Nhân nhanh giống mía c95 186 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro luận văn tốt nghiệp đại học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌCĐẶNG MINH HẰNG NHÂN NHANH GIỐNG MÍA C95-186 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC VINH 2011... Môi trường nuôi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC

ĐẶNG MINH HẰNG

NHÂN NHANH GIỐNG MÍA C95-186 BẰNG CÔNG NGHỆ

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

VINH 2011

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáoTh.s Phạm Thị Như Quỳnh, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào đã hướng dẫn tậntình và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

và hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp quý báu của cácthầy cô giáo trong bộ môn sinh lí – sinh hoá, sự tạo điều kiện ủng hộ của cán

bộ phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô – tế bào thực vật

Cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiệnthuận lợi nhất trong quá trình thực hiện đề tài

Lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học sẽ không tránh khỏi nhữngthiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và bạn bè để đề tàinghiên cứu của tôi được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Vinh, tháng 5 năm 2011Sinh viên thực hiện

Đặng Minh Hằng

MỤC LỤC

Đặt vấn đề 3

Chương I Tổng quan tài liệu 5

1.1 Công nghệ NCM-TB thực vật in vitro 5

1.1.1 Cơ sở khoa học của công nghệ NCM-TB thực vật in vitro 5

1.1.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

1.1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro 13

1.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.2.1 Trên thế giới 14

1.2.2 Ở Việt Nam 14

1.3 Tìm hiểu chung về cây mía 17

1.3.1 Đặc điểm thực vật của cây mía 17

1.3.2 Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía 18

Chương II Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 20

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 20

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 20

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 21

2.3.2 Điều kiện thí nghiệm 21

2.3.3 Vật liệu khởi đầu 21

2.3.4 Giai đoạn vào mẫu 21

2.3.5 Giai đoạn nhân nhanh 22

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 22

Chương III Kết quả nghiên cứu và thảo luận 23

3.1 Kết quả nghiên cứu giai đoạn vào mẫu 23

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lí hoá chất khử trùng HgCl20,1% đến tỉ lệ thành công của đỉnh sinh trưởng 23

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lí hoá chất khử trùng là H2O2 10% đến tỉ lệ thành công của đỉnh sinh trưởng 25

3.1.3 So sánh 2 thí nghiệm 27

3.2 Kết quả nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh 28

3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến hệ số nhân nhanh và sự sinh trưởng phát triển của chồi mía in vitro giống mía C95-186 28

3.2.2 So sánh kết quả nghiên cứu với một nghiên cứu khác 32

3.3 Một số lưu ý trong quá trình nhân giống mía bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro (giai đoạn vào mẫu và nhân nhanh) 36

3.3.1 Giai đoạn vào mẫu 36

3.3.2 Giai đoạn nhân nhanh 36

Kết luận và đề nghị 37

A Kết luận 37

B Đề nghị 37

Tài liệu tham khảo 38

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN

NCM – TB : Nuôi cấy mô – tế bào

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây mía (Saccharum officinarum L) thuộc ngành thực vật có hạt(Spermatophyta), lớp một lá mầm (Monocotyledneae), họ hoà thảo(Gramineae), chi Saccharum, là cây công nghiệp có nhiều giá trị, chủ yếu đểcung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến đường Đường là loạithực phẩm cần thiết cho đời sống, cung cấp năng lượng lớn cho con người.Đường còn là nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp thực phẩm như: sảnxuất bánh kẹo, đồ hộp, giải khát và trong các ngành y dược, hoá học

Ở nước ta cây mía là nguồn nguyên liệu duy nhất để chế biến đường và

nó được coi là một trong những cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây trồngcủa vùng đồi, vùng trung du và miền núi

Trong những năm gần đây ngành sản xuất mía đường gặp nhiều khókhăn trong việc tìm nguồn giống mía có năng suất và chất lượng cao, nhiềugiống đã bị thoái hoá, năng suất chất lượng thấp, mức độ dịch hại nhiều, đặcbiệt xảy ra trên các giống chủ yếu nhân giống bằng hom lưu gốc nhiều năm.Trong khi đó, các nhà máy chế biến đường vẫn thiếu một nguồn cung cấpnguyên liệu mía ổn định và đảm bảo về mặt giá cả và chất lượng

Từ thực tế này, vấn đề đặt ra là cần có một hệ thống hoàn chỉnh và liêntục để nhân giống, lưu trữ, phục tráng giống và nhân nhanh giống mới, đảmbảo hiệu quả, an toàn, đáp ứng yêu cầu sản xuất

Nuôi cấy mô tế bào in vitro là một công nghệ hiện đại cho phép sản

xuất những cây giống sạch bệnh với quy mô lớn, cung cấp cây giống với sốlượng lớn cho sản xuất trong thời gian ngắn nhất, cây con giống hệt bố mẹ vềcác đặc tính di truyền, hệ số nhân cao, độ đồng đều lớn, thể hiện tính ưu việt

so với các phương pháp nhân giống truyền thống khác

Xuất phát từ những vấn đề trên, để tìm hiểu và nghiên cứu sâu hơn về

kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro, đặc biệt là nghiên cứu việc nhân nhanh

giống mía bằng công nghệ in vitro góp phần cung cấp dữ liệu hoàn thiện côngnghệ nhân nhanh giống mía C95-186 để có được nguồn giống tốt, đảm bảo cả

về số lượng và chất lượng cho người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nhân nhanh giống mía C95-168 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro”.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Công nghệ NCM-TB thực vật in vitro

1.1.1 Cơ sở khoa học của công nghệ NCM-TB thực vật in vitro

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung và kĩ thuật nhân giống

vô tính in vitro nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự

phân hoá và phản phân hoá của tế bào [8]

1.1.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Theo Haberland (1902) mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật

đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh[8]

Theo quan điểm sinh học hiện đại thì mỗi một tế bào đã chuyên hoáđều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượngthông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành Vì vậy, trong điều kiện nhấtđịnh một tế bào bất kì đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đặctính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào [8]

Quá trình phát sinh hình thái trong NCM-TB thực chất là kết quả của

sự phân hoá và phản phân hoá [13]

1.1.1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào

Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khácnhau được hình thành từ nhiều loại tế bào Tất cả các tế bào đó đều bắt nguồn

từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinhchưa mang chức năng riêng biệt Sau đó, các tế bào phôi sinh này tiếp tụcđược biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan khácnhau Đó là sự phân hoá

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năngchuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trongđiều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chiamạnh mẽ Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hoá tế bào[8], [12]

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá [8] Phản phân hoá

1.1.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Là nhân tố quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy.Hầu hết các môi trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng để nuôi cấy mô và

tế bào thực vật đều bao gồm các thành phần sau:

+ Các nguyên tố muối khoáng

- Nguyên tố đa lượng

+ Chất làm đông môi trường (Agar) và một số các chất khác

a, Các loại muối khoáng

a 1 Các nguyên tố đa lượng

Các nguyên tố đa lượng bao gồm: Fe, N, P, K, S, Mg, Ca Chúng cóchức năng chính là tham gia vào thành phần cấu trúc của tế bào Nồng độ củacác nguyên tố trong môi trường trên 30 ppm (tức 30 mg/l)

- Nitơ (N): Tồn tại ở 2 dạng NO3- và NH4+, chúng được sử dụng riêng rẽhoặc phối hợp với nhau tuỳ từng loại cây và giai đoạn phát triển

- Lưu huỳnh (S): Nguyên tố này được cây hấp thu tốt nhất dưới dạng SO42-

- Photpho (P): Photpho thường được đưa vào môi trường nuôi cấy ởdạng muối phosphat và hai loại hợp chất hay dùng nhất là NaH2PO4, KH2PO4,ngoài ra khi photpho ở dạng H2PO4- còn có tác dụng như một hệ đệm, làm ổnđịnh pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy

- Magiê (Mg): Được cung cấp cho cây đưới dạng MgSO4.7H2O, nồng

Các nguyên tố vi lượng bao gồm: Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co đó là nhữngnguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm [2].

- Mangan (Mn): Thường được cây sử dụng dưới dạng MnSO4.4H2O.Thiếu Mn làm cho quá trình phân bào bị ức chế

- Bo (B): Thường được cây sử dụng dưới dạng H3BO3 Nếu thiếu Btrong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin Mô nuôi cấy có biểu hiệnthành mô sẹo hoá mạnh, nhưng thường là loại mô xốp, mọng nước, kém táisinh

- Molypden (Mo): Mo có tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạmtrong tế bào thực vật

- Đồng (Cu): Được cây hấp thu dưới dạng CuSO4, với nồng độ rất bé0,04 – 0,08 mM [2]

b Nguồn Cacbon (C)

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phươngthức dị dưỡng, cũng có thể sống bán dị dưỡng nhờ vào khả năng quang hợptrong điều kiện ánh sáng nhân tạo, nhưng rất yếu không đủ nguồn cacbon hữu

cơ cho sự sinh trưởng phát triển của cây Vì vậy trong môi trường nuôi cấycần được bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và thường dùng saccarosa với liềulượng thích hợp là 2 – 3% Trong một số trường hợp đặc biệt như nuôi cấybao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần, có thể dùng glucoza, mantoza, galactoza[2], [6]

c Các vitamin

Vitamin là các hợp chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc của enzim và cáccofacto của nhiều phản ứng sinh hoá Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thựcvật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưngthường không đủ về lượng do đó cần phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào,nhất là các vitamin thuộc nhóm B (Vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, myoinositol, biotin, pantothenic axit)

Các vitamin thường được pha trong hỗn hợp dung dich mẹ có nồng độcao gấp 500 hoặc 1000 lần dung dịch làm việc [2], [11]

Một số vitamin thường dùng trong môi trường nuôi cấy [11]

d Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môitrường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, có vai trò quyết định quá trình pháttriển hình thái của cây

Một số chất điều tiết sinh trưởng thường dùng [11]

Tên chất sinh trưởng Nồng độ sử dụng (mg/l)

2,4D [dichlorrophennoxy]

α-NAA [naphtylaxetic axit]

β-IAA [indol axetic axit]

IBA [indol butyric axit]

Kinetin [6 finfuryl amino purine]

BA [6-BAP][6benzy 1 amino purine]

2-IP[N6γ-γDimetylally1amino purine]

GA3 [Gibberelic axit]

0,2-50,1-50,1-50,1-20,1-20,1-20,1-20,1-2

Các chất đó thuộc các nhóm sau:

+ Auxin

Là một loại hoocmon thực vật (phytohormon), tăng cường các quá trìnhtổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ Có 4 loại auxin thườngđược sử dụng trong NCM-TB là:

- Indolylacetic (IAA)

- Naphthylacetic axit(α-NAA)

- 2,4- Dichlorphenoxyaxetic axit (2,4-D)

- Indolbutyric axit (IBA)

Hàm lượng của các chất này từ 0,1 - 2,0 ppm Tuỳ theo loại, hàm lượng

sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thíchsinh trưởng của mô, hoạt hoá sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chiamạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [2]

+ Xytokinin

Các hợp chất xytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành vàsinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961)

Các loại xytokinin thường được dùng trong nuôi cấy bao gồm:

- Kinetin (6- furfurylamio purine)

- Zeatin (6-[4 hydroxy-3-metyl-but-2- enylamino] purine)

- BAP (6- benzylamino purin)

- 2-ip (Isopentenyl adenine)

Trong nhóm này, Kinetin và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả

+ Axit abscisic (ABA)

ABA thuộc nhóm chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉcủa chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng

ABA thuộc nhóm chất ức chế sinh trưởng ABA có tác dụng tăng khảnăng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Vì

vậy nó được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định [ 2],[6].

e Các hỗn hợp chất tự nhiên

Một số hợp chất được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng như:

+ Nước dừa: Là hợp chất thường được sử dụng nhiều hơn cả Chất có

hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-inositol inositol) và một số axit amin khác Lượng nước dừa dùng trong môi trườngnuôi cấy thường khá lớn chiếm 10 - 20% thể tích môi trường [2], [11]

(m-Từ năm 1941 nước dừa được sử dụng để nuôi phôi của Datura và 1949nuôi mô của Daucus Kết quả phân tích thành phần của nước dừa từ non đếngià của Tulecke và CTV (1961) cho thấy trong nước dừa có:

-Amino axit tự do: Đạt nồng độ từ 190,5 ppm đến 685 ppm trongnước dừa tuỳ theo tuổi của quá trình từ non đến già Khi hấp ở nhiệt độ caochỉ còn khoảng 70 ppm

- Amino axit dạng liên kết có trong protêin và peptit

- Axit hữu cơ

+ Dịch chiết nấm men: Với dịch chiết nấm men, White (1934) lần đầu

tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn Thànhphần hoá học của dịch chiết nấm men ít được chú ý phân tích, chủ yếu chứa:đường, axit nuclêic, amino axit, vitamin, auxin, khoáng Tác dụng của dịchchiết nấm men rất tốt với rễ [2]

+ Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha): Thành phần hoá học chưa được

phân tích kĩ, chủ yếu chứa một số đường, vitamin và một số chất có hoạt tínhđiều khiển sinh trưởng [2]

+ Dịch chiết một số loại rau, quả tươi (khoai tây, chuối, cà rốt ): Với

thành phần có đường, axit nuclêic, vitamin, axit amin, khoáng…[2]

+ Dịch thuỷ phân casein: Được sử dụng rộng rãi trong kĩ thuật vi sinh

vật, ở NCM-TB thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung axit amin

+ Hỗn hợp axit amin nhân tạo: Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn

rất khác nhau Có thể yêu cầu axit amin của các loại tế bào rất khác nhau.Trong môi trường lỏng để nuôi mô sẹo lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ

mô sẹo prolin là một thành phần quan trọng [2]

f Chất làm đông môi trường (Agar) và các thành phần khác

+ Chất độn - thạch (Agar)

Agar là một trong những chất để làm đông môi trường phổ biến nhất (tạogel), được sử dụng làm chất đệm cho môi trường dinh dưỡng rắn lại Ở 800C,thạch ngậm nước chuyển thành dạng sol và ở 400C trở về trạng thái gel Khảnăng ngậm nước của thạch là 6 – 12 g/l nước [2]

Agar là một loại polysacarit của tảo (chủ yếu tảo hồng- Rodophyta) Tuy

ở trạng thái gel nhưng agar vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyển dễ dàng Vìvậy, thuận lợi cho sự hút dinh dưỡng của cây trong nuôi cấy mô [8]

+ Nước pha môi trường

Nước pha môi trường nuôi cấy phải là nước hoàn toàn sạch ion Thôngthường người ta sử dụng nước cất hai lần [2]

+ Than hoạt tính

Được dùng để hấp thu các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩmtrao đổi thứ cấp Làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nênsẫm khi có than hạt tính, có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ[2]

+ Độ pH của môi trường

Độ pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết cácmôi trường nuôi cấy pH 5,0 – 6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu

Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi trường rất rắn trong khi pH thấp lại giảmkhả năng đông đặc của Agar

Đối với nuôi cấy mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 6,0, sau 4 tuần nuôi cấy đạt được 6,0 - 6,5

-g Môi trường nuôi cấy

Môi trường được sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật rất phongphú, nhưng sử dụng phổ biến hơn cả là môi trường MS (Murashige - Skoog,1962).

Thành phần môi trường MS gồm:

Thành phần Hoá chất Nồng độ (mg/l)

Đa lượng

NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O

KH2PO4

1.6501.900440370

Vi lượng

Na2EDTA.2H2OFeSO4.7H2OMnSO4ZnSO4.7H2O

H3PO3KI

Na2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCaCl2.6H2O

37,2627,816,98,66,20,830.250,0250,025

Vitamin

GlyxineMyo-inositolNicotinic acidPyridocineThiamine

21000,50,50,1

Các chất hữu cơ Saccarose

Agar

306-8

Auxin

0,1-100,1-5

1.1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro

Về cơ bản quy trình nhân giống được chia thành 4 giai đoạn [13]

a Giai đoạn 1: Giai đoạn vào mẫu

Đây là giai đoạn khó khăn nhất có ý nghĩa quyết định tới toàn bộ quytrình nhân giống Giai đoạn này phải đảm bảo được các yêu cầu sau:

- Tỷ lệ chết thấp.

- Tỷ lệ sống cao

- Mô cấy sinh trưởng và phát triển tốt

Một số hoá chất thường dùng HgCl2, CaOCl2, NaOCl, H2O2 Tuỳ thuộc vàotừng mô thực vật mà lựa chọn nồng độ, thời gian xử lý và hoá chất thích hợp [13]

b Giai đoạn 2: Giai đoạn nhân nhanh

Giai đoạn nhân nhanh được xem là giai đoạn then chốt của cả quá trìnhnhân giống in vitro vì mục đích của giai đoạn này là nhằm tạo ra hệ số nhânchồi in vitro cao nhất Để tăng hệ số nhân chồi, phải đưa thêm vào môi trườngdinh dưỡng các chất điều tiết sinh trưởng: Auxin, Xytokinin, Gibberelin,…các hợp chất tự nhiên kết hợp với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Giaiđoạn này kéo dài trong khoảng 4 – 8 tuần [13]

c Giai đoạn 3: Giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Môi trường nuôi cấy thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin vì đây lànhóm hormon thực vật có vai trò sinh lý là tạo rễ bất định cho mô nuôi cấy,trong đó IAA, IBA, α-NAA, 2,4 D được sử dụng nhiều nhất Giai đoạn nàythường kéo dài 2 – 8 tuần [13]

d Giai đoạn 4: Giai đoạn huấn luyện thích nghi

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro, nó quyếtđịnh khả năng ứng dụng của quá trình này vào thực tiễn sản xuất Thời giantối thiểu cho sự thích nghi đó là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây cần đượcchăm sóc, bảo vệ cẩn thận trước những bất lợi như mất nước, nhiễm nấm, vikhuẩn,… Giai đoạn này cần có giá thể chăm sóc phù hợp

Phải giữ ẩm cho cây, khi đưa ra ngoài vườn ươm cần phải che chắn đểgiữ ẩm và tránh ánh sáng quá mạnh Giai đoạn này cần đảm bảo độ ẩm đất từ

76 – 80% và độ ẩm không khí đạt 82 – 85% [13]

1.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng công nghệ nuôi cấy mô tế

bào thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Trên thế giới

Năm 1952 lần đầu tiên tại Pháp, Morel và Martin đã tạo ra được câyhoa cúc sạch bệnh virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ năm 1958 – 1960,

một bộ sưu tập các cây được làm sạch bệnh đã được xây dựng nhờ kĩ thuậtnhân giống in vitro Từ đây người ta bắt đầu nhận thức được lợi ích củaphương pháp này trong nhân nhanh và kinh tế các giống, mà phương pháp tựnhiên không đáp ứng được Từ năm 1963, kĩ thuật nhân giống in vitro đã pháttriển rất nhanh trên thế giới, đặc biệt ở các nước phát triển [15].

Phương pháp nuôi cấy in vitro đã được áp dụng ở nhiều quốc gia nhưẤn Độ, Cu Ba, Trung Quốc, Đài Loan Tại Cu Ba hệ thống sản xuất và cungcấp mía giống được hình thành nhằm mục tiêu hình thành dịch vụ giống vàhom giống có độ thuần và chất lượng cao, sạch sâu bệnh để bảo quản tốt tính

di truyền và tăng cường thời gian khai thác giống thương phẩm Trong đóphương pháp nuôi cấy mô đóng vai trò then chốt trong việc nhân nhanh giống

cơ bản đạt tiêu chuẩn [4]

Tại Trung Quốc nhân giống mía bằng phương pháp này đã được triểnkhai ở một số vùng trồng mía Chỉ trong vòng 4 năm, giống Quế Đường 11 đãphủ kín hơn 32.000 ha, trong khi đó bằng phương pháp nhân truyền thốngphải mất hơn 10 năm mới có được diện tích tương tự [4]

Heinz, 1977 ở Hawaii và sau đó các nhà khoa học Đài Loan, Pháp,Cuba, Argenetina, đã thành công trong việc tái sinh mía từ callus, từ nuôi cấytúi phấn đã tạo được cây đơn bội có năng suất cao hơn trong điều kiện tựnhiên so với cây bố mẹ, hoặc phương pháp chọn dòng soma cho phép phânlập được các dòng kháng bệnh [7]

Phương pháp nhân giống và nhân dòng vô tính đặc biệt có ý nghĩa đốivới các cây trồng nhiệt đới vì chúng có độ dị hợp tử cao Hầu hết đều có thể

đưa vào nhân giống vô tính in vitro với mục tiêu thương mại hoá trên quy mô

lớn (theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987) [7]

1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các ngành khoa học nói chung và công nghệ NCM-TB nóiriêng đang tiến triển chậm hơn so với thế giới rất nhiều Việc ứng dụng nhữngthành tựu của phương pháp nhân giống in vitro còn là một lĩnh vực khá mới

mẻ, nhưng giàu tiềm năng phát triển Tuy nhiên, trong những năm gần đâychúng ta cũng đã đạt được những thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân

nhanh các loại cây như: cà phê, cỏ ngọt, chuối (Trung tâm CNSH), dứa (Việnnghiên cứu dầu và cây có dầu, Viện khoa học Việt Nam), mía đường (Trungtâm CNSH, Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, Trung tâm sinh học và câythực nghiệm)… và đã mang lại hiệu quả kinh tế cao [3].

Phương pháp nuôi cấy in vitro trên cây mía đã được thử nghiệm ởnhiều nơi như Viện Sinh Học Nhiệt Đới Việt Nam, Viện Khoa học NôngNghiệp Việt Nam, Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt Nam,… Tại Viện khoahọc và công nghệ Việt Nam đã thí nghiệm và nhân giống vô tính nhiều giốngcây trồng như: mía, ngô, dứa, lúa, thuốc lá… có khả năng chống chịu để phục

vụ cho việc trồng trọt ở địa bàn miền Bắc [7]

Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng nhiều hơn trong việc nhângiống và chọn tạo giống cây trồng nông nghiệp Đối với mía, phương phápnày có thể dùng bổ trợ cho phương pháp lai hữu tính để giữ một số đặc tính ditruyền tốt của bố mẹ mà chúng không có khả năng kết hợp trong tổ hợp lai[5]

Tuy việc nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô đối với câymía đã được tiến hành từ những năm 1970 nhưng cho đến nay thì nuôi cấy môcây mía vẫn còn là một vấn đề mới mà các nhà chọn tạo giống đang rất quantâm nghiên cứu [5]

Chi Thị Tứ, Mai Văn Quắc, Hồ Hữu Nhị (1994) đã nghiên cứu sử dụngkĩ thuật nuôi cấy mô tế bào để nhân nhanh một số giống mía ở Việt Nam như:CP5243, VN 72234, Việt đường và giống ROC 10 Kết quả nghiên cứu thuđược là: ở giai đoạn vào mẫu, lá non của cây mía được sử dụng làm vật liệutạo cụm chồi, xử lí thích hợp nhất với hoá chất HgCl2 0,1% trong 5 phút; Ởgiai đoạn nhân nhanh tạo cụm chồi kết quả thu được là: đối với 2 giống míaCP5243 và VN 72234 thì nồng độ BA thích hợp nhất cho sự phát sinh cụmchồi là 0,1 mg/l môi trường Đối với hai giống mía ROC 10 và Việt đường thìnồng độ BA thích hợp nhất cho sự phát sinh cụm chồi là 0,3 mg/l môi trường[10]

Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Uyển và cộng sự tại Trung TâmCông Nghệ Sinh Học đã cho thấy đối với nuôi cấy mô cây mía thì bộ phận

mô nuôi cấy thích hợp nhất cho việc tạo callus và tái sinh cây hoàn chỉnh làcác lá non còn đang bọc trong bẹ và đòng hoa non của cây [11].

Năm 2003, Thân Thị Thu Hạnh và Lưu Thị Duyên đã nghiên cứu kĩthuật nhân nhanh giống mía VN84-422 và VN85-1427 bằng phương pháp invitro, sử dụng nguyên liệu nuôi cấy là mắt mầm Kết quả nghiên cứu thu đượclà: ở giai đoạn nhân nhanh chồi đối với 2 giống mía VN84-422 và VN85-

1427 thì nồng độ 0,5 mg/l kinetin + 1,5 – 2 mg/l BAP thích hợp nhất và hệ sốnhân nhanh đạt 2,8 lần sau 3 – 4 tuần Ở giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnhnồng độ 2 – 4 mg/l α-NAA là thích hợp nhất [4]

Nguyễn Thị Nhẫn (2005) nghiên cứu kĩ thuật nhân nhanh các giốngmía Quế Đường 15 và F134 bằng phương pháp in vitro Kết quả nghiên cứuthu được: Ở giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu in vitro đối với mô cấy là đỉnhsinh trưởng và các mắt ngủ trên thân cây việc khử trùng bằng Hypocloriccanxi 5% trong 15 phút là phù hợp; Ở giai đoạn nhân nhanh in vitro môitrường phù hợp là: MS + 0,5 ppm α-NAA + 1 ppm BA Ở giai đoạn ra rễ tạocây hoàn chỉnh môi trường thích hợp là: MS + 0,5 ppm α-NAA (hoặc 7,5%Saccaroza) [8]

Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện KHKTNN, Viện Rau Quả TrungƯơng, Trung Tâm nghiên cứu ứng dụng KH và CN Hải Phòng, Sở KHCN NamĐịnh, công ty giống cây trồng Trung Ương I, Viện Sinh học Đà Lạt,… mỗi năm

sản xuất hàng triệu cây giống in vitro, củ giống in vitro của các loại cây hoa, cây

khoai tây, cây mía,… Tại Đà Lạt từ nhiều năm nay, rất nhiều phòng nuôi cấy môcủa tư nhân ra đời, hoạt động rất có hiệu quả và mỗi năm đã cung cấp một sốlượng lớn cây giống in vitro cho vùng sản xuất tại Đà Lạt và các vùng phụ cận[8]

1.3 Tìm hiểu chung về cây mía

1.3.1 Đặc điểm thực vật của cây mía

a- Rễ:

Rễ mía thuộc loại rễ chùm, gồm 2 loại rễ cây và rễ hom hay còn gọi là

rễ sơ cấp và rễ thứ cấp

+ Rễ sơ cấp: Được mọc từ các đốt của hom giống, đường kính bé, phânnhánh nhiều, có vai trò hút nước và dinh dưỡng cho cây ở thời kì đầu.

+ Rễ thứ cấp: Mọc từ gốc của mầm mới sinh ra của hom giống Thườngcây con có từ 3 – 5 lá thật thì rễ thứ cấp xuất hiện Rễ thứ cấp được chia thành

3 nhóm nhỏ là rễ mặt, rễ giữ và rễ ăn sâu

So với những cây hoà thảo khác cây mía có bộ rễ phát triển rất mạnh,một khóm có từ 500 – 2.000 rễ, tổng chiều dài có thể tới 100 – 500 m [1]

Ví dụ: Xantofin nhiều cây mía có màu đỏ, chlorofin nhiều cây có màuxanh, cả 2 chất này đều nhiều thì vỏ có màu tím, ít thì vỏ có màu vàng [1]

e- Mầm mía:

Nằm trên đai rễ, thường mỗi đốt chỉ có 1 mầm, cá biệt có 2 hoặc nhiềumầm Là phôi cây ở thế hệ sau, từ đây sẽ mọc ra cây mía mới sau trồng [9]

f- Lá mía:

Mọc thành 2 hàng so le, đối nhau hoặc theo đường vòng trên thân mía tuỳ giống, mỗi đốt có 1 lá Lá mía gồm phiến lá, bẹ lá và cổ lá Cổ lá là nơi tiếp giáp giữa bẹ lá và phiến lá [9].

g- Hoa và quả:

Hoa mía được bao bọc bởi chiếc lá cuối cùng của bộ lá Hoa mía lưỡngtính có 3 nhị đực, 2 nhị cái và 2 bầu noãn Khi nở các bao phấn của nhị đựctung phấn, nhờ gió mà nhị cái tiếp nhận được hạt phấn

Mía ra hoa trong điều kiện ngày dài từ 12 - 12,5 giờ, ánh sáng đầy đủ,nhiệt độ tối thiểu là 280C

Sau khi thụ phấn quả phát triển sau 25 – 30 ngày thì chín, khi chín hạtchuyển từ màu vàng sang màu hạt dẻ [9]

1.3.2 Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía

Cây mía có khả năng thích ứng rộng, tận dụng tốt năng lượng ánh sángmặt trời Cây mía có các yêu cầu cơ bản sau đây để cho năng suất, chất lượngcao:

- Thời kỳ tích luỹ đường cần nhiệt độ thấp và biên độ chênh lệch vềnhiệt độ khá lớn giữa ngày và đêm, nhiệt độ thích hợp từ 14– 250C [9]