KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 6 pdf

Nồng độ MgCl2 Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme 4.. EnzymeĐược chọn tùy mục đích

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR

1 Primer (mồi)

Mồi phải thỏa một số điều kiện cơ bản : (1) dài khoảng 18-24 base, (2)

Tm của 2 primer gần nhau, (3) [G:G] 40-60%, (4) không hình thành primer dimer, (5) không phải là trình tự lặp lại

2 DNA bản mẫu (template)

Hàm lượng đủ nhưng không quá cao, tinh sạch – không chứa các chất ức chế phản ứng (SDS, chất ức chế từ mẫu (hemoglobin, sắc tố, ), heparin, )

3 Nồng độ MgCl2

Cần cho hoạt động của Taq polymerase ; hàm lượng quá cao sẽ tạo nhiều sản phẩm ký sinh, quá thấp thì làm giảm hiệu quả nhân bản của enzyme

4 dNTP

Thành phần 4 loại dNTP phải cân bằng ; hàm lượng thường không đổi nhưng có thể thay đổi tùy điều kiện thực tế

5 Enzyme

Được chọn tùy mục đích sử dụng :

W Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) : thông dụng nhất, hoạt tính polymerase khá mạnh (35-100 nu/giây), có hoạt tính 5’3’ exonuclease

Stoffel DNA polymerase : tính chịu nhiệt cao hơn, không có hoạt tính 5’-3’exonuclease, hoạt động được ở phổ MgCl2 rộng € multiplex PCR

Taq và Stoffel DNA polymerase thêm 1 3’dA vào sản phẩm PCR

W Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis) : tính chịu nhiệt rất cao, nhân bản được những đọan DNA rất dài, có hoạt tính 3’-5’

exonuclease € tính trung thực cao hơn Taq pol 5-15 lần, tạo sản phẩm “đầu bằng”

W Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus) : có cả 2 hoạt tính 5’-3’ và3’-5’ exonuclease, tính trung thực cao hơn Taq pol 12 lần, thường dùng trong cycle sequencing

W Tth DNA polymerase (Thermus thermophilus) : vừa có chức năng

polymerase vừa có chức năng phiên mã ngược (RT) € dùng trong phản ưng RT-PCR

W UlTma DNA polymerase (Thermotoga maritima) : tính chịu nhiệt rất cao, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease € tính trung thực rất cao

CÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)

5 Chương trình PCR :

W Nhiệt độ : biến tính – 94-95qC ; lai < Tm của các primer ~ 5qC ; kéo dài - 72qC

W Thời gian của từng chu kỳ tùy thuộc thiết bị và kích thước sản phẩm

W Số lượng chu kỳ thường  40

Ví dụ : 1 chu kỳ - 95qC – 5‘

35 chu kỳ – 94qC – 30”

55qC – 30”

72qC – 45”

1 chu kỳ – 72qC – 10’

6 Thiết bị : Những cải tiến máy luân nhiệt liên quan đến (1) microtiter plate

96 giếng, (2) các block nhiệt riêng biệt trong 1 máy, (3) block dùng cho lam kính để tiến hành in situ PCR

7 Dụng cụ : Ống Eppendorf “thành mỏng” (thin-wall), đầu tip có phin lọcCÁC THÀNH PHẦN CỦA PHẢN ỨNG PCR (tiếp)

NHỮNG HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT PCR –

CÁCH KHẮÊC PHỤC

1 Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh

Ỵ Phân chia khu vực thí nghiệm, sử dụng đầu tip có phin lọc, găng tay thay thường xuyên, chiếu tia UV khu vực thí nghiệm, sử dụng hệ thống dUTP-ung,

2 Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp

Ỵ Lặp lại phản ứng PCR nếu cần thiết, sử dụng loại polymerase có tính trung thực cao như Pfu, DeepVent, UlTma polymerase

3 Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác

Ỵ Kỹ thuật viên cần được đào tạo tốt, tự động hóa, sử dụng hóa chất pha sẳn (kit) đã được chuẩn hóa

4 Thiết bị đắt tiền

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR

1 PCR : sử dụng 1 cặp mồi ; sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di

2 Nested / Semi-nested PCR : sử dụng 1 cặp mồi “ngoài” và 1 mồi/1 cặp mồi “trong” để tăng tính đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng PCR

3 Multiplex PCR : sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR đểphát hiện đồng thời nhiều trình tự DNA của 1 tác nhân (A) hay nhiều tác nhân (B)

(A)

(B)

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR (tiếp)

4 AP-PCR (Arbitrary Primed)/RAPD (Random Amplified Polymorphic

DNA) : sử dụng tổ hợp các primer “ngẫu nhiên” để xác dịnh “dấu ấn di truyền” của loài

(1)

(2)

5 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) : nhân bản hai đầu mút 5’và 3’ của 1 trình tự exon với 1 mồi đặc hiệu và 1 mồi “chung”

6 In situ PCR : thực hiện phản ứng PCR ngay trên mô/tế bào

7 PCR định lượng : định lượng sản phẩm PCR theo thời gian thực dựa trên mẫu dò phát hùynh quang

AAAAAAAA

TTTTTT

AAAAA

TTTTTTT

Gồm 2 bước :

1 RT (Phiên mã ngược) : tạo cDNA

2 PCR : nhân bản cDNA

Dùng để nhân bản RNA

REAL-TIME PCR

Dùng định lượng DNA hoặc RNA (real-time RT-PCR)

Định lượng dựa trên số tín hiệu huỳnh quang/phản ứng mà máy đọc được

Tác nhân đánh dấu thuộc hai nhóm :

W Chất phát huỳnh quang liên kết với DNA mạch đôi (SYBR Green, Ethidium bromide) sẽ phát huỳnh quang

W Chất phát hùynh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu

TaqMan probe

KẾT QUẢ PCR REAL-TIMEC

A

B

10 1 bản sao

10 1 bản sao

Dựng đường chuẩn (standard

curve) với một chất chuẩn có

nồng độ đã biết

Hàm lượng của thành phần cần

phát hiện được tính dựa trên

đường chuẩn này

Ct (Cycle threshold - chu kỳ ngưỡng) : chu kỳ PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền

Ghi chú : đường màu đỏ là t1n hiệu nền

TẠO DÒNG SẢN PHẨM PCR

Taq polymerase thường thêm 1A vào đầu 3’ Ỉ sử dụng T-vector để tạo dòng sản phẩm PCR Còn gọi là T-A cloning

PCR “NGƯỢC“

Dùng nhân bản vùng nằm hai bên một vùng đã biết trình tự

PCR „“TÁI TỔ HỢP“

Dùng để nối nhiều trình tự ngắn thành một trình tự dài, Ví dụ : nối promoter của gene A với vùng mã hóa của gene B

GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE (SEQUENCING)

PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT

(HÓA HỌC)

Nguyên lý : dựa trên sự phân cắt

hóa học DNA

Các bước chính :

1 Thu nhận trình tự DNA cần giải

2 Biến đổi hóa học đặc hiệu các

base

3 Loại bỏ các base biến đổi

4 Cắt mạch DNA ở vị trí bị loại

bỏ base

PHƯƠNG PHÁP SANGER (ENZYME HỌC) (DIDEOXY SEQUENCING METHOD)Nguyên lý : dựa trên sự tổng hợp DNA kết hợp với từng loại dideoxynucleotide

Các bước chính :

1 Thu nhận trình tự DNA cần giải

2 Nhân bản trình tự này với dNTP và từng loại ddNTP

Điện di phân tách các trình tự DNA tạo thành của hai phản ứng

ÈĐọc kết quả : tự động hoặc qua phóng xạ tự ghi

PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ MAXAM-GILBERT

Các phản ứng giải trình tự :

C : Hydrazine trong NaCl cắt base C

G : G được methyl hóa bằng dimethylsulfate sau đó bị cắt bằng kiềm

G + A : Formic acid cắt liên kết giữa base và đường

T + C : Hydrazine cắt vòng pyrimidine

Bước cuối :Piperidine cắt các base biến đổi

KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ HÓA HỌC

Kết quả của kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography)

PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ SANGER

GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG

MỘT SỐ BIỆN PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

The Single-Priming Method

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG 2 PRIMER

ĐỘT BIẾN

PHƯƠNG PHÁP KUNKEL

dut : dUTPase

ung : uracil-DNA-glycosylase

(W.P Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747-10751)

PHƯƠNG PHÁP “TÁI SẮP XẾP DNA” (DNA SHUFFLING)

Gồm các bước :

• “Đục lỗ” DNA bằng Dnase I

• Tiến hành PCR không có mồi : - Biến tính

- Tái bắt cặp

- Kéo dài

Ỵ Tạo ra những trình tự DNA “lai”

CHUYỂN VẬT LIỆU DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT

Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens có mang plasmid Ti

tái tổ hợp để chuyển gene vào tế

bào thực vật

MỘT SỐ BIỆN PHÁP CHUYỂN VẬT LIỆU DI

CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM

CHUYỂN GENE Ở ĐỘNG VẬT

LIỆU PHÁP GENE Ở ĐỘNG VẬT :

W Chuyển gene ở tế bào sinh dục Ỉ

động vật chuyển gene

W Chuyển gene ở tế bào sinh dưỡng

Ỉ động vật “khảm”

CHUYỂN GENE

Ở ĐỘNG VẬT

Chuyển gene ở động vật thông qua tế bào ES

(Embryonic Stem Cell – tế bào mầm)

CÂU HỎI PHẦN 6

1 Những yếu tố nào quyết định tính đặc hiệu ? độ nhạy của phương pháp PCR ?

2 Làm cách nào tăng tính đặc hiệu, độ nhạy của phương pháp PCR ?

3 Những cách hạn chế các nhược điểm của phương pháp PCR

4 Nêu một số ứng dụng của nested-,multiplex, AP-PCR, RACE, in situ PCR

5 Nêu cách thực hiện phản ứng real-time RT-PCR

6 Đường chuẩn là gì ? Xây dựng như thế nào ? Dùng làm gì ?

7 Ct là gì ? Vì sao cần xác định Ct ?

8 Nguyên lý của PCR tái tổ hợp

9 Nguyên lý phương pháp Giải trình tự theo Sanger, phương pháp Giải trình tự tự động Khác biệt giữa hai phương pháp ?

10 Có thể gây đột biến điểm không định hướng như thế nào ?

11 Có thể gây đột biến điểm định hướng như thế nào ?

12 Nêu một ứng dụng củ phương pháp “DNA Shuffling”

13 Cách chuyển vật liệu di truyền (VLDT) ở thực vật

14 Chuyển VLDT ở động vật : các cách tiếp cận và ưu nhược điểm của chúng