Thực nghiệm thành phần hóa học cây bọ mắm

Thực nghiệm thành phần hóa học cây bọ mắm

3.1 Cac điều kiện thí nghiệm

Metanol được chưng cất trước khi sử dụng (thu ở nhiệt độ 64-65°C )

Eter dầu hỏa được chưng cất ở phân đoạn 60-90%,

Cloroform ( Trung Quốc) có nhiệt độ sôi 642C,

Acetat cũl (Trung Quốc) có nhiệt độ 861 77-79°C

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản móng tráng sẵn của Merck Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại hoặc thuốc thử là dung dịch H;SO;¿ 10% hay dung

dich FeCl, / EtOH

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha

đảo, có cỡ hạt là 0,040 — 0,063 mm (240-430 mesh)

Phố NMR đo trên may Bruker Avance 500 (SOOMHz cho 'H va 125MHz cho 8C) cha Viện Hóa học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam với dung môi

(TMS nội chuẩn) CDCI;, CD:OD hoặc DMSO,

3.2 Điều chế cao

3.2.1, Điều chế cao từ mẫu cây khô

Mẫu cây bọ mắm, Pouzolzia zeylamica(L ) Benn, được thu hãi tại Hưng Lộc

~ Đồng Nai vào tháng 3 năm 2006

Mẫu tươi (30 kg) sau khi thu hái được rửa sạch, để ráo nước, thái nhỏ, hong

khô nơi thoáng mát, sau đó sấy khô ở 60-80 °C, thường xuyên đảo trộn cây để

tránh nấm mốc Mẫu khô (3 kg) được xay nhỏ thành bột rồi trích nóng với metanol để điều chế cao (Sơ đồ 3.1)

25

3.2.2 Điều chế cao từ cây tươi

Cây bọ mắm tươi (30kg) sau khi thu hái được rửa sạch, để ráo, thái nhỏ I1-

2cm, cho vào bình thủy tỉnh ngâm với metanol trong 24h, lọc lấy dịch chiết, cô quay chân không thu được 300g cao thô

Chỉ có cao thô trích từ cây tươi là có hoạt tính kháng khuẩn Do đó, chúng tôi

tiếp tục khảo sát trên cao thô trích từ cây tươi

Trích cao thô này lần lượt với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform và butanol để được các cao tương ứng cao eter dầu hỏa (80g), cao chloroform (12g),

cao butanol (40 ø) và cao nước là phần còn lại của cao thô sau khi trích với các

dung môi hữu cơ (125 g) (Sơ đỗ 3.2)

Cây tươi

(30kg)

Rửa sạch, phơi khô, xay nhuyễn

Bột cây

(3 kg)

- Trích nóng với Metanol

- Cô quay thu hồi dung môi

Cao Metanol thé (500 g)

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế cao từ cây khô

Cây tươi

(30kg)

- Rửa sạch, để ráo, cắt nhỏ 1-2em

- Ngâm với metanol

- Cô quay thu hồi dung môi

Cao metanol ban đầu

(300 g)

-_ Trích với các loại dung môi khác nhau

- Cô quay thu hồi dung môi

Cao nước (125g)

Cao butanol

(40 g)

Cao eter dầu

(80 g)

Cao cloroform

Sơ đồ 3.2 Quy trình điều chế cao từ cây tươi

3.2.3 Khảo sát cao eter dầu

Cao eter dầu hỏa (80 g) được sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi giải ly

có độ phân cực tăng dần thu được 10 phân đoạn từ E1 đến E10

Khảo sát phân đoan E7

Sắc ký cột phân đoạn E7 với hệ dung môi EP: AE sử dụng phương pháp

gradient nồng độ theo chiều tăng độ phân cực dung môi, kết hợp sắc ký bản

mồng, kết tinh lại thu được hợp chất BMEI (15mg) (Sơ đồ 3.3)

3.2.4 Khảo sát cao cloroform

Cao cloroform (5g) có kết quả sắc ký bản mỏng cho các vết tròn, tách rời

nhau rõ ràng nên được chọn để khảo sát

27

Sắc ký cột silica gel cao cloroform (5g) với các hệ dung môi giải ly có độ phân cực tăng dân Hệ dung môi ở đây được sử dụng là CHCI;:MeOH:H;O lân

lượt với tỷ lệ 1:0:0; 95:5:0; 9:1:0; §:2:0; 75:25:0; 7:3:0; 14:6:1; 6:4:1 Quá trình

sắc ký cột kết hợp với việc triển khai sắc ký bản mồng thu được 12 phân đoạn (sơ đồ 3.4)

Dựa vào sắc ký lớp mỏng của 12 phân đoạn thu được, nhận thấy phân đoạn

El (ứng với hệ giải ly CHCI;) cho vết rõ khi hiện màu bằng dung dịch HạSOx¿10% nên được tiếp tục khảo sát

Thực hiện sắc ký cột với phân đoạn F1 với hệ dung môi cloroform:eter dầu

hỏa tỷ lệ 7:3 thu được chất BMC I1 có khối lượng 20mg và sắc ký cột phân đoạn F2 thu được hdp chat BMCS8 (200mg)

(80 g)

yf

Cao eter dau | |

- Sắc ký cột silica gel với nhiều

hệ dung môi khác nhau

El

E2

||

BME3 (5 mg)

So dé 3.3 Quy trinh xu ly cao eter dâu

ce cloroform (5g) |

- Sắc ký cột silica gel với nhiều

hệ dung môi khác nhau

i

Sơ đồ 3.4 Quy trình xử lý cao chloroform

i

| ce

- Sắc ký cột silica gel với nhiều

hệ dung môi khác nhau

|

BI B3 BS B6

(12 g)

Sơ đồ 3.5 Quy trình xử lý cao butanol

29

3.2.5 Khao sat cae butanol

Cao butanol (40 g) sir dung phương pháp sắc ký cột trên siiea gel với các hệ

dụng môi giải ly có độ phân cực tăng dẫn thu được 6 phân đoạn từ B1 đến B6, (Sơ dé 3.4)

3.2.5.1 Khảo sát phân đoạn B3

Sắc ký cột silica gel phan doan B3 (120 ng) với hệ dung môi CHCI3: AE cé

sử dụng gradien nồng độ theo chiều tăng của độ phân cực dung môi có kết hợp sắc ký bản mỏng, thu được 3 phân đoạn từ B31 đến B33,

Tiếp tục sắc ký cột silica gel phân đoạn B33 (54,3 mg) với hệ dung môi CHCI3: AE sứ dụng gradien nồng độ theo chiều tăng của độ phân cực dung môi

có kết hợp sắc ký bản mồng, thu được chất kết tỉnh hình kừm mầu vàng ký hiệu

BMD1 (15 mg)

3.2.5.2 Khảo sát phân đoạn B5

Sắc ký cột siica gel phân đoạn B5 (1 g) với hệ dung môi CHCI3: MeOH:

HO (14:6:1) kết hợp sắc ký bản mồng, thu được § phân đoạn từ B51 đến B58

“-

Tiếp tục sắc ký cột lặp lại trên cột nhi silica gel với các dung môi thích hợp, kết tự

tỉnh lại nhiều lần thu được hai chất vô định hình màu vàng ký hiệu là BMBS

(74,5 mg) và BMB52 (30 mg)

3.3.6 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn

Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn các cao và hợp chất thu được

đối với các vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus, Streptococcus haemolyticus va vi khudn Gram (-) Escherichia coli

Phương pháp sử dụng: phương pháp khuếch tán trong bản thạch!”

Nguyên tắc: Dịch thử được cho vào những lỗ tròn ¿ = 6mm trên bản thạch đã cấy sẵn vi khuẩn Chất kháng khuẩn sẽ khuếch tán trong bản thạch ức chế sự

4 < 2 + ` A ®

phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn Đo $ vòng vô khuẩn giúp xác định

được tính kháng khuẩn của mẫu thử,

Hóa chất và dụng cụ:

Môi trường MHA

DMSO

Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus haemolyticus va vi

khuẩn Gram (-) Escherichia coli

Dia petri, pipet Pasteur, dung cu duc 16, tampon v6 khuẩn, kep

Thuc hién:

Môi truéng: Ding méi trudng tiéu chudn Antibiotic Assay medium N°1 Pha

môi trường, cho vòng mỗi ống nghiệm, mỗi 6ng 21ml Hap tiệt trùng

Vi khuẩn được hoạt hóa bằng cách phân lập trên một bản thạch, ấp 37°C trong 24 giờ, cấy vào môi trường lỏng ủ 37°C trong 15 giờ

Chất thử nghiệm: Pha trong DMSO (nếu không tan trong nước), nước

Chuẩn bị các bản thạch

Cho 0,2 ml huyền trọc đã hoạt hóa, trải đều lên mặt thạch, để 15 phút, ấp

khô mặt thạch ở 37C/15 phút

Đục lỗ trên bản thạch

Nhỏ chất thứ vào lỗ cho vừa đầy, để yên 20 phút

Đưa nhẹ nhàng các hộp vào tử ấm, ủ trong 24 gid

Đọc kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn