Việc nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhân nhanh với số lượng lớn cây giống nhằm đưa giống này phát triển ra sản xuất là yêu cầu cấp thiết của sản xuất.. Ảnh hưởng của phytohormon lên k
Trang 1NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG SP25 (Dianthus caryophyllus Make up) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
Lê Đức Thảo, Hoàng Ngọc Thuận, Nguyễn Thị Kim Lý, Trần Hoài Hương
Summary
Study on multiplication technology for SP25 Carnation variety
(Dianthus caryophyllus Make up) by tissue culture
The SP25 variety has been imported, evaluated and selected by Agricultural Genetics Institute It is being interested by producers and consumers at present So it is necessary to study on technique for multiplication by tissue culture The result showed that, to sterilize by HgCl2 0.1% at 6 minutes is the best choice The suitable culture medium for shoot formation and multiplication of SP25 was mixed in MS medium supplement with vitamins, 10% coconuts milk, 8.0 g/l agar, 2% sugar, BAP 0.7 mg/l and Kinetin 0.1 mg/l The coefficient of multiplication rate was 3.71 times The culture medium for root formation is MS medium supplemented with vitamins, 8.0 g/l agar, 2% sugar, IBA 0,05 mg/l and NAA 0.2 mg/l The best substrate for plantlets were mix substrate includes: 30% perlite and 70% rice husk burning
Keywords: Carnation, tissue culture, culture medium, sterilize, multiplication, root formation, plantlets,
substrates
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, trong các loại hoa cắt được
trồng, cNm chướng đang dần trở nên phổ
biến Cây cNm chướng ngày càng được
người tiêu dùng biết đến bởi sự đa dạng về
màu sắc, hoa rất bền, thuận lợi cho việc bảo
quản và vận chuyển đi xa Ở đồng bằng Bắc
bộ, hoa cNm chướng mới chỉ được trồng
một vụ trong năm, do đó, việc giữ giống
qua mùa hè trong điều kiện khí hậu không
thuận lợi và nhân giống cho vụ sau rất khó
thực hiện Về kỹ thuật nhân giống, sản xuất
hiện nay vẫn nhân giống chủ yếu bằng
phương pháp giâm cành qua nhiều thế hệ,
cây con chất lượng kém, hệ số nhân thấp
Thời gian qua, Viện Di truyền N ông
nghiệp đã nhập nội và tuyển chọn được một
số giống cNm chướng có chất lượng cao,
phù hợp với điều kiện sản xuất, trong đó có
giống SP25 chùm (Dianthus caryophyllus
Make up), có khả năng thích ứng cao, kể cả điều kiện đồng bằng Bắc bộ và được người sản xuất cũng như thị trường chấp nhận Việc nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhân nhanh với số lượng lớn cây giống nhằm đưa giống này phát triển ra sản xuất
là yêu cầu cấp thiết của sản xuất Vì vậy,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu quy trình
nhân giống hoa cNm chướng SP25 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠN G PHÁP
N GHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu nuôi cấy là chồi đỉnh và chồi nách của giống cNm chướng SP25
(Dianthus caryophyllus Make up) Sử dụng
Trang 2hai hóa chất khử trùng là HgCl2 0,1% và
H2O2 10%, 15%, 20%
- Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ nuôi cấy
25-280C, ánh sáng 1500-2000 Lux, thời
gian 8 giờ/ngày
2 Phương pháp nghiên cứu
Mẫu lấy về được rửa sạch dưới vòi
nước, cắt tỉa, bóc hết lớp lá bao tránh không
để giập, ngâm trong xà phòng loãng 5 phút,
rửa sạch dưới vòi nước và nước cất, tiếp tục
khử trùng bằng cồn 700 trong vòng 30 giây
Sau đó sử dụng hai chất khử trùng H2O2 và
HgCl2 để khử trùng ở các thời gian khác
nhau Rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng
và cắt từng đoạn mang mắt ngủ cho vào
môi trường nuôi cấy
Mẫu cho vào sau vài tuần sẽ xuất hiện
các chồi non từ các mắt ngủ, tách các chồi
non cho vào môi trường tái sinh chồi để
nhân nhanh
Sau các lần cấy chuyển, chọn các chồi
đủ tiêu chuNn cấy vào môi trường ra rễ, tạo
cây hoàn chỉnh
Cây con sau khi đưa ra khỏi bình nuôi cấy mô được rửa sạch môi trường bám dính
ở rễ bằng nước sạch, sau đó giâm vào khay bằng xốp với các giá thể khác nhau
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần nhắc lại Số liệu được xử lý thống kê trên chương trình IRRISTAT
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 )ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu
- Thí nghiệm bao gồm:
+ HgCl2 0,1% trong thời gian là: 4 phút, 6 phút, 8 phút tương ứng với các công thức từ 1 đến 3
+ H2O2 ở các nồng độ khác nhau trong cùng một thời gian 10 phút tương ứng với các công thức từ 1 đến 3: 10%, 15%, 20%
- Kết quả thu được ở bảng sau:
Bảng 1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng HgCl 2 0,1% đến tỷ lệ mẫu sống
ở giống c*m chướng SP25
Số mẫu sống sau
3 tuần
Tỉ lệ mẫu sống (%)
Nhận xét:
+ Từ ngày thứ 7, mẫu bắt đầu có hiện
tượng bị nhiễm nấm và nhiễm khuNn Sau
ngày thứ 19, các mẫu đã tương đối ổn định,
không có hiện tượng nhiễm mới
+ Sau 3 tuần, số mẫu sống ở mỗi công
thức cho thấy ở công thức 3 khi khử trùng
bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 8 phút thì
tỉ lệ mẫu không bị nhiễm cao nhưng có một
số mẫu bị chết, vì vậy số mẫu sống sót sau
3 tuần là không cao
+ Về khả năng bật mầm ở mỗi công thức: Công thức 1 và 2, sau 10 ngày đã xuất
Trang 3hiện mầm Công thức 3, sau 2 tuần xuất
hiện mầm
+ Về đặc điểm hình thái: Mầm ở công
thức 1 và 2 xanh và mập hơn so với công
thức 3
N hư vậy, khử trùng ở 8 phút thì số mẫu
bị nhiễm thấp, nhưng khả năng bật mầm chậm và mẫu xấu Khử trùng ở 6 phút cho kết quả tốt nhất, tỉ lệ nhiễm thấp và khả năng bật mầm sớm
Bảng 2 Ảnh hưởng của nồng độ H 2 O 2 đến tỷ lệ mẫu sống ở giống c*m chướng SP25
Kết quả cho thấy, sau 3 tuần, toàn bộ
mẫu được khử trùng bằng H2O2 10%, 15%
đều bị nhiễm Chỉ ở công thức 3 là còn mẫu
không bị nhiễm và đã bật mầm Khi khử
trùng bằng H2O2 thì nồng độ 20% trong 10
phút cho kết quả tốt nhất
Kết luận: Đối với cNm chướng SP25,
khử trùng bằng HgCl2 0,1% cho kết quả tốt
hơn so với dùng H2O2 Khử trùng bằng
HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 6 phút
cho kết quả tốt nhất
2 Ảnh hưởng của phytohormon lên khả
năng tái sinh và nhân nhanh chồi
Chúng tôi tiến hành 3 thí nghiệm để
nghiên cứu sự ảnh hưởng riêng rẽ của KIN
và BAP, đồng thời tác dụng của tổ hợp
BAP và KIN lên sự tái sinh và nhân nhanh chồi
2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới
sự tái sinh và nhân nhanh chồi
Các công thức thí nghiệm:
+ CT1: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar (đối chứng)
+ CT2: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP
+ CT3: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP
+ CT4: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 1 mg/l BAP
Kết quả thu được ở bảng sau:
Bảng 3 Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi
ở c*m chướng SP25 (sau 3 tuần)
ban đầu
Số chồi tạo thành
Hệ số nhân
Trang 4LSD (0,05) 1,33
Qua bảng kết quả trên cho thấy BAP có
ảnh hưởng tích cực đến sự tạo chồi mới Ở
công thức đối chứng, không có bổ sung
BAP thì hệ số nhân rất thấp (1,96 lần), mẫu
xấu, cao và gầy Khi nồng độ BAP tăng dần
thì hệ số nhân cũng tăng lên Kết quả tốt
nhất là môi trường được bổ sung BAP nồng
độ 0,7 mg/l, mẫu xanh, thân mập, đều cây
và đạt hệ số nhân là 3,38 Nhưng khi nồng
độ BAP tăng dần từ 0,7 đến 1 thì hệ số nhân
lại giảm dần, vì nồng độ BAP cao đã ức chế
quá trình tạo chồi mới
2.2 Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin
tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi
- Công thức thí nghiệm:
+ CT1: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar (đối chứng)
+ CT2: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,1 mg/l Kinetin + CT3: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin + CT4: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,5 mg/l Kinetin
- Kết quả thu được ở bảng 4:
Bảng 4 Ảnh hưởng của nồng độ KI? tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi
ở c*m chướng SP25 (sau 3 tuần)
Sau 3 tuần theo dõi, KIN cũng có tác
dụng tích cực đến quá trình tạo chồi Khi
nồng độ KIN tăng thì hệ số nhân chồi cũng
tăng, tuy nhiên chồi mới tạo thành cao và
rất gầy Nồng độ KIN ở 0,1 mg/l thì hệ số
nhân là cao nhất Khi nồng độ KIN tiếp tục
tăng thì hệ số nhân lại giảm
2.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và
Kinetin tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi
- Công thức thí nghiệm:
+ Đối chứng (ĐC): MS + 10% nước
dừa + 2% đường + 8 g/l agar
+ CT1: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin
+ CT2: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin
+ CT3: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin
+ CT4: MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin
Trang 5+ CT5: MS + 10% nước dừa + 2%
đường + 8 g/l agar + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l
Kinetin
+ CT 6: MS + 10% nước dừa + 2%
đường + 8 g/l agar + 1mg/l BAP + 0,3 mg/l
Kinetin
Kết quả thu được ở bảng 5:
Bảng 5 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và các nồng độ Kinetin tới sự tái sinh và nhân nhanh
chồi ở c*m chướng SP25 (sau 3 tuần)
BAP và KIN đều là những cytokinin tổng
hợp BAP kích thích sự tạo chồi mạnh, KIN
có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi mới,
làm tế bào kéo dài, tăng khả năng tổng hợp
diệp lục nên làm chồi tăng kích thước, khỏe
hơn và sinh trưởng tốt hơn Như vậy khi dùng
tổ hợp BAP và KIN vừa kích thích sự tạo chồi
mạnh, vừa tạo chồi khỏe và sinh trưởng tốt
Ở các công thức có bổ sung tổ hợp
BAP và KIN, hệ số nhân cao hơn so với
công thức chỉ bổ sung BAP hoặc KIN Môi
trường được bổ sung 0,7 mg/l BAP + 0,1
mg/l KIN đạt hệ số nhân cao nhất (3,71
lần), chồi xanh, mập và khỏe
2.4 Ảnh hưởng của phytohoormon đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
Chọn những chồi độc lập, cao khoảng
từ 2,5-3 cm, thân lá phát triển tốt cấy vào môi trường ra rễ đã chuNn bị
Công thức thí nghiệm:
+ CT1: MS + 2% đường + 8 g/l agar + 0,15 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA
+ CT2: MS + 2% đường + 8 g/l agar + 0,2 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA
+ CT3: MS + 2% đường + 8 g/l agar + 0,25 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA
Bảng 6 Ảnh hưởng của nồng độ ?AA và IBA tới tỷ lệ ra rễ trong ống nghiệm
của giống c*m chướng SP25
Trang 6CT2 30 30,0 100,0
Kết quả cho thấy, ở CT2 (môi trường
MS + 2% đường + 8 g/l agar + 0,2 mg/l
NAA + 0,05 mg/l IBA) cho tỷ lệ ra rễ sau 3
tuần đạt đến 100%
2.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây in vitro giai đoạn ngoài vườn ươm (sau 2 tuần)
Chọn cây hoàn chỉnh, trồng trên các giá thể khác nhau Theo dõi kết quả dựa trên các tiêu chí: Đặc điểm của thân, lá, màu sắc
Bảng 7 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sự sinh trưởng phát triển của cây
c*m chướng SP25
(cây)
Số mẫu sống (cây)
Tỷ lệ sống
Khi cây mới đưa ra từ phòng thí
nghiệm, cần phải đưa ra giá thể thích hợp
nhất để cây thích nghi với điều kiện ngoài
phòng thí nghiệm, đồng thời tạo thêm rễ
mới trước khi đưa ra đất Đối với cNm
chướng SP25 giá thể cát cho tỉ lệ cây sống
cao nhưng cây gầy và ít tạo rễ mới, đất màu
cho tỉ lệ cây sống thấp nhất Giá thể trấu
hun cho tỷ lệ cây sống và hình thái cây
tương đối tốt Giá thể hỗn hợp trấu hun +
Hạt perlite (tỷ lệ 7:3) là thích hợp nhất, tỉ lệ
cây sống đạt 100%, cây xanh, khỏe
IV KẾT LUẬN
1 Đối với giống SP25 mẫu được khử
trùng với HgCl2 0,1% trong thời gian 6 phút
cho tỷ lệ sống sau 3 tuần cao nhất (76,66%)
2 Môi trường MS + 10% nước dừa +
2% đường + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin đạt hệ số nhân cao nhất 3,71 lần
3 Môi trường tạo cây hoàn chỉnh MS +
2% đường + 8 g/l agar + 0,2 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA cho tỷ lệ cây ra rễ cao nhất đạt 100% sau 3 tuần
4 Tỷ lệ cây sống sau khi đưa ra vườn
ươm với giá thể trấu hun + hạt perlite (7:3) cho tỷ lệ sống và hình thái cây tốt nhất (100%) sau 2 tuần
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 71 ?guyễn Xuân Linh-Chủ biên, 1998 Hoa
và kỹ thuật trồng hoa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội
2 Lê Trần Bình, Hồ Hữu ?hị, Lê Thị
Muội, 1997 Công nghệ sinh học thực
vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội
3 Aamir Ali, Humera Afrasiab, Shagufta
?az, Mamoona Rauf, Javed Iqbal,
2008 “An efficient protocol for in
vitro propagation of carnation
(Dianthus caryophyllus)” Pakistan Journal of Botany, Vol 40, No 1, pp 111-121, 21 ref
4 4 Bora, A., Singh, S., Talukdar, M C.,
Hazarika, B ?., 2007 “An efficient
method for in vitro plant regeneration in carnation” Indian Journal of Horticulture, Vol 64, No 4, pp
439-443, 22 ref
5 Meena Wankhade, Shanti Patil, Nitin Solao, Renuka Naik, Pinki Kumari.,
2006 “In vitro propagation of carnation (Dianthus caryophyllus L.)” Annals of Plant Physiology, Vol 20, No 1, pp 29-34, 7 ref
6 Seo JinWook, Kim SukWeon, Min
SungRan, Liu, J R., 2007 “High
frequency somatic embryogenesis and plant regeneration in root explant cultures of carnation” Plant Biotechnology Reports, 2007, Vol 1,
No 2, pp 67-70
)gười phản biện: Trần Duy Quý
Trang 8T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
