Nghiên cứu thành phần hóa học cây nghệ xanh (curcuma aeruginosa roxb )

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, là điều kiện rất thuận lợi cho nước ta phát triển một thảm thực vật phong phú, đa dạng, trong đó có một lượng rất lớn là các loại cây có chứa tinh dầu.Tinh dầu xuất hiện và được phát triển theo nền văn minh của nhân loại. Ngay từ thời thượng cổ, con người đã biết sử dụng tinh dầu để thờ cúng, làm hương liệu, dược liệu. Khi kỹ nghệ nước hoa ra đời và phát triển mạnh mẽ vào khoảng thế kỷ XVII thì người ta xem tinh dầu như là vàng lỏng bên cạnh những thứ được coi là vàng đen như than đá và dầu mỏ. Hiện nay tinh dầu được đánh giá là nguyên liệu có giá trị kinh tế cao của nhiều ngành công nghiệp, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, gia vị, mỹ phẩm… và là lĩnh vực quan trọng không thể thiếu được của các nhà khoa học khi nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên 12 18 22.Trong số hàng ngàn loại cây có chứa tinh dầu, chi nghệ (Curcuma) thuộc họ Zingiberaceae là loài cây thảo phân bố ở rừng hầu khắp Việt Nam và nhiều nước trên thế giới. Là thảo dược không có độc tính và gia vị độc đáo mang tính truyền thống, nghệ đã trở thành cây thuốc quý, gần gủi trong đời sống hàng ngày.

Nghiên cứu thành phần hóa học cây nghệ xanh (Curcuma aeruginosa Roxb.)

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU 4

MỞ ĐẦU 5

1 Đặt vấn đề 5

2 Đối tượng nghiên cứu 6

3 Mục đích và nội dung nghiên cứu 6

4 Phương pháp nghiên cứu 6

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 Sơ lược về loài nghệ 8

1.2 Tình hình nghiên cứu về hóa học 8

1.3 Khảo sát một số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống với đối tượng nghiên cứu 9

1.3.1 Curcuma aromatica Salisb 9

1.3.2 Curcuma elata Roxb 11

1.3.3 Curcuma aeruginosa Roxb 13

Chương 2 THỰC NGHIỆM 16

2.1 Đặc điểm thực vật loài nghệ xanh ở Hướng Hóa - Quảng Trị .16

2.2 Thu hái và xử lý mẫu 17

2.3 Chưng cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước 17

2.4 Xác định các chỉ số vật lý của tinh dầu thân rễ 18

2.4.1 Chỉ số khúc xạ 18

2.4.2 Tỉ trọng tinh dầu 18

2.5 Xác định các chỉ số hóa học của tinh dầu thân rễ .18

2.5.1 Hàm lượng tinh dầu thân rễ 18

2.5.3 Chỉ số este 19

2.6 Chiết soxhlet mẫu thân rễ 19

2.7 Xác định TPHH 19

2.8 Phân lập cấu tử trong tinh dầu 19

2.8.1 Sắc kí cột 19

2.8.2 Sắc kí bản mỏng 20

2.8.3 Tách và xác định cấu trúc 21

2.9 Thử hoạt tính sinh học 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Hàm lượng và chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu thân rễ nghệ xanh 23

3.2 TPHH của tinh dầu nghệ xanh Hướng Hóa - Quảng Trị 25

3.2.1 Thành phần hóa học của tinh dầu lá(Tu-1) 25

3.2.2 Thành phần hóa học của tinh dầu thân (Tu-2) 26

3.2.3 Thành phần hóa học của tinh dầu rễ (Tu-3) 27

3.2.4 Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ (Tu-4) (10/10/2006) 29

3.2.5 Thành phần hóa học của tinh dầu thân rễ (Tu-7) (08/08/2007) 31

3.3 Thành phần hóa học tinh dầu các bộ phận thực vật 33

3.4 Thành phần hóa học chính của tinh dầu thân rễ nghệ xanh Hướng Hóa - Quảng Trị và một số loài nghệ khác đã công bố 34

3.5 Thành phần hóa học dịch chiết bã thân rễ trong dung môi n-hexan 36

3.6 Xác định cấu trúc phân tử của hợp chất tách được 37

3.6.1 Chất rắn tách được từ phân đoạn Tu-6 37

3.6.2 Chất rắn tách được từ phân đoạn Tu-11 38

3.7 Hoạt tính sinh học của tinh dầu và dịch chiết thân rễ trong n-hexan 48

KẾT LUẬN 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

1H- NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HSQC : Heteronuclear single quantum coherence

Tu-6 : Tinh thể tách được ở phân đoạn 171-181 trong hệ dung

môi rửa giải n-hexan:dietylete 9:1Tu-11 : Tinh thể tách được phân đoạn 48-82 trong dung môi

rửa giải n-hexan

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU

Hình 2.1 Loài nghệ xanh ở Hướng Hóa - Quảng Trị 16

Hình 2.2 Sơ đồ chưng cất và xác định TPHH tinh dầu 17

Hình 2.3 Sắc kí cột tinh dầu thân rễ nghệ xanh 20

Hình 2.4 Sơ đồ chiết, tách, xác định TPHH thân rễ nghệ xanh 22

Hình 3.1 Sắc ký đồ GC của tinh dầu lá nghệ xanh 26

Hình 3.2 Sắc ký đồ GC của tinh dầu thân nghệ xanh 26

Hình 3.3 Sắc ký đồ GC của tinh dầu rễ nghệ xanh 29

Hình 3.4 Sắc ký đồ GC của tinh dầu thân rễ nghệ xanh (10/10/2006) 29

Hình 3.5 Sắc ký đồ GC của tinh dầu thân rễ nghệ xanh (08/08/2007) 31

Hình 3.6 Sắc ký đồ GC của dịch chiết thân rễ nghệ xanh 37

Hình 3.7 Sắc ký đồ GC của chất rắn tách được phân đoạn Tu-6 38

Hình 3.8 Phổ MS của chất rắn Tu-11 39

Hình 3.9 Phổ 13C- NMR và DEPT của chất rắn Tu-11 40

Hình 3.10 Phổ 1H- NMR của chất rắn Tu-11 40

Hình 3.11 Phổ COSY của chất rắn Tu-11 45

Hình 3.12 Phổ HSQC của chất rắn Tu-11 46

Hình 3.13 Phổ HMBC của chất rắn Tu-11 47

Bảng 1.1 TPHH tinh dầu thân rễ Curcuma aff elata Roxb 12

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu thân rễ Nghệ xanh 23

Bảng 3.2 Tỉ trọng tinh dầu thân rễ Nghệ xanh 23

Bảng 3.3 Chỉ số khúc xạ tinh dầu thân rễ Nghệ xanh 23

Bảng 3.4 Chỉ số axit tinh dầu thân rễ Nghệ xanh 24

Bảng 3.5 Chỉ số este tinh dầu thân rễ Nghệ xanh 24

Bảng 3.6 TPHH tinh dầu lá nghệ xanh .25

Bảng 3.7 TPHH tinh dầu thân nghệ xanh .27

Bảng 3.8 TPHH tinh dầu rễ nghệ xanh 28

Bảng 3.9 TPHH tinh dầu thân rễ nghệ xanh (10/10/2006) 30

Bảng 3.10 TPHH tinh dầu thân rễ nghệ xanh (08/08/2007) 32

Bảng 3.11 TPHH tinh dầu các bộ phân thực vật nghệ xanh 33

Bảng 3.12 TPHH chính của tinh dầu thân rễ nghệ xanh Hướng Hóa - Quảng Trị và một số loài nghệ xanh khác đã công bố 35

Bảng 3.13 TPHH dịch chiết bã thân rễ trong dung môi n-hexan 36

Bảng 3.14 Các nhóm nguyên tử của chất tách được có ký hiệu Tu-11 42

Bảng 3.15 Sự tương quan HMBC trong phân tử hợp chất Tu-11 43

Bảng 3.16 So sánh dữ liệu phổ 1H- NMR và 13C- NMR của chất Tu-11 với chất furanodien từ tài liệu [5] 44

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, là điều kiện rất thuận lợi cho nước ta phát triển một thảm thực vật phong phú, đa dạng, trong đó có một lượng rất lớn là các loại cây có chứa tinh dầu

Tinh dầu xuất hiện và được phát triển theo nền văn minh của nhân loại Ngay

từ thời thượng cổ, con người đã biết sử dụng tinh dầu để thờ cúng, làm hương liệu, dược liệu Khi kỹ nghệ nước hoa ra đời và phát triển mạnh mẽ vào khoảng thế kỷ XVII thì người ta xem tinh dầu như là "vàng lỏng" bên cạnh những thứ được coi là

"vàng đen" như than đá và dầu mỏ Hiện nay tinh dầu được đánh giá là nguyên liệu có giá trị kinh tế cao của nhiều ngành công nghiệp, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, gia vị,

mỹ phẩm… và là lĩnh vực quan trọng không thể thiếu được của các nhà khoa học khi nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên [12] [18] [22]

Trong số hàng ngàn loại cây có chứa tinh dầu, chi nghệ (Curcuma) thuộc họ Zingiberaceae là loài cây thảo phân bố ở rừng hầu khắp Việt Nam và nhiều nước

trên thế giới Là thảo dược không có độc tính và gia vị độc đáo mang tính truyền thống, nghệ đã trở thành cây thuốc quý, gần gủi trong đời sống hàng ngày

Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy nghệ tác dụng tốt tới nhiều hệ thống cơ quan trong cơ thể như chống oxy hóa, điều trị khối u, ung thư, HIV, chống

dị ứng, chống thụ thai, có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương chống viêm nhiễm, chữa viêm loét dạ dày, hành tá tràng, ăn không tiêu, nôn mửa, ho Công dụng của nghệ được người dân phát hiện ngày càng nhiều trong gia vị hay

thuốc chữa bệnh truyền thống Thân rễ và rễ C Aeruginosa được người dân Thái Lan sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm, C Aromatica có công dụng giá trị là thiết lập sự ổn định của tuần hoàn máu và điều trị ung thư của y học hiện đại C Xanthorrhiza được dân gian sử dụng trong điều trị bệnh dạ dày, rối loạn tiêu hóa, táo

bón, tiêu chảy, kiết lị, tiêu chảy, sốt rét, trĩ, ói mửa Đặc biệt có giá trị và được nghiên cứu nhiều nhất là chất Curcumin trong củ nghệ với những tác dụng rất hữu ích, mở ra những hứa hẹn tốt đẹp trong việc điều trị những bệnh hiểm nghèo [9] [13]

Một trong những phương thuốc cổ truyền của người dân tộc Pa Cô và Vân Kiều ở huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị là phụ nữ sau khi sinh, người ta giã củ

"nghệ xanh" cho uống có tác dụng điều hòa khí huyết, giảm co thắt tử cung, phục

hồi sinh lực và sản phụ không cần phải uống loại thuốc nào khác Với những công

dụng độc đáo trên chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học cây nghệ xanh (Curcuma aeruginosa Roxb.) ở huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị" nhằm góp

phần vào việc phân loại hóa học, phân loại thực vật để bổ sung thêm những nghiên

cứu về chi Curcuma nói riêng và họ Zingiberaceae nói chung Qua đó góp phần giải

thích tác dụng chữa bệnh của loại nghệ này mà dân tộc thiểu số đã dùng, cũng như đóng góp vào vườn thuốc y học cổ truyền của nước nhà

2 Đối tượng nghiên cứu

Thân rễ, rễ, thân và lá loài nghệ xanh (Curcuma aeruginosa Roxb.) huyện

Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị

3 Mục đích và nội dung nghiên cứu

- Tìm hiểu đặc điểm hình thái thực vật và thành phần hóa học một số loài

Curcuma mọc hoang và trồng ở một số địa phương đã được nghiên cứu Xác định tên khoa học loại nghệ xanh ở Hướng Hóa - Quảng Trị

- Xác định hàm lượng và phân tích TPHH tinh dầu ở các bộ phận lá, rễ, thân

rễ và dịch chiết thân rễ trong dung môi n-hexan của loài nghệ xanh ở Hướng Hóa - Quảng Trị

- Tách và xác định cấu trúc cấu tử trong tinh dầu thân rễ loài nghệ xanh ở Hướng Hóa - Quảng Trị

- Thử hoạt tính sinh học của tinh dầu và dịch chiết loài nghệ xanh ở Hướng

Hóa - Quảng Trị

4 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết: Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, TPHH, ứng dụng của cây thuộc chi

Curcuma gần giống với đối tượng nghiên cứu.

- Xác định tên khoa học của cây: Đối chiếu với các tài liệu, so sánh với mẫu tiêu bản, nhờ các chuyên gia thực vật định tên khoa học của loài nghệ xanh ở Hướng

Hóa - Quảng Trị

- Tách tinh dầu: Chưng cất lôi cuốn hơi nước.

- Xác định các chỉ số vật lý: Xác định chỉ số khúc xạ bằng khúc xạ kế ABBE, xác định tỉ trọng tinh dầu

- Xác định TPHH của tinh dầu: Sắc kí khí - khối phổ liên hợp (GC/MS)

- Chiết Shoxlet bã thân rễ sau khi chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng dung môi n-hexan và xác định TPHH bằng phương pháp sắc kí khí - khối phổ liên hợp (GC/MS)

- Tách, phân lập và nhận danh các cấu tử từ tinh dầu bằng phương pháp sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HSQC

- Thử hoạt tính sinh học của tinh dầu trên các vi khuẩn Escherichia coli và nấm candida albicans tại bệnh viện TW Huế

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về loài nghệ

Chi Curcuma (nghệ) thuộc họ Zingiberaceae (gừng) hiện có khoảng 97 loài

mọc hoang dại và được trồng khắp các nước Đông Nam Á, Australia thuộc khu vực có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt phát triển phong phú và đa dạng nhất ở Ấn Độ và Trung Quốc, Thái Lan, Miến Điện, Malaixia Ở Việt Nam có 19

loài thuộc chi Curcuma đã được công bố và khai thác sử dụng làm phẩm màu thực

phẩm, nhuộm vải, làm gia vị, thuốc [9] [14]

Chi nghệ thuộc loại cây thảo ít khi cao đến 2m Thân rễ khỏe, nạc, phân nhánh, thịt thường có màu, các củ treo ở đầu ngọn rễ Lá hình dải, mũi mác, cán hoa

có lá ở gốc hoặc riêng biệt với thân mang lá Bông thường hình trụ với một cái chỏm

có màu hoặc hình trứng, không chỏm Các lá bắc ít nhiều màu xanh lục, bao lấy nụ hoa Hoa màu vàng hay hồng nhiều khi ẩn trong các lá bắc Đài hợp phía dưới thành hình ống có răng, tràng có ống ngăn, các thùy gần bằng nhau, thùy lưng rộng hơn Bao phấn có ô song song đôi khi nhọn ở gốc, nhị lép hình cánh hoa to gần bằng cánh môi nhiều khi gắn liền ở gốc chỉ nhị Cánh môi thường rộng và ngắn…[ 9 ]

1.2 Tình hình nghiên cứu về hóa học

Bộ phận chính được sử dụng và nghiên cứu nhiều nhất của cây nghệ là thân

rễ Thành phần chủ yếu của các loài nghệ là các hợp chất secquiterpenic, trong đó các α,β-xeton sesquiterpenoic không no là những chất thường có nhiều hoạt tính sinh học quý giá

- Trên thế giới: Có nhiều công trình nghiên cứu tương đối sâu rộng về TPHH

nghệ vàng (Curcuma longa), nghệ đen (Curcuma zedoaria), một số loài khác ít được

nghiên cứu hơn Nhiều cấu trúc secquitecpen có cấu trúc mới được phân lập từ tinh dầu nghệ vàng, nghệ đen, nghệ trắng, nghệ xanh

- Trong nước: Đi đầu trong lĩnh vực nghiên cứu về nghệ có các tác giả như

Phạm Thị Ánh Tuyết, Lương Sĩ Bỉnh, Phan Minh Giang, Vũ Ngọc Lộ, Phan Tống Sơn, Phạm Xuân Trường, Nguyễn Thị Bích Tuyết đã khảo sát được TPHH một số

loài như Curcuma longa Linn, Curcuma zedoaria Rose, Curcuma aromatica Salisb., Curcuma elata Roxb., Curcuma aeruginosa Roxb và một số loài Curcuma sp

khác

TPHH thường có sự khác nhau giữa các loài nghệ, giữa các bộ phận thực vật, giữa các khu vực phân bố, thời điểm nghiên cứu hay phương pháp nghiên cứu

Đối với tinh dầu thân rễ Curcuma longa Linn được Keiker, Rao và cộng sự ở

Indonesia nghiên cứu năm 1934 theo gồm các chất sau: d-α- phellandren (1%), βsabinen (0,6%); 1,8-cineol (1,0%); borneol (0,5%); zingiberen (2,0%); một hỗn hợp xeton sesquiterpen vòng no gọi là turmeron C15H24O và một xeton thơm C15H20O gọi

-là ar-turmeron (chiếm khoảng 40% hỗn hợp) Tinh dầu thân rễ Curcuma longa Linn

ở Ấn Độ chứa khoảng 80% là sesquiterpen, trong đó ar-turmeron (40%), zingiberen (25%), còn monoterpen có cineol (1,0%); borneol (0,5%) Ở Việt Nam, năm 2001,

Nguyễn Thị Bích Tuyết đã xác định được hơn 20 chất trong tinh dầu lá Curcuma

-phellandren (24,5%); 1,8-cineol (15,9%) và p-cymen (13,2%)

Rao, Shintre và Simosen đã nghiên cứu tinh dầu của thân rễ khô Curcuma

d-camphen (3,5%); cineol (9,6%); d-camphor (4,2%); d-borneol (1,5%); sesquiterpen

(10%), sesquiterpen ancol (48%) Trong khi đó tinh dầu Curcuma zedoaria Rose ở

Việt Nam chứa khoảng > 30% là sesquiterpen có M > 232 và 3-10% là campho, γ

-muurolen; borneol; α -farnesen; germacron

Như vậy việc khảo sát đầy đủ về phần hóa học các loại nghệ còn là phạm trù rộng lớn cho các nhà khoa học nghiên cứu về hợp chất tự nhiên

1.3 Khảo sát một số loài nghệ có đặc điểm thực vật gần giống với đối tượng nghiên cứu

1.3.1 Curcuma aromatica Salisb.

Có nhiều tên gọi khác nhau

Chinese: Yujin

French: Safran des indes

Thailand: Wan nang kham

Việt Nam: Nghệ rừng, Nghệ trắng [31]

Cây cao khoảng 1m, thân rễ màu vàng, rất thơm mùi long não Lá có phiến dài 30-60cm, rộng 15cm, cuống ngắn Phát hoa ở đất cao 20cm, rộng 7cm, lá hoa trên màu hồng, cánh hoa dài khoảng 1cm, môi tròn, noãn sào có lông [9]

Tinh dầu thân rễ Curcuma aromatica Salisb ở Ấn Độ chứa một số cấu tử

chính: d–camphen (0,8%); d–camphor (2,5%); sesquiterpen một vòng gồm hai đồng phân: l–α–curcumen; l–β–curcumen; sesquiterpen ancol (22%); Axit p–metoxy cinamic và một số chất chưa biết khác Thành phần chính của tinh dầu lá ở Ấn Độ

có chứa α- pinen (4,77%); β- pinen (3,70%); pabinen (0,68%); pyrcen (0,39%); α- phellandren (1,40%); 1,8–cineol (28,01%); p-cymen (1,45%); C8-andehit (2,62%); linalool (7,76%); paryophyllen (2,01%); geraniol (1,28%) [ 29]

Dịch chiết thân rễ tươi Curcuma aromatica Salisb ở Nhật Bản có các chất: germacron; curdion; (4S, 5S)–germacron; 4,5–epoxid; dehidrocurdion; neocurdion;

curcumenon; procurcumenol; metyl-zedoarondiol; zedoarondiol; isozedoarondiol… [30]

Theo tác giả Lương Sĩ Bỉnh, tinh dầu thân rễ Curcuma aromatica Việt Nam

có màu lục nhạt, có mùi thơm dễ chịu và các hằng số vật lí: nD30= 1,5150;

d20=1,0107 Phân tích tinh dầu bằng GC/MS kết quả thu được: 1,8–cineol (1,55%); terpinolen (2,12%); β–elemen (1,52%); humulen (2,56%); curzerenon (38,78%); germa–1(10), 4, 7(11)-trien–8–on (11,22%)… [1] [17]

Ở Việt Nam, dịch chiết ete dầu hỏa và etylaxtat từ Curcuma aromatica Salisb

có thành phần chủ yếu là các sesquiterpenoid có khung germacran và guain như furanodien; furanodienon; curzeron; curdion; curcumenon; zederon Tác giả Lương

Sĩ Bỉnh đã tiến hành tách tinh dầu nghệ trắng trên cột silicagen với hệ dung môi rửa giải ete dầu hỏa, etylaxetat kết quả tách được chất tinh khiết curzerenon C15H18O2

(tác giả cũng đã tách được chất này trong cây nghệ xanh) [1]

Trong dịch chiết thân rễ Curcuma aromatica Salisb trồng ở Sóc Sơn, Hà Nội gồm: furanodien (4,7%; 4,7%); α–selinen (0,8%; 0,9%); furanodienon và curzerenon

(30,7%; 20,7%); (E, E)–germacron (8,2%; 4,2%); curdion (3,4%; 2,3%); neocurdion

(5,0%; 3,0%); curcumenon (4,4%); zederon (6,2%; 14,9%)…

Theo Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hướng và Phan Tống Sơn thành phần hoá

học các phần chiết ete dầu hoả và etyl axetat của thân rễ Curcuma aromatica Salisb

gồm: δ-elemen, β-elemen; γ-elemen; α-humulen; β-selinen; furanodien; α-selinen;

β-selinen; furanodienon; curzerenon; humulen epoxit II; humulen epoxit III; isospathulenol; γ-eudesmol; β-eudesmol; selin-7(II)-en-4α-ol; (E,E) germacron, curdion; curcumenol; neocurdion; curcumenon; β-selinen-bis- epoxit; zederon Các khảo sát GC/MS, phổ 1H-NMR và 13C-NM của các sesquiterpenoid phân lập từ các các phần chiết cũng như các phân đoạn cho thấy các phần chiết chứa chủ yếu là các sesquiterpenoid, trong đó các thành phần có hàm lượng lớn có khung germacran [6]

1.3.2 Curcuma elata Roxb

Chúng tôi tìm được hai tên gọi khác sau:

English: Giant plume ginger

Việt Nam: Mì tinh rừng [31]

"Cây cao hơn 1m, củ vàng tái trong vàng đậm hơn Lá hình phiến bầu dục có thể to đến 30x100cm, mặt dưới lá như nhung Phát hoa ở đất, xuất hiện trước lá, cao 20cm, lá hoa xanh, bầu dục rộng, các lá hoa trên có màu tim tím, cánh hoa màu trắng hay hồng, cánh môi màu vàng…" [8]

Đối với loài Curcuma elata Roxb chúng tôi chưa tìm thấy tài liệu nào trên

thế giới công bố TPHH cũng như về ứng dụng Trong nước chúng tôi tìm thấy ba công trình nghiên cứu:

- Tác giả Phạm xuân Trường (năm 1999) nghiên cứu cây Curcuma elata

Roxb ở miền Bắc (thuộc các tỉnh Cao Bằng, Hòa Bình, Yên Bái, Nam Định) Tinh dầu thân rễ to có màu vàng xám, mùi thơm dịu, vị cay tê Hàm lượng tinh dầu 0,34%; n=1,5014 TPHH của tinh dầu được xác định trên máy GC và GC/MS tại

ĐH Hamburg – CHLB Đức (bảng 1.1) [20]

- Tác giả Nguyễn Thị Bích Tuyết (năm 2001) nghiên cứu cây Curcuma elata

tím sẫm TPHH của tinh dầu thân rễ được xác định bằng GC và GC/MS tại ĐH Wurzburg – CHLB Đức (bảng 1.1) [21].

- Tác giả Trần Thị Hòa (năm 2005) đã nghiên cứu cây Curcuma elata Roxb ở

Đăklăk Tinh dầu thân rễ có màu tím sẫm, nhẹ hơn nước hàm lượng tinh dầu: 0,243%; n32,7 = 1,488 (bảng 1.1) [8]

Bảng 1.1 TPHH tinh dầu thân rễ Curcuma aff elata Roxb.

ở tỉnh Kon Tum, tỉnh Đăklăk và ở miền bắc Việt Nam

Cấu tử ở Kon Tum (%)C elata Roxb. ở Đăklăk (%)C elata Roxb. ở Miền Bắc (%)C elata Roxb.

- Tác giả Trần Thị Hòa đã tiến hành chiết thân rễ Curcuma aff elata Roxb

bằng phương pháp chiết Soxhlet với dung môi n-hexan Các cấu tử trong dịch chiết

được nhận danh bằng phương pháp GC/MS tại Phòng cấu trúc - Viện Hoá học Hà Nội có khoảng 23 cấu tử Trong đó, thành phần chính gồm: epicurzerenon (33,24%); iso-α-cedren(29,78%); furanodien (5,63%); camphor (5,39%); α-myrcen (2,93%); germacron (2,51%), borneol (1,72%) …[8]

Từ dịch chiết n-hexan tác giả đã tách được phân đoạn của sắc kí cột rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan:axeton = 9:1 có chứa cấu tử curzerenon (54,8%) Ngoài

ra, từ dịch chiết hexan tác giả cũng tách được phân đoạn bằng hệ dung môi hexan:đietylete = 8:2 có chứa các cấu tử: benzen 1,3-điisopropyl-5-etyl (48,45%); bis (2-etylhexyl) phtalat (12,53%); butylat hiđroxi toluen… [8]

n-1.3.3 Curcuma aeruginosa Roxb.

Có nhiều tên gọi khác nhau

English: Pink and blue ginger

Malaysia: Temu hitam

Thailand: Kha min dam

Việt Nam: Nghệ ten đồng, Nghệ đen, Nghệ xanh, Ngải tím [31]

Phân bố ở Ấn Độ, nam Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Malaixia, Indonexia Ở nước ta, cây mọc hoang và được trồng ở các vườn gia đình từ Hà Giang, Tuyên Quang vào thành phố Hồ Chí Minh [3]

Năm 1987 tác giả Lương Sĩ Bỉnh đã nghiên cứu thành phần hoá học tinh dầu

thân rễ nghệ xanh Curcuma aeruginosa Roxb ở Việt Nam bằng phương pháp phân

tích kết hợp GC và GC/MS với kết quả hơn 24 chất đã được xác định gồm: β-pinen (1,23%); 1,8-cineol (2,98%); camphor (1,61%); β-elemen (2,82%); α-zingiberen (2,72%) Dựa vào sự phân tích các dữ liệu trên phổ khối, 1H-NMR, phổ UV và phổ

IR đã xác định được cấu trúc của một số thành phần chính như: trien-8-on (12,83%) và curzerenon (19,90%) [1]

germacra-1,4,7(ll)-Phan Tống Sơn và các cộng sự (1998) đã nghiên cứu thành phần hoá học thân

rễ nghệ xanh ở Việt Nam và đưa ra kết luận: Trong tinh dầu thân rễ gồm có β-pinen (1,23%); 1,8-cineol (2,98%); camphor (1,61%); β-elemen (2,82%) và xác định

được cấu trúc của một số thành phần chính như: curzerenon (19,90%); 1,4,7(11)-trien-8-on (12,83%)

geracra-Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hướng và geracra-Phan Tống Sơn nghiên cứu TPHH của dịch chiết ete dầu hỏa (sau khi chiết bằng etanol) từ thân rễ nghệ xanh “var B”

(Curcuma aff aeruginosa Roxb.) ở Hà Nội năm 1998 thu được các sesquiterpen và

sesquiterpenoic sau: β-elemen (1,3%); isocaryophyllen (0,3%); γ-elemen (1,3%); αcurcumen (0,1%); α-humulen (0,5%); β-guaien + γ-muurolen (0,2%); (E)-β-farnensen (0,4%), furanodien (2,7%); virdifloren (0,6%); β- chamigren (0,1%); δ-cadinen (0,1%); β-sesquiphellandren (0,3%); humulen epoxit II (0,1%); furanodienon + curzerenon (23,1%); β- eudesmol (0,6%); guaiazulen (1,3%); (E,E)-gemacron (5,2%); curdion (15,3%); curcumol (3,2%); curcumenol (2,7%) Bảy cấu

-tử đã được phân lập từ dịch chiết trên là furanodien; (E,E)-gemacron; furanodienon, curdion, curzerenon, curcumol và curcumeno [5]

Theo nghiên cứu của S.Zhang và các cộng sự năm 1982, tinh dầu thân rễ

Curcuma aeruginosa Roxb ở Trung Quốc chứa curcumenol; isocurcumenol;

germacron và curzerenon Trước đó các tác giả này đã xác định trong tinh dầu thân

rễ Curcuma aeruginosa Roxb có chứa: α-pinen; limonen; linalool; caryophyllen và curzerenon với hàm lượng cao

Thành phần chính của tinh dầu thân rễ Curcuma aeruginosa ở Thái Lan gồm:

β-pinen (7,71%); 1,8-cineol (9,64%); curcumenol (41,63%) [27]

Tinh dầu thân rễ Curcuma aeruginosa Roxb ở Indonesia được xác định năm

1990 có chứa các hợp chất chính sau: isocurcumenol (8,5%); β-eudesmol (6,5%); curdion (3,6%); curcumenol (9,9%); curcumanolid A và B (11,4%); dehyđro-curdion (9,4%) và curcumol (1,9%) [17]

Tinh dầu của thân rễ Curcuma aeruginosa Roxb ở Malaysia chứa thành phần

chính gồm: curzerenon (24,6%); 1,8-cineol (11%); camphor (10,6%); zedoarol (6,3%); isocurcumenol (5,8%) và furanogermenon (5,5%) [ 26]

Một số tác giả đã nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính chống loét

của dịch chiết một số thành phần của Curcuma aeruginosa Roxb., trong đó có hoạt

chất difurocumenon đã được dùng để làm thuốc Kết quả nghiên cứu của Phan Tống Sơn và cộng sự đã cho thấy tinh dầu nghệ xanh Việt Nam cũng như curzenon thu

được từ tinh dầu này có khả năng chống vi khuẩn lao, kìm hãm sự phát triển in vitro

của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis H37RV Năm 1996 các tác giả Văn Ngọc Hướng, Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn đã nghiên cứu hoạt tính chống vi khuẩn

từ thân rễ nghệ xanh và đưa ra kết luận: Các cặn bã dịch chiết ete dầu hỏa và benzen của thân rễ nghệ xanh ở Phú Thụy, Gia Lâm, ngoại thành Hà Nội có tác dụng ức

chế 8 loại vi khuẩn gây bệnh Các vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella typhi, Kleb Pneumoniae và Stap hylococus aureus bị kìm hảm sự phát triển bởi hoạt chất

curdion được phân lập từ thân rễ nghệ xanh [10]

Các tác giả Phan Minh Giang, Nguyễn Thị Tuệ, Đào Quốc Hùng, Phan Tống Sơn đã phân lập được các sesquiterpenoid bằng phương pháp sắc kí thành phần chiết trong dung môi n-hexan từ thân rễ nghệ xanh là zedoron và curdion Các nghiên cứu

hoạt tính sinh học cho thấy curdion có khả năng kháng vi nấm Aspergillus và vi khuẩn Staphylococcus aureus trong khi đó zederon lại thể hiện hoạt tính kháng Candida albicans Cả hai hợp chất này đều ức chế Fusarium oxysporum, đều không

thể hiện hoạt tính dọn gốc tự do cũng như các hoạt tính gây độc tế bào với 3 dòng tế bào ung thư người là Hep-G2, FI và RD [7]

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Đặc điểm thực vật loài nghệ xanh ở Hướng Hóa - Quảng Trị

Hình 2.1 Loài nghệ xanh ở Hướng Hóa - Quảng Trị

Cây cao 1,0 - 1,5m, thân rễ có đường kính 2-3cm, nạc, trắng ngà, mùi hăng,

vị rất đắng Lá hình mũi mác, thon nhọn hai đầu, dài khoảng 40 - 60cm, rộng

khoảng 10 - 15cm, dọc gân chính có bớt màu đỏ tím Bẹ lá (thân - thân giả) màu

xanh, hoa mọc giữa thân, cánh môi màu vàng, lá bắc có màu tím hồng

Loại nghệ xanh này đã được Viện Dược liệu Việt Nam giám định tên khoa

học là Curcuma aeruginosa Roxb Tên thường gọi là Nghệ ten đồng, Nghệ đen,

Nghệ xanh, Ngải tím Cây thường mọc hoang ở vùng miền núi huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị và được trồng bởi một số ít người dân tộc thiểu số, có tác dụng điều

hòa khí huyết, giảm co thắt tử cung, phục hồi sinh lực cho sản phụ sau khi sinh Đây

là cây thuốc độc đáo của người dân tộc Vân Kiều, Pa Cô và được người ta gọi là cây

"ngải bà đẻ”.

2.2 Thu hái và xử lý mẫu

Mẫu nghệ xanh (Curcuma aeruginosa Roxb.) được lấy tại thị trấn Khe Sanh,

huyện Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị (tháng 10 năm 2006 và tháng 5 năm 2007) Mẫu sau khi lấy được rửa sạch, để ráo nước, thái nhỏ và chưng cất thu tinh dầu các bộ phận lá, rễ và thân rễ Bã còn lại sau khi chưng cất hong khô tự nhiên rồi đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 450C, nghiền nhỏ để chiết soxhlet trong n-hexan Dịch còn lại sau khi chưng cất, cô cạn ngâm chiết trong n-hexan

2.3 Chưng cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

Các nguyên liệu tươi (lá, thân, rễ, thân rễ) sau khi rửa sạch để ráo nước, thái nhỏ, tiến hành thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước tại phòng thí nghiệm hợp chất thiên nhiên trường ĐHSP Huế Mỗi lần lấy khoảng gần 350g mẫu (thân rễ) cho vào bình cầu đáy tròn 1000ml, đổ nước cất đến 3/4 bình, lắp ống sinh hàn và bình hứng có thiết bị hồi lưu nước, đun trên bếp điện từ 5,5- 6 giờ

Các mẫu lá, thân, thân rễ, rễ tươi được tiến hành chiết lấy tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và xác định TPHH theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ chưng cất và xác định TPHH tinh dầu

Chưng cất lôi cuốn hơi nước

GC\MS

2.4 Xác định các chỉ số vật lý của tinh dầu thân rễ loài nghệ xanh Hướng Hóa

- Quảng Trị

2.4.1 Chỉ số khúc xạ ( n D25)

Chỉ số khúc xạ ( 25

D

n ) của các mẫu tinh dầu được xác định trên máy khúc xạ

kế Abbe với ánh sáng thường

Đo chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ phòng, sau đó có thể chuyển về 250C theo biểu thức:

25

D

n = n’+ r (t’-25) Trong đó: n’- chỉ số khúc xạ thí nghiệm

t’- nhiệt độ thí nghiệm

r - là hệ số hiệu chỉnh chỉ số khúc xạ khi nhiệt độ thay đổi 100C (r = 0,00045)

2.4.2 Tỉ trọng tinh dầu

Tỉ trọng các mẫu tinh dầu được xác định bằng picromet có dung tích 2ml, cân

trên cân phân tích Tỉ trọng tinh dầu được tính theo công thức:

2

1 25

2.5.1 Hàm lượng tinh dầu thân rễ (%) % = V m x 100%

V - thể tích tinh dầu (ml) chưng cất được

m - lượng mẫu thân rễ tươi (g) đem chưng cất

m - lượng tinh dầu dùng để xác định (g).

5,61 - là lượng KOH có trong 1ml dung dịch rượu (nồng độ KOH đúng bằng 0,1N) (mg)

2.5.3 Chỉ số este (E)

Chỉ số este được tính theo công thức:

m

V V

m - lượng tinh dầu dùng để xác định (g)

2.6 Chiết soxhlet mẫu thân rễ

Dịch và bã thân rễ nghệ xanh thu được sau khi chưng cất cô cạn, sấy thu được

450 gam khô, tiến hành chiết Soxhlet trong dung môi n-hexan sau đó cô đuổi dung môi được 3,5 gam dịch chiết Dịch chiết có màu vàng đậm, sánh, dễ dính, có mùi thơm

2.7 Xác định TPHH

Tinh dầu và sản phẩm dịch chiết thu được gửi xác định TPHH và hàm lượng tại Phòng nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa học Việt Nam Phổ được ghi trên máy GC/MS Engin 5989B MS (Mỹ) lắp đặt tại Viện Hóa học - Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia - Hà Nội Trong đó hệ GC có model 5898 series II (cột tách mao quản HP-5MS có kích thước: 30m×0,25mm×0,25µm, khí mang nitơ,

dung môi n-hexan) theo chương trình nhiệt độ: từ 60oC (10 phút) với 5oC/phút đến

260oC (10 phút); injector và detector: 250oC, tại viện Hoá học, viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội

2.8 Phân lập cấu tử trong tinh dầu

2.8.1 Sắc kí cột

Lắp cột (Φ= 3cm; d= 50cm) vào giá theo chiều thẳng đứng, lót một lớp bông

chứa dung môi n-hexan, khuấy đều cho hết bọt khí và tạo thể đồng nhất Cho dung môi n-hexan vào khoảng 1/2 cột và rót silicagel trên vào cột, dùng thanh cao su khỏ nhẹ vào thành cột cho chặt cột Rửa giải cột nhiều lần bằng dung môi n-hexan

Hình 2.3 Sắc kí cột tinh dầu nghệ xanh

Nạp mẫu tinh dầu (7 gam) thân rễ nghệ xanh từ từ vào cột và cho một lớp bông mỏng lên trên Sau đó lần lượt rửa giải bằng dung môi n-hexan, hệ dung môi n-hexan:dietylete (theo tỉ lệ tăng dần thể tích dietylete 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5), dietylete, axeton, rượu etylic chúng tôi đã thu được 395 phân đoạn

Dựa trên kết quả phân tích GC/MS kết hợp với sắc ký cột, một số cấu tử của tinh dầu sẽ được chiết tách khi rửa giải trên cột silicagel bằng các dung môi trên

2.8.2 Sắc kí bản mỏng

Sắc ký lớp mỏng nhận diện chất ở các phân đoạn sắc ký cột được tiến hành

trên bản mỏng nhựa silicagel SILG/UV254 tráng sẵn, độ dày 0,25mm, hiệu MACHEREY-NAGEL (ký hiệu Art-Nr 805021) Triển khai với các dung môi và hệ dung môi tương ứng với các dung môi và hệ dung môi khi rửa giải trên cột sắc kí, để

khô và soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại, nhận định chất qua vệt sáng trên bản mỏng

và giá trị Rf

2.8.3 Tách và xác định cấu trúc

Cấu tử thu được sau khi sắc kí cột và sắc kí bản mỏng, tách loại dung môi và

tinh chế lại đã thu được 2 chất rắn Tu-6 (thuộc phân đoạn 171-181 trong hệ dung môi rửa giải n-hexan: dietylete 9:1) và Tu-11 (thuộc phân đoạn 48-82 trong dung môi rửa giải n-hexan) Cấu trúc Tu-6, Tu-11 được xác định bằng phương pháp vật

lý: MS, H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HSQC (CDCl3, 500MHz) tại phòng Cấu trúc, Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.9 Thử hoạt tính sinh học

Tinh dầu thân rễ và dịch chiết thân rễ nghệ xanh (Curcuma aeruginosa Roxb.) Hướng Hóa - Quảng Trị trong dung môi n-hexan được thử tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn Escherichia coli và nấm candida albicans tại bệnh viện TW Huế

Hình 2.4 Sơ đồ chiết, tách, xác định TPHH thân rễ nghệ xanh (Curcuma

aeruginosa Roxb.) Hướng Hóa - Quảng Trị

Dịch chiết Các phân

đoạn

Phân đoạn Tu-6

Làm sạch, Chưng cất lôi cuốn hơi nước

Dịch chiết

GC/MS

Xác định TPHH

GC/MS,

1 H-NMR,

13 C-NMR, DEPT, COSY, HMBC, HSQC

THÂN RỄ NGHỆ TƯƠI

Chiết trong n-hexan

Chiết Soxlet trong n-hexan trong n-hexan Chiết Soxhlet

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO

LUẬN3.1 Hàm lượng và chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu thân rễ nghệ xanh

Tinh dầu thân rễ Nghệ xanh Hướng Hóa - Quảng Trị thu được bằng phương

pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước tại phòng thí nghiệm trường ĐHSP Huế Tinh dầu

có màu tím sẫm, nhẹ hơn nước, có vị đắng, nồng Hàm lượng và các chỉ số vật lí, hóa học của tinh dầu được trình bày trong các bảng sau:

* Hàm lượng

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu thân rễ Nghệ xanh

Lần Khối lượng thân rễ (g) Thể tích tinh dầu (ml) Hàm lượng %

Bảng 3.2 Tỉ trọng tinh dầu thân rễ Nghệ xanh

Lần Khối lượng tinh dầu (g) Khối lượng nước (g) Tỷ trọng

Bảng 3.5 Chỉ số este tinh dầu thân rễ Nghệ xanh

Lần Khối lượng tinh dầu (g) V 1 (ml) V 2 (ml) Chỉ số este

E = 45,86

Kết quả trên cho ta thấy:

- Hàm lượng tinh dầu thân rễ (0,364%) tương đương với hàm lượng tinh dầu của một số loài nghệ xanh ở các vùng khác

- Chỉ số khúc xạ tinh dầu thân rễ lớn, chứng tỏ trong tinh dầu có chứa nhiều hợp chất thơm hoặc vòng có nhiều nhóm chức chứa oxi

- Tỉ trọng tinh dầu thân rễ (0,9234) nhỏ hơn 1 chứng tỏ tinh dầu nghệ xanh

nhẹ hơn nước (phù hợp với kết quả thực nghiệm)

- Chỉ số axit của tinh dầu thân rễ là thấp, chứng tỏ hàm lượng axit tự do trong tinh dầu thân rễ ít

- Chỉ số este của tinh dầu thân rễ cây cũng tương đối thấp so với một số loài nghệ khác

3.2 Thành phần hóa học của tinh dầu nghệ xanh Hướng Hóa - Quảng Trị

3.2.1 Thành phần hóa học của tinh dầu lá (Tu-1)

Dựa trên sắc ký đồ GC/MS (hình 3.1) của tinh dầu lá nghệ xanh cho thấy có khoảng 13 chất đã được định danh Trong đó, cấu tử chính có thời gian lưu (RT) 37,38 phút là cấu tử chưa định danh 17,24% Các cấu tử đã được định danh có hàm lượng tương đối cao là 1,8-cineol 13,74%; β-pinen 2,14%; germacron 3,76%; germacren-B 1,33%; α –terpinen 1,44%; 3-cyclohexen-1-methanol 0,94% Ngoài ra, một số cấu tử có thời gian lưu là 9,84; 28,72; 34,82; 36,90 có hàm lượng tương đối cao TPHH tinh dầu lá được thể hiện ở bảng 3.6

Bảng 3.6 TPHH tinh dầu lá nghệ xanh Hướng Hóa - Quảng Trị

Hình 3.1 Sắc ký đồ GC của tinh dầu lá nghệ xanh

3.2.2 Thành phần hóa học của tinh dầu thân (Tu-2)

Hình 3.2 Sắc ký đồ GC của tinh dầu thân nghệ xanh