CHƯƠNG II CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ & TẾ BÀO THỰC ppsx

• Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài..

Trang 1

CHƯƠNG II

CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ

& TẾ BÀO THỰC VẬT

Nguồn gốc sự sống?

• Các nhà khoa học theo thuyết tự sinh:

đất ẩm  cỏ dại, bùn  lươn,…  Sự sống tự sinh (ngẫu nhiên)

• Pasteur: sữa để lâu  chua  sinh vật

có nguồn gốc từ sinh vật

Nguồn gốc sự sống?

Tính toàn thế

Sinh vật duy trì nòi giống như thế nào?

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

= Thuật ngữ mô tả các phương pháp

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong

ống nghiệm có chứa môi trường dinh

dưỡng thích hợp trong điều kiện vô

trùng

Lịch sử phát triển

• Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể

• Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua

• Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong

kỹ thuật nuôi cấy mô

• Năm 1960 – 1964, Morel nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng  thương mại

Trang 2

Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi

cấy mô và tế bào thực vật

• Về mặt lý luận sinh học cơ bản

• Về mặt thực tiễn sản xuất

B 1

B 4

B 5

1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

2 Tạo thể nhân giống

3.Nhân giống in vitro

4 Tái sinh cây hoàn chỉnh

5 Chuyển cây con ra vườn ươm

B 2

B 3

1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

• Khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý

của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy

mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và

vị trí lấy mẫu đó

• Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà

phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử

trùng hóa học như calcium hypochloride,

chlorur thủy ngân,

• Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro

• Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng

• Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo

• Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường

nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi,

đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho

phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài

• Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình

tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân giống in vitro

ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời

gian dài

• Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy

đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường

• Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài

Trang 3

5 Chuyển cây con ra vườn ươm

• Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa

sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng

râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,

• Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình

nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do

sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và

ex vitro

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

nuôi cấy mô thực vật

Mẫu cấy Môi trường nuôi cấy Ánh sáng Độ thoáng khí

1 Ảnh hưởng của mẫu cấy

Kiểu di truyền:

• Những cây hai lá mầm thông thường có khả

năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây

hạt trần rất khó tái sinh

• Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi

trường tự nhiên thì chúng hầu như dễ tái sinh

in vitro

• Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae,

Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae và

Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh

nhất

Tuổi sinh lý của cây:

• Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao

• Các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn, khi cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng giảm theo

• Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mẫu cấy già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào

Tuổi của mô và cơ quan:

• Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy

hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường

hợp ngoại lệ

• Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt

hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan

của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân

chia tế bào giảm

Tình trạng sinh lý:

• Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản

• Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này

Trang 4

Vị trí của mẫu cấy trên cây:

• Những chồi ban đầu được tách từ vị trí thấp

trên cây phát triển trong môi trường in vitro

tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn

chồi nách

• Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ

những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phần

khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có

phản ứng in vitro giống nhau

Kích thước mẫu cấy:

• Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ

• Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ

Vết thương:

• Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai

trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy

• Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp

thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng

thời ethylene được tạo ra nhiều hơn

Phương pháp cấy:

• Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực hoặc không

có cực

• Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy không cực

 Kiểu di truyền

 Tuổi sinh lý của cây

 Tuổi của mô và cơ quan

 Tình trạng sinh lý

 Vị trí của mẫu cấy trên cây

 Kích thước mẫu cấy

 Vết thương

 Phương pháp cấy

Khoáng đa lượng:

• Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên

• Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N,

P, K, Ca, Mg

2 Ảnh hưởng của môi trường

Trang 5

Khoáng vi lượng:

• Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,

người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi

lượng vào môi trường nuôi cấy

• Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào

là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo…

Carbon và nguồn năng lượng:

• Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose

• Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose

Vitamin:

• Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin

cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của

chúng

• Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất

trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid

nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol

Chất điều hòa tăng trưởng thực vật:

• Có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylen

• Tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi

Auxin

• Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng

trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô

phân sinh ngọn chồi từ nhu mô

• Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ

khởi rễ, nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng

của các sơ khởi này

• IAA, IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T,

phenoxyacetic acid

Cytokinin

• Kích thích tế bào phân chia (với điều kiện có auxin)

• Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào

• Kinetin, zeatin, BA, TDZ

Trang 6

Các chất hữu cơ không xác định:

• Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào

môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả

thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô

• Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate,

nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa

mạch, chuối, nước cam, nước cà chua

Nguồn cung cấp nitrogen:

• Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào

• Các nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparine và adenine

Than hoạt tính:

• Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường

nuôi cấy có tác dụng khử độc

• Ảnh hưởng của than hoạt tính: kích thích sự

tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt

tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô

tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy

Yếu tố làm đặc môi trường:

• Agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cấy mô thực vật

• Agar không phản ứng với các chất trong môi trường Độ cứng của agar quyết định bởi nồng

độ agar sử dụng và pH của môi trường

 Khoáng đa lượng

 Khoáng vi lượng

 Carbon và nguồn năng lượng

 Vitamin

 Chất điều hòa tăng trưởng thực vật

 Các chất hữu cơ không xác định, nguồn cung

cấp nitrogen, than hoạt tính, yếu tố làm đặc

môi trường

Một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5 (Gamborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao

và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn

Trang 7

Khoáng đa lượng mg l -1

NH 4 NO 3 1650

KNO 3 1900

KH 2 PO 4 170

MgSO 4 7H 2 O 370

CaCl 2 2H 2 O 440

Khoáng vi lượng mg l -1

H 3 BO 3 6.2

MnSO 4 4H 2 O 22.3

ZnSO 4 7H 2 O 8.6

Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.25

CuSO 4 5H 2 O 0.025

CoCl 2 6H 2 O 0.025

Na 2 EDTA 37.3

FeSO 4 7H 2 O 27.8

Vitamin và các chất hữu cơ khác mg l -1

Myo-Inositol 100

Nicotinic acid 0.5

Pyridoxine HCl 0.5

Thiamine HCl 0.1

Glycine 2.0

Thành

phần

môi

trường

MS

Khoáng đa lượng

NH 4 NO 3 1650 mg/l

KH 2 PO 4 170 mg/l CaCl 2 .2H 2 O 440 mg/l MgSO 4 .7H 2 O 370 mg/l

NH 4 NO 3 82,5 g/l

KH 2 PO 4 8,5 g/l

MgSO 4 .7H 2 O 37 g/l CaCl 2 2H 2 O 44 g/l

Stock 1 x 50 (20ml/l)

Stock 2 x 100 (10ml/l) Stock 3 x 100 (10ml/l)

Khoáng vi lượng

MnSO 4 .4H 2 O 22,3 mg/l

ZnSO 4 .7H 2 O 8,6 mg/l

Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,25 mg/l

CuSO 4 5H 2 O 0,025 mg/l

CoCl 2 6H 2 O 0,025 mg/l

Na 2 EDTA 37,3 mg/l

FeSO 4 .7H 2 O 27,8 mg/l

MnSO 4 .4H 2 O 1115 mg/l ZnSO 4 .7H 2 O 430 mg/l

Na 2 MoO 4 .2H 2 O 12,5 mg/l CuSO 4 5H 2 O 1,25 mg/l CoCl 2 6H 2 O 1,25 mg/l

Na 2 .EDTA 3,73 g/l FeSO 4 .7H 2 O 2,78 g/l

Stock 4 x 50 (20ml/l)

Stock 5 x 100 (10ml/l)

Vitamin

Myo-Inositol 100 mg/l Nicotinic acid 0,5 mg/l Pyridoxine HCl 0,5 mg/l Thiamine HCl 0,1 mg/l

Myo-Inositol 20 g/l Nicotinic acid 100 mg/l Pyridoxine HCl 100 mg/l Thiamine HCl 20 mg/l

Stock 6 x 200 (5ml/l)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi

cấy mô thực vật

Mẫu cấy Môi trường nuôi cấy

Ánh sáng Độ thoáng khí

 Một số mô hình và hệ thống

 Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân ngắn Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo thành cây nguyên vẹn

Nuôi cấy nốt đơn thân

Trang 8

Virus thực vật là một trong những tác nhân gây

thiệt hại nặng nề cho nền nông nghiệp

Virus lây lan nhờ côn trùng, tuyến trung, ve rận

hoặc thông qua con đường cơ học

Virus lan truyền trong cơ thể thực vật qua các

bó mạch Đa số các loài virus không truyền

nhiễm qua hạt

 Xử lý nhiệt, hóa chất,…

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

 Năm 1949, Limasset và Cornuet nhận thấy trong cây bị nhiễm, mật độ virus giảm dần khi đến gần điểm phát triển sinh dưỡng

 Năm 1952, Morel và Martin khẳng định có thể tách mô phân sinh chồi đỉnh của cây trồng bị nhiễm virus in vitro để thu được cây sạch bệnh

Mô phân sinh là một đỉnh tròn gồm các tế bào

phân chia tích cực, có đường kính khoảng 0,1

mm và dài khoảng 0,25 mm

Sử dụng khối mô bao gồm cả đỉnh sinh trưởng

và 1 hoặc 2 sơ khởi lá có kích thước 0,5-1 mm

Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch bệnh virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này

Quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy bao phấn

• Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn  các cây đơn bội và đơn bội kép  biểu hiện tất cả các tính trạng  ứng dụng trong việc chọn giống

• Được áp dụng thành công ở trên 250 loài thực vật, gồm các cây thuộc họ Liliaceae

Trang 9

• Vật liệu

Nụ hoa 3,5 – 5 cm chứa hạt phấn ở giai đoạn

đơn nhân muộn

• Phương pháp

• Khử trùng với etanol 70 1 phút và hypoclorid calcium 8% 15 phút

• Nuôi cấy trên MS có picloram 2mg/l, zeatin 2mg/l và sacaroz 6%

• Trong tối, ở 25°C  mô sẹo

• Sau 2 tháng, mô sẹo  MS có picloram 0,1mg/l, BA 0,01mg/l và sacaroz 3%  cụm chồi

• Cây con  môi trường MS  tăng trưởng và tạo rễ (ở 25oC, 1600  100 lux)

Quy trình nuôi cấy bao phấn

Hạt phấn

Sau 14 ngày GĐ 2 tế bào

GĐ 4 tế bào

GĐ 8 tế bào

Mô sẹo (sau 2 tháng) Cụm chồi

Cây con

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi

cấy mô thực vật

Mẫu cấy Môi trường nuôi cấy Ánh sáng Độ thoáng khí

 Một số mô hình và hệ thống

nuôi cấy mới

Hệ thống nuôi cấy Bioreactor

Môi trường rắn:

- Lãng phí

- Tích tụ phenol gây độc cho mẫu cấy

Môi trường lỏng:

- Trao đổi khí hạn chế

- Dễ xảy ra hiện tượng thủy tinh thể

Trang 10

Môi trường lỏng lắc:

- Gây tổn thương cho mẫu cấy

Môi trường lỏng có sục khí:

(Bioreactor)

Bioreactor = bình phản ứng

có những tính chất:

• Điều kiện vô trùng

• Môi trường lỏng có sục khí

• Số lượng mẫu cấy nhiều

• Có khả năng tự động hóa

Hệ thống nuôi cấy Bioreactor tự tạo

Hệ thống nuôi cấy Bioreactor tự động

Trang 11

Quy trình nhân sinh khối thực vật bằng hệ

thống Bioreactor:

• B1 Thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng

• B2 Nhân sinh khối

• B3 Tạo rễ cho cây con trước khi ra vườn ươm

Các thông số ảnh hưởng đến hiệu quả của

hệ thống Bioreactor

• Sự vận chuyển khí oxy và khả năng hòa tan oxy vào môi trường

• Môi trường dinh dưỡng

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Hệ thống ngập chìm tạm thời

Định dạng
Số trang	14
Dung lượng	2,01 MB