Các kỹ thuật chính của công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật pdf

Bảo quản nguồn gen in vitro ưu điểm của kỹ thuật nhân nhanh in vitro: Phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền Có thể nhân giống cây

1.KháI niệmchung

Nhân giống vô tính in vitro:

Là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ

phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân, lá, của

cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nhân nhanh in vitro được ứng dụng vào:

Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công

tác giống.

Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.

Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt

giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác.

Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.

Bảo quản nguồn gen in vitro

ưu điểm của kỹ thuật nhân nhanh

in vitro:

Phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các

cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

Có thể nhân giống cây trồng ở qui mô công nghiệp

(kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương

pháp thông thường)

Dễ dàng tạo được cây sạch virus

Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ

hoá >nâng cao hiệu quả nhân bằng các phương

pháp thông thường sau đó

H¹n chÕ cña kü thuËt nh©n nhanh

ChuyÓn ra m«i tr−êng tù nhiªn

Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi

cấy).

virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu

bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm

tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh

trưởng của mẫu cấy in vitro.

Bước 1: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm

thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

-Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát

triển của cây: mô non, ít chuyên hoá ( đỉnh chồi, mắt ngủ,

lá non, vảy củ )

-Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp:thường dùng

các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl,

Ca(OCl)25-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung

dịch Br

Bước 2: Nhân nhanh

thái vă tăng nhanh số lượng thông qua các con

đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo

phôi vô tính.

kiện ngoaị cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất

Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều

xytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy

độ ánh sáng 2000- 4000 lux.

Bước 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi

trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi

trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ

auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi

chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang

môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng

trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng

hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của xytokinin

để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh

Bước 4: thích ứng cây in vitro

ngoài điều kiện tự nhiên.

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây

sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

Cây trong ống nghiệm đn đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất

định (số lá, số rễ, chiều cao cây).

Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi

Cây giống

Cây con Nuôi cấy chồi đỉnh

Nuôi cấy đoạn thân Tạo chồi trực tiếp Tạo phôi trực tiếp

Cây từ phôi

Tạo chồi gián tiếp

Tạo phôi gián tiếp Cây con

Phát sinh hình thái trực tiếp

Phát sinh hình thái gián tiếp Mẫu cấy

Hoạt hoá chồi nách

Sự phát triển của chồi nách được kích thích bằng cách

loại bỏ ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi và đoạn

thân mang mắt ngủ Theo phương thức này sự phát triển

chồi diễn ra theo hai cách:

-Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách

Trường hợp này thường xảy ra khi nuôi cấy cây hai lá

mầm như thuốc lá, khoai tây, hoa cúc

-Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách Trường hợp

này hay gặp với cây 1 lá mầm như mía, lúa,

Tạo chồi bất định

Trong trường hợp này cần phải thực hiện quá trình

phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào

soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua

giai đoạn phát triển mô seo

ở các đối tượng một lá mầm như lan, dứa, chuối, hoa

loa kèn thường gặp sự phát triển cây qua giai đoạn

dẻ hành (protocorm): cùng một lúc mẫu cấy tạo thành

hàng loạt protocorm, các thể này hoặc tiếp tục sản sinh

protocorm mới hoặc phát triển thành cây

Tạo phôi vô tính

Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính

cũng cần phải thực hiện quá trình phản phân hoá

và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào soma hình

thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai

đoạn phát triển mô sẹo.Nhưng phôi vô tính có cấu

trúc lưỡng cực bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm

Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn

chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt

giống nhân tạo

Tạo phôi vô tính

Sự hình thành phôi có 2 bước:

Sự phân hoá các tế bào có khả năng phát sinh phôi:

cần môi trường giàu auxin Các tế bào có khả năng

phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều

hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm

đặc, giàu protein và ARN thông tin

Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình

thành: cần môi trường nghèo hoặc không có auxin

Nồng độ cao của auxin kích thích sự hình thành

phôi vô tính nhưng ức chế quá trình phân hoá và

phát triển tiếp theo của các phôi này

H×nh 28 Sù h×nh thµnh ph«i v« tÝnh cña c©y c¶i dÇu.

A: giai ®o¹n sím (7-10 ngµy); B: giai ®o¹n gi÷a (10-14 ngµy); C: giai ®o¹n cuèi

Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

Khái niệm

Có thể sử dụng các polyme sinh

học để bao gói 1 phôi vô tính với

một thể tích nhất định môi

trường dinh dưỡng để tạo hạt

nhân tạo

Hạt nhân tạo được dùng trong

nhân giống các cây lai F1có giá

trị cao, cây chuyển gen, bảo tồn

cây có nguy cơ tuyệt chủng và

nguồn gen ưu tú (elit)…

Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

đồng ruộng không cần giai đoạn thích ứng

bảo vệ thực vật, chất kích thích sinh trưởng

Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

Điều kiện:

Hệ thống sản xuất hạt giống nhân tạo phải có khả

năng sản xuất với số lượng lớn các thể phôi soma

và phôi soma được sản xuất đồng nhất, để có thể

được trồng trọt bằng những kỹ thuật truyền thống

một cách trực tiếp

Hệ thống sản xuất hạt nhân tạo phải được cơ giới

hóa và không phụ thuộc vào những thiết bị đắt tiền

và nhất là thỏa mnn yêu cầu vô trùng

Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

Các bước tạo hạt nhân tạo

 Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi trường dinh dưỡng

với mật độ phù hợp và bổ sung Na-alginate được làm tan

trong nước với nồng độ 2-4%

 Dùng pipet (máy nhỏ giọt) nhỏ 100-150àl huyền phù

nêu trên có chứa 1 phôi soma vào dung dịch CaCl2

(2-2,5%) Khi đó sẽ sinh ra phản ứng trao đổi ion Na-Ca và

hạt nhân tạo đượchình thành, có đủ độ cứng thích hợp

Sau đó chuyển qua ngâm trong nước làm cứng hạt

Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

 Dùng Ca-alginate thường hạt luôn luôn ẩm ướt bề

mặt, hiện nay người ta dùng một loại polymer

Elvax 4260 để bao lớp alginate

 Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để giúp hạt nhân

tạo dễ dàng bảo quản và nẩy mầm khi cần thiết

Kitto & Janick, đặt hạt cây cà rốt trên khay có

chứa 25% polyoxyethylene để làm mất nước, và

khi làm ướt lại thì hạt được tái sinh và phát triển

thành cây hoàn chỉnh

Hạt nảy mầm in vitro Hạt tạo từ phôi vô tính Hạt tạo từ protocorm Hạt nảy mầm in vitro

Callus phôi hoá

Cây từ hạt nhân tạo Cây in vitro ở vườn ươm Cây từ hạt nhân tạo

Cây mẹ

Tạo hạt nhân tạo

Nh©n gièng qua t¹o cñ in vitro

T¹o cñ khoai t©y in vitro

Nh©n gièng qua t¹o cñ in vitro

T¹o cñ loa kÌn in vitro

Các tồn tại của nhân giống cây trồng

bằng nuôi cấy mô

1.Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability)

Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất (True-to-type)

với số lượng rất lớn Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tao

ra những biến dị soma Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại

cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh.

Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là;

 Kiểu di truyền (Genotype): Tần số biến dị ảnh hưởng bởi genotyp của các loài cây

trồng khác nhau Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biến bị.

 Số lần cấy chuyển (Subcultures) số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng

cao Theo Amstrong và Phillips (1988): khi nuôi cấy lâu dài thường gây ra biến dị

nhiễm sắc thể.

 Loại mô (Tissue): Nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh in vitro ít

bị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác

Biến dị trong nhân giống dứa Cayen

Chồi bị sọc lá, bạch tạng Chồi dị dạng

Các tồn tại của nhân giống cây trồng

bằng nuôi cấy mô

2.Sự nhiễm mẫu (explant contamination)

Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử

trùng mẫu đưa vào nuôi cấy Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như:

Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas

có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại

khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2 tuần nuôi cấy) Để khắc phục

được hiện tượng trên cần:

 Trước hết cần phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn

 Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm

khuẩn và nấm Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có

phản ứng đến kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng

kháng sinh Chất kháng sinh thường gây ra những huỷ hoại ở ty thể và

lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất.

Sự nhiễm mẫu cấy

Các tồn tại của nhân giống cây trồng

bằng nuôi cấy mô

3.Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy (Toxic

compounds phenol)

Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hoá nâu hay đen mẫu, mẫu này có

thể khuyếch tán trong môi trường Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều

chất tanin hoặc hydroxyphenol Thí dụ các chất phenol eucomicacid và tyramine đn

làm hoá nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy.

Các phương pháp loại trừ sự hoá nâu:

 Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1 - 0,3%): phương pháp này đặc

biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides Tuy

nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số

chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác.

 Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt ở mẫu một số cây

ăn quả, (táo, hồng)

 Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng.

 Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy.

 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1 - 2 tuần).

 Cấy chuyển mẫu liên tục(1-2ngày/lần) sang môi trường tươi trong 1 - 2 tuần

Sự tiết độc tố từ mẫu cấy

Các tồn tại của nhân giống cây trồng

bằng nuôi cấy mô

4.Hiện tượng thuỷ tinh hoá (Vitrification).

 Cây bị “thuỷ tinh hoá”- thân lá cây mọng nước,trong suốt, cây rất khó sống khi

đưa ra ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh

 Thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự

trao đổi khí thấp Đặc biệt thường xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm

chướng, hoa đồng tiền và hoa cúc.

 Cây bị thuỷ tinh hoá thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều

phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nước Cây in vitro thường có mật độ khí khổng

cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá

trình nuôi cấy.

Để tránh hiện tượng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải

pháp:

 Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp

suất thẩm thấu cao.

 Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trường

 Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy.

 Sử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng.

Những công nghệ mới trong vi

nhân giống cây trồng

1.Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng

 Là bước phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào do giáo sư

T Koyoki Kozai đề xuất và nghiên cứu từ hơn 2 thập kỷ qua

 Công trình nghiên cứu tập trung vào vấn đề nhân giống cây nuôi

cấy mô trên môi trường không có đường nhưng được điền khiển

chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2.

 Công nghệ này đn được thử nghiệm thành công trên nhiều đối

tượng cây trồng như cà chua; khoai lang; rau spinach; dưa chuột;

xà lách; keo; cà phê; xoài; tre; thông;

 Công nghệ này đang được tiếp tục hoàn thiện để làm cơ sở cho

hệ thống nhân giống công nghiệp hóa (T Kozai; F.Afreen;

S.M.A.Zobayed - 2005)

Những công nghệ mới trong vi

 Lợi ích của vi nhân giống sử dụng hệ thống quang

tự dưỡng

Tốc độ sinh trưỏng, chất lượng và tỷ lệ sống của mô

thực vật được nâng cao ở tất các các bước trong nhân

giống trong điều kiện tự dưỡng

Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do không sử

dụng đường trong môi trường

Tỷ lệ đột biến có thể được giảm vì cây đựoc nuôi

trong điều kiện môi trường giống tự nhiên

Tự động hoá và do đó giảm được chi phí lao động

Cây vẫn sinh trưởng trong điều kiện vô trùng vì vậy vẫn dẫn đến

chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá

Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa Ví dụ: một bioreactor vibro - mixer ( rung

và trộn) trang bị với các ống silicone sục khí tự do đn có khả năng sản xuất

100000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong một lít dung dịch huyền phù nếu nh− dung dịch đó đ−ợc đặt trên một tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần (Preil và cộng sự, 1988)

Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành rất phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy

Những công nghệ mới trong vi

Thuận lợi của hệ thống bioreactor so với nuôi cấy

trong bình:

Thuận lợi thứ nhất là thể tích nuôi cấy tăng, thường là ít nhất 1 lít

Điều này cho phép sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần

những kỹ thuật cao cấp

Thuận lợi thứ hai, hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với

một cơ chế khuấy, bằng cơ học hay bằng thổi khí, để duy trì nuôi

cấy gần như đồng dạng

Thuận lợi thứ ba, khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi

cấy và môi trường vật lý có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh

trưởng Có những chỉ dẫn về các nhân tố môi trường như pH và

oxygen hòa tan Điều này không thể thực hiện được với hệ thống

nuôi cấy bình tam giác.