Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật di truyền phân tử để chẩn đoán bệnh di truyền phổ biến ở người Việt Nam nhằm hạn chế hiệu quả gen bệnh và đề xuất hướng điều trị

Báno 1: Trình tự cặp mồi đặc hiệu của °en FVIII dùng trong phàn ứng PCR để phát hiện đột biến gây bệnh máu khó đông Hemophilia A... N hững sản phẩm PCR của bệnh nhân và bà m ẹ sẽ được ph

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HOC

3 Ths Nguyễn Quỳnh Uyển - T runs tâm CNSH, Đ H Q G H N

4 Ths Lê Nhật Minh - Viện Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội

5 BS T r á n Kiêm H a o - Đại học Y H à Nội

ỉ là Nội - 2005

BÁO CÁO T Ó M TẮT

1 Tên đề tài:

Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật di truyền phân tử để chẩn đoán bệnh di truvền

phổ biến ở người V iệt N a m n h ằ m hạn c h ế hiệu q u ả g en b ệnh và đề xuất

hướng điều trị

M ã số: Q G -0 3 -1 3

2 C hủ trì đề tài: TS Võ Thị Thương Lan

3 Các cán bộ tham gia:

- PGS.TS Trịnh Hồng Thái - Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN-ĐHQGHN

- Ths Nguyễn Thị Trung - Khoa Sinh học, Trường ĐKHTN-ĐHQGHN

- Ths Lè Nhật Minh - Viện Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội

- Ths Nguyễn Quỳnh Uyển - Trung tâm CNSH, ĐHQGHN

- BS T rần K iê m H ảo - Đ ại học Y H à N ội

4 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

- Sứ dụng phương pháp nested-PCR và kết hợp với PCR-RFLP phân tích các

kiểu đột biến trên gen CYP21 liên quan đến bệnh tăng sản thượns thận bẩm sinh

gâv nam hoá Kết quả có thể được áp dụng để xét nghiệm chẩn đoán

4.2 N ội dung:

- T ác h chiết A D N từ bệnh ph ẩm m á u để d ù n g cho kỹ th u ậ t P C R - R F L P với các cặp m ồi đặc hiệu nh ằm phân tích các đột biến điểm cù a gen m ã cho yếu tố

VIII liên quan đến bệnh máu khó đông

- Tách chiết A D N từ tóc của bệnh nhi d ù n g cho kỹ thuật n es te d -P C R và

P C R -R F L P nhằm phát hiện đột biến điểm , dột biến m ất đoạn trên g en CYP21 liên quan 'tốn bênh táng sán thương thận bám sinh.

- Xây dựng được phương pháp đa hình ADN kết hợp với PCR-RPLP^sử

dụng enzym giới hạn Acil trên vùng exon 1 của gen CYP21 để xác định đột biến

đ iể m E1PL.

- Xây dựng được phương p háp nested-PCR sử dụng e n z y m giới hạn HhaẢ trên vùng intron 2 của gen CYP2Ỉ để xác định đột biến I2g tại vị trí cắt nối exon-

intron.

- Xây dựng được phương pháp xác định nhanh đột biến mất đoạn 8 bp ở

exon 3 trên gen CYP21.

- Góp phần đào tạo 1 nghiên cứu sinh theo hướng nghiên cứu của đề tài (dự kiến bảo vệ vào tháng 3/2006)

- Đã có 2 bài báo đăng trên tạp chí chuyên ngành.

SƯ M M ARY

1 The title project:

A pp lic atio n o f m o le c u la r genetic m e th o d s in diagnosis o f genetic deseases

in V ie tn a m e s e population for prevention o f h a rm íu l effects on the health

C ode num b e r: QG-02,-13

2 Project Coordinator: Dr Vo Thi Thuong Lan

3 Project members:

- Assoc.Pro.Dr Trinh Hong Thai Department of Biology Hanoi Universitv of

Science, H anoi N atio n al University.

- MSc Nguyen Thi Trung Department of Biologv, Hanoi Universitv of Science,

H anoi N ational University.

- MSc Nguyen Quynh Uyen Center of Biotechnologv, Hanoi National University

- MSc Le N hat M inh Pasteur Institute o f H anoi.

- Dr T ran K ie m Hao H anoi M e d ic in e College.

4 The objectives and research contents:

4.1 The objectives:

- Application of PCR-RFLP method to analyse mutation in the intron 18 of

the gene en c o d in g the factor VIII that involves in H e m o p h ilia A.

- A p p lication o f P C R -R F L P and nested- PC R m eth o d s to analyse m u tatio n s

in the exon 1, intron 2 and deletion in the exon 3 of the gene CYP2Ỉ that involves

in the conơenital adrenal hyperpalasia

4.2 The research contents:

- Isolation of DNA from blood for PCR with the speciíic primers of the

gene en c o d in g the factor VIII that involves in H e m o p h ilia A.

- A p p lication o f P C R -R F L P to detect m u tatio n in the intron 18 o f the gene

encodins the factor VIII

- Isolation of DNA from hairs for nested-PCR and multiplex-PCR \vith the speciíic primers of the gene encodins the 21 hvdroxylase that involves in the consenital adrcnal hvperplasia

- A p p lication o f P C R - R F L P to detect m utatio n in the ex o n 1 intron 2 and clolction in the ex o n 3 ol the een c cn co d iim the 21 h vdroxylasc.

4

5 Main results:

- A method of PCR-RFLP using the restriction enzvm Bell for the intron 18

o f the g en e en c o d in g the íacto r V III to detect m o th ers bearing the m u tated aene.

- A method of PCR-RFLP using the restriction enzym Acil for the exon 1 of the CYP21 gene to detect mutation in this exon.

- A method of nested-PCR in combination with PCR-RFLP using the

restriction enzym Hhaì for the intron 2 of the CYP21 gene to detect mutation in

this intron.

- A method of PCR to rapidly detect the deletion on the exon 3 of the

CYP21 gene.

- Two papers have been published/accepted

- O n e G rad u ate student is being directed under the research direction o f the project.

TS V o Thi T h u o n g Lan

P roject im p le m e n tin g O rgan iza tio n

H anoi N ational ư n iv e rs itv

II M Ở Đ Ẩ U

1 Bệnh ưa chẩy m áu hay còn gọi là H em ophilia là m ột bệnh di truyền gen lặn, liên kết nhiễm sắc thể giới tính X Bệnh do thiếu các yếu tố đông

m áu tham gia vào quá trình đôn g m áu như yếu tố VIII (H em ophilia A) hoặc

yếu tố IX (H em o ph ilia B) [1, 2], trong đó thiếu hụt yếu tố VIII là chủ yếu

Gen m ã hóa tổng hợp yếu tố V III (FV III) nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc

thể giới tính X (X q28) có kích thước 186 kb bao gồm 26 vùng exon và 25

vùng intron [4] T rên gen FV III có các vị trí nhận biết của en zvm e giới hạn

ổc/I/intron 18; Xbaĩ/intron 22; H i n d ỉ ỉĩ / intron 19; ổg/1/intron 25; M sp l vùng

đuôi 3 ’ Đ ây là những m ark er được dù n g để đánh giá sự bất thường của

FV III gây ra bệnh m áu k hó đông [6, 7, 8] Bước đầu, chúng tôi đã chọn

m ark er nhận biết bởi enzym Bell n h ằm phân tích sự đa hình A D N trên vùng

intron 18 b ằ n g phương pháp P C R -R F L P [5] Kết quả mà chúng tồi nhận

được phần nào đáp ứng cho vấn đé cấp bách được đặt ra là cần xác định được

những bà m ẹ m ang gen dị hợp tử xhx và chẩn đoán sớm, có thể là ngay từ

giai đoạn bắt đầu m an g thai, để có những biện pháp xử lý thích ứng với mỗi

trường hợp

2 Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là bệnh di truyền lặn

[10, 14] Đ ây là m ột tronơ những bệnh chuyển hoá thường gặp nhất, đặc

trưng bởi sự thiếu hụt hoạt tính của một tro n s các enzym cần thiết cho quá

trình sinh tổng hợp cortisol; 2 1 -h y d ro x y lase (21-OH), 1 lp -h y d ro x y la se (11-

OH), 17-hydroxylase (1 7 -O H ), 3P-H SD và 20-22 D esm olase [10] H ầu hết

(90-95% ) các trường hợp m ắc bệnh TSTTBS là do thiếu hụt en zym 21 -O H

G iám thiểu lượng e n zy m 21 -O H tác động nghiêm trọng đến tổng hợp

cortisol của thượng thận, khiến phần lớn aldosterone bị thiếu hụt, dẫn đến

tănti tiết AC TH tuyến yên và sán xuất thừa anđroơen E nzym 2 1 -O H được

m ã hoá bời se n C Y P 2 Ỉ nằm trên nhiễm sác thể sỏ' 6 p 2 ỉ -3, chiều dài kh o ản g

3 kb vù g ồ m 10 exon Đột biến tròn gen này xảy ra chủ yếu tại exon 1, intron

2, và mất đoạn trên cxon 3 [14 17] Bước đáu chúng tôi sử dụng p h ư ơ n s

pháp P C R -R P L P và nesteđ-PC R với các cặp mồi dặc hiệu để phân tích

nhữim đột biẽn hay iiặp nàv [14, 15, 18] Két quá chúng tỏi nhận được phục

vụ cho c ỏ n2 tác chan đoán sớm Điéu này rất có ý n ah ĩa tro n s phát hiện

7

bệnh và điều trị thích hợp, hạn ch ế nguy cơ tử vong do suy thượng thận cấp Bên cạnh nguy cơ tử vong cao, bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh dẫn đến hiện tượng nam hoá ở trẻ gái, giả dậy thì sớm, gây ảnh hưởng nặng nề đến sự phát triển thể chất, chức năng sinh dục, sinh sản, tâm lý của bệnh nhi và gia đình.

8

r a NỘ I D U N G C H ÍN H CỦA ĐỂ TÀ I

Đề tài được tiến hành với hai bệnh: bệnh máu khó đông Hemophilia A

và bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

* Bệnh máu khó đông Hemophilia A là một bệnh di truyền gen lặn Đại đa số bệnh nhân (>90%) mắc bệnh này do đột biến trên gen mã cho yếu

tố FVIII Gen này nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X Do đó, bệnh chỉ được biểu hiện ở người con trai khi người mẹ mang gen mã cho yếu tố FVIII bị đột biến Trên gen FVIII có một số dấu chuẩn là những vị trí nhận biết của

enzyme giới hạn Bc/I/intron 18, A7x/I/intron 22, H in d ỉĩỉ/ intron 19,

#g/I/intron 25, M sp\ vùng đuôi 3 ’ Đây là những dấu chuẩn cho phép đánh

giá được sự bất thường của FVIII gây ra bệnh máu khó đông Bước đầu,

chúng tôi đã chọn dấu chuẩn nhận biết bởi enzym Bell nhằm phân tích sự đa

hình ADN trên vùnơ intron 18 bằng phương pháp PCR-RFLP Mẫu ADN được tách từ mẫu máu lấy từ các bà mẹ và của bệnh nhân nam (con trai)

* B ệ n h tăng sản th ư ợ n g t h ậ n bẩm sinh (TSTTBS) cũng là bệnh di truyền lặn Hầu hết bệnh nhân TSTTBS liên quan đến đột biến trên gen

CYP21 nằm trên nhiễm sắc thể thường Đột biến xảy ra trên gcn này chủ yếu

ở exon 1, intron 2 và mất đoạn ở exon 3 Vì vậy chúng tôi phân tích cả 3 loại đột biến này sử d ụ n s ADN tách từ mẫu tóc của một số bệnh nhân trẻ em, một số là trẻ sơ sinh bị mất muối, suy thận cấp được chẩn đoán mắc bệnh TSTTBS Do hầu hết bệnh nhàn nhỏ tuổi (2 tháng-5 tuổi) nên chúng tôi áp dụng phương pháp tách chiết ADN từ mẫu tóc chứ không lấy máu nhằm giam thiếu đau đối với bệnh nhân và lượng mẫu không đòi hỏi nhiều

D ướ i đ â y c h ú n g tôi x in tr ì n h b à y t ó m tắ t n h ữ n g k ế t q u ả m à đ ề tài đ ạ t đ ư ợ c

1.2 T á ch ch iết A D N gen om e từ máu: ■

N ă m m l m áu được lấy từ m ỗi đối tượng nghiên cứu M áu được chống đông bằng E D T A lOmM Thêm 15 ml dung dịch phá vỡ tế bào hồng cầu và trộn đều bằn g lắc nhẹ ủ m ẫu trong đá 30 phút cho đến khi h ồ n g cầu ly tan hết L y tâm thu cặn là các bạch cầu có nhân Các tế bào bào bạch cầu được dùng để tách A D N thông qua các bước sử dụng dung dịch phá vỡ m àng nhân, phân hủy protein bằng proteinase K và tủa A D N bằng isopropanol Bước cuối cùng, A D N được rửa với cồn 70% và hoà trong 400 ul đệm TE

A D N này được sử dụng trong phản ứng PCR

1.3 P hản ứng PCR:

Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho vùng intron 18

để nhân bản đoạn tương ứng từ gen FVIII trong A D N genom e Do phản ứng PCR rất nh ạy với sự thay đổi nồng độ các chất tham gia phản ứng, nhiệt độ gắn mồi, số chu kỳ nhân bản nên chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm thăm dò tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng Chúng tôi tìm được điều kiện tối

ưu cho phản ứng ở thể tích 50 ul như sau: 5ịi1 A D N khuôn; 2 0 0 |iM dNTPs; l,5 m M M g C l2; 0,5 u Taq; lịil mỗi loại mồi nồng độ 40nM ; 5|il đệm PCR Phản ứng PCR thực hiện trên m áy A m p Gen 9700 với chương trình 94°C- 7 ’;

30 chu kỳ: 9 4 ° c - 1’; 58°C -1’; 7 2 ° c - 1 ’; 7 2 0C 10 phút; 4 ° C -2 0 \ Trình tự cặp mồi đặc hiệu được trình bày trên Bảng 1

Báno 1: Trình tự cặp mồi đặc hiệu của °en FVIII dùng trong phàn ứng PCR để phát hiện đột biến gây bệnh máu khó đông Hemophilia A.

G cn F V I I I

M ồi 8.1 5' T A A A A G C T T T A A A T G G T C T A G G C 3 ’

M ồi 8.2 5' T T C G A A T T C T G A A A T T A T C T T G T T C 3'

1.4 K ết q u ả n gh iên cứu:

1.4.1 K ế t q u ả p h ả n ứng P C R :

A D N tách từ các bệnh nhân H em ophilia A và các bà mẹ được dùng trong phản ứng PCR với cặp m ồi đặc hiệu 8.1 và 8.2 sả n phẩm sau phản ứng được điện di trên gel polyacrylam ide 10%, 100V trong 60phút Gel được nhuộm bạc để quan sát các băng AD N Kết quả được trình bày trên Hình 1 Kết quả cho thấy sản phẩm PCR là đoạn A D N có độ dài 142 bp được nhân bản từ các m ẫu bệnh phẩm nghiên cứu N hững sản phẩm PCR của bệnh nhân

và bà m ẹ sẽ được phân tích tính đa hình bằng phản ứng cắt với enzym giới

hạn Bell để xác định cá thể m ang gen bệnh m áu khó đông.

Hình 1: Kết quả PCR với cặp mồi 8.1 và 8.2 của các mẫu bệnh phẩm M l : Thang

A D N 4>x \14Haellh M2: Thang ADN pBR322 MspV, Các mẫu từ số 1 đến số 7: Sản phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A M ẫu số 8: đối chứng dương.

1.4.2 K ế t q u ả p h ả n tích R F L P của intron 18 b ằ n g e m zym g iới hạn B e ll:

Sán phẩm PCR, đoạn A D N có kích thước 142 bp, được tiến h ành phân

tích tính đa hình bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn Bell Đ oạn A D N dài

142 bp thuộc v ù n 2 intron 18 trên nhiễm sắc thể X bình ihường có m ột vị trí

nhận biết của enzym ni ới hạn Bell tại nucleotit thứ 99 Do đó nó sẽ bị cắt

thành hai đoạn A D N có chiều dài tương ứng là 99 bp và 43 bp Khi xảy ra

đột biến điếm làm thay đổi trình tự tại vị trí nhận biết của B c lI, đoạn A D N

1.4 K ết q u ả n gh iên cứu:

1.4.1 K ế t q u ả p h ả n ứng P C R :

A D N tách từ các bệnh nhân H em ophilia A và các bà mẹ được dùng trong phản ứng PCR với cặp m ồi đặc hiệu 8.1 và 8.2 Sản phẩm sau phản ứng được điện di trên gel polyacrylam ide 10%, 100V trong 60phút Gel được nhuộm bạc để quan sát các băng ADN Kết quả được trình bày trên Hình 1 Kết quả cho thấy sản phẩm PCR là đoạn A D N có độ dài 142 bp được nhân bản từ các m ẫu bệnh phẩm nghiên cứu N hữ ng sản phẩm PCR của bệnh nhân

và bà m ẹ sẽ được phân tích tính đa hình bằn g phản ứng cắt với enzym giới

hạn BclI để xác định cá thể m ang gen bệnh m áu khó đông.

— — ^ — * <■* — * v ế

194 b p

118 bp — L j V _ _ _ «—J *- 147bp

Hình 1: Kết quả PCR với cặp mồi 8.1 và 8.2 của các mẫu bệnh phẩm M l : Thang

A D N (Ị)X MAHaeYlh M2: Thang A DN pBR322 Msph Các mẫu từ sô' 1 đến số 7: Sản phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A Mẫu số 8: đối chứng dương.

1.4.2 K ế t q u ả p h â n tích R F L P của intron 18 b ằ n g em zym g ió i hạn B e ll:

Sàn phẩm PCR, đoạn A D N có kích thước 142 bp, được tiến hành phân

tích tính đa hình bàng phán ứng cắt với enzym giới hạn Bell Đ oạn A D N dài

142 bp thuộc vùng intron 18 trên nhiễm sắc thể X bình thường có m ột vị trí

nhận biết củ a en zym ciới hạn Bell tai nuclcotit thứ 99 Do đó nó sẽ bị cắt

thành hai đoạn A D N có chiéu dài tương ứng là 99 bp và 43 bp Khi xảy ra

đột biên đ iếm làm thay đổi trình tư tai vị trí nhận biết của Bell, đoạn A D N

không bị cắt và giữ nguyên chiều dài 142 bp Như vậy tính đa hình độ dài

các đoạn AD N cắt với enzym giới hạn Bell (PCR-RFLP) gồm các đoạn ADN

có kích thước 142 bp; 99 bp và 43 bp Kết quả này cho thấy hoàn toàn có thể

sử dụng đa hình BclI/ intron 18 để xác định những cá thể mang đột biến, đặc

biệt xác định những bà mẹ dị hợp tử đối với gen bệnh có khả năng truyền gen bệnh cho con trai gây nên trạng thái bệnh lý ở người con Kết quả trình bày trên Hình 2

Hình 2: Kết quả điện di và phân tích PCR-RFLP M l: ADiN chuẩn (Ị) X I 74 Híieĩĩh

M2: thang ADN chuẩn pBR 322 Msp\. Mẫu số 1-2: cặp me con thứ 1; mẫu số 3-4: cặp mẹ con thứ 2; mẫu số 5-6: cặp mẹ con thứ 3; mẫu số 7-8: cặp mẹ con thứ 4.

Phân tích kết quả đa hình của những cặp mẹ con trên Hinh 2 cho thấy: a/ Với cặp mẹ con thứ nhất (mẫu số 1: người con trai; mẫu số 2: người mẹ) và cặp mẹ con thứ tư (mẫu sô' 7: người con trai; mẫu số 8: người mẹ) cho thấy rõ tính đa hình của các cá thể Theo kết quả RFLP của hai người mẹ này thì đột biến xay ra trên một nhiễm sắc thể giới tính X tại vùng khống mã hoá intron 18, thuộc đoạn ADN dài 142bp được nhân lên bằng phản ứng PCR Đột biến nàv tưưnu ứng với sự thay đổi nucleotide làm mất vị trí nhận

biết của enzym ciới hạn Bell Kết quá là một đoạn ADN dài 142 bp vẫn được

giữ nguyên, không bị cắt bởi Bell Như vậy, có thể kết luận được người mẹ

có kiểu gen x hx và là người mang gen bệnh

Đổng thời phân tích R FLP trên Hình 2 ở hai người con trai (mẫu sô 1

và m ẫu số 7) của hai bà mẹ này cho thấy chỉ có duy nhất một đoạn ADN kích thước 142 bp Kết hợp với sô liệu được cung cấp về tình trạng mắc bệnh máu khó đông Hemophilia A của những người con trai này, chúng tôi có thể

đi đến kết luận chính xác rằng: người con trai nhận một gen tổn thương x h từ

mẹ và có kiểu gen là X hY và biểu hiện kiểu hình bệnh máu khó đông

Tổng hợp lại có thể nhận định chính xác về tình trạng bệnh ở hai cặp

mẹ con thứ nhất và thứ tư như sau: cả hai người mẹ có kiểu gen dị hợp tử

x hx Người mẹ mang gen bệnh và truyền gen đó cho con trai mình tạo nên kiểu gen X hY gây nên bệnh máu khó đông

b/ Với cặp mẹ con bệnh nhân thứ hai (mẫu số 3: con trai và mẫu số 4: người mẹ) chỉ có một đoạn ADN 142bp Kết quả này cho thấy trên nhiễm

sắc thể X không có vị trí nhận biết của enzym giới hạn Bell Có thể kết luận

người mẹ có kiểu gen đổng hợp tử x hx h do đột biến xảy ra trên cả hai nhiễm

sắc thể giới tính làm mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn Bell Nếu vậy,

người mẹ phải bị bệnh máu khó đông Những trường hợp người phụ nữ mang gen đồng hợp tử x hx h có biểu hiện bệnh rất nặng và vô cùng hiếm hoi Trên thế giới hiện nay chỉ ghi nhận 10 trường hợp phụ nữ bị bệnh máu khó đông

và những người này thường chết từ độ tuổi rất sớm do mất máu nhiều lần trong đời sống sinh lý binh thường có ở bất kỳ người phụ nữ nào Tuy nhiên những thông tin lâm sàng chỉ ra rằng ở người mẹ ở cặp thứ hai không phải như vậy Kết quả với bà mẹ thứ hai có thể được giải thích như sau: Đoạn ADN dài 142 bp ớ đây không bị cắt có thể do nhiểu lý do như enzvm giới hạn không hoạt độns, có chất ức chế trong phản ứng, hoặc do sai sót trong quá trình nhân bản A D N Hơn nữa, tần số đa hình cho mỗi chỉ thị không phái hoàn toàn là 100% Do đó, chưa thể kết luận được người mẹ mang gen

đ ổ n ơ hợp tử xhxh vì có thế vi trí của enzym giới hạn Bell trên vùng không

mã hoá intron 18 ở người mẹ này là trường hợp đặc biệt Trong những trường hợp như vậy một tro nơ những hướng suy nghĩ tiếp theo mà chúng tôi mong muốn được tiến hành là xác định trình tự đoạn ADN này Ngoài ra, người

13

con trai bị bệnh máu khó đông nên cần làm thêm một số chỉ thị khác như

enzym giới hạn Xbal trên vùng không mã hoá intron 22, enzym giới hạn

H in dỉll trên vùng không m ã hoá intron 19, enzym giới hạn BglI trên intron

2 5

c/Với cặp mẹ con bệnh nhân thứ 3 (mẫu số 5: con trai; mẫu sô 6: người mẹ) có thể kết luận cả hai mẹ con đều không mang đột biến ở vị trí

nhận biết của Bell Do đó, băng ADN 146 bp của người con bị phân cắt bởi

BclI thành hai đoạn A D N 99 bp và 43 bp Kết quả này chỉ ra rằng nhiễm sắc

thể X là bình thường với chỉ thị enzym giới hạn BclI Tuy nhiên kết hợp

thông tin lâm sàng, người con trai bị bệnh máu khó đông Hemophilia A như vậy là nhiễm sắc thể X của người con trai này phải là không bình thường Kiểu gen X hY biểu hiện bệnh là do nhận một nhiễm sắc thể X tổn thương từ

mẹ nhưng đột biến không xẩy ra ở vị trí của Bell mà ở vị trí khác Điều này

cũng phù hợp khi phân tích tính đa hình của người mẹ Kết quả trên Hình 2 cho thấy người mẹ chỉ có hai đoạn ADN là 99 bp và 43 bp Như vậy cả hai

nhiễm sắc thể X của người mẹ này là bình thường ở vị trí Bell Muốn có

những kết luận chính xác về tình trạng bệnh máu khó đông của cặp mẹ con này cần tiến hành phân tích thêm ở những chỉ thị khác tương tự như đã nêu trong trường hợp cặp mẹ con thứ hai Nếu kết quả phân tích tính đa hình với người mốich kết quả bình thường thì có thế đưa đến một kết luận khác: nhiễm sắc thể X của mẹ là hoàn toàn bình thường Người con trai mắc bệnh máu khó đông có thể là do đột biến tự phát xảy ra trong quá trình hình thành

tế bào sinh dục (ở nsười mẹ) Các đột biến mất đoạn hay đột biến điểm có thể xảy ra khi người mẹ sinh con ở tuổi quá 35 hoặc trạng thái sức khoẻ không tốt

1.5 Kết luận:

Như vậy là có 4/9 2Ĩa dinh; (44,44%) bà mẹ xác định được sự di hợp

tử về bệnh Hemophilia A (XhX) và truyền gen bệnh đột biến trên vùng intron

18 liê n q u a n với e n z v m c iớ i h ạ n Bell s a n g c h o c o n c ủ a m ì n h Tí lệ n à y c ũ n g

k h ô n " nhỏ khi so với các quẩn thế dân cư khác trong khu vực như Trung Quốc Nhật Bàn Tuy nhiên, với sò' lượng mẫu còn hạn chế, chúng tòi chưa

14

đưa ra những nhận định về tỉ lệ dị hợp tử lan truyền trong quần thể ngươi Việt nam Ở đây chúng tôi mới bước đầu xây dựng và triển khai một phương pháp sinh học phân tử để chẩn đoán bệnh di truyền ở người Bệnh nhân mắc bệnh m áu khó đông nếu được phát hiện sớm, điều trị kịp thời và đầy đủ sẽ tham gia sinh hoạt và hoạt động xã hội như những thành viên bình thường

Do vậy việc xác định sớm, xác định chính xác những cá thể mang gen bệnh (người mẹ) cũng như các cá thể mang các đột biến tự phát sinh có khả năng lan truyền trong quần thể đối với bệnh máu khó đông hemophilia A là vô cùng cần thiết và hoàn toàn có thể tiến hành được Qua đó có thể đưa ra những ý kiến tư vấn di truyền khi người mẹ mang gen bệnh có thai Ngoài ra, kết quả chẩn đoán nhanh còn cung cấp những thông tin chính xác cho công tác chăm sóc và điều trị bệnh nhân được tốt hơn Đồng thời có thể đóng góp

c h o v iệ c đ i ề u tr a c h ấ t lư ợ n g d â n s ố v à đ ề ra n h ữ n g c h í n h s á c h th í c h h ợ p

15

2 B Ệ N H T Ă N G SẢ N THƯỢNG THẬN BAM s i n h (TSTTBS)

2.1 Đ ối tượng nghiên cứu:

Chẩn đoán sớm bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh đặc biệt có ý

nghĩa đối với các bệnh nhi nhằm tránh các tai biến cấp tính và điểu trị kịp thời không đê lại hậu quả lâu dài vì hiện tượng nam hoá ở bé gái hoặc dậy thì sớm ở bé trai Vì vậy, chúng tôi chọn đối tượng nghiên cứu là các bệnh nhi được điều trị ở Bệnh viện Nhi Trung ương Nhằm giảm đau cho trẻ khi lấy máu, đặc biệt với trẻ sơ sinh và giảm chi phí cho các khâu bảo quản mẫu, chúng tôi lấy mẫu bệnh phẩm là tóc từ 43 bệnh nhi tăng sản thượng thận bẩm sinh thể cổ điển (27 nam, 16 nữ) đã được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết, Bệnh viện Nhi trung ương, thời gian từ 1993-2002 Tiêu chuẩn chẩn đoán được trình bày trên Bảng 2

Bảng 2 : Tiêu chuẩn chẩn đoán biểu hiện TSTTBS thể cổ điển (gồm thể mất muối-MM và thể nam hoá đơn thuần-NHĐT).

Lâm

sàng

- Biểu hiện suv thượng thận cấp.

- Bất thườns bộ phận sinh dục ngoài: phì đại âm vật ờ trẻ gái hoậc/có phì đại dương vật ở trẻ trai.

- Natri < 133 Kali > 5,2 mmol/1.

- 17-CS/ nước tiểu > 14 incrnol/

- Điện siái đỏ bình thường.

- 17-CS/ nước tiểu > 14 mcmol/ 24 giờ.

- Karyotype.

- X quans tuổi xươno tãns.

16

2.2 T ách chiết A D N :

Bệnh phẩm gồm 5-10 sợi tóc (chứa chân tóc) được giữ trong ơạc khử

trùng, bảo quản ở nhiệt độ phòng Phần chân tóc được xử lý với Chelex 10%

ở nhiệt độ cao trong 10 phút Dưới tác dụng của chelex, tế bào bị phá vỡ và

A D N giải phóng ra khỏi nhân Sau khi ly tàm hai lần, mỗi lần 10.000

vòng/phút trong 5 phút ở 4° c , cặn tủa chelex bị loại bỏ, dịch trong chứa

AD N được thu lại và dùng cho phản ứng PCR Chúng tôi dùne 3 jLil dịch

chiết chứa AD N cho mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 Ịil

2.3 Phản ứng PCR:

Chúng tôi áp dụng kỹ thuật RFLP-PCR kết hợp với nested-PCR để xác

định đột biến thường gặp ở exon 1, intron 2, và đột biến mất đoạn 8 bp ở

exon 3 của gen C Y P 2 1 Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PerkinElm'er

9700 Trình tự các cặp mồi dùng để phát hiện những đột biến này được trình

bày trên Bảng 3

Bảng 3: Trình tự các cặp mồi đặc hiệu của gen CYP2Ỉ dùns trong phàn ứng PCR

để phát hiện đột biến gây bệnh TSTTBS

sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột và được cắt với enzym giới hạn A c ì l Đột biến E1PL làm thay đổi vị trí nhận biết của Acil, do đó với mẫu ADN của bệnh nhân sẽ xuất hiện băng ADN 196 bp không bị cắt bởi Acil Đối với

người bình thường, đoạn ADN này bị cắt thành hai phân đoạn tương ứng với

153 bp và 43 bp

- Để phát hiện đột biến I2g ở intron 2 gây sai hỏng trong quá trình cắt nối exon-intron, chúng tôi thực hiện phản ứng nested - PCR với hai cặp mồi P1/P2 và P7/P8 Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi P1/P2 Sau đó, sản phẩm PCR được pha loãng từ 50 đến 500 lần và được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR lần thứ hai với cặp mồi P7/P8 Sản phẩm PCR lần

thứ hai được cắt bằng enzym giới hạn Hhal để phát hiện đột biến I2g do đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym Hhal Do đó, ở người bình thường, sản phẩm nested-PCR không bị cắt bởi Hlial nên có kích thước 378

bp, trong khi với bệnh nhân mang đột biến I2g sẽ có 2 băng ADN là 354 bp

Vị trí các cặp mồi cho phản ứng PCR được trình bày trên Hình 3

Hình 3: VỊ trí các mỏi trên gen CYP2Í. A1/A2, cặp mồi dể phát hiện mất đoan 8

bp hay chuyến đoạn sen ớ exon 3 B1/B2 cặp mồi dể phát hiện đột biến E1PL ở exon 1 P l / P 1 và P7/P8 là 2 cặp mồi dùng cho nested-PCR để phát hiện dột biến A/C->G ở intron 2 (I2g).

18

Do phản ứng PCR rất nhạy với sự thay đổi nồng độ các chất tham gìa phản ứng, nhiệt độ gắn mồi, số chu kỳ nhân bản nên chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm thăm dò tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng Điều kiện nhiệt độ và thời gian tối ưu cho các bước trong phản ứng PCR với các cặp mồi được trình bày trên Bảng 4.

Bảng 4 Điều kiện phản ứng PCR tuơng ứng với các cặp mồi phát hiện đột biến trên gen CYP21.

50 đến 500 lần sản phẩm PCR lẩn thứ nhất (với cặp mồi P1 và P2) Chúng tôi nhân thấy ở đô pha loãng 100 lần thì sản phàm PCR ro net khong co san phẩm phụ Đây là nồna độ pha loãng thích hợp cho cặp mồi P7/P8 Như vậy,

c h ú n ơ tôi đã tìm đươc điêu kiên thích hợp cho cuc thí-inh phcin thcim giíi phun ứnơ nhu' sa u ’ N ồ n a đô thích hơp cUti cuc thciĩih phun thum gici phcìn ưng P>^R lán thứ nhất ớ thể tích 25 ul như sau: 3f.ll ADN khuôn; 2 0 0liM dNTPs;

1 5m M M^C12; 0,5 u Taq; lf.ll mỗi loai mói nổng độ 10 ịiM; 2.5|.il đệm PCR S in plrim PCR được điện di trên gel agarose Nusieve 3:1 nóng độ 3-

19

4%, điện th ế 80V trong thời gian 2 giờ Loại agarose Nusieve 3:1 có khả

năng phân ly các đoạn ADN kích thước nhỏ và sai khác nhau chỉ vài

nucleotide Do đó, chúng tôi dùng Nusieve 3:1 thay cho việc sử dụng polyacrylamide rất độc và mất nhiều thời gian chuẩn bị gel, điện di, xử lý mẫu Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm ethidium bromide và các băng ADN được chụp trên máy ImaTech 800

2.4 K ết quả nghiên cứu:

2.4.1 P h át hiện độ t biến E 1P L ở exon 1 trên gen CYP21:

Để phát hiện đột biến E1PL ở exon 1, chúng tôi sử dụng cặp mồi

B1/B2 với B2 chứa trình tự không có ở CYP21P (mất đoạn 8-bp) Do đó cặp

mồi này chỉ cho phép khuếch đại đoạn ADN đặc hiệu của gen C Y P 2 1 Sản

phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được tinh khiết và phân cắt bằng enzyme giới

hạn A cil để phát hiện đột biến E1PL Đột biến này làm thay đổi trinh tự nhận

biết của enzym, do đó sản phẩm PCR (196 bp) không bị cắt ở người bình

thường, băng ADN 196 bp bị cắt bởi Aciĩ thành hai băng ADN 153 bp và 43

bp Căn cứ vào sự xuất hiện của băng 196 bp hoặc băng 153 bp sau khi điện

di trên agarose NuSieve 4%, chúng tôi xác định được một mâu ADN cúa bệnh nhi (có kiểu hình mất muối) cho 2 băng 196 bp và 153 bp, tương ứng với kiểu gen dị hợp tử ở đột biến E1PL Kêt quả được trình bày trên Hình 4

- 196 fep

- 3 5 3 bp

Hình 4: Phát hiện đột biến E1PL Sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cắt bời enzyme Aci\. Mâu sô 9 có 2 băng 196 bp và 153 bp xác định kiểu gen dị hợp tử E1PL Cac mâu khác chỉ có một băng 153 bp, tương ứng với cá thể khôn° có đột biến này M: Thang ADN chuẩn <t>X174/7/a<?III.

2.4.2 P h á t hiện độ t biến I2 g tại vị trí cắt nôi exon-intron:

Đột biên I2g được phát hiện nhờ sử dụng phản ứng nested-PCR với hai cặp mồi P1/P2 và P7/P8 Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi P1/P2 Sản phẩm PCR với cặp mồi P1/P2 được pha loãng 100 lần và được sử dụng làm khuôn trong phản ứng P C R với cặp mồi P7/P8 Kỹ th u ậ t này c h o

phép làm giàu mẫu, đổng thời tăng tính chính xác của phản ứng Sán phẩm PCR thu được có kích thước 378 bp Mồi P8 được thiết kế để phát hiện đột

biến I2g Đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym H ha I Do đó,

sản phẩm nested-PCR với mẫu ADN của người mang gen bị đột biên I2g sẽ

bị cắt bởi H haĩ, tạo thành 2 đoạn 354 và 24 bp Ngược lại, sản phẩm PCR với mẫu AD N của người binh thườns không bị cắt bởi Hỉial nên xuất hiện băng

378 bp Căn cứ vào sự có mặt của băng ADN 378 bp và 354 bp để nhân biết các dạng đ ồ n s hợp tử bệnh do đột biên I2g, dị hợp tử mang gen bệnh và người bình thườnơ T ro n s tổng sô 43 bênh nhi chung toi phat hiẹn được 8 trườn" hơp đ ồ n ơ hợp tử đôt biên I2s và 4 irưòng hợp đi hợp tư Ket qua được trình bày trên Hình 5

21

- 196 kp

- 1 5 3 bp

Hình 4: Phát hiện đột biến E1PL Sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cát bói enzyme Aciỉ. Máu sô 9 có 2 bãng 196 bp và 153 bp xác định kiểu gen dị hợp tử E1PL Các mâu khác chỉ có một băng 153 bp, tương ứng với cá thể khón° có đột biến này M: Thang ADN chuẩn ỳ X m /H a e ỉỉĩ.

2.4.2 P h á t hiện độ t biến I2g tại vị trí cắt nối exon-intron:

Đột biến I2g được phát hiện nhờ sử dụng phản ứng nested-PCR với hai cặp mồi P1/P2 và P7/P8 Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi P1/P2 Sản phẩm PCR với cặp mồi P1/P2 được pha loãng 100 lần và được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi P7/P8 KỸ thuật này cho phép làm giàu mẫu, đồng thời tăng tính chính xác của phản ứng Sản phẩm PCR thu được có kích thước 378 bp Mồi P8 được thiết kế để phát hiện đột

biến I2g Đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết của enzym tìh a ỉ Do đó,

sản phẩm nested-PCR với mẫu ADN của người mang gen bị đột biến I2g sẽ

bị cắt bởi H haỉ, tạo thành 2 đoạn 354 và 24 bp Ngược lại, sản phấm PCR với mẫu A D N của người bình thường không bị cắt bời Hhal nên xuất hiện băng

378 bp Căn cứ vào sự có mặt của băng ADN 378 bp và 354 bp để nhận biết các ciạns đổnsi hợp tử bệnh do đột biên I2g, dị hợp tử mang gen bệnh và nơười bình thường Tron SI tổng số 43 bệnh nhi chúng tỏi phát hiện được 8 trườn" hợp đồng hợp tử đột biến I2g và 4 irường hợp dị hợp tử Kết quá được trình bày trên Hình 5

21

1 2 f 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12

m m

- 196 kp _:153 bp

Hình 4: Phát hiện đột biến E1PL Sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 được cắt bời enzyme Aciỉ. Máu sô 9 có 2 băng 196 bp và 153 bp xác định kiêu gen dị hợp tử E1PL Các mẫu khác chỉ có một băng 153 bp, tương ứng với cá thê không có đột biến này M: Thang ADN chuẩn ỘX1 74///í2é’III.

2.4.2 P h á t hiện đ ộ t biến I2g tại vị trí cắt nôi exon-intron:

Đột biến I2g được phát hiện nhờ sử dụng phản ứng nestcd-PCR với hai cặp mồi P1/P2 và P7/P8 Đầu tiên, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi P1/P2 Sản phẩm PCR với cặp mồi P1/P2 được pha loãng 100 lần và được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi P7/P8 Kỹ thuật này cho phép làm giàu mẫu, đổng thời tăng tính chính xác của phản ứng Sản phẩm PCR thu được có kích thước 378 bp Mồi P8 được thiết k ế đê phát hiện đột biến I2g Đột biến này làm xuất hiện vị trí nhận biết c ủ a enzym Hlỉdì D o đó, sản phẩm nested-PCR với mẫu ADN của người mang gen bị đột biên I2g sẽ

bị cắt bởi Hlial, tạo thành 2 đoạn 354 và 24 bp Ngược lại, sản phẩm PCR với mẫu ADN của người bình thườns không bị cắt bởi Hhal nên xuất hiện băng

378 bp Căn cứ vào sự có mặt của băng ADN 378 bp và 354 bp đế nhận biết các dạng đ ổ n s hợp tử bệnh do đột biên I2g, dị hợp tử mang gen bệnh và người b ì n h thường Trong tổng sô 43 bệnh nhi chúng tôi phát hiện được 8 trườn" hợp đồng hợp tử đột biên I2s và 4 irường hợp đi hợp tư Ket qua được trình bày trên Hình 5

21