lập ti u chí đối với tính đồng nhất v độ ổn địnhphù hợp theo TCVN 9596 (tương ứng ISO/IEC 13528: 2015) về ―phươngpháp thống kê dùng trong thử nghiệm thành thạo bằng so sánh liên phòng thínghiệm‖[16]

1.4.1 Mẫu m u toàn phần chứa HbA1c dùng trong ngoại kiểm

Mẫu ngoại kiểm là mẫu được sử dụng trong các chương trình ngoạikiểm tra chất lượng xét nghiệm, thường là mẫu mù với giá trị ấn định đượcxác định dựa vào sự đồng thuận của các phòng xét nghiệm tham gia

Có 2 loại mẫu là mẫu chuẩn RM (Reference Material) và mẫu chuẩnđược chứng nhận CRM (Certified Reference Material) [15], [21]

- Theo định nghĩa của cơ quan đo lường hợp pháp quốc tế (OIML):Mẫu chuẩn là một vật liệu hay một chất mà một hay nhiều tính chất của chúng

đủ tính đồng nhất và độ ổn định được tạo n n để chuẩn hóa một dụng cụ,đánh giá một phương pháp đo hoặc để xác định giá trị đối với các vật liệu

- Mẫu chuẩn được chứng nhận là mẫu chuẩn được đặc trưng với mộtgiấy chứng nhận cung cấp giá trị của tính chất quy định, độ hông đảm bảo

đo kèm theo và công bố về liên kết chuẩn đo lường

Hiện nay tại Việt Nam chưa có đơn vị n o báo cáo hay công bố về việcsản xuất bộ mẫu chuẩn cho chương trình ngoại iểm HbA1c trong bệnh đáitháo đường, vì vậy trong nghi n cứu n y chúng tôi xây dựng quy trình sảnxuất mẫu máu to n phần chứa HbA1c dùng trong ngoại kiểm, kiểm soát chấtlượng xét nghiệm HbA1c, bộ mẫu n y sử dụng nguyên liệu sản xuất t cácmẫu máu to n phần chứa nồng độ HbA1c t người bình thường v người mắcbệnh đái tháo đường Việc sản xuất này bắt nguồn t những khuyến cáo của

tổ chức y tế thế giới (WHO) và hiệp hội đái tháo đường Hoa K (ADA), đưaxét nghiệm HbA1c vào xét nghiệm thường quy để chẩn đoán bệnh đái tháođường bên cạnh đó hiệp hội cũng y u cầu phải kiểm soát hệ thống đo kết quảHbA1c với điều kiện các hệ thống trả kết quả phải được ngoại kiểm tra chấtlượng chặt chẽ [42]

1.4.2 Đ nh gi tính đồng nhất

Việc đánh giá tính đồng nhất luôn đòi hỏi nhà sản xuất phải thiết lậptính đồng nhất của mẫu chuẩn đối với xét nghiệm định lượng HbA1c Địnhnghĩa mẫu chuẩn đủ đồng nhất được yêu cầu trong TCVN 9596: 2013 Nhàsản xuất mẫu chuẩn phải tiến h nh đánh giá tính đồng nhất của mẫu chuẩntrong quá trình thực hiện và thực hiện sau khi mẫu chuẩn đã được đóng gói ởdạng cuối cùng Việc thực hiện bao gồm lấy mẫu thuận tiện và thực hiện cácphép phân tích để chứng minh vật liệu l đủ đồng nhất Nếu mẫu chuẩn đượcsản xuất trong các lô khác nhau thì cần kiểm tra tính tương đương của t ng lô[16]

1.4.3 Đ nh gi độ ổn định

Việc đánh giá độ ổn định luôn yêu cầu phải thiết lập độ ổn định củamẫu chuẩn phải phù hợp với mục đích của nhà sản xuất là xét nghiệm địnhlượng HbA1c phải đạt được yêu cầu trong TCVN 8245: 2009; TCVN 9596:

2013 Khi đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn, nhà sản xuất phải tiến hànhthử nghiệm, hiệu chuẩn, đo lường, lấy mẫu hoặc các hoạt động để đánh giá độ

ổn định Trong quá trình đánh giá độ ổn định phải đánh giá cả trong điều kiệnvận chuyển và chọn thời điểm đánh giá phù hợp để xác nhận tất cả các mẫu

đủ ổn định khi sản xuất đến khi triển hai chương trình ngoại kiểm [15],[ 21]

1.4.4 Nghi n cứu tính đồng nhất

- Kh i niệm tính đồng nhất

Về mặt lý thuyết, một vật liệu được xem l ho n to n đồng nhất với đặctrưng đã cho nếu hông có sự hác biệt n o giữa những giá trị trong t ng cáthể với nhau Tuy nhi n trong thực tế, một vật liệu được chấp nhận l đồngnhất hi những giá trị giữa những cá thể có sự hác biệt hông đáng ể hi sosánh với các mẫu thử được sản xuất [21]

- Thiết kế thực nghiệm

Đối với việc nghi n cứu tính đồng nhất, TCVN 9596: 2013 quy định

hi đánh giá tính đồng nhất phải chọn 10 mẫu tối thiểu hoặc 10% số lượngmẫu được chọn ngẫu nhi n t các lô Tất cả các mẫu đã lựa chọn tiến h nhthử nghiệm 2 lần lặp lại cho t ng xét nghiệm [16]

Có 2 dạng ổn định được xem xét trong chứng nhận mẫu chuẩn:

+ Độ ổn định d i hạn của vật liệu tại nơi lưu trữ của nh sản xuất,thường l thời hạn sử dụng của vật liệu

+ Độ ổn định ngắn hạn èm theo mọi tác động đặc biệt do vận chuyểnmẫu (có thể l điều iện vận chuyển giả định) [16], [21]

- Thiết kế thực nghiệm

Có 2 phương thức cơ bản trong nghi n cứu độ ổn định

+ Nghi n cứu độ ổn định cổ điển tức là các mẫu ri ng biệt được chuẩn

bị cùng một điều iện giống nhau v được đo theo thời gian

+ Nghi n cứu độ ổn định đẳng thời đánh giá các mẫu chuẩn đồng thờitrong những điều iện lặp lại

Khi nghi n cứu độ ổn định thường mất thời gian 2 tháng, TCVN 9596:

2013 quy định phải chọn 3 mẫu tối thiểu một cách ngẫu nhi n trong t ng lôđược sản xuất theo t ng thời điểm v tiến h nh thử nghiệm 2 lần lặp lại đốivới t ng tính chất, ết quả thu được sẽ so sánh với tính chất trước hi đượcbảo quản [16]

1.4.6 C c vật liệu mẫu kiểm chuẩn dùng trong xét nghiệm HbA1c [28]

Loại vật liệu được sản xuất dùng trong xét nghiệm ngoại iểm HbA1c

là mẫu máu to n phần Mẫu máu to n phần được thu thập t nhiều nguồnkhác nhau cụ thể l thu thập t người tình nguyện, t mẫu máu của bệnh nhânsau hi thực hiện xét nghiệm chẩn đoán bệnh v mẫu máu thu thập t cáctrung tâm truyền máu huyết học Tr n thế giới việc sản xuất mẫu ngoại iểmphần lớn họ sử dụng máu tòa phần như nghi n cứu ở Ý của Mosca A vàWeykamp C (2014) [34], sử dụng máu toàn phần t người tình nguyện viênbình thường và bệnh đái tháo đường được thực hiện ở Đức, Bỉ, H Lan đượcthực hiện bởi Kaiser P (2016) [29], quy trình thực hiện của họ bước đầu tiênkêu gọi tình nguyện viên sau khi các tình nguyện vi n đăng ý tham gia họ đã

tư vấn về lợi ích của việc tham gia của chương trình, bước tiếp theo họ làmxét nghiệm thử nghiệm để phân loại người bình thường v người bệnh đáitháo đường với nồng độ HbA1c phù hợp với chương trình đã đề ra ban đầu vàcuối cùng họ sẽ có lịch hẹn giờ v địa điểm cụ thể để cho tình nguyện viênđến nơi đúng theo hướng dẫn họ tiến hành lấy máu để thực hiện chương trìnhngoại kiểm

Do bộ mẫu ngoại iểm được gửi đến nhiều đơn vị phòng xét nghiệmtham gia phân tích sau đó gửi ết quả phân tích về trung tâm iểm chuẩn chấtlượng xét nghiệm thống , đánh giá thông qua so sánh ết quả li n phòng, vìvậy mẫu ngoại iểm phải đạt được các y u cầu sau:

- Mẫu máu to n phần dùng trong ngoại iểm được xác định đặc tính rràng không có các yếu tố nguy cơ gây nhiễm: HIV, HCV, HBsAg

- Mẫu được chứa trong các ống có nắp đậy ín, hông bị rò rỉ trong vậnchuyển cũng như hi bảo quản

- Mẫu máu to n phần trong ngoại iểm phải chứa nồng độ HbA1c đạt

ti u chuẩn chọn mẫu ban đầu trong sản xuất

- Bộ mẫu máu to n phần ngoại iểm HbA1c đạt đồng thời hai ti u chíđánh giá chất lượng l tính đồng nhất v độ ổn định trong hoảng thời giannhất định.

1.4.6 C c phương ph p sản xuất bộ mẫu m u toàn phần chứa nồng độ HbA1c dùng trong ngoại kiểm

Hiện nay mẫu ngoại iểm chứa HbA1c ở Việt Nam chưa có công bố vềviệc sản xuất loại mẫu ngoại kiểm cho đến thời điểm hiện tại, phần lớn các cơ

sở ngoại kiểm đều mua mẫu t nước ngoài với giá thành rất cao điều kiện bảoquản và chất lượng mẫu cũng bị ảnh hưởng đáng ể, mặc khác theo chỉ đạocủa chính phủ tiến tới liên thông kết quả xét nghiệm trên phạm vi toàn quốcnăm 2025 [1], các phòng xét nghiệm phải có sự kiểm soát chất lượng xétnghiệm thông qua đánh giá độ thành thạo liên phòng T những yêu cầu trênviệc sản xuất bộ mẫu ngoại kiểm HbA1c trong giai đoạn này là rất cần thiết.Căn cứ vào TCVN 8245 và TCVN 9595 và các nghiên cứu của thế giới chúngtôi nghiên cứu quy trình sản xuất bộ mẫu máu toàn phần dùng ngoại kiểmHbA1c với đa dạng mẫu khác nhau như đông hô, đông lạnh mẫu máu toànphần hoặc sử dụng máu toàn phần không qua lưu trữ dùng trong ngoại kiểmnhư nghi n cứu của Kaiser P và các cộng sự (2016) [29] Trong nghi n cứunày chúng tôi tiến hành sản xuất bộ mẫu ngoại iểm theo hai phương phápđông hô [8], [14] v đông lạnh mẫu máu toàn phần [25],[ 28], tuy nhiên việcđông hô mẫu máu toàn phần đòi hỏi phải có thiết bị đông hô chuy n dụng

và cần phải cân đo thể tích mẫu ban đầu khi chia nhỏ thật chính xác để thuậnlợi cho việc hoàn nguy n sau n y đảm bảo nồng độ mẫu không chênh lệnhđáng ể, giúp cho việc đánh giá, bảo quản, phân phối mẫu đến PXN phân tích

an toàn thuận lợi

1.4.6.1 Kỹ thuật đ ng kh mẫu máu tòan phần

Phương pháp đông hô được áp dụng trong sản xuất mẫu chuẩn ngoạikiểm sẽ giúp cho mẫu sau hi đông hô hông bị thay đổi tính chất v nồng

độ HbA1c sau khi hoàn nguyên, t nguồn nguyên liệu ban đầu máu toàn phầnsau hi đã được trộn đều không bị tán huyết sau đó chia nhỏ thể tích 1ml máutoàn phần vào tube chứa mẫu

1.4.6.2 Gi trị của mẫu đ ng kh

Mẫu đông hô có giá trị l m ổn định chất lượng của sản phẩm tươi, sứcsống của sản phẩm éo d i, vận chuyển v bảo quản dễ d ng hơn Đông hôđược sử dụng trong nhiều lĩnh vực như bảo quản vacxin, sinh phẩm, protein,máu, huyết tương v các sản phẩm của huyết tương, các tổ chức mô, xương,vitamin, enzyme, các mẫu bệnh phẩm khác [8],[ 14],[ 38]

1.4.6.3 Nguy n lý hoạt động của quy trình đ ng kh

Nguy n lý của quá trình đông hô l nguy n liệu được đông lạnh độtngột tại điểm chuyển thể, khiến nước t thể lỏng sang thể rắn, rồi qua xử lýchân hông thăng hoa th nh thể hơi rồi ngưng tụ th nh nước rồi thải ra ngoài.Theo nguyên lý này, sản phẩm được l m đông hô vẫn giữ nguyên hình thái,khi hoàn nguyên bằng nước cất hoặc dung dịch thích hợp thì sản phẩm sẽ trởlại trạng thái ban đầu

Qu trình đ ng kh trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Trong giai đoạn n y sản phẩm được l m lạnh t nhiệt độmôi trường khoảng 20o

C giảm xuống nhiệt độ -10oC đến -51o

C hay còn gọi làgiai đoạn cấp đông, đồng thời trong giai đoạn n y bình thăng hoa được hútchân hông n n áp suất hơi nước trong bình giảm so với trong lòng vật liệudẫn tới hiện tượng thoát ẩm trong lòng vật liệu Kết thúc giai đoạn n ykhoảng 10% – 15% nước thoát ra hỏi sản phẩm

Giai đoạn 2: hay còn gọi l giai đoạn thăng hoa, trong giai đoạn nàynhờ dòng nhiệt chủ yếu là các bức xạ t các tấm bức xạ, nước trong sản phẩmsấy bắt đầu thăng hoa Độ ẩm của sản phẩm sấy giảm rất nhanh, giai đoạn này

có tốc độ và nhiệt độ sấy hông đổi Cuối giai đoạn n y, nhiệt độ sản phẩmsấy mới dần tăng t -10oC đến -40oC l n đến 0oC Đến đây quá trình thănghoa kết thúc Hiệu quả đông hô ở giai đoạn n y đạt được t 95 - 97%

Giai đoạn 3: hay còn gọi l bốc hơi ẩm còn lại: trong giai đoạn n y ápsuất trong bình thăng hoa vẫn duy trì áp suất thấp ~18Pa so với bên ngoài nhờbơm chân hông v sản phẩm vẫn tiếp tục được gia nhiệt, nước vẫn tiếp tục tthể lỏng sang thể hơi v đi v o bình thăng hoa, giai đoạn bốc hơi ẩm còn lạichính là quá trình sấy chân hông bình thường, kết thúc quá trình đông hôsản phẩm Hiệu quả đông hô ở giai đoạn n y đạt tới 99% (độ ẩm còn lại l1% đến < 2%)

Hình 1.6: Thiết bị đ ng kh mẫu EYELA FDU-2100

1.5 TÌNH HÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.5.1 Tình hình ngoại kiểm hóa sinh tr n thế giới

Các chương trình ngoại kiểm đã bắt đầu t nhiều thập kỷ trước ở trênthế giới Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng được triển khai rộng rãi trêncác lĩnh vực: Sinh hóa, huyết học, vi sinh, ý sinh trùng… Đến cả lĩnh vựckhó triển khai ngoại kiểm như giải phẫu bệnh cũng đã bắt đầu triển khai vàonăm 2017 Chương trình ngoại kiểm hóa sinh là một trong các lĩnh vực bắtđầu triển khai khá sớm v o năm 1969 tại Anh [26] với 650 phòng xét nghiệmtham gia và triển khai 20-35 chỉ ti u Năm 1988, các nước Trung đông đã tiếnhành ngoại kiểm tra chất lượng hóa sinh được 7 năm, mẫu ngoại kiểm đượcphân phối t nước Anh v có 88 đơn vị tham gia ngoại kiểm V đến nay thìchương trình ngoại kiểm hóa sinh đã phổ biến khắp các nước trên thế giới vàtriển khai rộng rãi các chỉ số hóa sinh [24] Các mẫu ngoại kiểm hóa sinh banđầu chỉ có khoảng 24 chỉ số hóa sinh đến nay đã l n đến hơn 100 chỉ số Một

số đơn vị triển khai ngoại kiểm và cung cấp mẫu ngoại kiểm hóa sinh trên thếgiới được biết đến như l Randox (Anh), CLIA (Mỹ), RCPA (Úc) và CMPT(Canada)…

1.5.2 Tình hình ngoại kiểm hóa sinh trong nước

Ở Việt Nam, việc thực hiện các chương trình ngoại kiểm tra chất lượngxét nghiệm được biết đến khá muộn so với thế giới Theo nghiên cứu của VũQuang Huy 2008 [19] kết quả nghiên cứu chỉ có 56 PXN tham gia chươngtrình ngoại kiểm Nghiên cứu khác của Nguyễn Văn Thắng, Vũ Quang Huy

và cộng sự 2014 [20], đánh giá 86 PXN tham gia chương trình ngoại kiểmHóa sinh – Miễn dịch chương trình hợp tác với Australia tại Trung Tâm KiểmChuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh.Kết quả PXN đạt chiếm tỷ lệ t 45,0 - 70,3%, hông đạt t 19,6 - 57,1%; kết

quả t 40,4% năm 2012 l n 53,3% năm 2013 v 78,6% trong năm 2014; ếtquả sai lệch giảm t 37,0% năm 2012 xuống 22,7% năm 2013 v còn 9,0%năm 2014 [20] Theo thống kê của Vũ Quang Huy v cộng sự 2016, đánh giákết quả thực hiện 19 chương trình ngoại kiểm cho thấy tỉ lệ các đơn vị thamgia ngoại kiểm cao nhất là Sinh hóa 95,7% [4].

1.5.3 Tình hình ngoại kiểm HbA1c

- Hiện nay ở Việt Nam chương trình ngoại kiểm HbA1c đã được triểnhai v đây cũng l thông số được Bộ y tế liệt kê vào nhóm danh mục đượcliên thông xét nghiệm theo quyết định 3148/QĐ-BYT ng y 07 tháng 7 năm

2017, mặt khác vì HbA1c còn rất mới mẽ, mẫu ngoại kiểm hầu hết mua tnước ngoài giá thành rất cao n n các đơn vị tham gia còn hạn chế Cho đếnthời điểm hiện tại ở Việt Nam chưa có báo cáo hay công bố công trình nàosản xuất bộ mẫu ngoại kiểm HbA1c Hiện tại Trung Tâm Kiểm Chuẩn ChấtLượng Xét Nghiệm Y Học Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh đơn vị n y đãtriển khai nghiên cứu sản xuất bộ mẫu Ngoại kiểm HbA1c để phục vụ trongngoại kiểm đây l bước tiến mới nó mở ra cánh cửa cho việc cung cấp mẫungoại kiểm ở Việt Nam với giá thành phù hợp hơn trong bối cảnh hiện nay

- So với các nước trên thế giới ngoại kiểm HbA1c đã phát triển khásớm theo nghiên cứu của Wey amp C W v Penders T J (1993) đã sử dụngmáu toàn phần để sản xuất mẫu ngoại kiểm ở Hà Lan mẫu đã gởi đến 101phòng xét nghiệm tham gia thực hiện với 2 nồng độ thấp và nồng độ cao [40],còn ở nghiên cứu của Mosca A và Weykamp C (2014) [34]; Kaiser P vàSpannagl M (2016) [29] đã sử dụng máu toàn phần lấy t tình nguyện viênmẫu máu hông qua lưu trữ để dùng trong ngoại kiểm HbA1c tại Đức, Bỉ và

Hà Lan ngoài ra với hình thức mẫu máu như vậy ở Mỹ, Thụy Điển, Na Uy vàChâu Á cũng thực hiện rất thành công

Ngoài ra tổ chức EQA ở Đức (INSTAND), Bỉ (WIV / IPV) và Hà Lan(SKML) đã tổ chức một chương trình với các mẫu có thể thay đổi và cácgiá trị đích được gán với Li n đo n Hóa học lâm sàng quốc tế (IFCC) hệthống tham khảo tối ưu hiện nay Kết quả tổng hợp được đánh giá theo môhình IFCC qua bốn cấp độ: tổng thể, mỗi quốc gia, mỗi nhà sản xuất và mỗiquốc gia cho mỗi nhà sản xuất Mục đích của dự án n y l để xác nhận tínhkhả thi của dự án EQA ở ba quốc gia, một chương trình EQA dựa tr n độ chínhxác với máu toàn phần, để kiểm tra đánh giá quá trình thực hiện định lượngHbA1c xét nghiệm trong và trên toàn quốc gia và nhà sản xuất, để xem xétcác giới hạn chấp nhận EQA [29].

- Trong trường hợp hemoglobin glycated (HbA1c), các chương trìnhEQAS có sẵn trên thế giới, nhưng rất hó để so sánh các thao tác kỹ thuật của

họ với nhau Trong các PXN đủ điều kiện, một hệ thống chất lượng gồm banguyên tắc cơ bản được đưa ra: công nhận cho Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc

tế ISO 15189, QC nội bộ và EQA [54] Đối với kiểm soát nội bộ, hai mẫukiểm soát (với mức thấp và cao về nồng độ HbA1c) Các mẫu máu toàn phầnđông lạnh và đông hô được sử dụng trong ngoại kiểm Việc tham gia chươngtrình EQA hoặc đánh giá độ thành thạo mang lại giá trị thông tin b n ngo i đểquản lý chất lượng của thử nghiệm HbA1c Mẫu máu toàn phần đã được sửdụng thành công trong các thử nghiệm thành thạo khác nhau và EQAS ở Hoa

K , Châu Á, Thụy Điển, Hà Lan và Na Uy [39]