ứng dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả năng đối kháng bệnh héo xanh cà chua do vi khuẩn ralstonia solanacearum của một số chủng vi sinh vật đối kháng

TRẦN QUANG MINH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

………… o0o…………

TRẦN QUANG MINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT

SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

………… o0o…………

TRẦN QUANG MINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÀ CHUA DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM CỦA MỘT

SỐ CHỦNG VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo và các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam luôn quan tâm, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn

và kính trọng sâu sắc tới TS Lê Như Kiểu – Trưởng bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hóa đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình thực tập

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô chú và các anh chị trong bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hóa đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ADN Axít deoxyribonucleic

AO Acridine da cam

ARN Axít ribonucleic

Bp Base pair (cặp bazơ)

rARN ARN riboxom

Chc Các bon hữu cơ

CFU Colony forming unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1 Đặc tính sinh lý sinh hoá chính của vi khuẩn R.solanacearum 8 Bảng 2 Đánh giá độc tính vi khuẩn Ralstonia solanacearum 26 Bảng 3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập

Bảng 12 Tác động của một số thể đột biến lên bệnh héo xanh cà chua

trong điều kiện nhà kính

57

Bảng 13 Ảnh hưởng của một số thể đột biến đến khả năng sinh 58

trưởng và phát triển của cây cà chua giống HT7 khi 2 tuần

tuổi

Bảng 14 Kết quả thử độc tính của chế phẩm đối kháng trên chuột 59 Bảng 15 Kết quả xử lý thống kê trọng lượng chuột thí nghiệm 60 Bảng 16 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến mật độ và

hoạt tính sinh học của hai thể đột biến

63

Bảng 17 Ảnh hưởng nhệt độ môi trường lên men đến mật độ và

hoạt tính sinh học của hai thể đột biến

67

Bảng 18: Ảnh hưởng độ pH môi trường lên men đến mật độ và hoạt

tính sinh học của hai thể đột biến

67

Bảng 19 Mật độ vi khuẩn đột biến trên nền chất mang khác nhau

sau 6 tháng lưu giữ bảo quản

67

Bảng 22 Kích thước vòng đối kháng của các thể đột biến trong chế

phẩm

71

Bảng 23 Một số tính chất hóa học và sinh học đất thí nghiệm

(Mê Linh- Hà Nội)

73

Bảng 24 Khả năng phòng chống bệnh héo xanh cà chua của thể đột

biến trên ruộng trồng tại xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà

Nội

74

Bảng 25 Ảnh hưởng của chế phẩm vi khuẩn đột biến đến năng suất

cà chua tại xã Tiền Phong- Mê Linh- Hà Nội

76

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cây cà chua bị bệnh héo xanh do R Solanacearum 39

Hình 2 Biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn ở lát

cắt dọc đoạn thân cây cà chua

40

Hình 3 Một số hình thái khuẩn lạc đại diện cho vi khuẩn

gây bệnh héo xanh cà chua

Hình 7 Khả năng phòng trừ bệnh héo xanh của một số thể đột biến

trong điều kiện nhà lưới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i

MỤC LỤC

Trang

1.1 Tình hình gieo trồng cà chua ở Việt Nam và trên thế giới 4

1.3 Mức độ phổ biến và gây hại của R solanacearum 5

1.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn R solanacearum 8

1.5 Các con đường xâm nhiễm của vi khuẩn R solanacearum 11 1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi

1.8.3 Sử dụng tác nhân vi sinh vật trong phòng bệnh hại thực vật 15

1.9.2 Gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân vật lý 17

1.9.3 Gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân hoá học 17

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii

1.13.1 Một số thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật bằng phương

pháp đột biến trên thế giới và ở Việt Nam

22

2.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng Ralstonia solanacearum gây

bệnh héo xanh cà chua

25

2.2.1.1 Thu mẫu và phân lập vi khuẩn gây bệnh 25

2.2.1.2 Đánh giá tính độc của R solanacearum 26

2.2.1.3 Nhận dạng vi khuẩn R solanacearum bằng kỹ thuật PCR 27 2.2.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối

2.2.3.1 Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa 32

2.2.3.2 Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp tự gen

phần tử 16S rARN

34

2.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh héo xanh

cà chua của chế phẩm vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới quy mô

3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo

xanh cà chua

39

3.1.1 Thu mẫu, phân lập và tuyển chọn vi khuẩn gây bệnh 39

3.1.2 Thử nghiệm tính độc của các chủng R solanacearum 42

3.1.3 Nhận dạng vi khuẩn R solanacearum bằng kỹ thuật PCR 42

3.2 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với R

solanacearum từ mẫu cây và đất trồng cà chua

43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii

3.2.2 Đánh giá hoạt lực đối kháng của các chủng vi khuẩn 45 3.3 Nghiên cứu các hoạt tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh

vật đối kháng

47

3.3.2 Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp giải trình tự

gen phần tử 16S rARN

48

3.4 Xử lý đột biến và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính đối

kháng cao nhất với vi khuẩn R Solanacearum gây bệnh héo xanh

bằng phương pháp đột biến

50

3.4.1 Xử lý đột biến và tuyển chọn các thể đột biến 50 3.5 Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh cà chua của một số

3.6 Đánh giá tính an toàn của các chủng vi sinh vật đối kháng 58 3.7 Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh vật đột biến phòng trừ

bệnh héo xanh cà chua

61

3.7.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường sản xuất 62

3.7.4 Một số yếu tố chính ảnh hưởng quá trình lên men thu sinh khối 64

3.7.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men vi khuẩn đột

biến

64

3.7.4.2 Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men vi khuẩn đột biến 65

3.7.4.4 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn đột biến 70

3.7.4.5 Đánh giá hoạt tính đối kháng của các chế phẩm đột biến

trong thời gian bảo quản

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong thực tế ngành nông nghiệp ở các nước trên thế giới nói chung

và ở Việt Nam nói riêng gặp rất nhiều khó khăn về một số bệnh nghiêm

trọng, trong đó đặc biệt là bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây

ra Đây là một trong những loại bệnh cây trồng thuộc đối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ tổng hợp của FAO [41]

Ở nước ta bệnh héo rũ do vi khuẩn đã phát sinh ở hầu hết các địa phương có trồng các cây như: cà chua, vừng, lạc, thuốc lá, khoai tây, ở các tỉnh, thành phố: Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thái Nguyên, Thanh Hoá, Nghệ An có nơi có lúc bệnh đã gây thiệt hại nặng tới mức gây chết 100% cây trồng [1,3, 10, 11, 13] Nhưng cho tới nay, những nghiên cứu về bệnh héo rũ vi khuẩn trên cây trồng chưa nhiều và chưa sâu, chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân bố của bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn một số giống cây trồng hiện có

Đã có nhiều nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng để ứng dụng trong phòng trừ bệnh héo này Song mới chỉ dừng ở mức độ phân lập

và tuyển chọn được chủng vi khuẩn đối kháng dạng dại

Mặc dù phòng trừ bệnh héo xanh bằng các chế phẩm sinh học đang là mối quan tâm của nhiều cơ quan nghiên cứu trong nước, nhưng cho đến nay chưa có sản phẩm nào có hiệu quả phòng trừ cao và nếu có chỉ có tác dụng trên một đối tượng cây trồng nhất định Lý do chủ yếu là do hạn chế về Khoa học và công nghệ Do vậy việc ứng dụng các kỹ thuật đột biến rất có triển vọng tạo ra được các chủng vi sinh vật mới có tính đối kháng cao hơn, phổ đối kháng rộng hơn chủng gốc phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học là rất cần thiết và cấp bách Xuất phát từ những lý do và đòi hỏi nêu trên,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả năng đối kháng bệnh héo xanh cà chua do vi

khuẩn Ralstonia solanacearum của một số chủng vi sinh vật đối kháng”

2 Cơ sở khoa học của đề tài

- Trước tình hình thực tế bệnh héo xanh một số cây trồng ở Việt Nam

và trên thế giới, cần phải có nghiên cứu cơ bản và hiệu quả để có những kết

quả chính xác và khoa học về loài vi khuẩn R.solanacearum;

- Dựa vào kết quả nhiên cứu, phương pháp phân lập, nhận dạng và đặc

trưng loài R.solanacearum của các nhà tiên phong trong lĩnh vực nghiên cứu

loài vi khuẩn này;

- Trong chiến lược phòng chống bệnh héo xanh một cây trồng bằng biện pháp sinh học, các nghiên cứu ở nước ngoài trước hết thường bắt đầu từ tìm kiếm những vi sinh vật đối kháng dễ kiểm soát mà không gây bệnh cho người, gia súc, thực vật;

- Ở Việt Nam một số tác giả cũng đó tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng các vi sinh vật (VSV) trong phòng trừ bệnh héo xanh một số cây trồng;

- Dựa vào khả sinh kháng sinh, một số chất hữu cơ hoặc khả năng cạnh tranh các vi chất trong môi trường của một số loài vi khuẩn, dẫn đến chúng

có khả năng kìm hãm sinh trưởng và phát triển những loài vi khuẩn khác

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

-Cung cấp thêm số liệu, thông tin về bệnh héo xanh vi khuẩn cà chua;

- Xác định được những chủng R.solanacearum đang phổ biến ở một số

địa phương và độc tính của chúng, để có thể sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo về loài vi khuẩn này;

- Phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng

cao với R.solanacearum để sử dụng trong phòng chống bệnh héo xanh;

- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng có hoạt tính sinh học cao,

ổn định trong thời gian dài bằng phương pháp đột biến phục vụ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng;

4 Mục tiêu của đề tài

- Phân lập, tuyển chọn, lưu giữ và ứng dụng các chủng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh héo xanh cà chua;

- Sử dụng phương pháp đột biến nhằm tăng cường khả năng đối kháng bệnh héo xanh cây trồng của một số chủng vi sinh vật đối kháng;

- Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh héo xanh của chế phẩm vi sinh đối kháng đột biến phòng chống bệnh héo xanh cà chua ở phạm vi phòng thí nghiệm, nhà lướivà đồng ruộng quy mô nhỏ;

5 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập và tuyển chọn một bộ sưu tập đa dạng các chủng vi khuẩn

R.solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua;

2 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng (VKĐK) với

R.solanacearum từ những mẫu đất và mẫu cây cà chua;

3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng VKĐK;

4 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính đối kháng cao nhất với vi

khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo xanh bằng phương pháp đột biến;

5.Đánh giá khả năng phòng chống bệnh héo xanh cà chua của chế phẩm vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới quy mô nhỏ

6 Đánh giá tính an toàn của các chủng vi sinh vật đối kháng;

7 Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh vật đột biến phòng trừ bệnh héo

xanh cà chua;

8 Đánh giá hoạt tính đối kháng của chế phẩm trong điều kiện ngoài đồng

ruộng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình gieo trồng cà chua ở Việt Nam và trên thế giới

Cà chua được trồng rất phổ biến ở nước ta, những năm gần đây diện tích trồng cà chua vào khoảng 10000 - 12000 ha mỗi năm Cà chua được trồng chính vụ vào tháng 10 hàng năm và thu hoạch đến hết tháng 2 năm sau, nhưng thường có vụ sớm và vụ muộn Vụ sớm được trồng vào tháng 8 hàng năm còn vụ muộn vào tháng giêng năm sau ở miền Bắc cà chua được trồng chủ yếu ở những vùng ven đô và những vùng trọng điểm canh tác rau màu của một số tỉnh, thành phố như: Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Vĩnh Phúc Hơn 70% sản lượng (khoảng

80000 tấn) được thu hoạch trong vụ đông xuân (tháng 12 năm trước đến tháng 3 năm sau)

Theo số liệu của FAO năm 1999, trên thế giới hiện có 158 nước trồng

cà chua với tổng diện tích khoảng 3,594 triệu ha, đứng đầu trong các loại rau, năng suất trung bình là 25,4 tấn/ha và sản lượng hàng năm xấp xỉ 91,29 triệu tấn quả Châu Á là khu vực trồng cà chua nhiều nhất: 1,19  1,22 triệu

ha và cũng là nơi có sản lượng cao nhất: 26,7  28,5 triệu tấn Các nước có diện tích trồng cà chua lớn như: Trung Quốc: 339300 ha, Ai Cập: 140000

ha, Philippn: 16500 ha, Thái Lan: 12000 ha Nhìn chung diện tích trồng cà chua ở Việt Nam và trên thế giới là rất lớn

1.2 Bệnh héo xanh cà chua

Bệnh héo xanh cà chua là do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra,

là một loại bệnh có nguồn gốc từ đất, phổ biến nhất ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và nhiệt độ ấm trên thế giới [52, 55, 58]

Biểu hiện đầu tiên của bệnh có thể quan sát thấy đó là những lá non ở phần ngọn của cây bị héo trước tiên và dần dần rủ xuống Sau đó phần bị héo chuyển dần xuống phía dưới gốc cây (phần lớn các trường hợp thấy những nhánh cây có biểu hiện héo trước) Những triệu chứng điển hình như trên thường gặp ở những cây đang vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh nhất, đó là thời kỳ cây bắt đầu ra hoa, kết quả Hiện tượng này phổ biến đến mức làm cho nhiều nhà nghiên cứu thường băn khoăn tự hỏi, phải chăng có sự biến đổi sinh lý sâu sắc trong cây ở giai đoạn này nên khiến cho cây dễ bị nhiễm và phát bệnh

Năm 1965, Kelman và Sequeira đã tìm ra được một số cơ chế phát sinh của bệnh Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản bào và mạch gỗ của cây, nó khác biệt với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa và gây khối u [54]

1.3 Mức độ phổ biến và gây hại của R solanacearum

Ngày nay, R.solanacearum được ghi nhận là vi khuẩn gây hại cây trồng

ở hầu hết các châu lục, phổ biến là ở các nước Angola, Trung Quốc, Bangladesh, Ấn Độ, Indonesia, Srilanka, Ethiopia, Lybia, Kenya, Hoa Kỳ, Việt Nam, Zambia [1, 10, 30, 34] Ở Việt Nam, bệnh héo xanh cà chua do vi

khuẩn R.solanacearum gây ra là một trong những bệnh gây hại phổ biến làm

chết héo hàng loạt cây cà chua trên đồng ruộng, nhất là ở vùng đồng bằng sông Hồng Bệnh được ghi nhận trên cà chua, khoai tây, thuốc lá, lạc, vừng, gừng, ớt [5, 16, 17, 18]… Ở Indonesia, bệnh được phát hiện đầu tiên trên lạc vào năm 1905 ở vùng Cirebo Thiệt hại do bệnh gây ra có thể từ 15 – 90 % năng suất [30, 46] Ở Đài Loan bệnh được gây hại trên cà chua, khoai tây, thuốc là, ớt, lạc… trên nhiều loại cây trồng sự thiệt hại do bệnh gây ra có thể

từ 5 – 100 % năng suất [40]

1.4 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.4.1 Hình thái và phân loại

Tế bào loài R.solanacearum có hình oval ngắn, gram âm, tròn ở hai đầu,

thường thấy ở dạng đơn, ghép đôi hoặc ghép 4, nhưng ít khi kết thành chuỗi Tuy có sự dao động đáng kể nhưng kích thước của chúng khoảng 0,5 - 1,0 µm  1,5 – 5,0 µm (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1994) Hầu như chúng luôn chuyển động, có một đến vài tiên mao ở một cực của tế bào, bề mặt khuẩn lạc thường nhẵn, đôi khi gồ ghề, chảy hoặc không chảy, màu trắng đục hoặc phớt hồng, hoặc trắng Cả chủng có tính độc cao và tính độc thấp đều có các lông nhỏ ở rìa [18, 53 ]

Vị trí phân loại của R solanacearum được sắp sếp như sau: Proteobacteria- Proteobacteria- Burkholderiales- Burkholderiaceae-Ralstonia solanacearum

Bacteria-Trong gần 30 năm qua, một hệ thống phân loại theo hai xu hướng đã được sử dụng, nó phản ánh những hướng tiếp cận thật khác biệt để giải quyết vấn đề phân loại dưới loài

- Xu hướng thứ nhất, đề cao ái lực giữa vi khuẩn với cây chủ và xác lập ra các nòi “race”

- Xu hướng thứ hai, khai thác các đặc điểm sinh hoá đã được lựa chọn

kỹ, làm cơ sở để phân biệt thành các chủng sinh học (biovar)

“Chủng” và “chủng sinh học” đều là cách ghép nhóm mang tính hình thức ở mức độ cấu trúc dưới loài và không bị ràng buộc bởi bất kỳ một khoá phân loại vi khuẩn nào Kết quả 5 chủng đã được mô tả dựa vào quan hệ mật thiết với cây chủ và 5 biovar khác nhau dựa vào khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau (3 đường và 3 rượu) Biovar 1 và 2 thuộc loại dinh dưỡng

kém linh hoạt so với biovar 3 và 4, giữa các biovar còn khác nhau bởi các hình ảnh điện di đồ, các protein màng Biovar 1 và 2 còn khác biovar 3, 4 và

5 trên cơ sở các mẫu ADN thăm dò và trên cơ sở phân tích RFLP

Biovar 1 và 2 chiếm ưu thế ở châu Mỹ, biovar 3 ở châu Á Ở Philippin thấy có mặt cả 4 biovar, còn biovar 2 có phân bố địa lý rộng nhất, trong khi

đó biovar 3 có đặc điểm dinh dưỡng linh hoạt hơn cả Có một bằng chứng

cho rằng R solanacearum là một loài cổ, chỉ có quan hệ xa với các loài thuộc chi Ralstonia Theo phân loại, R solanacearum như là một nhóm ở bên trong Ralstonia đã được biết trong nhiều năm dựa vào phân tích số liệu

của những đặc điểm hình thái, lai ADN - ADN hoặc ARN - ARN [68]

Các chủng R solanacearum biến đổi mạnh về các hoạt động sinh hoá,

phổ cây chủ và khả năng gây bệnh Năm 1964, Buddenhagen đã đề cập đến

các sơ đồ phân loại khác nhau và chia R solanacearum thành 3 chủng dựa

trên hình thái và sinh thái học của chúng [32] :

Chủng 1: Gồm các cá thể gây bệnh ở thuốc lá, các cây chủ họ cà

(Solanaceae) và một số loài thực vật khác

Chủng 2: Gồm các cá thể gây bệnh ở cây chủ thuộc họ Musaceae

Chủng 3: Gồm các cá thể gây bệnh ở lạc, khoai tây và một số ít cây chủ khác

Năm 1964, Hayward đã nhóm các chủng thuộc loài R solanacearum

thành 5 biovar Dựa vào sự đa hình về chiều dài đoạn ADN được tạo ra bởi các enzym cắt giới hạn (RFLP) và đã chia các chủng sinh học thành hơn 40

nhóm RFLP [56, 57] Kelman và Hayward cho rằng R solanacearum là một

loài không đồng nhất, đa dạng với tính chuyên hoá khác nhau, bao gồm một

số biovar và pathovar khác biệt nhau [52, 53]

1.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn R solanacearum

Vi khuẩn R.solanacearum có dạng hình gậy, hai đầu hơi tròn, kích

thước 0,5 - 1,5 µm, gram âm, sinh trưởng hiếu khí, không hình thành bào tử,

có khả năng tổng hợp poly -  - hydroxybutyrat như là nguồn cacbon dự trữ Mặc dù nó không tạo ra sắc tố phát huỳnh quang nhưng nó có thể tổng hợp

sắc tố khuếch tán mầu nâu trên môi trường thạch có chứa Tyrozin R.solanacearum có thể khử nitrat thành nitrit và tạo ra khí nhưng không thể

thuỷ phân tinh bột, hoá lỏng yếu hoặc không hoá lỏng gelatin

Những đặc tính sinh hoá chính của vi khuẩn R.solanacearum được

tóm tắt ở bảng 1 (Hayward, 1960 ) [47]

Bảng 1 Đặc tính sinh lý, sinh hoá chính của vi khuẩn R.solanacearum

Chú thích:

(+): Phản ứng dương hoặc phát triển được

(-): Phản ứng âm hoặc không phát triển

Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển thay đổi từ 25 – 35 0

C

R.solanacearum có phản ứng khác nhau với chất kháng sinh, các nòi vi

khuẩn có thể mẫn cảm với Streptomyxin, chống chịu với Penixilin,

Viomyxin, [21, 50] R solanacearum là loại vi sinh vật tồn tại ở trong đất

thường xuyên gây ra bệnh chết héo trên nhiều loại cây trồng như lạc, khoai tây, cà chua, ớt, thuốc lá phổ biến rộng ở hầu hết khắp các vùng, gây tác hại lớn cho sản xuất, chúng lan truyền theo nước tưới, xâm nhập vào cây qua các vết thương và di chuyển vào trong các bó mạch Bệnh thường xảy ra vào lúc cây đang tăng trưởng Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ tương đối cao, đất

ẩm, xâm nhập qua vết thương, sinh sản ở các bó mạch, ký chủ và di chuyển

ở các bó mạch từ thân đến lá, sinh độc tố phá bó mạch làm cây tắc nghẽn sự vận chuyển nước và các chất dinh dưỡng làm cây héo và chết, bệnh hại nhiều trên đất cát pha, đất thịt bệnh nhẹ hơn Trên những ruộng trồng luân canh với cây lúa nước bệnh nhẹ Vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ 30 – 370

C nhiệt độ tối thiểu là 100 C, tối đa là 410 C, nhiệt độ gây chết là 520 C, mẫn cảm được với môi trường khô [1, 20, 59]

1.4.3 Tính độc của Ralstonia solanacearum

Khi bị xâm nhiễm bởi R solanacearum sau một thời gian (phụ thuộc

vào điều kiện môi trường) cây chủ bắt đầu bị héo, hiện tượng này là do có sự

bịt kín những bó mạch (xylem) bởi polysacarit ngoại bào do R.solanacearum

tiết ra, trước đây người ta vẫn cho rằng đó là N axetylgalactoamin

(GALNAc)

Năm 1954, Kelman kết luận, có mối quan hệ giữa hình thái khuẩn lạc với tính độc và các chủng tổng hợp polysacarit ngoại bào là các chủng có

độc tính [54] Các chủng đột biến của R solanacearum có thể được phát

hiện dễ dàng khi canh khuẩn được cấy vạch trên môi trường thạch Kelman

có 2, 3, 5 Triphenyl tetrazolium clorit, kết hợp quan sát sau 36  48 giờ dưới ánh sáng xuyên chéo Những đột biến có tính độc yếu hoặc không có tính độc hình thành các khuẩn lạc nhỏ hình chai, có một quầng đỏ xẫm nổi bật Chủng dại có độc tính hình thành những khuẩn lạc màu trắng, thể lỏng, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm Những đột biến hình chai mất độc tính có thể tách trực tiếp từ cây bệnh nhưng với số lượng

ít so với loại có độc tính Sự hình thành các cá thể không có tính độc trong canh khuẩn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản Những vi khuẩn có tính độc

có thể bảo quản được trong nước cất vô trùng [47, 48]

Tổng hợp chất nhầy polysacarit là một thuộc tính chung của tất cả các

chủng R solanacearum có độc tính Bản thân tính độc phức tạp hơn nhiều, nên

không thể giải thích chỉ căn cứ vào sự hiện hữu hay không hiện hữu của chất nhầy polysacarit, vì tính độc nếu xem xét trong phạm vi mối quan hệ với tính đặc hiệu loài thì không liên quan tới sự tổng hợp chất nhầy, thường các nguồn vi khuẩn gây độc trên cà chua có độc tính cao hơn các nguồn phân lập từ các cây chủ khác [31, 71, 74, 77]

Một sự tương quan chặt chẽ giữa việc tạo ra exopolysacarit (EPS) và tính độc, được chứng minh bằng việc tạo ra những đột biến không độc, gen điều

khiển EPS nằm ở vùng gen ops và eps [77] Cấu trúc của polysacarit đã được xác

định [38], những đột biến không có polysacarit và không độc hoàn toàn sẽ không

có khả năng hình thành khuẩn lạc trên rễ cây chủ Những số liệu này cho thấy, đã

có mối liên quan giữa tính độc, tính xâm thực vào rễ và chất lượng của

polysacarit đã được tạo ra trong thân cây

1.5 Các con đường xâm nhiễm của vi khuẩn R solanacearum

Người ta thường thấy các hình thức chủ yếu mà R solanacearum xâm

nhập vào cây chủ như sau:

- Do tương tác giữa vi khuẩn gây bệnh với các quần thể đơn bào ăn rễ như giun tròn thì tỷ lệ mắc bệnh cao vi giun tròn làm tổn thương và biến dạng bộ rễ và qua đó vi khuẩn rễ dàng xâm nhập vào [33,50]

- Côn trùng sâu hại mang vi khuẩn, chúng chích hút vào cây, qua đó vi khuẩn rễ dàng xâm nhập vào cây chủ Hình thức này rất phổ biến và vi khuẩn lan truyền nhanh có thể làm cho cả một cánh đồng bị chết héo [50]

- Do sự chăm sóc làm cho cây bị đứt rễ, sây xát thân, dập lá…mà vi khuẩn tiềm trữ trong đất, không khí hoặc qua nguồn nước có cơ hội tấn công vào cây chủ

- Với những vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, chúng có thể xâm nhập qua các lỗ mở ở rễ cây, khí khổng ở lá cây, thủy khổng và lỗ ở vỏ [50]

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi

khuẩn R.solanacearum

1.6.1 Nhiệt độ không khí

Bệnh héo xanh thường xuất hiện ở những vùng có khí hậu nóng ẩm

Nhiệt độ thích hợp cho R.solanacearum phát triển là 25 – 35 0C, nhiệt độ tối thiểu 100 C tối đa là 410 C, pH thích hợp 7 – 7,2 [55] Tốc độ phát triển của bệnh tăng sau khi lây nhiễm nếu nhiệt độ tăng trong phạm vi 26,7 – 37,8 0

C Nhiệt độ cao làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh trong cây chủ, dẫn đến cây bị héo nhanh hơn, số lượng vi khuẩn thôi vào đất nhiều hơn, dẫn đến sự xâm nhiễm vào cây bên cạnh cũng tăng lên

1.6.2 Nhiệt độ đất

Nhiệt độ trên 250 C và ở độ sâu 5 cm cùng với độ ẩm của đất cao là điều kiện thuận lợi cho bệnh héo xanh phát triển [59]

Ngoài nhiệt độ không khí, nhiệt độ của đất cũng là một yếu tố ảnh

hưởng đến sinh trưởng và phát triển của R.solanacearum Vaughan đó phát

hiện ra rằng, bệnh héo xanh vi khuẩn không phát triển khi nhiệt độ của đất dưới 21,10 C mặc dù sự xâm nhiễm vẫn xảy ra

1.6.3 Cường độ chiếu sáng

Đã có một số nghiên cứu, khảo sát ảnh hưởng phối hợp của cường độ chiếu sáng và chu kỳ quang lên sức đề kháng của cây chủ đối với vi khuẩn gây bệnh héo xanh Cường độ chiếu sáng giảm, không làm giảm sức đề kháng của cà chua 1169 đối với chủng vi khuẩn LB - 6 ở nhiệt độ 26,60

C, trong khi đó làm giảm rất đáng kể sức đề kháng của cà chua ở 290

C [52]

1.6.4 Độ ẩm của đất

Độ ẩm cao của đất thường thấy ở những nơi đất phẳng, ruộng, vùng bình nguyên hoặc những vùng có mưa lớn, nói chung rất thuận lợi cho bệnh héo xanh vi khuẩn phát triển Sức đề kháng của vi khuẩn gây bênh là rất lớn

ở những nơi đất ẩm, nhưng chúng sẽ bị tổn thương nặng khi đất gặp hạn và ngập nước, như không tăng sinh ở đất khô Mức độ giảm quần thể

R.solanacearum trong đất bị sấy khô xảy ra chậm hơn so với đất bị xử lý ướt

(ngập nước) [1, 42]

1.6.5 Ảnh hưởng của các loại đất

Vander Zaang quan sát những cánh đồng ở Đông Nam Á đã cho rằng, đất ngập nước, đất trồng mía có mùa khô thật sự, những cánh đồng ngập

nước sông với chu kỳ mối năm một lần đều thuộc loại không chứa

R.solanacearum

Năm 1965, Chae Gun Phea phát hiện ra rằng, sự xâm nhiễm không xày

ra ở trên cát, nhưng nó lại là cao nhất ở đất thịt nặng, một mẫu đất sẽ không cản trở vi khuẩn gây bệnh phát triển nhưng lại không cho phép bệnh phát triển, điều này dễ nhận thấy bởi tỷ lệ cây chủ bị chết giảm, có thể nhờ sự tồn tại một thành phần nào đó ở trong đất (như canxi chẳng hạn), trong trường hợp cụ thể này, nó ức chế vi khuẩn gây bệnh phát triển đồng thời làm giảm mức độ gây hại của chúng

1.7 Biện pháp phòng trừ

1.7.1 Biện pháp hóa học

Hiện nay, vẫn chưa có loại thuốc nào để phòng trừ đặc hiệu bệnh héo xanh trên cây trồng, tuy nhiên biện pháp hóa học vẫn được xem là cần thiết hiện nay, nhưng xét về lâu dài biện pháp hóa học ngày càng thể hiện các mặt trái của nó như làm cho tác nhân gây bệnh trở nên kháng thuốc, đặc biệt là gây ô nhiễm môi trường và sức khỏe con người một cách nghiêm trọng

1.7.2 Biện pháp sinh học

Khi sử dụng thuốc hóa học để bảo vệ thực vật thì thuốc sẽ tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt lá, quả, thân cây, mặt đất, mặt nước và một lớp chất lắng gọi là dư lượng ban đầu của thuốc Vì vậy biện pháp sinh học trong công tác bảo vệ thực vật ngày càng chú ý khai thác và vị trí của biện pháp này ngày càng được nâng cao Việc bảo vệ môi trường sống, môi trường sản xuất cũng như tiến hành nông nghiệp sạch thì biện pháp này càng có ý nghĩa hơn

Sử dụng một số vi khuẩn đối kháng (VKĐK) Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens để xử lý hạt giống trước khi gieo, nhúng rễ cây

con trước khi trồng hoặc đưa vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ sau khi trồng nhằm ức chế, cạnh tranh và tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh [3, 14, 15, 22, 23]

Sử dụng phế phẩm V58 có chứa vi sinh vật đối kháng trên ruộng trồng

cà chua ở Tiền Phong Mê Linh Vĩnh Phúc, kết quả thu được có công thức sử dụng V58 tỷ lệ chết giảm còn 25 % so với đối chứng

Ngoài ra, chúng ta cần phải làm đất vườn ươm sạch bệnh, cày bừa kỹ, bón đạm vừa phải, phân chuồng phải hoai mục, luân canh với cây lúa nước

1988, Cook đó đưa ra một khái niệm rộng hơn về phòng trừ sinh học Theo theo tác giả (Biocontrol) là việc sử dụng vi sinh vật, gen và các sản phẩm của gen để điều khiển các tác nhân gây bệnh Các cách điều khiển tác nhận gây bệnh có thể là:

- Duy trì mật độ nguồn bệnh ở mức độ thấp dưới ngưỡng kinh tế

- Làm chậm hoặc loại trừ tiến triển xâm nhiễm của bệnh

- Kích hoạt và tạo điều kiện phát huy hệ thống tự vệ của cây

1.8.2 Lựa chọn tác nhân phòng trừ sinh học

Chiến lược (Biocontrol) có thể chia thành 2 loại:

- Chiến lược dựa trên nguyên tắc cơ bản về sinh thái học hay còn gọi là phòng trừ sinh học cổ điển [54] Hay phòng trừ sinh học chỉ xử lý một lần

- Chiến lược sử dụng vi sinh vật như là một loại thuốc sinh học và việc

xử lý có những điểm gần giống như xử lý thuốc hóa học nhằm mục đích kiểm soát bệnh trong một khoảng thời gian giới hạn Chiến lược này còn được gọi là phòng trừ sinh học tăng dần Sự khác nhau về chiến lược phòng trừ ảnh hưởng đến sự lựa chọn và phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học

Đối với chiến lược (Biocontrol) tăng dần, người ta chú ý đến nguồn gốc của vi sinh vật đối kháng Tuy nhiên những hiểu biết về khía cạnh này là điều cần thiết cho việc đánh giá rủi ro và là một trong những yêu cầu cần thiết cho quá trình đăng ký thương mại hóa sản phẩm Có một số phương pháp sàng lọc tác nhân phòng trừ sinh học dựa trên hoạt tính của enzim thủy phân của vi sinh sinh vật đối kháng, tương tác giữa vi sinh vật gây bệnh và

vi sinh vật đối kháng, phương pháp có liên quan đến cây ký chủ

1.8.3 Sử dụng tác nhân vi sinh vật trong phòng bệnh hại thực vật

Nhiều công trình nghiên cứu về tác nhân phòng trừ sinh học công bố từ đầu thế kỷ 20 trong đó có vi khuẩn đang là nhóm vi khuẩn hoại sinh mà phổ

biến nhất là Pseudomonas spp, kế đến là Bacillus spp và Streptomyces [9,

65, 67] Những nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn trên thân lá cây

đó dẫn đến việc chia chúng thành 3 loại: loại có hại cho cây trồng, loại trung tính và loại có ích cho cây trồng Ảnh hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này

là do chúng sản sinh ra chất kích thích tăng trưởng cho cây, các chất ức chế hoặc làm suy yếu các tác nhân gây bệnh hoặc cả hai Cơ chế ban đầu ức chế

tác nhân gây bệnh là tiết ra các chất kháng sinh [43, 45] Tuy nhiên những yếu tố khác như việc tiết ra chất siderophores, HCN, sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng có vai trò quan trọng trong việc ức chế tác nhân gây bệnh [60,

61, 62] Trong số các loài Pseudomonas spp, P fluorescens được chú ý và

tăng cường nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại nấm bệnh lưu tồn trong đất, loài vi khuẩn này có khả năng kích thích sự phát triển cây trồng Bằng cách xử lý hạt có hay không có chất mang hoạt chủng vào đất cùng với giá thể làm thức ăn nền, đó làm giảm mức trầm trọng của bệnh, làm gia tăng sự phát triển và tăng năng xuất cây trồng Với thuận lợi là có nhiều cơ chế tác dụng như: định cư, chiếm chỗ, loại trừ mầm bệnh ra khỏi vùng thích hợp, tiết chất kháng sinh (Pyrrolnitrin, pyoluteorin… ) ngoại ký sinh, cạnh tranh dinh dưỡng (hợp chất sắt… ), ra tăng sức đề kháng cho cây, Pseudomonas rất có triển vọng sử dụng trên lĩnh vực thương mại

Biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều khiển môi trường, cây trồng và vi sinh vật đối kháng một cách thích hợp nhằm để tạo lên một thế cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại nhờ đó bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức độ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan trọng về mặt kinh tế

Biện pháp sinh học không có mục đích tiêu diệt toàn bộ mầm bệnh và cũng không có khả năng này

1.9 Nghiên cứu đột biến

1.9.1 Khái niệm đột biến

Đột biến (hay biến dị di truyền) là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền (nhiễm sắc thể, ADN) dẫn đến sự biến đổi của một hoặc một

số tính trạng, những biến đổi này có thể di truyền cho các đời sau

Người ta sử dụng 2 phương pháp gây đột biến nhân tạo để tạo nguồn nguyên liệu quý cho tạo giống mới [6, 7, 8, 44]

1.9.2 Gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân vật lý

Các loại tia phóng xạ (tia X, gamma, tia bêta, chùm nơtron) có tác dụng kích thích và ion hoá các nguyên tử khi chúng xuyên qua các tổ chức, tế bào sống, ảnh hưởng đến ADN, ARN khi tác động lên phân tử nước Trong chọn giống thực vật, tuỳ từng giống cây mà sử dụng cường độ, liều lượng phù hợp

để xử lí lên hạt khô, hạt nảy mầm, đỉnh sinh trưởng Còn đối với tia tử ngoại

vì không có khả năng xuyên sâu nên chỉ được dùng cho vi sinh vật để gây các đột biến gen

1.9.3 Gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân hoá học

Công bố của hai tác giả Rapopor và Gustafson năm 1948 chỉ ra một số chất hoá học như: Ethyleimine (EI); Diethylsunfate (DES); Nitrozoethylurea (NEU); consixin; 2,4D… có thể thấm vào tế bào tác động lên nhiễm sắc thể gây nên các đột biến về số lượng, cấu trúc nhiễm sắc thể và các đột biến gen

Các hóa chất gây đột biến có đặc điểm là có thể chỉ gây hiệu quả đột biến đối với một số lượng ít đối tượng

Ví dụ kháng sinh Streptomycine chỉ gây đột biến ở tảo đơn bào và một

số vi sinh vật, không gây đột biến trên nhiều đối tượng khác Các tác nhân gây đột biến hóa học có thể chia thành các nhóm sau:

- Nhóm 1: Các chất ức chế tổng hợp bazơ nitơ trong cấu trúc ADN như coffein, ethyluretan

- Nhóm 2: Các chất đồng đẳng với bazơ chứa nitơ như coffein, 5 bromuracil, các chất gần giống với bazơ chứa nitơ, nên nó làm ADN gắn nhằm khi tổng hợp

Ví dụ: Bromodeoxiuridine (BUdR) và 5 - bromouracil (BU) là các bazơ đồng đẳng của thymine Chúng thường ở dạng keo, nhưng ngẫu nhiên

đôi khi chuyển sang dạng enol và có khả năng bắt cặp với guanine Như vậy,

BU có thể xâm nhập vào bắt cặp bổ sung với A (A - BU) và ở vùng sao chép tiếp theo gắn bắt cặp với G và (BU - G), A - Tđược thay thành G - C BU như vậy có thể xâm nhập sai, khi gắn thay chỗ cho cytosine tạo G - BU, tiếp theo A bắt cắp với BU tạo A - BU và vùng sao chép tiếp A bắt cặp với T thành A - T Trong cả hai trường hợp, chất đồng đẳng Brom - uracil (BU) đều có khả năng tạo thay đổi trên ADN, cặp A - T, G - C và ngược lại G - C,

A - T

- Nhóm 3: Các chất alkyl hóa làm đứt mạch ADN như ethyl methanesulfonate (EMS), methyl methanesulfonate (MMS), ethylene imine (EI), nitrosoguanidine (NG)…Ngược với sai hỏng sao chép, các tác nhân gây đột biến như axit nitric và khí ngạt nitrogen (nitrogen mustard) có thể gây biến đổi trực tiếp trên ADN Theo Schuster và một số khác, axit nitric tác động trước hết tách nhóm amino khỏi adenine và cytosine và tương ứng biến các base này thành hypoxanthine (H) và uracil (U) Sau biến đổi, H có thể bắt cặp với C và U với A, các vùng sao chép tiếp theo làm G thay chỗ A

và T thay C Các chất khác như hydroxylamine (H2NOH) và các chất cho nhóm OH có thể gây nên đồng chuyển Theo Freese và các cộng sự, hydroxylamine có lẽ là chất có tính đặc hiệu cao nhất trong các tác nhân gây đột biến, nhờ đó có thể chuyển cytosine sang dạng bắt cặp được với adenine

- Nhóm 4: Các chất chêm vào ADN Nhóm các chất gồm proflavin, màu acridine và nhóm được gọi là ICR (ICR compound) là những chất có phân tử mặt phẳng tương tự cặp base Chúng có thể chèn vào phân tử ADN làm thêm hoặc mất base Chúng thường gây đột biến lệch khung do thêm hay mất cặp bazơ nitơ

Tất cả các tác nhân gây đột biến đều là tác nhân gây ung thư (Cancinogen) nhưng các tác nhân gây ung thư không phải đều gây đột biến

Hiện nay nhiều tác nhân gây đột biến được sử dụng trong chọn giống nhằm tăng nguồn biến dị Bên cạnh đó với nạn ô nhiễm trên thế giới người ta phát hiện nhiều tác nhân đột biến hóa học mới xuất hiện trong môi trường

1.10 Phương pháp phát hiện đột biến

Muốn phát hiện các đột biến có hiệu quả cần có hệ thống chọn lọc để tìm thấy các đột biến hiếm hoi trong khối rất lớn các dạng không đột biến Các hệ thống chọn lọc đột biến có nhiều và phụ thuộc vào các đột biến khác nhau Các cách phát hiện 3 dạng đột biến:

Khái niệm lực phân giải (resolving power) được dùng để chỉ khả năng phát hiện các đột biến rất hiếm so với không đột biến Lực phân giải càng lớn khi phát hiện được các đột biến càng hiếm

Ví dụ, các đột biến đề kháng có độ phân giải cao vì khi cấy số lượng rất lớn tế bào lên môi trường chọn lọc có chứa tác nhân thì phần lớn tế bào chết, chỉ số rất ít tế bào có đột biến đề kháng mọc thành khuẩn lạc

1.10.1 Phương pháp đề kháng

Ở vi khuẩn, các tác nhân chọn lọc thường là thuốc và phage Các đột biến dễ dàng được phát hiện trên môi trường agar có thuốc hay phage ở dạng các khuẩn lạc được mọc lên

1.10.2 Phương pháp làm giàu chậm (default enrichment method)

Việc phát hiện các đột biến khuyết dưỡng khó khăn hơn Dung dịch vi khuẩn pha loãng được cấy lên bề mặt môi trường agar tối thiểu để mọc rời thành khuẩn lạc Một lớp môi trường tương tự được đổ lên trên, phủ lớp mỏng Hộp pétri được ủ để các khuẩn lạc bình thường mọc lên Sau đó, đổ phủ lên thêm một lớp môi trường dinh dưỡng có bổ sung và ủ tiếp cho chất

bổ sung khuếch tán Các đột biến khuyết dưỡng sẽ mọc sau, khi có chất bổ sung, nên khuẩn lạc nhỏ hơn do mọc chậm

1.10.3 Phương pháp làm giàu hạn chế (limited enrichment method)

Phương pháp làm giàu hạn chế là dạng đơn giản hơn của phương pháp làm giàu chậm Các vi khuẩn được cấy trên môi trường tối thiểu có một ít bổ sung Trong điều kiện đó, các đột biến khuyết dưỡng mọc đến khi hết chất dinh dưỡng bổ sung thì dừng, nên tạo khuẩn lạc nhỏ Các vi khuẩn bình thường tiếp tục mọc tạo khuẩn lạc to

1.10.4 Phương pháp làm giàu nhờ penicilline

Được áp dụng cho các vi khuẩn Penicilline có tác động diệt các vi khuẩn bình thường khi phân chia Các vi khuẩn được cho vào môi trường tối thiểu có penicilline Các vi khuẩn đang tăng trưởng bị diệt, chỉ các tế bào đột biến không tăng trưởng còn sống sót Sau đó, hỗn hợp được cấy lên môi trường không có penicilline thì các đột biến khuyết dưỡng mọc lên với tỉ lệ tương đối cao hơn

1.10.5 Phương pháp lọc

Được sử dụng để chọn lựa các đột biến khuyết dưỡng ở nấm sợi Dung dịch các bào tử được nuôi trong môi trường dinh dưỡng thiếu chất bổ sung Các đột biến thiếu chất bổ sung không mọc được, các dạng bình thường mọc ra nhiều sợi khi lọc qua màng lọc sợi thủy tinh, các dạng bình thường nhiều sợi bị giữ lại, các dạng đột biến đi qua màng lọc Dung dịch có nhiều dạng đột biến được cấy lên môi trường có chất bổ sung và kiểm tra tìm các dạng đột biến

1.10.6 Trong phương pháp in

Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường có dinh dưỡng Dùng miếng nhung (có nhiều lông mịn) in đúng các vị trí khuẩn lạc trên môi trường tối thiểu Các khuẩn lạc đột biến không mọc lên được Căn cứ vị trí khuẩn lạc không mọc ở bản sao tách các đột biến khuyết dưỡng

Ngoài các phương pháp nêu trên còn có các phương pháp chuyên biệt

để phát hiện nhiều loài đột biến khác.Nhiều phương pháp chọn lọc đột biến được sử dụng cho việc chọn lọc đột biến ở các tế bào nuôi cấy mô của sinh vật bậc cao

1.12 Ảnh hưởng của liều lượng và cường độ các chất gây đột biến

Các thí nghiệm sau năm 1927 với bức xạ năng lượng cao cho thấy các đột biến nhân tạo phụ thuộc rất lớn vào liều lượng: liều chiếu phóng xạ càng lớn thì tần suất phát sinh đột biến trong quần thể sinh vật càng cao

Mối quan hệ đơn giản giữa liều lượng phóng xạ và tần số đột biến được Timofeeff - Ressovsky, Lea, Catcheside và những người khác giải thích bằng giả thuyết "bia" (Target Hypothesis) Theo thuyết này, mỗi "va đập" của bức xạ vào gen hay nhiễm sắc thể (như bia để tập bắn) có xác suất gây đột biến cao Liều lượng phóng xạ càng lớn, các va đập càng nhiều và xuất hiện nhiều đột biến Sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng và cường

độ gây đột biến của các tia năng lượng chỉ ở một giới hạn nhất định Khi liều lượng quá cao sự phụ thuộc có phức tạp hơn có thể gây nhiều tế bào bị

chết Giả thuyết bia được củng cố thêm khi bức xạ được thực hiện với cường độ khác nhau Sự tăng tần số đột biến phụ thuộc vào liều lượng ít phụ thuộc vào cường độ cao (thực hiện 1 lần với mật độ bức xạ cao) và cường độ thấp Điểm đáng lưu ý, nhiều nghiên cứu cho thấy các bức xạ ion hoá có hiệu quả gây đột biến ở tất cả các sinh vật và không có liều lượng ngưỡng, có nghĩa là dù liều lượng thấp vẫn có khả năng gây đột biến Loài người đấu tranh ngăn chặn việc thử vũ khí hạt nhân chính vì sự gia tăng độ phóng xạ trên quả đất sẽ làm tăng tần số đột biến ở người

1.13 Thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật bằng phương pháp đột biến

1.13.1 Một số thành tựu chọn tạo giống vi sinh vật bằng phương pháp đột biến trên thế giới và ở Việt Nam

Năm 1925, hai nhà khoa học của Viện Phóng xạ ở Leningrad G.A.Nadson và G.S.Philopov lần đầu tiên trên thế giới đó nhận được các đột

biến ở nấm men dưới ảnh hưởng của phóng xạ Radi

Năm 1927, G.Muller đó chứng minh tia X làm tăng đáng kể tần số đột biến ở ruồi dấm Năm 1928, Stadler đó nhận được các đột biến tia X ở bắp

và đại mạch Chọn giống phóng xạ, hoá học được tiến hành có hiệu quả trên

vi sinh vật trải qua 2 giai đoạn đó là giai đoạn chọn giống bậc thang: trải qua nhiều bậc chọn lọc các đột biến năng suất, các nòi vi sinh vật được tăng lên

dần

+ Chọn các thể đột biến sinh trưởng mạnh để tăng sinh khối ở nấm men

và vi khuẩn làm thức ăn chăn nuôi Chọn tạo các chủng vi sinh vật phân giải xenluloza, photpho khó tan, kali… cố định nitơ có hoạt lực cao ổn định làm phân bón, tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng tuyển chọn bằng phương pháp đột biến cho hoạt lực đối kháng cao và ổn định để sử dụng trong Bảo vệ Thực vật…

Cho đến nay, bằng phương pháp gây đột biến nhân tạo đó tạo được hàng loạt chủng vi sinh vật có giá trị kinh tế cao

- Chọn các thể đột biến tạo ra chất có hoạt tính cao

VD: chiếu tia phóng xạ rồi chọn lọc đó tạo được các chủng nấm penicilin có hoạt tính tăng gấp 200 lần

- Chọn các thể đột biến sinh trưởng mạnh để tăng sinh khối ở nấm men và vi khuẩn

- Chọn những chủng vi sinh vật có đột biến giảm sức sống, không có khả năng gây bệnh mà đóng vai trò như một kháng nguyên, gây miễn dịch ổn định cho vật chủ chống được loại vi sinh vật đó Trên nguyên tắc này, người

ta đó tạo được các vacxin phòng bệnh cho người và gia súc

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Các môi trường phân lập vi khuẩn:

+ Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R solanacearum

(Kelman, 1954) [7]: pepton 10 g; cazein thủy phân 1 g; glucoza 5 g; thạch

20 g; nước cất 1 lần 1000 ml; chỉnh pH= 7,0, khử trùng ở 0,5 at, 1210C, 20 phút, làm lạnh đến 600

C và thêm 5 ml 2 – 3 - 5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1%

+ Môi trường 523: Để nuôi cấy R solanacearum: Cao nấm men 4 g; cazein

thủy phân 8 g; sucaroza 10 g; MgSO4.7H2O (6,25%) 5 ml; K2HPO4 12,5%) 16,3 ml; thạch 18 g; nước cất 1000 ml; chỉnh pH = 7,0

+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng: Cao nấm men 5 g; pepton 20 g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml; chỉnh pH = 7,0

+ Môi trường CPG: Tuyển chọn các thể đột biến: Casaminoacid 1 g; pepton

10 g; glucoza 10 g; thạch 20 g; nước cất 1000 ml; chỉnh pH = 7,0

- Các dung dịch đệm chủ yếu để tách ADN vi sinh vật

+ Đệm CTAB: 100 mM Tris HCl, pH = 9,0; 20 mM NaEDTA, pH = 8,0; 1,4M NaCl; 2% Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB); 0,2% - mercapto ethanol

+ Đệm gây tan tế bào “Lysis”: 50 mM Tris - HCl; 50 mM EDTA; 3% SDS;

1% 2 - mercapto ethanol; chloroform; TE : saturated phenol (1/1 phenol bão hoà trong TE); TE: 10 mM Tris - HCl (pH = 8,0); 1 mM EDTA; 3M NaOAc

(pH = 8,0); isopropanol, ethanol 70%

+ Dung dịch mẹ:

* Dung dịch phenol bão hoà TE

* Dung dịch chloroform: isomyalcohol (24/1)

* Dung dịch TE (10 mM Tris – HCl; pH = 8,0; 1 mM EDTA)

+ Dung dịch đệm điện di 10xTBE: Tris Base: 108 g; axít boric 55 g; 0,5M EDTA (pH = 8,0) 40 ml; nước 1.000 ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập và tuyển chọn chủng Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh cà chua

2.2.1.1 Thu mẫu và phân lập vi khuẩn gây bệnh

- Phương pháp thu mẫu bệnh: Chỉ thu mẫu ở những cây mới bị bệnh Mỗi

thửa ruộng (khoảng 200 m2) thu 2  5 đoạn thân sát gốc có kích thước 3 cm, giữ trong túi polyetilen Ghi thời gian thu mẫu (ngày, tháng, năm), địa điểm, giống cây, Sau mỗi lần cắt, dụng cụ cắt phải được tẩy trùng bằng cồn 70%

để tránh làm lây lan mầm bệnh giữa các mẫu với nhau [1]

- Phương pháp xử lý mẫu: Sau khi được rửa sạch bằng nước máy và sát

trùng bề mặt bằng cồn 70%, các mẫu bệnh được bổ dọc và cắt những phần bị nhiễm bệnh (có màu nâu nhạt), ngâm trong ống eppendorf chứa 1 ml nước cất vô trùng, sau 20 phút loại bỏ đoạn thân nhiễm bệnh ra khỏi ống dịch thôi

vi khuẩn Những ống dịch này được bảo quản ở nhiệt độ 40

C

- Phương pháp phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum: Tiến hành pha

loãng dịch thôi vi khuẩn sao cho có thể thu được các khuẩn lạc riêng biệt sau khi cấy gạt trên môi trường TTC, ủ ở nhiệt độ 28C  2C Theo dõi và ghi kết quả sau 24, 48 và 72 giờ Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc tiến hành chọn 3 đến 5 khuẩn lạc để cấy vạch trên môi trường 523 Sau 24  48 giờ ủ

ở nhiệt độ 28C  2C, tiến hành chọn những khuẩn lạc có kiểu hình thái điển hình và giữ trong nước cất vô trùng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.1.2 Đánh giá tính độc của R solanacearum

R solanacearum là loài vi khuẩn gây bệnh héo xanh điển hình và có

khả năng biến dị nhanh Chúng luôn có xu hướng mất tính độc và hình thái khuẩn lạc của chúng có thể thay đổi từ dạng chảy sang dạng không chảy khi bảo quản trong nước cất, hiện tượng này quan sát được khi nuôi cấy chủng trên môi trường TTC [93]

Vì vậy, khâu chọn những khuẩn lạc chảy và thử tính độc của chúng là rất cần thiết trong việc duy trì, bảo quản các chủg vi khuẩn có tính độc Thí nghiệm này được thực hiện bằng cách lây nhiễm nhân tạo chủng vi khuẩn cần kiểm tra trên dòng cà chua chỉ thị L - 390

Sau khi cấy trên môi trường 523, vi khuẩn R solanacearum được

nhiễm vào những cây cà chua có 5  6 lá thật bằng phương pháp cắm tăm (dùng tăm nhọn vô trùng lấy một ít tế bào cắm vào nách lá cây cà chua) [92], [150], cây được chăm sóc ở điều kiện tự nhiên, nhiệt độ trung bình 280C 

300C, ghi kết quả số cây chết và sống sót hàng ngày Dựa vào kết quả về mức độ chết của cây cà chua để đánh giá mức độ độc của chủng vi khuẩn cần nghiên cứu

Bảng 2 Đánh giá độc tính vi khuẩn Ralstonia solanacearum

0 Không có triệu chứng

1 Một lá héo hoặc héo từng phần

2 Hai tới ba lá héo hoặc héo từng phần

Các chủng R solanacearum được nuôi cấy trên môi trương TTC

không màu trong 24  48 giờ ở 300C để thu sinh khối Sinh khối vi khuẩn được chứa trong ống eppendorf có thể tích 1,5 ml với 0,5 ml nước cất vô trùng

- Thu tế bào: Ống sinh khối vi khuẩn được ly tâm ở vận tốc 12000 vòng/phút, 3 phút, gạn bỏ phần nước, thu tủa

- Làm tan tế bào: Hoà tan tủa tế bào vi khuẩn trong 250 l dung dịch đệm (40 mM Tris - acetat, pH 7,8; 20 mM Na - acetat; 1 mM EDTA; SDS 1%; 50 g/ml RNAaza) Votex kỹ để vi khuẩn phân tán đều trong dịch đệm

- Bổ sung 66 l dung dịch 5 M NaCl, votex kỹ trong 2 phút

- Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút, 10 phút ở 40C

- Chiết xuất phân lớp: Chuyển phần dịch sang một ống eppendorf

khác, bổ sung chloroform với thể tích 1/1, trộn đều bằng cách đảo nhẹ ống trong 2 phút

- Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút Trong ống phân thành 3 lớp, ADN có ở lớp trên (pha nước), chuyển pha trên sang ống mới

- Tủa ADN: Bổ sung cồn 100% lạnh vớ tỉ lệ thể tích 2,5/1 so với thể tích dung dịch trong ống Giữ ở - 40C trong thời gian 1  2 giờ

- Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút, 10 phút để thu phần tủa ADN

- Rửa ADN kết tủa: Bổ sung 200  300 l cồn 80% Lặp lại bước này

1  2 lần Sau đó làm khô tự nhiên phần tủa trong buồng cấy vô trùng hoặc sấy khô trong máy hút chân không, hoà tan ADN trong 50 l đệm 1xTE (10

mM Tris - HCl, 1 mM EDTA, pH = 8,0) và giữ ở - 200C

* Nhân bản gen (PCR)

Hỗ trợ phản ứng PCR đựợc thiết lập như sau:

Thành phần của hỗn hợp phản ứng nhân bản gen Thể tích (l)

10 x đệm nhân gen (10 x PCR buffer - 500mM KCl; 100

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR như sau:

Taq-Chạy điện di ở đệ thế 30 ÷ 40V, 60 ÷ 80 mA Nhuộn ADN bằng Ethidium Bromide (EtBr), quan sát và chụ ảnh dưới ánh sáng đèn tử ngoại

2.2.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng [5]

- Thu mẫu: Mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây

khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm  20

cm, mỗi điểm thu 100 g đất, mẫu được đựng trong từng túi polyetilen riêng

biệt, ghi ngày tháng năm và địa điểm thu mẫu

- Phân lập và tuyển chọn:

Chuẩn bị mẫu: 10 g đất được khuấy đều trong 90 ml nước cất khử trùng, lắc 30 phút, để lắng tự nhiên, lấy phần dịch trong để phân lập vi khuẩn đối kháng Mẫu thu từ các cây được nghiền trong cối sứ có chứa 1 ml nước cất khử trùng, bỏ cặn, sử dụng phần dịch để phân lập vi khuẩn đối kháng

Bước 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha loãng đến nồng độ nhất định, sao cho khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc PDA, ủ ở nhiệt độ 280C  300

C trong 24  48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt

Bước 2: Những khuẩn lạc có sắc tố vàng, nâu hoặc xanh nhạt được hoà loãng trong các ống eppendorf riêng biệt, dùng 100l dung dịch trải đều

trên bề mặt đĩa môi trường KB hoặc PDA (mật độ tế bào trong dung dịch sao cho sau khi ủ ở 280C  300C trong 24  48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt)

Bước 3: Phun dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh phủ lên bề mặt môi trường, ủ ở nhiệt độ 280C  300C trong 24  48 giờ

Bước 4: Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vòng vô khuẩn), nghĩa là có vi khuẩn đối kháng tại điểm đó

Bước 5: Những tế bào vi khuẩn đối kháng được làm sạch và giữ trong nước cất khử trùng hoặc glyxerol 30% ở - 800C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

- Tuyển chọn vi khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

Bước 1: Trải đều vi sinh vật gây bệnh (hoặc vi sinh vật kiểm định) phủ lên bề mặt môi trường, ủ ở nhiệt độ thích hợp (đối với vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật kiểm định)

Lưu ý: Sao cho bề mặt môi trường khô

Bước 2: Dùng ống kim loại vô trùng đục lỗ trên môi trường đã cấy vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật kiểm định

Bước 3: Nhỏ địch nuôi cấy vi sinh vật cần kiểm tra vào lỗ thạch vừa mới đục xong và ủ ngăn mát tủ lạnh (4 - 100 C) từ 1 đến 2 giờ (để các hoạt chất khuếch tán đều vào môi trường) sau đó đem ủ ở nhiệt độ thích hợp (dựa vào nhiệt độ phát triển tối ưu của vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật kiểm định)

Bước 4: Quan sát vòng ức chế cho đến khi vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật kiểm định phát triển toàn bộ bề mặt môi trường

*Đọc kết quả

Hoạt tính đối kháng của vi sinh vật đối kháng được thể hiện thông qua vòng đối kháng (vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc của vi sinh vật đối