NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học cây NIỆT GIÓ

Sự tăng cường thu mua niệt gió với số lượng lớn của các thương gia Trung Quốc (ước tính hàng vài chục tấn mặc dù đây chỉ là loài cây mọc hoang) khiến ta đặt ra câu hỏi tại sao? Niệt gió (Wikstroemia indica C.A.Mey.) thuộc họ Trầm (Thymelaeaceae) mọc hoang khắp nơi ở các vùng rừng núi nước ta. Trong dân gian, người ta sử dụng vỏ rễ và vỏ thân để chữa tuyến lâm ba kết hạch, hen suyễn, ho gà, viêm amidan, viêm tuyến mang tai; lá tươi đắp chữa đinh nhọt, sưng tấy, vết thương, rắn cắn 6, 9. Cho đến nay thế giới đã có một số công trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của niệt gió và phát hiện khả năng kháng HIVI, viêm gan B, chống sốt rét và ung thư

ĐẶT VẤN ĐỀ

Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước và con người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc Theo ước đoán hệ thực vật ở Việt Nam có khoảng 12.000 loài, trong đó có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc [10] Đó là nguồn tài nguyên quý chưa được khai thác hết tiềm năng Cùng với đó, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc từ cây cỏ đã đặt ra yêu cầu cần phải đẩy mạnh nghiên cứu để tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu, bào chế các dạng thuốc mới

từ thảo mộc đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe của nhân dân

Sự tăng cường thu mua niệt gió với số lượng lớn của các thương gia Trung Quốc (ước tính hàng vài chục tấn mặc dù đây chỉ là loài cây mọc hoang) khiến ta đặt ra câu hỏi tại

sao? Niệt gió (Wikstroemia indica C.A.Mey.) thuộc họ Trầm (Thymelaeaceae) mọc hoang

khắp nơi ở các vùng rừng núi nước ta Trong dân gian, người ta sử dụng vỏ rễ và vỏ thân

để chữa tuyến lâm ba kết hạch, hen suyễn, ho gà, viêm amidan, viêm tuyến mang tai; lá tươi đắp chữa đinh nhọt, sưng tấy, vết thương, rắn cắn [6], [9] Cho đến nay thế giới đã có một số công trình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của niệt gió và phát hiện khả năng kháng HIV-I, viêm gan B, chống sốt rét và ung thư [5], [19], [33]

Mặc dù vậy ở nước ta có rất ít nghiên cứu về loài này Do đó cần có những nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các bộ phận của cây

niệt gió Bước đầu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa

học cây niệt gió (Wikstroemia indica C.A.Mey)” Kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở

khoa học, tiền đề tạo ra chế phẩm thuốc hoặc thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị viêm đường hô hấp, lao, ung thư để đưa vào ứng dụng một nguồn dược liệu sẵn có ở nước ta

Mục tiêu của đề tài:

-Phân lập 3-5 chất từ cây niệt gió

-Đào tạo cán bộ nghiên cứu mới

-Đào tạo sinh viên đại học

- Viết 1 bài báo trên tạp chí chuyên ngành

Nội dung nghiên cứu:

-Phân tính định tính các lớp chất

- Chiết tách, phân lập các chất

- Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập được

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 THỰC VẬT HỌC

Cây bụi hoặc gỗ, ít khi là bụi nhỏ hay cỏ

Lá đơn, mọc cách hay đối, không có lá kèm, cuống lá thường phân đốt

Hoa lưỡng tính, không hiếm khi thành cụm hoa hình đầu, không có cánh hoa Đặc trưng bởi lá đài thường hợp thành ống và thường có phần phụ (dạng cánh hoa hay dạng vảy) ở gần cọng đài Nhị đẳng số (45) và đối diện với lá đài, nhưng thường thì chúng gấp đôi và xếp thành 2 vòng ở 2 mức khác nhau; đôi khi có triền tuyến mật quanh nhụy Bộ nhụy gồm 2 -12 lá noãn, hợp thành bầu thượng 1 hoặc 2-5 (12) ô, mỗi ô chứa 1 noãn treo Quả dạng mọng hay hạch đôi khi là quả nang [4]

 Phân bố

Có 50 chi / 650 loài ở hầu khắp thế giới trừ Bắc cực Ở Việt Nam có 7 chi: Aquilaria, Daphne (Eriosolena), Edgeworthia, Enkleia, Linostoma, Rhamnoneuron, Wikstroemia và

hơn 15 loài [4]

1.1.3 Chi Wikstroemia Endl.

Wikstroemia Endl là một chi nhỏ gồm 55-70 loài cây bụi có hoa và cây nhỏ trong họ Thymelaeaceae Ở Việt Nam, chi này có 7 loài: W androsaemifolia, W cochinchinensis,

W indica, W dolichantha, W meyeniana, W nutans, W.poilanei [6].

1.1.4 Cây niệt gió (Wikstroemia indica)

Còn gọi là: Dó niết Ấn, dó cành, gió niệt, gió cánh, gió miết, gió tin thảo, sơn miên bì, địa ba ma, độc ngư đằng, gió cảnh

Tên khoa học: Wikstroemia indica (L.) C A Mey

Tên khác: Daphne cannabina Lour, Wikstroemia viridiflora Meisn., Wikstroemia indica var viridiflora Hook.f [6], [7], [10].

 Đặc điểm thực vật:

Theo các tài liệu: [7], [39], [10], [6]:

Niệt gió là cây bụi, mọc sum sê, quanh năm xanh tươi, cao 0,3-0,6m (1m), mang nhiều cành gầy, màu đỏ nhạt, nhiều khi mọc đối, có những sẹo lá nổ rõ lên

Lá mọc đối, phiến lá mỏng, hình trứng thuôn, dài 3-4cm, rộng 1- 2 cm, hai đầu tù hay hơi nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt; cuống rất ngắn

Hoa màu vàng lục mọc thành chùm ở đầu cành hay thành bông rất ngắn (0,5-1cm) Cuống hoa dài 1-2mm Đài màu xanh lá, hình ống hơi phình ở họng, chia 4 răng dài ngắn không đều; tràng 0; nhị 8, xếp thành 2 hàng dọc trên ống đài, chỉ nhị rất ngắn; bầu có 1 ô,

có ít lông ở đỉnh Quả mọng khi chín có màu đỏ tươi hình trứng, kèm theo vết tích của bao hoa, phần cơm hơi dầy Hạt có vỏ mỏng và mềm, vỏ trong cứng và đen nhạt Mùa hoa: tháng 5-9 Mùa quả: tháng 6-12

 Phân bố:

Việt Nam: Mọc hoang khắp nơi núi rừng, bụi bờ nước ta, từ vùng núi thấp đến các

tỉnh Trung du Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ [7]

Thế giới: Mọc nhiều ở ngọn đồi, núi đá dốc, nơi có nhiều cây bụi, độ cao dưới 1500

m Phân bố chủ yếu ở Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hải Nam, Hồ Nam, Tứ Xuyên, Đài Loan, Vân Nam, Chiết Giang, Ấn Độ, Malaysia, Myanma, Philippin, Thái Lan, Việt Nam, Úc, quần đảo phía đông, nam Thái Bình Dương, Mauritius, Sri Lanka [39]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng W indica có chứa các thành phần có hoạt tính

sinh học phong phú bao gồm cả flavonoid, biflavonoid, coumarin, lignan, acid béo và polysaccharid Trong đó thành phần hóa học đặc trưng của cây này là biflavonoid

1.2.1 Flavonoid

Chín flavonoid đã được phân lập từ W indica và được xác định là:

kaempferol-3-O-β-D-glucosid (1) [23]; 5,7,trihydroxy-3',5'-dimethoxyflavon (2); 5-hydroxy-7,

4'-dimethoxyflavon (3) [27]; nicotiflorin (4); D-primeversyl genkwanin (5); quercitrin (6) [14]; thevetiaflavon (7) [23]; genkwanin (8); wikstroemin (9) [28] (hình 1.1), tricin (9a) [5]

Hình 1.1 Một số flavonoid phân lập từ niệt gió

1.2.2 Biflavonoid

Biflavonoid là thành phần đặc trưng của W indica Các biflavonoid đã được phân

lập từ W indica là: sikokianin B (10); sikokianin A (10b), sikokianin C (11); Sikokianin

D (11b) (từ dịch chiết n-buthanol của rễ W indica) [15, 37]; wikstrol A (12); wikstrol B

(13); genkwanol A (14); daphnodorin B (15) [7] Gần đây các nhà khoa học đã phát hiện

thêm ba biflavonoid là: 4'-methoxydaphnodorin E (16) [36];

4'-methoxydaphnodorin D1 (17) và 4'-4'-methoxydaphnodorin D2 (18) [35]

Theo các tài liệu đã công bố, một số coumarin đã được phân lập ra từ W indica bao

gồm: umbelliferon (19); daphnoretin (20); daphnoretin-7-O-β-D-glucosid (21); 6'-hydroxy, 7-O-7'-dicoumarin (22) [13, 15, 4] và wikstrosin (23) [24] Me H.K cùng cộng sự (2007) cũng đã tìm thấy edgeworin (24), và daphnogitin (25) [20] có trong W indica.

Lignan là một nhóm các hợp chất chuyển hóa thứ cấp thực vật Từ phân đoạn ethyl

acetat của W indica, các nhà khoa học đã phân lập và xác định cấu trúc của bốn lignan

epoxy là: matairesinol (26), wikstromol (27), arctigenin (28) và pinoresinol (29) [23] Ngoài ra, các đồng phân: (+)-arctigenin, (+)-medioresinol (30) [20, 28] (+)-lariciresinol (31), (-)-secoisolariciresinol (32) [4] cũng đã được phân lập.

1.2.5 Acid béo

Sử dụng phương pháp cất kéo hơi nước để chưng cất kết hợp với phương pháp sắc

ký khí khối phổ (GC-MS), các nhà khoa học đã xác định được dầu từ W indica bao gồm

37 hợp chất với thành phần cấu tạo chủ yếu là acid hexadecanoic, acid 9-octadecenoic, acid 9,12-octadecadienoic, acid 9-hexadecenoic, acid pentadecanoic, acid dodecanoic và acid decanoic với tỉ lệ khối lượng tương ứng là 60,44%; 7,13%; 5,48%; 2,42%; 1,21%; 0,76% và 0,51% [17]

1 2.6 Các thành phần khác

Ngoài các thành phần đã được nêu ở trên, nhiều thành phần khác cũng đã được phân

lập từ W indica đó là:

+Sesquiterpen: Indecanon dưới dạng dầu không màu (33) [28],

+ Phytosterol: 7-oxo-β-sitosterol (34) [26], stigmastan-3,7-diol (35), stigmast-5 3β,7α-diol (36), daucosterol (37) [13],

en-+ Anthraquinon: physcion (38),

+ Các chất nhóm acetanilid: asperglaucid (42) và anabellamid (43) [26] được phân lập

từ phân đoạn ether dầu,

+ Polysaccharid: Các polysaccharid có trong W indica cấu tạo từ glucose, arabinose,

acid galacturonic, galactose và xylose [9],

+ Các chất khác: docosyl-3-methoxy-4-hydroxyferulat (39), hexacosoic-α-glycerid acid (40) và 4-(l,2,3-trihydroxypropyl)-2,6-dimethoxyphenyl-l-O-β-D-glucopyranosid (41)

[13]

26 28

37

Hình 1.4 Một số hợp chất khác phân lập từ niệt gió

1 3 TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ TÁC DỤNG TRÊN LÂM SÀNG

W.indica đã được chứng minh có nhiều tác dụng dược lý như kháng khuẩn, kháng

virus, kháng viêm, ức chế khối u, chống sốt rét và chống dị ứng

1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn

Nước sắc W indica có hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ, kháng lại 4 loại

vi khuẩn thử nghiệm là Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Sarcina lutea với giá trị MIC tương ứng là 156, 78, 78 và 39 (mg/ml); giá trị MBC tương ứng là

312, 156, 156 và 78 (mg/ml) [28] Khả năng kháng khuẩn của W indica cũng được thể

hiện rõ rệt ở chế phẩm chứa 4,01g bột thô [12]

1.3.2 Tác dụng kháng virus

W indica có tác dụng ức chế đáng kể trên một số virus như virus cúm, virus viêm gan

B và HIV-1 [15], cao chiết từ W indica có khả năng ức chế trực tiếp lên virus cúm (type 1)

[25] Arctigenin (28), và daphnoretin (20) trong niệt gió cho thấy tác dụng ức chế hoạt

động của virus HIV-1 [15, 25] Năm 1996, Chen và cộng sự đã chứng minh daphnoretin là chất hoạt hóa protein kinase C và có tác dụng ức chế mạnh lên virus hepatitis B (HBV)

trong tế bào gan của người [11] Các hợp chất 4'- methoxydaphnodorin E (16) và daphnoretin (20) có khả năng ức chế mạnh virus hợp bào hô hấp (RSV) với giá trị IC50 tương ứng là 2,8 μg/ml [36] và 5,87 μg/ml [34]

1.3.3 Tác dụng chống sốt rét

Trong khảo sát in vitro sàng lọc các thảo dược có tác dụng chống sốt rét, cao chiết butanol từ rễ của W indica cho thấy có tác dụng ức chế đáng kể ký sinh trùng sốt rét

n-Trong đó, hai biflavonoid là sikokianin B (10) và sikokianin C (11) có khả năng kháng lại

các chủng Plasmodium falciparum kháng chloroquin với giá trị IC50 tương ứng là 0,54 µg/ml và 0,56 µg/ml [15]

1.3.4 Tác dụng chống viêm

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh W indica có khả năng kháng viêm Tác dụng này

chủ yếu do sự có mặt của wikstroemin (9) Wikstroemin có thể ức chế rõ rệt sự phù nề và

sưng tấy ở chuột Khả năng kháng viêm của W indica được thể hiện ở cả giai đoạn đầu và

giai đoạn tăng sinh của quá trình viêm Hơn nữa, wikstroemin cũng có thể làm giảm sản xuất acid acetic, chất gây ra phản ứng đau nhức ở chuột, mà không gây nghiện như các

thuốc giảm đau thông thường [27] W indica dạng viên cho thấy có tác dụng chống viêm

rõ rệt trên chuột cống ở liều 3,6 g/kg và 7,2 g/kg trọng lượng cơ thể, và trên chuột nhắt ở liều 15,0 g/kg trọng lượng cơ thể [12]

1.3.5 Tác dụng ức chế khối u và tế bào ung thư

Chen và cộng sự đã sử dụng dịch chiết nước, các phân đoạn khác nhau của dịch chiết

ethanol 95% của W indica, khảo nghiệm in vitro trên ba dòng tế bào ung thư (Hela,

SGC-7901, Bel-7402) để sàng lọc tác dụng ức chế khối u của W indica Kết quả cho thấy dịch

chiết ethanol 95% có tác dụng ức chế mạnh mẽ trên các dòng tế bào ung thư Trong đó, các

phân đoạn ether dầu, chloroform và ethyl acetat của W indica được xác định là có tác

dụng gây độc tế bào [10] Trong quá trình nghiên cứu sàng lọc, daphnoretin (20) được phát

hiện là nhân tố chính trong tác dụng ức chế khối u của W indica Chất này cho thấy tác

dụng ức chế sự tăng trưởng của khối u và di căn Thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư

là AGZY-83-a, Hep2 và HepG2 daphnoretin từ W indica có tác dụng ức chế khối u rõ rệt

với giá trị IC50 tương ứng là 8,73; 9,71 và 31,34 μg/ml Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy

tỉ lệ sống sót của ba loại tế bào ung thư này giảm rõ rệt sau khi được điều trị bằng daphnoretin (10,30 μg/ml trong 72 giờ), đồng thời nồng độ canxi trong tế bào tăng lên rõ rệt (P <0,05) Sự ức chế của daphnoretin có thể liên quan đến quá tải canxi trong tế bào [29]

Nước sắc W indica cho thấy tác dụng ức chế mạnh trên khối u sarcoma lymphotic

(L-1) dạng cổ trướng và khối u cổ trướng Ehrlich ở chuột với tỷ lệ tương ứng 45,4% và 97% Dịch nước sắc này cũng ức chế rõ rệt tế bào ung thư cổ tử cung và ung thư bạch cầu trên chuột [18]

Các thành phần có hoạt tính sinh học như wikstroemin (9), matairesinol (26) và

arctigenin (28) có tác dụng chống ung thư bạch cầu Đồng thời, các flavonoid từ W indica

cũng có khả năng chống ung thư bạch cầu hiệu quả [15]

Các polysaccharid có trong W indica có tác dụng kích thích rõ ràng đến tế bào tạo

máu ở cả hai loại bình thường và mang khối u của chuột (làm tăng số lượng tủy xương

GM-CFU-C) Ngoài ra, polysaccharid từ W indica còn có tác dụng ngăn ngừa tác hại của

tia bức xạ [9]

1.3.6 Ảnh hưởng trên hệ sinh dục

Các este diterpen từ Thymelaeaceae được đánh giá là có khả năng gây sảy thai [28]

Dịch chiết ether dầu từ rễ W.indica có tác dụng trên cơ quan sinh sản khi thí nghiệm trên

chuột, chó và khỉ Liều có tác dụng tương ứng là từ 50-100; 0,5 và 0,05-0,06 mg/kg Không có thay đổi bất thường nào được phát hiện trong trọng lượng cơ thể, mức thẩm thấu hồng cầu cũng như chức năng gan, thận của các động vật được thí nghiệm Cũng theo thí

nghiệm trên, stigmast-5-en-3β,7α-diol (36) được xác định là thành phần có thể gây sảy thai

khi mang thai trong ba tháng giữa của thai kỳ [32]

1.3.7 Thúc đẩy ung thư

Mặc dù nhiều thành phần trong W indica có hoạt tính ức chế khối u, một số chất lại có khả năng thúc đẩy sự phát triển của khối u Dịch chiết ether của W indica gây cảm

ứng trên kháng nguyên sớm của virus Epstein-Barr (EB) và thúc đẩy sự đột biến các tế bào lympho gây ra bởi virus EB [31] Dịch chiết nước cũng có tác dụng thúc đẩy ung thư biểu

mô mũi họng và ung thư cổ tử cung ở chuột gây ra bởi methylcholanthren và virus herpes simplex [22].

1.3.8 Độc tính và tác dụng phụ

Một số nghiên cứu cho thấy W indica có độc tính W indica có thể gây ra ngộ độc với

các biểu hiện như: chóng mặt, mắt mờ, buồn nôn, nôn mửa, bụng căng, đau bụng và tiêu

chảy Rễ W indica có thể gây ra loạn nhịp tim, đôi khi nổi mề đay Tuy nhiên, dịch chiết

từ W indica đã được chứng minh là có độc tính thấp [7] Trong thí nghiệm độc tính cấp

của Lin L.M., liều uống dung nạp tối đa ở chuột là 172 g/kg dược liệu, bằng 238,2 lần liều uống thông thường ở người lớn Theo thử nghiệm độc tính bán trường diễn ở chuột, không

có thay đổi có ý nghĩa về hành vi, màu lông, mức ăn, trọng lượng cơ thể, cũng như công

thức máu sau khi cho uống thuốc viên với W indica 18,1 g/kg và 36,2 g/kg trong 30

- Vỏ rễ và vỏ thân để chữa tuyến lâm ba kết hạch, hen suyễn, ho gà, viêm

amidan, viêm tuyến mang tai; lá tươi đắp chữa đinh nhọt, sưng tấy, vết thương, rắn cắn [1], [2], viêm vú cấp tính và viêm mô tế bào [28]

- Vỏ thân có tác dụng lợi tiểu, tán kết dùng trong bệnh cổ trướng [1]

- Dịch truyền và nước sắc từ rễ W indica kết hợp một số loại thảo mộc đã được sử

dụng để phòng và điều trị nhiều bệnh khác nhau, như bệnh về đường hô hấp, nhiễm khuẩn, bệnh viêm gan, viêm tuyến vú và hội chứng thận hư [8, 28, 30]

Các ứng dụng lâm sàng của niệt gió được tóm tắt ở bảng 1.1.[28]

Bảng 1.1 Các ứng dụng lâm sàng của W indica

Bệnh

Nhóm điều trị

bằng W

india

(số ca)

Nhóm đối chứng (số ca)

Thời gian (ngày)

Tỉ lệ có tác dụng ở nhóm điều trị (%)

Tỉ lệ có tác dụng ở nhóm đối chứng (%)

Tỉ lệ khỏi hẳn

ở nhóm điều trị (%)

Tuy nhiên, ở một khía cạnh khác, có nghiên cứu chỉ ra rằng niệt gió làm thúc đẩy ung thư Vì vậy, việc nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các bộ phận

trong cây niệt gió ở Việt Nam là một việc làm cần thiết để làm sáng tỏ tiềm năng và giá trị làm thuốc của cây thuốc quý này

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

- Mẫu nghiên cứu là thân rễ của cây niệt gió được thu hái vào tháng 5/2011 tại Bắc Giang Mẫu cây được lưu tiêu bản tại Khoa Tài nguyên dược liệu – Viện dược liệu và đã

được ThS Nguyễn Quỳnh Nga thẩm định và kết luận tên khoa học là Wikstroemia indica

C.A Mey thuộc họ Trầm (Thymelaeaceae)

- Thân cây niệt gió được phơi khô, cắt miếng mỏng và xay nhỏ làm mẫu nghiên cứu

Hình 2.1 Hình ảnh cây niệt gió chụp tháng 5/2011 tại Bắc Giang

2.1.2 Thiết bị, hóa chất

 Thiết bị

- Tủ sấy dược liệu MEMMERT

- Máy xác định độ ẩm PRECISA

- Cân phân tích PRECISA

- Máy đo điểm chảy STUART

- Máy cất quay lớn BUCHI

- Máy cất quay nhỏ BUCHI

- Cột sắc ký, bình chiết quả lê, bình nón, bình cầu, cốc có mỏ, ống nghiệm, pipet pasteur, phễu lọc Buchner

- Đèn tử ngoại (UV)

- Máy đo phổ hồng ngoại IMPAC 410-NICOLET FT-IR

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE-500 MHz

 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết thích hợp:

- Dung môi: MeOH, ethanol, n-hexan, aceton, dicloromethan, chloroform, EtOAc… và các thuốc thử

- Silicagel cho sắc ký cột (0,04-0,063 mm, Merck)

- Bản mỏng silicagel tráng sẵn (MERCK): Pha thuận (Silica gel 60 F254) và pha đảo (Silica gel 60 RP-18 F254 s) hoạt hóa trong tủ sấy ở nhiệt độ 105-110◦C trong 60 phút

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong thân cây niệt gió: Sử dụng các phản ứng

tạo màu, phản ứng đặc trưng trong ống nghiệm với các thuốc thử chung của từng nhóm chất để phát hiện sự có mặt của các nhóm chất trong dược liệu (theo các tài liệu [1], [2], [3])

2.2.2.Định lượng tổng các chất chiết được trong các phân đoạn:

- Tạo cắn tổng bằng phương pháp ngâm với ethanol 950

- Chiết trên bình gạn với các dung môi thích hợp để thu được các phân đoạn dịch chiết

- Cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được các cắn khô, sau đó dùng phương pháp

cân để định lượng

2.2.3.Khảo sát các cắn phân đoạn bằng SKLM: Dùng bản mỏng tráng sẵn silicagel

GF254 để định tính số lượng chất có trong mỗi phân đoạn với các hệ dung môi thích hợp

2.2.4.Phương pháp tách và phân lập các hợp chất:

Để phân lập các hợp chất chúng tôi kết hợp các phương pháp:

- Sắc ký cột pha thuận, sử dụng silicagel cỡ hạt 0,040-0,0063mm, rửa giải với các hệ dung môi thích hợp

- Kết tinh lại trong hệ dung môi

Độ tinh khiết của các chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, nhận biết bằng đèn tử ngoại, phun dung dịch H2SO4 10% - hơ nóng, đo điểm chảy…

2.2.5.Nhận dạng cấu trúc các chất tách được từ thân cây niệt gió:

Sử dụng các phương pháp phân tích phổ thích hợp, kết hợp với tham khảo cơ sở dữ liệu phổ đã công bố:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT, kết hợp với các phổ hai chiều HMBC, HSQC

- Phổ IR

- So sánh SKLM với chất đối chiếu trong cùng điều kiện

Chương 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học

Thân cây niệt gió được chiết bằng các dung môi thích hợp để thu được các nhóm chất, sau

đó tiến hành loại tạp và làm giàu nhóm chất bằng các phương pháp khác nhau, dùng các thuốc thử, phán ứng hóa học đặc trưng để xác định sự có mặt của các nhóm chất

- Định tính alcaloid: Sử dụng phản ứng với thuốc thử chung: TT Mayer, TT Dragendorff,

TT Bouchardat của alcaloid

- Định tính flavonoid: Phản ứng Cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng với dd FeCl3 5%

- Định tính saponin: Hiện tượng tạo bọt

- Định tính glycosid tim: Phản ứng Liebermann-Burchard, phản ứng Baljet, phản ứng Legal, phản ứng Keller- kiliani

- Định tính coumarin: Phản ứng mở đóng vòng lacton, phản ứng Diazo hóa

- Định tính tanin: Phản ứng với dd FeCl3 5%, chì acetat 10%, dung dịch gelatin1%

Phản ứng với dd gelatin 1%

Ghi chú : (-) âm tính, (+) dương tính (++) dương tính rõ, (+++) dương tính rất rõ.

Nhận xét: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ta thấy thân cây Niệt gió có chứa

flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, đường khử, acid amin, anthranoid, polysaccharid, hợp chất steroid và không chứa alcaloid, glycosid tim, saponin, tannin, chất béo

3.2 Điều chế các phần chiết từ cây niệt gió

3 kg dược liệu khô được ngâm với cồn 90% ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần 3 ngày) Các dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng (190,55 g) Cặn chiết này được phân bố lại lần lượt trong các dung môi có độ phân cực tăng

dần: n-hexan, dichlomethan, ethyl acetat; cất loại hết dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần cặn chiết tương ứng n-hexan (17,79 g), dichlomethan (50,99 g), ethyl acetat (37,75

g) Cất kiệt dịch nước còn lại dưới áp suất giảm ở 80°C cho phần chiết nước

3.3 Phân tích, phân tách các phần chiết

3.3.1 Phần chiết n-hexan

Phân tích phần chiết n-hexan (WIH) bằng TLC

Dùng capila đưa chất lên bản mỏng tráng sẵn DC Aluflolien 60F254 Merck Sau đó khảo sát sắc kí lớp mỏng trong các hệ dung môi sau: n-hexan/ axeton; n-hexan/ etyl axetat

Sự phân tách đạt kết quả tốt khi khai triển trong hệ dung môi: n-hexan-aceton : 7/3

(v/v)