KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 5 ppsx

CÁC BƯỚC TẠO DÒNGBiến nạp vector tái tổhợp vào vi khuẩn Chọn lọc dòng cần tìm Xử lý enzyme tạo đầu so le, đầu bằng Nối vector/ W PCRvới mồi đặc hiệu W Sửdụngkhángthể đặc hiệu... CHUẨN B

TẠO DÒNG

HAI CHIẾN LƯỢC TẠO DÒNG

IN VIVO & IN VITRO

NGUYÊN TẮC TẠO DÒNG ( IN VIVO)

CÁC BƯỚC TẠO DÒNG

Biến nạp vector tái tổhợp vào vi khuẩn

Chọn lọc dòng cần tìm

Xử lý enzyme tạo đầu so

le, đầu bằng

Nối vector/

W PCRvới mồi đặc hiệu

W Sửdụngkhángthể đặc hiệu

CHUẨN BỊ cDNA ĐỂ TẠO

DÒNG

mRNA Ỉ cDNA

Ỉ gắn thêm các

linker có mang

trình tự nhận biết của RE

Ỉ Cắt bằng RE

tương ứng tạo đầu

so le

XỬ LÝ ĐOẠN GẮN CHÈN CÓ ĐẦU BẰNG

W Gắn thêm các linkers mang trình tự nhận biết của RE

W Vector có chứa các trình tự nhận biết của RE tương ứng

TẠO DÒNG BẰNG

PCR

W Mồi (primer) dùng trong phản ứng PCR có mang trình tự nhận biết của RE

W Sản phẩm PCR được cắt bằng RE phù hợp tạo đầu so le

W Nối với vector đã xử lý với cùng loại RE

TẠO DÒNG TRONG

PLASMID

- Tạo plasmid tái tổ hợp

- Biến nạp tế bào E coli : ủ chung với

plasmid TTH có hiện diện CaCl2 ; tạo sốc nhiệt

- Nuôi trên đĩa thạch có ampicillin để chọn dòng vi khuẩn có thu nhận

plasmid TTH

- Thu nhận các dòng tế bào có chứa plamid TTH

W Plasmid thế hệ thứ nhất

W Plasmid thế hệ thứ hai :

pBR322

W Plasmid thế hệ thứ ba :

pUC, pSP, Bluescript,

PLASMID pUC18/19

TẠO DÒNG TRONG PLASMID pUC

BỘ GENE PHAGE VÀ SỰ TỰ RÁP

TẠO DÒNG VỚI VECTOR LÀ PHAGE

Thu nhận DNA phage

Ỉ Loại bỏ trình tự không

cần cho sự đóng gói

Ỉ Gắn trình tự cần tạo dòng

vào thay cho trình tự loại bỏ

Ỉ Đóng gói vào vỏ bọc của

phage

Ỉ Đem xâm nhiễm tế bào vi

khuẩn để chuyển trình tự cần tạo dòng vào vi khuẩn

TẠO DÒNG cDNA

Đem dung dịch phage tái tổ hợp trải trên lớp tế bào vi khuẩn phủ đầy mặt thạch Ỉ tạo đĩa

ly giải

TẠO ĐĨA LY GIẢI (PLAQUE ASSAY)

Bề mặt thạch phủ một lớp tế bào E coli Ỉ Thêm huyền phù virus tái tổ

hợp Ỉ Phủ tiếp lên trên một lớp agar mềm Ỉ Ủ Ỉ Mỗi đĩa ly giải tương

ứng với vùng ly giải do một phần tử virus gây ra

PHÁT HIỆN ĐĨA LY GIẢI CÓ CHỨA DÒNG CẦN TÌM

Hộp thạch với các đĩa ly giải

È

Aùp màng lai lên mặt thạch

È

Ủ màng lai trong dung dịch kiềm để

ly giải phage giải phóng DNA phage

TỔNG HỢP M13 MẠCH ĐÔI

COSMID VECTOR PHC79

TẠO DÒNG BẰNG VECTOR COSMID

TẠO NGÂN HÀNG BỘ GENE

TẠO DÒNG VỚI BAC (NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO CỦA VI KHUẨN

TẠO DÒNG TRONG VECTOR BIỂU HIỆN

W Vector biểu hiện là vector có

mang các promoter cho phép phiên mã trình tự gắn chèn (insert)

W Sử dụng RNA polymerase phù

hợp với promoter để phiên mã

mạch muốn sử dụng làm khuôn

PHIÊN MÃ & DỊCH MÃ TRÌNH TỰ TẠO DÒNG

TẠO DÒNG BẰNG VECTOR “CON THOI”

Mục tiêu : Nhân bản và chọn lọc trình tự gắn chèn (insert) trong 2 loại tế bào chủ khác nhau

CHỌN DÒNG TÁI TỔ HỢP

Chọn các dòng có mang vector tái tổ hợp dựa trên đặc tính

kháng 2 kháng sinh của vector pBR322

CHỌN DÒNG TÁI TỔ HỢP

Chọn dòng tái

tổ hợp dựa

(xanh/trắng)

LAI TRÊN KHUẨN LẠC CHỌN DÒNG CẦN TÌM BẰNG LAI PHÂN TỬ

-Mẫu dò được suy ra từ trình tự amino acid dựa theo mã di truyền, được tổng hợp và đánh dấu, sau đó đem lai với màng lai có mang cá trình tự DNA đã được cố định

CHỌN DÒNG CẦN TÌM BẰNG KHÁNG THỂ

W Tạo một ngân hàng biểu hiện

W Cảm ứng cho các protein biểu hiện

W Phát hiện dòng cần tìm trong ngân hàng biểu hiện với kháng thể đánh dấu vàđặc hiệu cho protein biểu hiện

CÂU HỎI PHẦN 5

1 Vector dùng để tạo dòng cần có những đặc điểm gì

2 Có những loại vector nào ? Ưu nhược điểm của các loại ấy ? Ứng dụng của chúng ?

3 Đặc điểm của các vector plasmid pUC, pSP, Bluescript

4 Mô tả cách sử dụng vector là phage

5 Vector biểu hiện dùng để làm gì ? Cho ví dụ

6 Vcetor con thoi dùng để làm gì ? Cho ví dụ

7 Mô tả cách tạo ngân hàng bộ gene

8 Mô tả cách tạo ngân hàng cDNA

9 Cách phát hiện dòng cần tìm bằng kháng thể

10.Cách phát hiện dòng cần tìm bằng mẫu dò nucleic acid

11.Cách biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn