Từ trước đến nay việc nghiên cứu, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên rất đa dạng và phong phú làm dược liệu và thực phẩm… đã và đang được đặc biệt chú trọng. Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới ẩm nên hệ thực vật rất phong phú và đa dạng, đó là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá cần được khai thác, bảo tồn và xử dụng hợp lý.Họ Zingiberaceae là thảo dược không có độc tính, được xử dụng làm gia vị cho nhiều món ăn và làm dược liệu điều trị được khá nhiều bệnh. Phần lớn chúng có thể cho tinh dầu có mùi thơm, trong đó một số có thể được dùng làm chất thơm trong hương liệu, mỹ phẩm... Ở nước ta Gừng, Riềng và Nghệ là những loài cây cỏ quen thuộc gắn bó với đời sống hàng ngày. Chi Nghệ (Curcuma) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là cây rất phổ biến ở nước ta, chúng mọc hoang rất nhiều nơi, một số loài được trồng khá phổ biến để dùng làm gia vị, thuốc chữa bệnh... Theo chúng tôi được biết, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về TPHH và công dụng của nhiều loài nghệ nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng của mỗi loài.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
ĐINH ĐỨC QUÂN
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÂY CURCUMA SP (CURCUMA AFF RUBESCENS?)
Ở TỈNH KON TUM
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60 44 27
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS NGUYỄN THỊ BÍCH TUYẾT
Huế, Năm 2007
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô giáo,
TS Nguyễn Thị Bích Tuyết, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều
về tài liệu và hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình thực
nghiệm và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo của khoa Hóa học, các thầy cô ở Phòng Đào tạo sau Đại học – Đại học Sư phạm Huế, các thầy cô ở trường Đại học Khoa học Huế, trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học Việt Nam đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh KonTum, trường PTTH – DTNT Sa Thầy đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành nhiệm
vụ được giao Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp
và bạn bè đã động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện
luận văn.
Tác giả luận văn
Đinh Đức Quân
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô giáo,
TS Nguyễn Thị Bích Tuyết, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều
về tài liệu và hướng dẫn tận tình trong suốt quá trình thực
nghiệm và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo của khoa Hóa học, các thầy cô ở Phòng Đào tạo sau Đại học – Đại học Sư phạm Huế, các thầy cô ở trường Đại học Khoa học Huế, trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học Việt Nam đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh KonTum, trường PTTH – DTNT Sa Thầy đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành nhiệm
vụ được giao Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp
và bạn bè đã động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện
luận văn.
Tác giả luận văn
Đinh Đức Quân
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của
riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận
văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng
và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên
cứu nào khác
Tác giả luận văn
Đinh Đức Quân
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của
riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận
văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng
và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên
cứu nào khác
Tác giả luận văn
Đinh Đức Quân
Trang 4MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa i
Lời cam đoan ii
Lời cảm ơn iii
MỤC LỤC 1
Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt 3
Danh mục các hình vẽ, bảng biểu 4
MỞ ĐẦU 6
1 Đặt vấn đề 6
2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu 7
3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 7
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8
1.1 Phân loại thực vật chi Curcuma, họ Zingiberaceae 8
1.2 Sơ lược về tình hình nghiên cứu chi Curcuma về mặt hóa học 8
1.2.1 Curcuma aeruginosa Roxb 8
1.2.2 Curcuma angustifolia Roxb 9
1.2.3 Curcuma aromatica Salisb 10
1.2.4 Curcuma inodora aff 11
1.2.5 Curcuma longa Linn 11
1.2.6 Curcuma sichuanensis X X Chen 13
1.2.7 Curcuma wenyjin Y.H Chen ed C Ling 14
1.2.8 Curcuma zedoaria (Berg.) Rosc 15
1.3 Công dụng của một số loài nghệ và một số chất chiết tách từ nghệ 16
Chương 2: THỰC NGHIỆM 19
2.1 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tách chiết, thu và định lượng tinh dầu 21
2.1.1 Mô tả sơ lược đặc điểm thực vật cây Curcuma sp ở tỉnh Kon Tum 19
2.1.2 Xử lý mẫu thực vật 20
2.1.3 Tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước 20
2.1.4 Chiết shoxlet mẫu thân rễ khô 21
2.2 Phương pháp xác định các chỉ số vật lý và hóa học của tinh dầu 22
2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu 22
2.2.2 Phương pháp xác định các chỉ số vật lý và hóa học của tinh dầu 22
2.3 Phương pháp tách và xác định thành phần hoá học 22
Trang 52.3.2 Tách và tinh chế 23
2.4 Xác định cấu trúc 24
2.5 Thử hoạt tính sinh học 24
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25
3.1 Định lượng tinh dầu 25
3.1.1 Hàm lượng tinh dầu lá 25
3.1.2 Hàm lượng tinh dầu bẹ lá (thân giả) 25
3.1.3 Hàm lượng tinh dầu thân rễ 25
3.1.4 Hàm lượng tinh dầu rễ 26
3.2 Các chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu 26
3.2.1 Các chỉ số vật lý 26
3.2.2 Các chỉ số hóa học 27
3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu 28
3.3.1 TPHH của tinh dầu lá 28
3.3.2 TPHH của tinh dầu bẹ lá 30
3.3.3 TPHH của tinh dầu rễ 32
3.3.4 TPHH của tinh dầu thân rễ 33
3.4 Thành phần hóa học của dịch chiết thân rễ trong dung môi n-hexan 34
3.5 So sánh TPHH và hàm lượng các cấu tử chính của các mẫu tinh dầu và dịch chiết 36
3.6 Xác định cấu trúc hợp chất DC16-26 và TD66-83 36
3.6.1 Khối phổ (MS) của chất DC16-26 37
3.6.2 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất DC16-26 38
3.6.3 Phổ 1 H-NMR của chất DC16-26 41
3.6.4 Phổ HSQC của chất DC16-26 41
3.7 Thử hoạt tính sinh học 44
3.8 Xác định tên khoa học cây Curcuma sp ở tỉnh Kon Tum 45
KẾT LUẬN 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Trang 6Ký hiệu Tên gọi
13C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C
1H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
CTCT Công thức cấu tạo
DCN0 Dịch chiết thân rễ khô cây Curcuma sp (Curcuma aff
rubescens?) ở tỉnh Kon Tum trong dung môi n-hexan
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU
Hình 2.1 Một số hình ảnh về cây Curcuma sp (Curcuma aff.
rubescens?) ở tỉnh Kon Tum 19
Hình 2.2 Sơ đồ thu, tách và xác định TPHH của các mẫu tinh dầu 20 Hình 2.3 Sơ đồ thu, tách và xác định TPHH của mẫu thân rễ khô 21
Trang
Trang 7Hình 3.2 Sắc ký đồ GC/MS của tinh dầu bẹ lá (thân giả) 30
Hình 3.3 Sắc ký đồ GC/MS của tinh dầu rễ 32
Hình 3.4 Sắc ký đồ GC của tinh dầu thân rễ 33
Hình 3.5 Sắc ký đồ GC/MS của dịch chiết thân rễ trong dung môi n-hexan 35
Hình 3.6 Phổ MS của chất DC16-26 37
Hình 3.7 Phổ MS so sánh của chất DC16-26 với phổ của germacron 38
Hình 3.8 Phổ 13 C- NMR của chất DC16-26 39
Hình 3.9 Phổ 13 C- NMR, DEPT90 và DEPT135 của chất DC16-26 39
Hình 3.10 Phổ 1 H- NMR của chất DC16-26 41
Hình 3.11 Phổ HSQC của của chất DC16-26 43
Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu lá 25
Bảng 3.2 Hàm lượng tinh dầu bẹ lá 25
Bảng 3.3 Hàm lượng tinh dầu thân rễ 25
Bảng 3.4 Hàm lượng tinh dầu rễ Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) Kon Tum 26
Bảng 3.5 Tính chất vật lý của các mẫu tinh dầu 26
Bảng 3.6 Chỉ số khúc xạ của tinh dầu thân rễ 27
Bảng 3.7 Chỉ số axit của tinh dầu thân rễ 27
Bảng 3.8 Chỉ số este của tinh dầu thân rễ 27
Bảng 3.9 TPHH của tinh dầu lá 29
Bảng 3.10 TPHH của mẫu tinh dầu bẹ lá 31
Bảng 3.11 TPHHcủa tinh dầu rễ 32
Bảng 3.12 TPHH của tinh dầu thân rễ 34
Bảng 3.13 TPHH của dịch chiết thân rễ trong dung môi n-hexan 35
Bảng 3.14 So sánh TPHH và hàm lượng các cấu tử chính của các mẫu tinh dầu và dịch chiết dm n-hexan 36
Bảng 3.15 So sánh 13 C-NMR của chất DC16-26 với các dữ liệu 13 C-NMR của của 3,7-dimetyl-10-(1-metyletyliden) xyclodeca-3,7-dien-1-on 40
Bảng 3.16 So sánh phổ 1 H-NMR của chất tách được có ký hiệu DC16-26 với phổ 1 H-NMR của 3,7-dimetyl-10-(1-metyletyliden) xyclodeca-3,7-dien-1-on 42
Trang 8Bảng 3.17 Dữ liệu phổ HSQC của chất tách được có ký hiệu DC16-26 42 Bảng 3.18 Hoạt tính sinh học của TD thân rễ 44 Bảng 3.19 Đặc điểm thực vật của cây Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?)
Kon Tum so với cây Curcuma rubescens và cây Curcuma aromatica Salisb 45
Bảng 3.20 So sánh TPHH chính của tinh dầu thân rễ cây Curcuma sp.
(Curcuma aff rubescens?) Kon Tum với cây Curcuma rubescens và cây Curcuma aromatica Salisb 46
MỞ ĐẦU
1 Đặt vấn đề
Từ trước đến nay việc nghiên cứu, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên rất
đa dạng và phong phú làm dược liệu và thực phẩm… đã và đang được đặc biệt chútrọng Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới ẩm nên hệ thực vật rất phong phú và đadạng, đó là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá cần được khai thác, bảo tồn và xửdụng hợp lý
Trang 9Họ Zingiberaceae là thảo dược không có độc tính, được xử dụng làm gia vị
cho nhiều món ăn và làm dược liệu điều trị được khá nhiều bệnh Phần lớn chúng
có thể cho tinh dầu có mùi thơm, trong đó một số có thể được dùng làm chất thơmtrong hương liệu, mỹ phẩm Ở nước ta Gừng, Riềng và Nghệ là những loài cây cỏquen thuộc gắn bó với đời sống hàng ngày
Chi Nghệ (Curcuma) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) là cây rất phổ biến ởnước ta, chúng mọc hoang rất nhiều nơi, một số loài được trồng khá phổ biến đểdùng làm gia vị, thuốc chữa bệnh Theo chúng tôi được biết, hiện nay trên thếgiới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về TPHH
và công dụng của nhiều loài nghệ nhằm lựa chọn nâng cao giá trị sử dụng của mỗiloài
Trên địa bàn tỉnh Kon Tum có một loài nghệ mọc hoang ở một số nơi vàđược một số người dân địa phương (người dân tộc thiểu số) trồng dùng làm thuốcchữa bệnh cho trẻ em mới sinh Tuy nhiên, chúng tôi chưa tìm thấy tài liệu nàotrên thế giới cũng như trong nước công bố TPHH và công dụng của loài nghệ này
Với lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học cây
Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum” Hy vọng rằng,
những kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là bằng chứng khoa học góp phần vào việc
sử dụng loại tài nguyên này vào các lĩnh vực sản xuất dược liệu, hương liệu và mỹphẩm… cũng như góp phần vào việc xác định phân loại thực vật và từ đó cóhướng qui hoạch canh tác, khai thác và sử dụng loại thực vật này trên địa bàn tỉnhKon Tum nói riêng và cả nước nói chung
2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Tinh dầu các bộ phận cây, dịch chiết trong dung
môi n-hexan từ thân rễ (rhizomes) Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh
Kon Tum
Trang 10- Mục đích nghiên cứu: Khảo sát thành phần hoá học, phân lập và xác định
cấu trúc của cấu tử chính của tinh dầu và dịch chiết từ thân rễ trong n-hexan cây
Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum.
3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Nội dung nghiên cứu:
+ Xác định TPHH của tinh dầu bay hơi thân rễ, rễ con, thân, lá cây
Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum.
+ Xác định TPHH dịch chiết n-hexan từ thân rễ cây Curcuma sp.
(Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum.
+ Phân lập và xác định cấu trúc của cấu tử chính (hàm lượng lớn hay cóhoạt tính chính) từ dịch chiết và tinh dầu thân rễ trong n-hexan
+ Thử hoạt tính sinh học của tinh dầu trên một số chủng vi khuẩn tại PhòngSinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học vàCông nghệ Việt Nam
- Phương pháp nghiên cứu:
+ Nghiên cứu lý thuyết: Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên,tổng quan các tài liệu về đặc điểm thực vật, TPHH, công dụng của một số cây
thuộc chi Nghệ (Curcuma) của họ Gừng (Zingiberaceae).
+ Phương pháp tách tinh dầu: Tinh dầu bay hơi được thu bằng phươngpháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
+ Phương pháp chiết: Chiết Soxhlet bằng các dung môi hữu cơ
+ Phương pháp tách và xác định thành phần hoá học của tinh dầu: Sắc kýcột (SKC), sắc ký bản mỏng (SKBM), sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC/MS) + Phương pháp xác định cấu trúc: Đo phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT,HSQC, HBMC
+ Phương pháp xác định các hằng số vật lý: Xác định chỉ số khúc xạ bằngkhúc xạ kế Abbe Xác định chỉ số axit, chỉ số este bằng phương pháp chuẩn độ
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Phân loại thực vật chi Curcuma, họ Zingiberaceae
Curcuma - tiếng Ả Rập là kurkum: cây nghệ tây, màu vàng nghệ Đặc điểm
Trang 11phân nhánh, có thịt thường có màu, mang củ ở cuối các rễ, có khi là thân rễ yếu,không có rễ phình ở cuối Lá xếp hai dãy, có cuống có bẹ, phiến hình dải, hìnhngọn giáo hay trái xoan, hình tim ở gốc nhiều hay ít, màu lục nhạt, toàn cây códạng như cây chuối hoa Cán hoa có lá ở gốc, hoặc tách biệt với thân có lá Cụmhoa là một bông mọc đứng, hình trụ, tạo thành bởi các lá bắc lõm xếp sít nhau,thường màu lục, ở nách của lá bắc có hoa mau tàn, màu vàng hay hồng, có khi nằmthụt trong lá bắc Đài hình ống có 3 răng, tràng hình ống, loe ở đỉnh, với 3 thùybằng nhau với một môi to trải ra, 3 nhị với chỉ nhị dạng cánh, với bao phấn cósừng mảnh và dài Ở ngọn của bông, các lá bắc đều bất thụ nhưng lại có màu,thường là vàng, hồng hoặc đỏ tùy từng loài Cánh môi thường rộng và ngắn Bầu 3
ô, noãn nhiều, nhụy lép 2, với nhụy dạng sợi, đầu nhụy dạng chén Quả nang có vỏmỏng, hạt nhiều, có áo hạt [3]
Theo các tài liệu, chi Curcuma (họ Zingiberaceae) trên thế giới có khoảng 95
loài (ngoài ra còn có một số loài chưa được định danh) Ở các nước Đông Dương
có khoảng 19 loài, ở Việt Nam có khoảng 14 loài [4], [6], [10], [13], [17], [24]
1.2 Sơ lược về tình hình nghiên cứu chi Curcuma về mặt hóa học
Theo chúng tôi được biết hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu củanhiều tác giả trong nước và trên thế giới về TPHH và công dụng của các loài nghệ.Các công trình nghiên cứu cho thấy TPHH của tinh dầu các loại nghệ chủyếu là sesquiterpen và dẫn xuất của chúng, monoterpen chiếm phần nhỏ hơn nhiều[5]
Dưới đây, chúng tôi tổng hợp một số kết quả nghiên cứu về TPHH và
phương pháp nghiên cứu một số loại cây thuộc chi Curcuma.
1.2.1 Curcuma aeruginosa Roxb (Nghệ xanh, Nghệ ten đồng, Nga truật
(Trung Quốc), Ngải tím, zédoaire (Pháp), zedoray (Anh) )[3], [8], [20], [22]
Phân bố ở Ấn Độ, miền Nam Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Malaixia,Indonexia Ở nước ta, cây mọc hoang và được trồng ở các vườn gia đình từ HàGiang, Tuyên Quang vào thành phố Hồ Chí Minh [2] [3] [5]
Trang 12Thân rễ Curcuma aeruginosa Roxb gồm có curcuminoid, tinh dầu Trong
đó, tinh dầu thân rễ gồm có các cấu tử: limonen, α-pinen, linalol, caryophllen,
curzerenon, aerugidiol và difurocumenon [24].
Tinh dầu thân rễ Curcuma aeruginosa Roxb ở Indonesia được xác định chứa
các hợp chất chính isocurcumenol (8,5%), -eudesmol (6,5%), curdion (3,6%),curcumenol (9,9%), curcumanolid A và B (11,4%), dehydro-curdion (9,4%) vàcurcumol (1,9%) [25]
Năm 1998, Phan Tống Sơn và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần hoá họcthân rễ nghệ xanh ở Việt Nam kết quả cho thấy thành phần chính của tinh dầu thân
rễ gồm -pinen (1,23%), 1,8-cineol (2,98%), camphor (1,61%), -elemen(2,82%) và đã xác định được cấu trúc của một số cấu tử chính như: curzerenon(19,90%), germacra-1,4,7(11)-trien-8-on (12,83%) [20]
Tinh dầu thân rễ C aeruginosa Roxb được thu bằng phương pháp cất lôi
cuốn hơi nước, sau đó xác định thành phần bằng phương pháp GC/MS cho thấy ởPhú Thụy (Hà Nội) hàm lượng tinh dầu chiếm 0,3% so với nguyên liệu tươi,TPHH chứa 28 cấu tử, trong đó các cấu tử chính curzeron (14,9%), ở Phú Bình(Huế), thành phần chính gồm: curzeron (16,2%), germacron (13,6%), 1,8-cineol(13,5%), camphor (5,7%) [24]
1.2.2 Curcuma angustifolia Roxb (Nghệ lá hẹp) [3]
Tinh dầu thân rễ Curcuma angustifolia Roxb Trồng ở trung tâm và miền
nam Ấn Độ được phân tích bằng phương pháp GC/MS nhận ra 81 và 78 cấu tử,chiếm 95 và 99% hàm lượng tinh dầu tương ứng Những cấu tử chính của tinh dầuthân dễ cây này ở Trung tâm Ấn Độ gồm các đồng phân của xanthorrhizol(12,7%), methyl eugenol (10,5%), axit palmitic (5,2%) và camphor (4,2%) Tinh
dầu thân rễ cây này ở Travancore (miền nam Ấn Độ) chứa germacron (12,8%),
camphor (12,3%), isoborneol (8,7%), curdion (8,4%) và 1,8-cineol (4,8%) [35]
Trang 131.2.3 Curcuma aromatica Salisb (Nghệ trắng, Uất kim (Trung Quốc), Ngải
trắng, Nghệ sùi, Bạch tỵ uất kim) [3], [7], [9], [19], [22]
Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Campuchia, ở Việt Nam cây mọc hoang vàcũng được trồng ở nhiều gia đình [3]
Theo tác giả Lương Sĩ Bỉnh, tinh dầu thân rễ Curcuma aromatica Việt Nam
được phân tích bằng GC/MS kết quả thu được: 1,8–cineol (1,55%); terpinolen
(2,12%), β–elemen (1,52%), humulen (2,56%), curzerenon (38,78%), germacron
(11,22%)… [1], [19]
TPHH chính của các phần chiết trong ete dầu hỏa (petroleum ether) và etyl
axetat của thân rễ nghệ trắng thu hoạch tháng 11 năm 1996 tại Sóc Sơn, Hà Nộitheo tài liệu [7] cho thấy chủ yếu là các sesquiterpenoid, trong đó thành phần cóhàm lượng lớn là các sesquiterpenoid có khung germacran Ở phần chiết trong etedầu hỏa định danh được 20 cấu tử, trong đó các cấu tử chính furanodien (4,7%),furanodienon và curzerenon (30,7%), (E,E)-germacron (8,2%), neocurdion (5,0%),zederon (6,2%), còn ở phần chiết trong etyl axetat định danh được 15 cấu tử trong
đó các cấu tử chính gồm furanodien (4,7%), furanodienon và curzerenon (20,7%),(E,E)-germacron (4,2%), neocurdion (3,0%), zederon (14,9%)
Thân rễ C aromatica Salisb được sử dụng như những thuốc truyền thống ở
Trung quốc, Nhật bản và Đông Nam Á Người ta đã cô lập được nhiều loạisesquiterpen từ những cây này Năm 1987 ba sesquiterpen mới là isozedoarondiol,methylzedoarondiol và neocurdion được cô lập cùng với 7 sesquiterpen đã biết làgermacron, curdion, (4S,5S)-germacron-4,5-epoxit, dehydrocurdion,
procurcumenol, zedoarondiol và curcumenon từ thân rễ C aromatica Năm 1990
người ta đã đưa ra mười một sesquiterpen phụ trong đó có guaian, seco-guaian vànhững bộ khung germacran [39]
Trang 14
O
dehydrocurdione O
O
H HO H
procurcumenol
O
H HO H
zedoarondiol OH
1.2.4 Curcuma inodora aff.
Năm 2006, theo kết quả nghiên cứu của các tác giả: Malek, Sri Nurestri, Seng, Chan Kam, Zakaria, Zuriati, Ali, Nor Azah, Et al tinh dầu thân rễ và lá
tươi của C inodora aff từ Malaysia thu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn
hơi nước, sau đó dùng phương pháp phân tích GC/MS nhận ra 55 và 32 cấu tửchiếm 89,3% và 66,9% hàm lượng các tinh dầu tương ứng Cấu tử chính của tinhdầu thân rễ là curzerenon (20,8%), germacron (11,1%), curdion (7,5%),1,8-cineol (5,3%) và β-eudesmol (4,6%); tinh dầu lá là curzerenon (16,9%),germacron (7,5%), 1,8-cineol (5,3%) và farnesol (5,0%) [30]
1.2.5 Curcuma longa Linn (Curcuma domestica Valet., Nghệ vàng, Khương
hoàng) [15], [14], [16], [22]
Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, các nước Đông Dương đến Madagasca vàchâu Đại Dương, ở Việt Nam cây mọc hoang và cũng được trồng rộng rãi khắp nơi[3]
Theo tài liệu [34] thân rễ và lá tươi cây Curcuma longa L được thu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước bằng thiết bị kiểu Clevenger trong 4 giờ,
lần lượt cho 0,8% và 0,65% tinh dầu tương ứng Tinh dầu đã được làm khô bằngnatri sunfat khan và giữ trong tủ ướp lạnh tại 4°- 5°C trước khi phân tích Tinh dầuthân rễ được phân tích bằng GC/MS xác định được 52 cấu tử chiếm 98,6% hàmlượng tinh dầu, cấu tử chính gồm α-turmeron (44,1%), β-turmeron (18,5%) vàar-turmeron (5,4%) Tinh dầu lá chứa 61 cấu tử đã được nhận dạng chiếm 99,8%hàm lượng tinh dầu, cấu tử chính gồm α-phellandren (53,4%), terpinolen (11,5%)
và 1,8-cineol (10,5%)
Ở Việt Nam, tinh dầu lá bao gồm chủ yếu là các chất α-phellandren (24,5%),1,8-cineol (15,9%), p-cymen (13,2%) và β-pinen (8,9%), trong khi đó ở Nigeriabao gồm chủ yếu là các chất α-phellandren (47,7%) và terpinolen (28,9%) [34]
Trang 15Khi khảo sát thành phần tinh dầu thân rễ C Longa ở Sri Lanka, người ta thấy
rằng khi cây trưởng thành hàm thì lượng turmeron tăng đồng thời, trong khi đó1,8-cineol và α- phellandren thì giảm xuống [34]
TPHH của tinh dầu thân rễ C domestica ở Malaysia được xác định chứa
lượng đáng kể α-turmeron (45,3%), linalool (14,9%) và β-turmeron (13.5%), ởTrung Quốc có chứa lượng lớn turmeron và ar-turmeron, ở đồng bằng phía bắc Ấn
Độ chứa ar-turmeron (59,7%), ở các vùng khác của Ấn Độ có zingiberen (25,0%)
và ar-turmeron (25,0%) Theo kết quả phân tích của tác giả Gopalam và Ratnambal
thực hiện khảo sát trên nhiều cây C longa trồng ở miền Nam Ấn Độ cho thấy
những cấu tử chính là ar- turmeron, turmeron và limonen, ở vùng đông bắc củaBhutan (Ấn Độ) ar-turmerol (16,7-25,7%), α-turmeron (30,1-32%) và β- turmeron
(14,7-18,4%) Tinh dầu lá C longa có nguồn gốc ở Bhutan (Ấn Độ), có các cấu tử
chính gồm α-phellandren (18,2%), 1,8-cineol (14,6%), p-cymen (13,3%) vàterpinolen (11,6%), trong khi ở miền đồng bằng phía Bắc Ấn Độ, cấu tử chính làp-cymen (25,4%), 1,8-cineol (18%), cis-sabinol (7,4%) và β- Pinen (6,3%) [34]
Thành phần tinh dầu cây Curcuma longa Linn CV ROMA từ đồng bằng
Bắc Ấn Độ ở Lucknow được thu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước và xác địnhTPHH bằng phương pháp GC/MS cho thấy tinh dầu thân rễ chứa 84 cấu tử chiếm100% tinh dầu, trong đó các thành phần chính là 1,8-cineol (11,2%), α-turmeron(11,1%), β-caryophyllen (9,8%), ar-turmeron (7,3%), và β-sesquiphellandren(7,1%) Tinh dầu lá chứa 83 cấu tử chiếm 97,4% hàm lượng tinh dầu, cấu tử chính
là terpipolen (26,4%), 1,8-cineol (9,5%), α-phellandren (8%) và terpinen-4-ol(7,4%) [21]
Tinh dầu thân rễ Curcuma longa từ vùng Himalaya thấp Bắc Ấn Độ chứa 52
cấu tử đã được nhận dạng chiếm 98,6% tinh dầu Các cấu tử chính là α-turmeron(44,1%), β-turmeron (18,5%), ar-turmeron (5,4%) Tinh dầu lá chứa 61 cấu tử đãđược nhận dạng chiếm 99,8% tinh dầu, gồm α-phellandren (53,4%), terpinolen(11,5%) và 1,8-cineol (10,5%) [11]
Năm 2001, Nguyễn Thị Bích Tuyết đã xác định được hơn 20 chất trong tinh
dầu lá Curcuma longa Linn trong đó cấu tử chính là các monotecpen như -pinen
(8,9%), -phellandren (24,5%), 1,8-cineol (15,9%) và p-cymen (13,2%) [25]
Trang 16Các tác giả Golding, Pompo và Semuel sử dụng phương pháp sắc ký thanh
(flash chromatography) đã tách được hai đồng phân của α-turmeron và β-turmeron từ tinh dầu thân rễ C longa và xác định cấu trúc bằng phương pháp
Thân rễ C longa Salisb được sử dụng làm gia vị và làm chất màu (màu
vàng) cho thức ăn, bởi nó chứa các curcuminoid Từ thân rễ của cây này, cáccurcuminoid và các sesquiterpen mới là 4-hydroxybisabola-2,10-dien-9-on; 4-methoxy-5-hydroxy-bisabola-2,10-dien-9-on; 2,5-dihydroxybisabola-3,10-dien, vàprocurcumadiol được cô lập cùng với curcumenon, dehydrocurdion, (4S,5S)-germacron-4,5-epoxit, bisabola-3,10-dien-2-on, α-turmeron, bisacumol, bisacuron,curcumenol, isoprocurcumenol, zedoarondiol, và procurcumenol [39]
hydroxy-OH 2,5-dihydroxybisabola -3,10-diene
OH
OH
diene-2-one O
bisabola-3,10--turmerone O
bisacurone O
H
OHOH
O
O
OH O
O
isoprocurcumenol H
Trang 17Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả: Xin Zhou, Zhangwan Li, GuangyiLiang, Jin Zhu, Daopin Wang, Zongwei Cai, công bố năm 2007 Thành phần bay
hơi của tinh dầu cây Curcuma Sichuanensis X X Chen trồng ở Sichuan (Trung
Quốc) được thu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và sử dụng kỹthuật phân tích GC/MS phát hiện 44 cấu tử chiếm 87,1 % tinh dầu; các cấu tửchính gồm epi-curzerenon (26,9%), germacron (12,4%), isocurcumenol (9,7%),β-elemen (6,4%) và curzeren (6,2%) Theo kết quả phân tích bán định lượng chothấy các sesquiterpen (85,4%) cao hơn monoterpen (1,5%) khoảng 55 lần [38]
1.2.7 Curcuma wenyjin Y.H Chen ed C Ling.
TPHH thân rễ C wenyjin Y.H Chen ed C Ling (ở Trung Quốc) có các cấu
tử chính là wenyjin, germacron epoxyd, limonen, α-pinen, linalol, caryophyllen,curdion [24]
O O
O OH
O Wenyjin
Trên thế giới, có nhiều phương pháp nghiên cứu TPHH của tinh dầu bay
hơi Phương pháp HSME-GC-MS (headspace solvent microextraction - gas
chromatography - mass spectrometry) là một trong những phương pháp phân tích
được sử dụng để xác định những hợp chất bay hơi từ cây C wenyujin Y.H Chen et
C Khi so sánh giữa HSME-GC-MS, GC-MS với hai phương pháp khác là
SPME-GC-MS (solid-phase microextraction - gas chromatography-mass spectrometry)
và phương pháp SD-GC-MS (steam distillation - gas chromatography - mass
spectrometry) người ta thấy HSME-GC-MS xác định được 66 cấu tử,
SPME-GC-MS cho 71 cấu tử và SD-GC-SPME-GC-MS cho 63 cấu tử HSME-GC-SPME-GC-MS có chi phí thấphơn, nhiều sự lựa chọn hơn về dung môi chiết và yêu cầu một số lượng mẫu nhỏhơn và có thể dùng trực tiếp từ mẫu dạng bột để phân tích Phương pháp HSME-GC-MS là một phương pháp đơn giản, rẻ tiền và có hiệu quả cao [40]
Năm 2005, các tác giả: Jizhong Yan, Gang Chen , Shengqiang Tong, Yeping
Feng, Liuqing Sheng, Jianzhong Lou, đã sử dụng phương pháp HSCCC (high
-speed counter - current chromatography ) , phân lập được hai hợp chất có hoạt tính
sinh học trong tinh dầu thân rễ C wenyujin (ở Trung Quốc), đó là hai sesquiterpen
Trang 18germacron và curdion nhờ sử dụng hệ dung môi hai pha gồm ete dầu hỏa – etanol
– dietylete – nước (petroleum ether–ethanol–diethyl ether–water) với tỷ lệ thể tích
5:4:0,5:1, thu được 62mg germacron và 93mg curdion từ 658mg tinh dầu, độ tinhkhiết đạt trên 95% Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp 1H-NMR và EIMS [37]
O
Germacrone
O
O CurdioneNhững sesquiterpen có một nhóm 7α-isopropyl, như curcumol, curdion,curcumalacton, và một epoxy germacran mới là (1R,10R)-epoxy-(-)-1,10-
dihydrocurdion được cô lập từ tinh dầu cây Curcuma wenyujin Y.H Cheng & C.
Ling hiện nay được sử dụng điều trị ung thư ở Trung Quốc [39]
OH O
H
O R
O R=-H
1.2.8 Curcuma zedoaria (Berg.) Rosc (Nghệ đen, Nga truật, Ngải tím, Tam
nại, Nghệ tím, Nghệ xanh đồng) [15], [16], [18], [22], [25]
Phân bố ở Himalaia, Xri Lanca, Chittagong (Ấn Độ), Vân Nam (Trung
Quốc) ở Việt Nam cây này mọc hoang và được trồng ở khắp nơi từ Bắc vào Nam
[3]
Theo tài liệu [28] tinh dầu thu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước từ lá cây C zedoaria được nghiên cứu bằng phương pháp GC/MS xác định được 23 cấu tử, chiếm 75% lượng tinh dầu Tinh dầu C zedoaria chủ yếu chứa
mono- và sesquiterpenoid, các monoterpen hydrocarbon (2,3%), các monoterpenoxy (26%), cấu tử chính của tinh dầu lá gồm α-terpinyl axetat (8,4%), isoborneol(7%), dehydrocurdion (9%) và selina-4(15),7(11)-dien-8-on (9,4%)
Những khảo sát hóa học trên tinh dầu thân rễ C zedoaria (ở Ấn Độ) của các
tác giả Gurdip Singh, Om Prakash Singh, Y R Prasad, M P Lampasona và CCatalan (09/2003) sử dụng kỹ thuật HPLC, GC và GC/MS, cho thấy cấu tử chính
gồm 1,8-cineol (18,5%), o- và p-cymen (18,42%) và α-phellandren (14,93%),
Trang 19terpinolen (4,11%), α-pinen (3,28%), β-turmeron (3,1%), β-pinen (2,93%),β-phellandren (2,0%)… Tinh dầu này được sử dụng để sản xuất thuốc diệt côn
trùng Odontotermes obesus Rhamb, với liều tối thiểu 2 µL dùng trong khoảng thời
gian 24 giờ, côn trùng bị tiêu diệt 100% [31]
Thành phần bay hơi của tinh dầu Curcuma zedoria Rosc ở huyện Đô Lương,
tỉnh Nghệ An và huyện Hương Sơn, tỉnh Hà Tĩnh được thu bằng phương phápchưng cất lôi cuốn hơi nước với hiệu suất tinh dầu đạt 0,22% Các mẫu được phântích bằng kỹ thuật GC và GC/MS phát hiện được hơn 50 chất Thành phần chínhgồm epicurzerenon (15,0%; 38,8%) và germacron (22,6%; 14,8%) tương ứng vớimỗi mẫu ở hai vùng Thành phần phụ bao gồm β-pinen (2,9%; 2,5%), 1,8-cineol(4,8%; 0,2%), camphor (2,0%; vết), isoborneol (1,0%; vết), β-elemen (1,2%;0,3%), zingiberen (1,0%, 0,3%), benzofuran-6-ethyxyl-4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl-5-isopropyl, (2,09%; 2,8%), 2,4-diisopropenyl-1-methyl-1-vinyl-cyclohexan, (1,3%; 1,3%), germacren (1,8%; 2,3%), α-cadinol (1,4%; 0,9%), T-muurolol(1,5%; 1,3%), dẫn xuất furanodien (1,6%; 3,8%) [26]
Thân rễ khô C zedoaria Roscoe là một nguồn giàu terpenoid Ba
curcuminoid chính và hơn 40 sesquiterpen, kiểu eudesman, kiểu guaian, kiểucarabran, kiểu germacran, kiểu bisaboran, kiểu eleman và kiểu xanthan đã được cô
lập từ cây này Những sesquiterpenoid nào đó được thu được từ C zedoaria là các
cyclopropasesquiterpen cũng như curcumenon, curcarabranol A và B,curcumenolacton A, B và C, 4-epicurcumenol, neocurcumenol, gajutsulacton A và
B, và 2 zedoarolid A và B [39]
O
O R OH H
curcarabranol A : R = -H
curcarabranol B : R = -H
O
H curcumenolactone A : R = -H curcumenolactone C : R = -OH
O R
O O
OH H
OH
H HO zedoarolide B
Trang 201.3 Công dụng của một số loài nghệ và một số chất chiết tách từ nghệ
Thân rễ khô C zedoaria Roscoe là một vị thuốc thô, đã được sử dụng để
chữa bệnh ở Trung quốc, ở Nhật bản chủ yếu như chữa bệnh dạ dày Thân rễ của
C zedoaria cũng được sử dụng khắp nơi ở Ấn Độ và các nước Đông Nam Á như
làm chất kích thích, thuốc chữa dạ dày, thuốc thông ruột, thuốc lợi tiểu, chữa tiêuchảy, chất chống nôn, chống bệnh sốt nhiệt, chống viêm và tẩy uế… Nó có khảnăng ức chế những yếu tố độc hại về sinh học [39] Gần đây, việc chiết xuất và chế
tạo một số dẫn xuất của terpenoid từ nghệ đen (Curcuma zedoaria) để trị lở loét
cũng đã được cấp bằng sáng chế ở Nhật Bản
Phạm Đình Tỵ và các đồng nghiệp ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên
đã chiết tách thành công tinh nghệ từ nghệ vàng Thành phần chính của tinh nghệ
là hoạt chất curcumin Chất curcumin có hoạt tính sinh học khá độc đáo như giảiđộc gan, ngăn cản sự phát triển của vi trùng lao, hàn gắn vết thương trong và ngoài
cơ thể, chống viêm loét dạ dày, hành tá tràng, đường tiết niệu Curcumin còn làchất chống oxi hóa mạnh, có khả năng tiêu diệt các gốc tự do và các loại men hạigây ung thư có trong thức ăn, nước uống hằng ngày [23]
Một nghiên cứu mới đây của các nhà khoa học thuộc Đại học Haward (Mỹ)cho thấy curcumin có tác dụng kháng virus HIV ở cả hai thể cấp và mãn tính của
tế bào Hy vọng rằng curcumin được điều chế từ nghệ vàng sẽ là một trong nhữngloại thuốc hiệu lực chống lại bệnh HIV-AIDS với mức phí tổn mà nhiều người cóthể chấp nhận được
Theo các nghiên cứu mới đây, Curcumin có hoạt tính chống viêm và là mộtchất có khả năng ức chế phản ứng oxi hóa do các enzym sinh ra Curcumin có thểtriệt tiêu sự phát triển của khối u bởi việc ngăn chặn những con đường truyền tínhtrạng trong những tế bào Sự phân hủy của curcumin phụ thuộc vào pH của môitrường, Curcumin phân hủy nhanh chóng trong môi trường huyết thanh tự do Trên
cơ sở phân tích phổ khối lượng và đo quang (sự giảm cấp của curcumin trong dungdịch đệm phốt phát 0.1 M ở pH 7.2), xác định được trans-6-(4’-hydroxy-3’-methoxy-phenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal là sản phẩm giảm cấp chính; vanillin, axitferulic và feruloylmethane là những sản phẩm giảm cấp phụ
Trang 21OCH3 OCH3 OCH 3
OH CHO CH=CHCOOH CH=CHCOCH3
OH OH
Curcumin
trans-6-(4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl)
Vanillin xuất hiện làm tăng thêm ức chế sự phát sinh đột biến trong vi khuẩn
và những tế bào loài động vật có vú Nó có thể đóng vai một chất kháng đột biếnbằng việc sửa đổi sự sao chép ADN và phục hồi những hệ thống ADN sau thiệt hại
tế bào DNA gây ra bởi những đột biến xuất hiện Vanillin là một chất thu dọn cácgốc superoxide và hidroxyl [29]
Chất (4S,5S)-(+)gemeron-4,6-epoxid trích ly từ cây nghệ trắng (Curcuma
aromatica) đã được đăng ký bằng sáng chế ở Nhật Bản để trị bệnh tiểu đường.
Tinh dầu nghệ Curcuma aromatica đã dùng vào điều trị các khối u não được phát
hiện sớm
Thử nghiệm các dịch chiết từ thân rễ cây nghệ xanh (Curcuma aeruginosa)
mọc ở Việt Nam cho thấy, chúng có tác dụng ức chế 8 loại vi khuẩn gây bệnh.Riêng curdion- một loại sesquiterpendiceton thường gặp trong nhiều loại nghệ-
kìm hãm sự phát triển của Escherichia coli, Salmonellatyphi, Kieb pneumoniac và
Staphylococus aureus là các loại vi khuẩn gây bệnh [12]
Curzerenon và các đồng phân epicurzerenon, furanodienon, isofuradienonđều là những chất có tính kháng khuẩn đã được nghiên cứu ở Nhật Bản qua các
chiết xuất của nghệ xanh (C aeruginosa Roxb.)
Trang 22Chương 2
THỰC NGHIỆM2.1 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tách chiết, thu và định lượng tinh dầu
2.1.1 Mô tả sơ lược đặc điểm thực vật cây Curcuma sp ở tỉnh Kon Tum
Cây Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum, cao từ 1 –
2m Thân rễ có đường kính 1 – 4,5cm, nạc, màu vàng cam đậm, thơm Lá hình mũimác, thon nhọn hai đầu, dài khoảng 40 – 60cm, rộng khoảng 10 – 15cm, cuống lá
màu đỏ tím, dài khoảng 30 – 40cm, gân lá chính màu đỏ tím Bẹ lá (Thân - Thân
giả) màu đỏ tím Hoa mọc giữa thân; cánh môi màu vàng; lá bắc không sinh sản
màu trắng xanh, đầu và viền hơi phớt hồng, đốm đỏ tím, lá bắc sinh sản có màuphớt đỏ tím Đầu chót rễ có củ chứa tinh bột
Cây mọc hoang ở Kon Tum và được một số ít người dân tộc thiểu số trồngdùng để chữa bệnh cho trẻ em mới sinh
Hình 2.1 Một số hình ảnh về cây Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?)
ở tỉnh Kon Tum
Toàn cảnh Thân rễ và rễ
Lá (mặt dưới, mặt trên) Toàn cây Hoa
2.1.2 Xử lý mẫu thực vật
Mẫu cây Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) được lấy ở khu vực khu vực bìa
Trang 23tháng 09 năm 2006 Mẫu sau khi lấy được cắt tách từng bộ phận, rửa sạch, để ráonước tự nhiên ở nhiệt độ phòng Mẫu lá và bẹ lá được thái nhỏ để thu tinh dầu,phần thân rễ và rễ sau khi thái lát mỏng 1-2mm và giã dập sau đó dùng để thu TD.
Để tiến hành thu dịch chiết, phần thân rễ sau khi được làm sạch, thái látmỏng được hong khô tự nhiên rồi đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 450C -
500C, nghiền nhỏ thành bột để chiết
2.1.3 Tách tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, xác định TPHH và cấu trúc chất TD66-83
Hình 2.2 Sơ đồ thu, tách và xác định TPHH của các mẫu tinh dầu cây
Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum
Thu tinh dầu tương ứng
Xác định cấu tử tách được (TD66-83)
MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQCSKC + SKBM
1 Thêm n-hexan, 2 Kết tinh lạnh, 3 Tách
Trang 24Các mẫu lá, bẹ lá, thân rễ, rễ tươi được tiến hành chiết lấy tinh dầu bằngphương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và xác định TPHH theo sơ đồ hình 2.2 Lấy 250g mẫu lá, 300g mỗi mẫu bẹ lá, thân rễ, rễ tươi cho vào bình cầu đáytròn dung tích 500 ml, thêm nước cất tới chừng 2/3 bình, lắp ống sinh hàn hồi lưu,đun trên bếp cách thuỷ từ 8 đến 10 giờ Tinh dầu thu được không màu, nhẹ hơnnước, có mùi thơm đặc trưng, làm khô nước bằng Na2SO4 khan và bảo quản ởnhiệt độ dưới 50C.
2.1.4 Chiết shoxlet mẫu thân rễ khô
Hình 2.3 Sơ đồ thu, tách và xác định TPHH của mẫu thân rễ khô cây
Phần tan trong nước Dịch chiết n-Hexan
Phần keo không tan
Trang 25520 gam bột mẫu thân rễ khô cây Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở
tỉnh Kon Tum được chiết kiệt bằng metanol trong thiết bị chiết soxhlet trong thờigiam trung bình mỗi lần chiết 47- 48h kể từ lúc dung môi sôi Dịch chiết thu được
có màu nâu đỏ, mùi thơm dễ chịu, cất loại dung môi thu được 93,8g chất lỏng màunâu đỏ, sánh, có mùi thơm Cho thêm khoảng 300ml nước cất vào bình tam giácchứa 93,8g mẫu dịch cô metanol và lắc khoảng 30 phút, sau đó cho từ từ n-hexan
và lắc rồi chiết nhiều lần, tách phần keo màu nâu đen không tan trong nước và hexan, lọc và chiết tách thu lớp dịch n-hexan, phần dịch nước có màu vàng nâu.Dịch n-hexan có màu nâu đỏ nhạt, cô đuổi dung môi thu được 41,016g dịch cô cómàu nâu đỏ đậm, sánh, có mùi thơm
n-Kết quả xử lý toàn bộ quá trình chiết soxhlet và kỹ thuật thực nghiệm đượctóm tắt trong sơ đồ hình 2.3
2.2 Phương pháp xác định các chỉ số vật lý và hóa học của tinh dầu
2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu
Hàm lượng tinh dầu trong mẫu (H%) được xác định bằng phương pháp địnhlượng tinh dầu theo tiêu chuẩn Việt Nam
2.2.2 Phương pháp xác định các chỉ số vật lý và hóa học của tinh dầu
Chỉ số khúc xạ ( 25
D
n ) của các mẫu tinh dầu được xác định trên máy khúc xạ
kế Abbe với ánh sáng thường
Các chỉ số axit, este được xác định bằng phương pháp định lượng tinh dầutheo tiêu chuẩn Việt Nam
2.3 Phương pháp tách và xác định thành phần hoá học
2.3.1 Xác định thành phần hóa học
TPHH của các mẫu tinh dầu tinh dầu lá, bẹ lá, thân rễ, rễ và mẫu dịch chiết
trong n-hexan cây Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum được
nhận diện bằng phương pháp GC/MS Phổ được ghi trên máy GC/MS Engin5989B MS (Mỹ) lắp đặt tại Viện Hóa học - Trung tâm Khoa học tự nhiên và Côngnghệ quốc gia - Hà Nội Trong đó, hệ GC có model 5898 series II (cột tách maoquản HP-5MS có kích thước: 30m 0,25mm 0,25m, khí mang nitơ, dungmôi n-hexan) ghép máy MS-MD kèm ngân hàng dữ liệu WILEY275.L theo
Trang 26chương trình nhiệt độ: từ 60oC (10 phút) với 5oC/phút đến 260oC (10 phút);injector và detector: 250oC.
2.3.2 Tách và tinh chế
* Xử lý mẫu trước khi chạy sắc ký cột
Mẫu tinh dầu thân rễ và mẫu dịch cô trong n-hexan được kết tinh bằngphương pháp kết tinh lạnh trong n-hexan, sau ba lần, tách thu lấy phần rắn có trạngthái tương ứng là tinh thể hình kim, màu trắng và tinh thể hình kim, màu trắng cónhuốm màu vàng
* Sắc ký cột
Mẫu rắn tách ra từ tinh dầu thân rễ và mẫu rắn tách ra từ dịch chiết trong
n-hexan của cây Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) ở tỉnh Kon Tum tiến hành
chạy sắc ký cột trên hai cột có kích thước tương ứng là Ф = 2cm, d = 40cm, vớichiều dài silicagel d = 21cm và Ф = 3cm, d = 50cm, với chiều dài silicagel d =30cm
Lắp cột vào giá theo chiều thẳng đứng, lót bông, giấy lọc, cát dưới đáy cột,đóng khóa và cho n-hexan khoảng 1/3 chiều dài cột Cho silicagel (silicagelMerck, cỡ hạt 0,063-0,200 mm) vào cốc chứa dung môi n-hexan, khuấy cho ra hếtbọt khí sau đó rót từ từ hỗn hợp vào cột, cho tiếp lớp giấy lọc, cát và bông lên trên,
để ổn định một thời gian Hạ mức dung môi trong cột, nạp mẫu vào cột với lượngchất hấp phụ gấp 25-50 lần về khối lượng so với mẫu
Rửa giải cột lần lượt bằng các hệ dung môi: n-hexan; n-hexan:dietylete (tỷ lệthể tích lần lượt 1:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5); dietylete; etanol
* Sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng nhận diện chất ở các phân đoạn sắc ký cột được tiến hànhtrên bản mỏng nhựa silica gel SIL G/UV254 tráng sẵn, độ dày 0,25mm, hiệuMACHEREY-NAGEL (ký hiệu Art-Nr 805021) Triển khai với các dung môi và
hệ dung môi tương ứng với các dung môi và hệ dung môi khi rửa giải trên cột sắc
kí, để khô Khi soi dưới ánh sáng đèn tử ngoại chúng tôi nhận thấy các chất trongcác phân đoạn không xuất hiện trên đèn tử ngoại Khi oxi hóa mẫu trên bản mỏng
Trang 27với chất oxi hóa là K2Cr2O7 trong môi trường axit, nung nóng, chúng tôi nhận định
sơ bộ được chất qua vệt sáng trên bản mỏng và xác định giá trị Rf
Từ ống nghiệm số 66 đến 83 của cột chạy mẫu rắn tách ra từ tinh dầu chúngtôi thu được chất rắn kết tinh hình kim, màu trắng (ký hiệu TD66-83) kiểm trabằng sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexan:dietylete (8:2) thấy xuất hiện mộtchấm tròn có giá trị Rf = 0,81
Từ ống nghiệm số 16 đến 26 của cột chạy mẫu rắn tách ra từ dịch chiết chúngtôi thu được chất rắn kết tinh hình kim, màu trắng (ký hiệu DC16-26) kiểm trabằng sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexan:dietylete (8:2) thấy xuất hiện mộtchấm tròn có giá trị Rf = 0,81
2.4 Xác định cấu trúc
Các chất có ký hiệu TD66-83 và DC16-26 được tách ra từ mẫu tinh dầuthân rễ và dịch chiết thân rễ trong dung môi n-hexan, sau khi tinh chế, tách loạidung môi đem xác định cấu trúc dựa trên các phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT,HMBC, HSQC
2.5 Thử hoạt tính sinh học
Mẫu tinh dầu thân rễ Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?) Kon Tum
được tiến hành thử tính kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn kiểm định tạiPhòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoahọc và Công nghệ Việt Nam
Trang 28Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Định lượng tinh dầu
III.1.1 Hàm lượng tinh dầu lá ( H)
Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu lá Curcuma sp (Curcuma aff rubescens?)
(%)117,0
H
3.1.2 Hàm lượng tinh dầu bẹ lá (thân giả) ( H)
Bảng 3.2 Hàm lượng tinh dầu bẹ lá Curcuma sp (Curcuma aff.
rubescens?) Kon Tum
Lần thực hiện Khối lượng mẫu
(gam)
Thể tích tinh dầu
(ml)
Hàm lượng (ml/g)
(%)15,0
H
3.1.3 Hàm lượng tinh dầu thân rễ ( H)
Bảng 3.3 Hàm lượng tinh dầu thân rễ Curcuma sp (Curcuma aff.
rubescens?) Kon Tum
Lần thực hiện Khối lượng mẫu
(gam)
Thể tích tinh dầu
(ml)
Hàm lượng (ml/g)
(%)93,0
H
