Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán virút cúm a h1n1

~ 1 ~ LỜI MỞ ĐẦU Lịch sử đã ghi nhận ba đại dịch cúm vào các năm 1918 (cúm Tây Ban Nha), 1957 (cúm Châu Á) và 1968 (cúm Hồng Kông). So với các vụ dịch cúm mùa hàng năm thường xảy ra vào các tháng mùa đông, đại dịch cúm thường xuất hiện sau vài thập kỷ. Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 được cho là đã cướp đi trên 40 triệu người trên thế giới trong vòng chưa đầy một năm. Cuối tháng ba và đầu tháng 4 năm 2009, vụ dịch cúm A H1N1 đã được phát hiện đầu tiên ở Mexico và sau đó lan ra một số nước lân cận. Bệnh cảnh lâm sàng nhiều trường hợp nhiễm cúm H1N12009 khác biệt rõ rệt so với các trường hợp nhiễm cúm mùa thông thường hàng năm, trong đó tỉ lệ mắc tập trung vào nhóm người trẻ khỏe mạnh. Ngày 1162009, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ cao nhất, pha 6, cho thấy mức lan rộng trong cộng đồng ở ít nhất hai đại lục. Các dữ liệu cuối năm 2009đầu 2010 từ nhiều vùng dịch khác nhau cho thấy chủng virút cúm đại dịch H1N12009 lây lan rất nhanh và trở thành chủng chiếm ưu thế tại nhiều nơi trên thế giới. Theo thống kê của WHO đến ngày 1932010 đã có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ có người bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và nâng tổng số người tử vong lên trên 16800 người. Cũng tại thời điểm này, Bộ Y tế Việt Nam đã ghi nhận trên 11000 trường hợp bị nhiễm bệnh tại 6064 tỉnh thành Việt Nam, con số tử vong là 58 người. Hiện tại, các kỹ thuật phòng thí nghiệm trong chẩn đoán virút cúm đại dịch AH1N12009 bao gồm các kỹ thuật phân tử, phân lập qua nuôi cấy, định type bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HI hay miễn dịch huỳnh quang và test nhanh 54. Trong đó test nhanh có thể được sử dụng rộng rãi nhất trong chẩn đoán virút cúm ở nhiều quốc gia. Tuy nhiên giá thành của các bộ kit thương mại hiện nay là một trong những khó khăn của các nước đang phát triển. Việc sử dụng các test nhanh trong chẩn đoán virút cúm đại dịch AH1N12009 cũng đang gặp nhiều tranh cãi do tính chính xác của nó. Do đó các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện được lựa chọn để phát hiện virút cúm đại dịch 2009. Phương pháp phiên mã ngược realtime PCR (rRTPCR) được CDC xây dựng và đã được sử dụng đầu tiên trong chẩn đoán virút cúm đại dịch 2009 54. Phương pháp này có ưu điểm ít tốn thời gian và có độ nhạy cao hơn một số phương pháp truyền thồng. Nhưng đây là phương pháp đòi hỏi sử dụng máy móc chuyên dụng đắt tiền, bộ mồimẫu dò phải được thay đổi phù hợp tình hình dịch tễ và kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Do đó phương pháp này khó có thể sử dụng rộng rãi ở tất cả các phòng xét nghiệm, đặc biệt là phòng xét nghiệm ở vùng sâu vùng xa. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tạo ra bộ kít chẩn đoán đồng thời virút cúm A nói chung và virút cúm H1N1 đại dịch 2009, sử dụng phương pháp phân tử khá đơn giản và yêu cầu thiết bị tương đối rẻ tiền mà các phòng xét nghiệm có thể trang bị được. Việc tạo ra bộ kít này có thể giúp các phòng xét nghiệm trong cả nước, kể cả các phòng xét nghiệm vùng sâu xa phát hiện sớm bệnh nhằm kịp thời định hướng điều trị cũng như giúp ngăn ngừa ổ dịch có thể xảy ra trong khu vực. Mục tiêu đề tài: 1. Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo kít chẩn đoán virút cúm đại dịch AH1N12009 bằng kỹ thuật RTPCR. 2. Sản xuất bộ kít chẩn đoán dựa trên qui trình vừa được tạo ra ở trên.

MỤC LỤC

Trang

Lời mở đầu 1

Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 3

1.1.1 Tình hình thế giới 3

1.1.2 Tình hình Việt Nam 6

1.2 Virút cúm đại dịch 7

1.2.1 Virút cúm A 7

1.2.2 Các đại dịch cúm trong quá khứ 9

1.2.3 Virút cúm A đại dịch H1N1/2009 11

1.3 Các phương pháp chẩn đoán cúm 18

1.3.1 Phương pháp huyết thanh học 18

1.3.2 Phương pháp miễn dịch 19

1.3.2.1 Phương pháp miễn dịch enzyme 19

1.3.2.2 Phương pháp chẩn đoán nhanh 19

1.3.2.3 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20

1.3.3 Phương pháp nuôi cấy virút 21

1.3.4 Phương pháp phân tử 21

1.4 Các phương pháp chẩn đoán cúm A/H1N1-2009 22

1.4.1 Phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên 22

1.4.2 Phương pháp phân tử 23

1.5 Tác nhân ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán virút cúm 23

1.5.1 Loại mẫu bệnh phẩm 24

1.5.2 Chất lượng mẫu 24

1.6 Các đặc tính quyết định việc đánh giá chính xác trong chẩn đoán 24

1.6.1 Các đặc tính hiệu suất 25

1.6.1.1 Độ nhạy và độ đặc hiệu 25

1.6.1.2 Giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm 25

1.6.1.3 Độ lặp lại 25

1.6.1.4 Độ chính xác 26

1.6.2 Các đặc tính sử dụng 26

1.6.3 Chọn lựa phương pháp chuẩn tham khảo 26

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp 2.1 Vật liệu 28

2.1.1 Thiết bị - dụng cụ 28

2.1.1.1 Thiết bị 28

2.1.1.2 Dụng cụ 29

2.1.2 Sinh phẩm - hóa chất 29

2.2 Đối tượng nghiên cứu 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm 33

2.3.1.1 Loại mẫu 33

2.3.1.2 Vận chuyển và trữ mẫu 33

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập virút cúm trên tế bào MDCK 34

2.3.2.1 Chuẩn bị tế bào MDCK trước nuôi cấy 34

2.3.2.2 Nuôi cấy virút 35

2.3.3 Phản ứng ngưng kết hồng cầu 35

2.3.4 Tách chiết RNA virút 36

2.3.5 Phương pháp real-time PCR 37

2.3.5.1 Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng 37

2.3.5.2 Thực hiện phản ứng 37

2.3.6 Phương pháp RT-PCR 38

2.3.7 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di 38

2.3.8 Thiết kế mồi 38

2.3.9 Xây dựng chứng nội 39

2.3.10 Phương pháp biến nạp 39

2.3.10.1 Nối DNA mục tiêu vào vector 39

2.3.10.2 Biến nạp các plasmid vào tế bào E coli khả nạp TOP10 40

2.3.10.3 Phân tích kết quả biến nạp 41

2.3.10.4 Tách plasmid mục tiêu từ tế bào chọn lọc 41

2.3.10.5 Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn 41

2.3.11 Phương pháp sản xuất enzyme 42

2.3.11.1 Điều kiện nuôi cấy và biểu hiện 42

2.3.11.2 Chiết xuất và tinh sạch enzyme 42

2.3.12 Điện di SDS-PAGE 42

2.3.13 Định lượng plasmid DNA 43

2.3.14 Phương pháp giải trình tự 43

2.3.14.1 Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự 44

2.3.14.2 PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình tự 44

2.3.14.3 Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy giải trình tự 45

2.3.15 Các phương pháp thống kê 46

2.3.15.1 Độ nhạy 46

2.3.15.2 Độ đặc hiệu 46

2.3.15.3 Giá trị tiên đoán dương 46

2.3.15.4 Giá trị tiên đoán âm 47

2.3.15.5 Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu 47

Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kit xét nghiệm 49

3.1.1 Thiết kế mồi 49

3.1.1.1 So sánh trình tự và thiết kế mồi 49

3.1.1.2 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi được thiết kế 51

3.1.2 Điều chế enzyme Taq polymerase 52

3.1.2.1 Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase 52

3.1.2.2 Hoạt tính Taq polymerase 54

3.1.3 Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR 55

3.1.4 Chuẩn hóa các điều kiện phản ứng RT-PCR 59

3.1.4.1 Khảo sát điều kiện phản ứng RT-PCR đơn 59

3.1.4.2 Khảo sát điều kiện multiplex RT-PCR 67

3.1.5 Xây dựng chứng nội cho phản ứng multiplex RT-PCR 73

3.1.5.1 Quy trình tạo chứng nội 73

3.1.5.2 Khảo sát nồng độ chứng nội tối thiểu cho phản ứng RT-PCR 76

3.1.5.3 Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội 77

3.1.6 Khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu 78

3.1.6.1 Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp 78

3.1.6.2 Khảo sát độ nhạy của phương pháp 79

3.1.6.3 Khảo sát độ lặp lại 82

3.1.7 Tạo chứng dương 82

3.2 Xây dựng quy trình sử dụng kit xét nghiệm cúm H1N1/09 84

3.2.1 Khảo sát điều kiện bảo quản 84

3.2.2 Quy trình xét nghiệm bằng RT-PCR 85

3.2.3 Tiêu chuẩn cơ sở 87

3.3 Kết quả kiểm định bộ kit thành phẩm pFLU 88

3.3.1 Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM 89

3.3.2 Kết quả kiểm định tại Viện kiểm định Quốc gia vắc xin và Sinh phẩm y tế (NICVB) 91

3.3.3 Kết quả triển khai thực tế tại TTYTDP các tỉnh phía Nam 92

Chương 4: Kết luận và đề nghị 4.1 Kết luận 99

4.2 Đề nghị 101

Tài liệu tham khảo 102

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa : Amino acid (axít amin)

ATCC : The American Type Culture Collection

(Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỳ) BHI : Brain-Heart Infusion (Môi trường nước thịt dạng lỏng) BHIA : Brain-Heart Infusion Agar

(Môi trường nước thịt dạng thạch)

bp : Base pair (Cặp base)

BSA : Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) CDC : Center of Disease Prevention and Control

(Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ) CPE : Cytopathic effect (Hiện tượng hủy hoại tế bào)

cDNA : Complementary DNA (DNA bổ sung)

ddH2O : Deionized distilled water (Nước cất khử ion)

ddNTP : Dideoxy nucleoside triphosphates

dsDNA : Double-stranded DNA (DNA mạch đôi)

E.coli : Vi khuẩn Escherichia coli

EDTA : Ethylene-Di-amine-Tetra-acetic acid

EIA : Enzyme immuno assay

ER : Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất)

FAO : Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Lương – Nông Thế giới)

FBS : Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bê)

FN : False negative (Âm tính giả)

FP : False positive (Dương tính giá)

HAU : Hemagglutination unit (Đơn vị ngưng kết hồng cầu)

HBSS : Hank's Buffered Salt Solution

HPAI : Highly pathogenic avian influenza

LB : Luria Bertani medium (Môi trường LB)

LPAI : Low pathogenic avian influenza

(Cúm gia cầm độc lực thấp) MDA5 : Melanoma differentiation antigen 5

MDCK : Madin-Darby Canine Kidney cell

(Tế bào thận chó Madin-Darby)

MEM : Mminimum essential medium

(Môi trường thiết yếu tối thiểu)

mRNA : Messenger RNA (RNA thông tin)

mRT-PCR : Multiplex reverse transcription - polymerase chain

NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification

NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin công nghệ sinh học của Hoa kỳ) NEP : Nuclear export protein (Protein xuất nhân)

OD : Optical density (Mật độ quang)

OIE : World organisation for animal health

Real-time PCR : Real – time polymerase chain reaction

rRT-PCR : Real – time reverse – transcription polymerase chain

RIDT : Rapid influenza diagnostic test

RIG-I : Rectinoic acid inducible gene - I

RNA : Ribonucleic acid

RNP : Ribonucleoprotein

rpm : Round per minute (Vòng/phút)

RT-PCR : Reverse transcription - polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược)

S.O.C : Super optinal broth with catabolic repressor

(Môi trường giàu dinh dưỡng)

ssDNA : Single-stranded DNA (DNA mạch đơn)

Ta : Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp)

TCID 50 : 50% tissue culture infectious dose

(Liều xâm nhiễm 50% tế bào nuôi cấy)

TEMED : Tetramethylethylenediamine

Tm : Melting temperature (Nhiệt độ tan chảy)

TN : True negative (Âm tính thực)

TP : True positive (Dương tính thực)

UV : Ultraviolet (Tia cực tím)

vRNA : Viral RNA (RNA của virút)

vRNP : Viral ribonucleoprotein (Ribonucleoprotein của virút) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

μl : Microliter

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các axít amin quan trọng trên các protein có vai trò trong độc tính virút

cúm 15

Bảng 1.2 So sánh các xét nghiệm chẩn đoán cúm hiện có 21

Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp (mix) chẩn đoán cúm A/H1N1 2009 bằng rRT-PCR

37

Bảng 2.2 Chương trình nhiệt cho phản ứng rRT-PCR chẩn đoán cúm A/H1N1 38 Bảng 2.3 Chuyển đổi 1 đơn vị hấp phụ ở bước sóng 260nm 43 Bảng 3.1 Bảng nồng độ mồi được khảo sát trong phản ứng multiplex RT-PCR có

chứng nội 77

Bảng 3.2 So sánh kết quả 2 phương pháp multiplex RT-PCR và rRT-PCR 80 Bảng 3.3 Tiêu chuẩn cơ sở cho qui trình sản xuất kit xét nghiệm virút cúm đại dịch

A/H1N1-2009 bằng RT-PCR 87

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009 4

Hình 1.2 Bản đồ hoạt động của các type (subtype) virút cúm đầu năm 2010 5

Hình 1.3 Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam (Viện Pasteur TP.HCM) 6

Hình 1.4 Cấu trúc hạt virút cúm A 7

Hình 1.5 Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bào chủ 8

Hình 1.6 Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dịch từ 1918-2009 10

Hình 1.7 Hình dạng virút cúm A/H1N1 11

Hình 1.8 Nguồn gốc tái tổ hợp của virút cúm A đại dịch H1N1/2009 13

Hình 2.1 Loại mẫu xét nghiệm virút cúm A/H1N1-2009 33

Hình 2.2 Minh họa phương pháp HA 36

Hình 2.3 Sơ đồ biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli 40

Hình 2.4 Nguyên tắc máy giải trình tự DNA tự động 45

Hình 3.1 Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H, N và M trên NCBI 49

Hình 3.2 Trình tự gen M và gen H1 bảo tồn 50

Hình 3.3: Các mồi được thiết kế để phát hiện virút cúm A/H1N1-2009 51

Hình 3.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi 52

Hình 3.5 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E Coli 53

Hình 3.6 Kết quả phân tích SDS-PAGE Taq polymerase 54

Hình 3.7 Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme 54

Hình 3.8 So sánh hỗn hợp enzyme RT-PCR 56

Hình 3.9 Khảo sát tỷ lệ thành phần hỗn hợp enzyme 57

Hình 3.10 So sánh hỗn hợp các enzyme chạy RT-PCR 1 tube 58

Hình 3.11 Khảo sát nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược cho từng cặp mồi 59

Hình 3.12 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi phản ứng đơn 61

Hình 3.13 Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng đơn 62

Hình 3.14 Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng đơn 63

Hình 3.15 Kết quả khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng đơn 64

Hình 3.16 Khảo sát thời gian phiên mã ngược phản ứng đơn 65

Hình 3.17 Khảo sát thời gian trong phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) đơn 66

Hình 3.18 Khảo sát nhiệt độ phiên mã ngược trong phản ứng multiplex 67

Hình 3.19 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng khuếch đại chuỗi multiplex 68 Hình 3.20 Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex 69

Hình 3.21 Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng multiplex 70

Hình 3.22 Kết quả khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng multiplex 71

Hình 3.23 Khảo sát thời gian phiên mã ngược trong phản ứng multiplex 72

Hình 3.24 Khảo sát thời gian khuếch đại chuỗi (PCR) phản ứng multiplex 72

Hình 3.25 Kết quả khuếch đại MA1-MA2 74

Hình 3.26 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp mang IC trong tế bào E.coli 74

Hình 3.27 Kết quả 6 khuẩn lạc được tách plasmid 75

Hình 3.28 Kết quả kiểm tra IC chèn vào plasmid bằng PCR 75

Hình 3.29 Kết quả khảo sát nồng độ chứng nội trong phản ứng RT-PCR 76

Hình 3.30 Kết quả nồng độ mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội

77

Hình 3.31 Xác định số bản sao gen H1 bằng phương pháp rRT-PCR 78

Hình 3.32 Giới hạn phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCR 79

Hình 3.33 Kết quả 28 trong số 63 mẫu dương tính cúm A/H1N1-2009 xét nghiệm bằng multiplex RT-PCR 80

Hình 3.34 Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm virút cúm A/H1N1-2009 81

Hình 3.35 Kết quả độ lặp lại của phản ứng mRT-PCR 82

Hình 3.36 Kết quả bảo quản RNA virút 83

Hình 3.37 Khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản hỗn hợp multiplex 85

Hình 3.38 Bộ kit pFLU thành phẩm 88

Hình 3.39 Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM 89

Hình 3.40 Giấy chứng nhận của Viện Kiểm định Quốc gia 91

Hình 3.41 Triển khai kit pFLU tại TTYTDP An Giang 93

Hình 3.42 Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bạc Liêu 94

Hình 3.43 Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bến Tre 95

Hình 3.44 Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đà Lạt 96

Hình 3.45 Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Nai 97

Hình 3.46 Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Tháp 98

LỜI MỞ ĐẦU

Lịch sử đã ghi nhận ba đại dịch cúm vào các năm 1918 (cúm Tây Ban Nha), 1957 (cúm Châu Á) và 1968 (cúm Hồng Kông) So với các vụ dịch cúm mùa hàng năm thường xảy ra vào các tháng mùa đông, đại dịch cúm thường xuất hiện sau vài thập kỷ Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 được cho là đã cướp đi trên 40 triệu người trên thế giới trong vòng chưa đầy một năm

Cuối tháng ba và đầu tháng 4 năm 2009, vụ dịch cúm A H1N1 đã được phát hiện đầu tiên ở Mexico và sau đó lan ra một số nước lân cận Bệnh cảnh lâm sàng nhiều trường hợp nhiễm cúm H1N1-2009 khác biệt rõ rệt so với các trường hợp nhiễm cúm mùa thông thường hàng năm, trong đó tỉ lệ mắc tập trung vào nhóm người trẻ khỏe mạnh Ngày 11/6/2009, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ cao nhất, pha 6, cho thấy mức lan rộng trong cộng đồng ở ít nhất hai đại lục

Các dữ liệu cuối năm 2009-đầu 2010 từ nhiều vùng dịch khác nhau cho thấy chủng virút cúm đại dịch H1N1-2009 lây lan rất nhanh và trở thành chủng chiếm ưu thế tại nhiều nơi trên thế giới Theo thống kê của WHO đến ngày 19/3/2010 đã có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ có người bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và nâng tổng số người tử vong lên trên 16800 người Cũng tại thời điểm này, Bộ Y tế Việt Nam đã ghi nhận trên 11000 trường hợp

bị nhiễm bệnh tại 60/64 tỉnh thành Việt Nam, con số tử vong là 58 người Hiện tại, các kỹ thuật phòng thí nghiệm trong chẩn đoán virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 bao gồm các kỹ thuật phân tử, phân lập qua nuôi cấy, định type bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HI hay miễn dịch huỳnh quang

và test nhanh [54] Trong đó test nhanh có thể được sử dụng rộng rãi nhất trong chẩn đoán virút cúm ở nhiều quốc gia Tuy nhiên giá thành của các bộ kit thương mại hiện nay là một trong những khó khăn của các nước đang phát

triển Việc sử dụng các test nhanh trong chẩn đoán virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 cũng đang gặp nhiều tranh cãi do tính chính xác của nó Do đó các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện được lựa chọn để phát hiện virút cúm đại dịch 2009

Phương pháp phiên mã ngược real-time PCR (rRT-PCR) được CDC xây dựng và đã được sử dụng đầu tiên trong chẩn đoán virút cúm đại dịch

2009 [54] Phương pháp này có ưu điểm ít tốn thời gian và có độ nhạy cao hơn một số phương pháp truyền thồng Nhưng đây là phương pháp đòi hỏi sử dụng máy móc chuyên dụng đắt tiền, bộ mồi/mẫu dò phải được thay đổi phù hợp tình hình dịch tễ và kỹ thuật viên có kinh nghiệm Do đó phương pháp này khó có thể sử dụng rộng rãi ở tất cả các phòng xét nghiệm, đặc biệt là phòng xét nghiệm ở vùng sâu vùng xa

Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tạo ra bộ kít chẩn đoán đồng thời virút cúm A nói chung và virút cúm H1N1 đại dịch 2009, sử dụng phương pháp phân tử khá đơn giản và yêu cầu thiết bị tương đối rẻ tiền

mà các phòng xét nghiệm có thể trang bị được Việc tạo ra bộ kít này có thể giúp các phòng xét nghiệm trong cả nước, kể cả các phòng xét nghiệm vùng sâu xa phát hiện sớm bệnh nhằm kịp thời định hướng điều trị cũng như giúp ngăn ngừa ổ dịch có thể xảy ra trong khu vực

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009

1.1.1 Tình hình thế giới

Đại dịch cúm do virút cúm A/H1N1 2009 là đại dịch đầu tiên của thế

kỷ 21 khởi nguồn từ các nước ở khu vực Bắc Mỹ, đầu tiên có thể từ Mexico [7]

Khoảng cuối tháng giêng và đầu tháng hai năm 2009, Mexico ghi nhận

sự tăng vọt các bệnh nhân mang triệu chứng giống cúm (ILI) được cho là biểu hiện đặc trưng của virút cúm mùa Các nhà chức trách về sức khỏe Mexico cho rằng vụ dịch do virút cúm A/H1N1 “mới” có thể bắt đầu vào giữa tháng

ba khi quốc gia này xảy ra nhiều trường hợp có triệu chứng hô hấp cấp, chủ yếu ở những người trẻ tuổi và khỏe mạnh Ngày 14 tháng 4 một bệnh nhân trẻ tuổi đến phòng mạch tại Bang Oxaca khám với triệu chứng hô hấp cấp không đặc trưng và tử vong sau đó Các bác sỹ điều trị cho rằng có thể do SARS, nhưng kết quả kiểm tra âm tính Mẫu tử vong được kiểm tra một lần nữa và xác định bệnh nhân đã bị nhiễm virút cúm A/H1N1 “mới”

Tại Hoa kỳ, các trường hợp đầu tiên được phát hiện vào giữa tháng 3/2009 là 2 trẻ em ở nam California Trường hợp tử vong đầu tiên được báo cáo vào ngày 29/4/2009 ở một bệnh nhi 23 tháng tuổi Từ đó mạng lưới giám sát cúm trên toàn Hòa kỳ đã được tăng cường mạnh mẽ

Quốc gia thứ 3 phát hiện virút cúm đại dịch 2009 là Canada vào cuối tháng 4 năm 2009 Các virút cúm được nhận dạng tương tự virút cúm ở Hoa

kỳ và Mexico [55]

Trước tình hình gia tăng số bệnh nhân bị nhiễm cúm A/H1N1 mới tại các nước thuộc Châu Mỹ và đặc biệt là sự lan rộng trong cộng đồng ở

Mexico, ngày 27/4/2009 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo đại dịch cúm A/H1N1 ở mức 4 Đây là mức chỉ sự lan truyền từ người sang người của chủng virút cúm động vật hay chủng virút cúm tái tổ hợp

WHO tiếp tục tăng mức độ báo động đại dịch cúm A/H1N1 lên mức 5vào ngày 29/4, mức báo động cho thấy mức độ ảnh hưởng và lan rộng của virút cúm từ hai quốc gia trở lên trong cùng một vùng địa lý

Hình 1.1 Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009

Đến ngày 11/6/2009, sau hai tháng kể từ khi phát hiện chủng virút cúm

“mới”, WHO tuyên bố đại dịch cúm đã thực sự nổ ra trên toàn cầu với tốc độ lây lan từ người sang người, từ quốc gia này sang quốc gia khác và từ vùng này sang vùng khác một cách nhanh chóng Tại thời điểm đó gần 30.000 trường hợp dương tính đã được phát hiện ở 74 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó có 114 trường hợp tử vong

Cho đến nay đã có trên 200 quốc gia và vùng lãnh thổ xác định có trường hợp bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và con số người mắc lên đến hàng trăm ngàn trường hợp, trong đó số lượng tử vong trên 17 ngàn người (WHO, 16/4/2010) (hình 1.1) Tuy nhiên theo đánh giá của các chuyên gia con số này trên thực tế có thể lớn hơn rất nhiều do số người nhiễm bệnh không được xét nghiệm hoặc không đi xét nghiệm rất lớn

Hiện tại, virút cúm đại dịch 2009 phân bố chủ yếu ở các khu vực châu

Mỹ, Đông phi, Tây Phi và Đông Nam Á Tại các khu vực này virút cúm đại dịch 2009 vẫn là chủng cúm chiếm ưu thế và lưu hành song song với các chủng cúm mùa (A/H1N1, A/H3N2 và B) và đặc biệt là cúm gia cầm (A/H5N1) tại khu vực Đông và Đông Nam Á (hình 1.2)

1.1.2 Tình hình Việt Nam

Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo phát hiện bệnh nhân nhiễm virút cúm đại A/H1N1-2009 Ca dương tính đầu tiên tại Việt Nam được phát hiện vào ngày 30/5/2009 là một du học sinh từ Hoa Kỳ về Kể từ

đó Việt Nam đã thực sự bước vào cuộc chiến chống đại dịch với chính sách thắt chặt việc rà soát thân nhiệt, cách ly kiểm tra đối với những người có biểu hiện thân nhiệt bất thường tại các cửa khẩu, sân bay Ngoài ra những người từng tiếp xúc với trường hợp dương tính cúm A/H1N1-2009 hay từ các vùng dịch tễ về cũng được cách ly giám sát

Hiện tại tình hình lây lan cũng như mối nguy hiểm do virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 gây ra tại Việt Nam có vẻ lắng xuống Điều này có thể được lý giải: thứ nhất là do chiến dịch giám sát virút cúm đại dịch A/H1N1-

2009 đã được thay đổi kể từ cuối năm 2009 từ chỗ xét nghiệm đại trà trong cộng đồng đến việc chỉ giám sát các vùng nguy cơ, phát hiện, kiểm soát và ngăn chặn tại chỗ (không cần phải xét nghiệm từng cá nhân); thứ hai virút cúm thường gây dịch theo mùa nhất định, ở vùng ôn đới virút thường gây dịch vào mùa thu – đông, còn ở các nước nhiệt đới virút thường hoạt động mạnh vào mùa mưa (WHO), do đó nhiều khả năng virút cúm đại dịch H1N1-

2009 cũng hoạt động theo chu kỳ tương tự

iang

Cà Mau

Hình 1.3 Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam 3/2010(Viện Pasteur TP.HCM)

Theo báo cáo của Bộ Y tế ngày 20/3/2010, Việt Nam đã xác định 11.202 trường hợp dương tính với virút cúm đại dịch H1N1-2009 tại 60/64 tỉnh, thành phố 15 địa phương ghi nhận có trường hợp tử vong, nâng tổng số

ca tử vong lên 58 người, trong đó phụ nữ mang thai chiếm 23%, trẻ em dưới

10 tuổi chiếm 14,3%

1.2 Virút cúm đại dịch

1.2.1 Virút cúm A

Virút cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, và được chia thành các thứ

type (subtype) khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) Hiện tại, có 16 kháng nguyên HA (H1 – H16)

và 9 kháng nguyên NA (N1 – N9) đã được xác định Virút cúm A có bộ gene gồm 8 sợi RNA đơn, mạch âm (-), mỗi loại mã hóa cho một hoặc hai protein (hình 1.4) [26]

Protein HA có chức năng gắn kết với các thụ thể, và dung hợp virút với màng tế bào chủ Sau khi xâm nhập vào tế bào theo cách thực ẩm bào (endocytose), các hạt virút được bao bởi thể nhân (endosome) Nhờ độ pH

Hình 1.4 Cấu trúc hạt virút cúm A

axít, các ion H+ bên trong thể nhân đi vào hạt virút thông qua kênh ion M2 để phát vỡ tương tác protein - protein, nhờ đó cắt đứt liên kết giữa vRNA và M1, phóng thích RNP vào nhân tế bào chủ [26] Tại đây, xảy ra quá trình sao chép

và phiên mã vRNA nhờ ba protein có hoạt tính polymerase: PB1, PB2, PA cùng với protein NP (nucleoprotein) Các phức hệ ribonucleoprotein (vRNP) mới tổng hợp xong sẽ được chuyển từ nhân ra tế bào chất nhờ tín hiệu xuất nhân (nuclear export protein – NEP) của NS2 và protein nền M1 [37] Tại bề mặt tế bào chủ, các vRNP kết hợp với các thành phần cần thiết được màng tế bào gói lại, hình thành các hạt virion hoàn chỉnh nhô ra ngoài Cuối giai đoạn này, nhờ hoạt tính phân cắt axít sialic nối giữa tế bào với các kháng nguyên

bề mặt virút mới sinh của protein NA, giúp các hạt virion thoát ra ngoài và có thể xâm nhiễm vào tế bào khác để tiếp tục chu trình sinh trưởng mới (hình 1.5)

Hình 1.5 Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bào chủ

1.2.2 Các đại dịch cúm trong quá khứ

Virút cúm A đã gây ra nhiều trận dịch trong quá khứ, một vài trận trong

số đó phát triển thành đại dịch Đại dịch cúm xuất hiện thường là do sự phát triển của chủng virút mới, xa lạ với hệ miễn dịch ở người Có hai nguyên nhân chính: quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền (reassortment) và sự lây truyền qua nhiều loài khác nhau (interspecies transmission) dẫn đến việc hình thành chủng virút với các protein bề mặt HA, NA hoặc protein bên trong mới, rồi lưu hành trong cộng đồng người [34]

Đại dịch cúm Tây Ban Nha (Spanish influenza - H1N1) Đại dịch xảy ra

vào năm 1918 – 1919 được xem như một ví dụ điển hình về tính khốc liệt của virút cúm trong lịch sử, làm thiệt mạng khoảng hơn 50 triệu người trên toàn thế giới Đầu tiên, đợt dịch nhẹ vào mùa xuân 1918 được thay thế bởi đợt dịch thứ hai từ tháng 9 đến tháng 11, tỉ lệ tử vong của đợt dịch này lớn hơn 2,5%

so với tỉ lệ tử vong thông thường của dịch cúm là nhỏ hơn 0,1% Đợt dịch thứ

ba với tỉ lệ tử vong tương tự (2,5%) đã lan nhanh trên toàn thế giới năm 1919 Tuy virút “cúm Tây Ban Nha” đã không được phân lập trong suốt hai năm gây đại dịch 1918-1919, nhưng trình tự bộ gene của virút này đã được giải mã và các nhà khoa học cũng phát hiện virút H1N1 này sở hữu một số axít amin trên nhiều protein giống với virút cúm người Virút cúm Tây Ban Nha không có nhiều axít amin mang tính bazơ tại vị trí phân cắt trên protein

HA (multibasic HA cleavage site) – một trong số các tiêu chuẩn cho tính độc lực cao của cúm gia cầm [34]

Bằng kỹ thuật di truyền ngược các nhà khoa học đã tái tạo ra “virút cúm Tây Ban Nha” hoàn chỉnh cùng với những nghiên cứu trên chuột (mice) [22]

và động vật linh trưởng (primates) [24] cho thấy chủng virút cúm này có khả năng gây ra những đáp ứng miễn dịch bẩm sinh khác thường, một đặc điểm giống với chủng H5N1 độc lực cao Điều này góp phần gây độc lực và tỉ lệ tử

vong cao ở người Những nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng, protein HA, phức hệ sao chép (PB1, PB2, PA), NS1 và protein PB1-F2 cũng tham gia vào tính độc lực của virút, đặc biệt protein HA và PB2 đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong khả năng lan truyền giữa các loài khác nhau của virút cúm [50]

Hình 1.6 Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dịch từ 1918-2009

Các mũi tên màu vàng chỉ cho một hay nhiều gene được thừa hưởng từ virút cúm của loài thủy cầm Mũi tên gạch nối màu nâu cho biết chủng virút không lưu hành trong một thời gian Mũi tên màu nâu cho thấy các con đường tiến hóa của virút cúm người; mũi tên màu xanh chỉ cho các chủng cúm heo (swine); và mũi tên màu từ xanh sang nâu chỉ cho virút cúm người có nguồn gốc từ heo Các gene của chủng cúm người 1918, cúm heo H1N1 và cúm H1N1 1979 đều có nguồn gốc từ virút cúm gia cầm, một số gene khác “được tặng” cho chủng cúm đại dịch H1N1 2009

[32]

Đại dịch cúm Châu Á (Asian Influenza – H2N2) Virút cúm Châu Á ban

đầu xuất hiện ở phía nam Trung Quốc vào khoảng tháng 2 năm 1957, sau đó lan đến Singapore (tháng 3/1957), Hong Kong (tháng 4/1957), Nhật Bản (tháng 5/1957), Hoa Kỳ và Vương Quốc Anh (tháng 10/1957) Chỉ tính riêng

ở Hoa Kỳ, đợt dịch này làm thiệt mạng khoảng 70.000 người Virút gây đại dịch “cúm Châu Á” là kết quả của quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền giữa virút cúm người (human) và gia cầm (avian) dẫn đến việc hình thành chủng H2N2 tái tổ hợp sở hữu ba gene H2, N2, PB1 của virút gia cầm và năm gene còn lại của chủng virút cúm người [23]

Đại dịch cúm Hong Kong (Hong Kong Influenza – H3N2) Năm 1968,

chủng virút tái tổ hợp H3N2 xuất hiện và gây đại dịch, virút H3N2 này sở hữu gene H3 và PB1 từ virút cúm gia cầm Virút H3N2 lần đầu tiên được phân lập năm 1968 và gây đại dịch vào mùa đông của những năm 1968 – 1970 Tại Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 33.800 người bị tử vong trong đợt dịch này [23]

1.2.3 Virút cúm A đại dịch H1N1/2009

Đa số các hạt virion cúm A đại dịch H1N1/2009 có hình dạng tròn khá đều đặn khi chụp dưới kính hiển vi, với đường kính từ 80 – 120 nm (CDC)

Hình 1.7 Hình dạng virút cúm A/H1N1

(A) Hình dáng tròn đều của hạt virion swine H1N1 theo CDC (B)

Hình dáng que dài trong thí nghiệm của Neumann, chiều dài của thanh bar

màu đen là 1 µm.

Trong khi một số khác có hình dáng khác lạ, ví dụ khi nuôi cấy virút đại dịch H1N1/2009 trên tế bào MDCK, Neumann thấy có khá nhiều virion có dạng hình que dài, thậm chí có một số que virion dài hơn 1 µm (hình 1.7) [34] Bằng phương pháp giải trình tự (sequencing) và định type gene (genotyping), các nhà khoa học đã xác định virút cúm A đại dịch H1N1/2009

là kết quả tái tổ hợp của bốn dòng virút (quadruple reassortants): virút cúm heo thường (classical swine), virút cúm gia cầm Bắc Mỹ (North American avian), virút cúm người H3N2 và virút cúm heo dòng Á – Âu (Eurasian avian-like swine) Cụ thể, vào cuối thập niên 1990, sự tái tổ hợp của ba dòng virút: human H3N2, North American avian và classical swine hình thành dòng virút cúm heo H1N2 (triple reassortant H1N2) và virút cúm H3N2, đồng thời cùng lưu hành trong quần thể heo ở Bắc Mỹ Sau đó, dòng virút cúm heo H1N2 triple này lại tái tổ hợp với virút cúm heo dòng Á – Âu tạo ra dòng virút đại dịch H1N1-2009 ngày nay [34]

Virút cúm A đại dịch H1N1-2009 sở hữu gene PB2 và PA từ dòng virút cúm gia cầm Bắc Mỹ, gene PB1 từ dòng cúm người H3N2, gene H1, NP và

NS từ dòng cúm heo thường (classical swine), gene N1 và M từ dòng cúm heo Á – Âu (Eurasian-like swine) (hình 1.8) Các gene PB1, PB2 và PA tuy

có nguồn gốc từ người và gia cầm, nhưng chúng đã từng lưu hành trong quần thể heo từ khoảng năm 1997 – 1998, nên có khả năng trong thời gian đó virút cúm heo H1N2 triple đã thích nghi với điều kiện sống trong cơ thể động vật hữu nhũ Do đó, đây cũng có thể là một trong số các yếu tố thuận lợi để cho virút cúm heo H1N2 triple khi kết hợp với virút cúm heo dòng Á – Âu tạo thành chủng H1N1-2009 và dễ dàng lây nhiễm từ người sang người [34]

Sự khác biệt tại vị trí gắn kết thụ thể đặc hiệu loài trên protein HA của virút cúm gia cầm và người do các axít amin xác định Đối với protein H2 và H3, Glutamine (Gln) tại vị trí 226 và Glycine (Gly) tại vị trí 228 sẽ đặc hiệu với thụ thể gia cầm, trong khi Leucine (Leu) và Serine (Ser) tại hai vị trí này

sẽ đặc hiệu với thụ thể người Còn đối với H1, các axít amin tại vị trí 190 và

225 (đếm theo chuỗi H3) xác định tính gắn kết thụ thể đặc hiệu loài Asp (Aspartic acid) tại hai vị trí 190 và 225 (được tìm thấy trong H1 của virút cúm người) sẽ có nhiều khả năng đặc hiệu với thụ thể người, trong khi Glu (Glutamic acid) và Gly (Glycine) tại vị trí 190 và 225 (được tìm thấy trong H1 của virút cúm gia cầm) sẽ có nhiều khả năng đặc hiệu với thụ thể gia cầm [47] Những thông tin nghiên cứu gần đây cho thấy virút cúm đại dịch H1N1-

2009 sở hữu các axít amin “giống với H1 của chủng virút cúm người” tại hai

vị trí 190 và 225, điều này có thể giúp cho virút đại dịch H1N1-2009 lan

Hình 1.8 Nguồn gốc tái tổ hợp của virút cúm A đại dịch H1N1/2009

truyền một cách hiệu quả trên người Có một chi tiếc đáng lưu ý là một số chủng virút cúm đại dịch H1N1-2009 lại có axít amin tại vị trí 135 hoặc 226 (chuỗi H1) giống với H5 của các chủng H5N1 phân lập từ người, mà những

vị trí này có ảnh hưởng đến chức năng gắn kết thụ thể của virút [34] Vì vậy, những đột biến này cần nên được nghiên cứu chi tiết hơn

Những nghiên cứu trên tế bào còn cho thấy phức hệ sao chép (PB2, PB1, PA) cũng góp phần quan trọng trong độc tính virút, thông qua quá trình sinh trưởng Ngày nay, Lysine ở vị trí PB2-627 được xem là một tiêu chuẩn xác định độc tính của virút cúm trong nhiều loài động vật hữu nhũ Những thay đổi axít amin tại vị trí này cho thấy có sự khác biệt về độc tính của virút H5N1 khi nghiên cứu trên chuột Virút với Lysine (Lys) tại vị trí này gây độc tính trên chuột, trong khi những virút với Glutamic axít (Glu) ở vị trí này không gây độc tính trên chuột [17] Điều đặc biệt là hầu hết các chủng virút cúm người sở hữu Lysine tại vị trí này, trong khi hầu hết các chủng virút gia cầm vị trí PB2-627 là Glutamic axít, ngoại trừ các dòng H5N1 tại hồ Qinghai (Qinghai Lake) và hậu duệ của chúng

Nhiều nghiên cứu đã mô tả cơ chế gây độc của Lysine ở vị trí PB2-627 Thay đổi axít amin này không giúp virút ảnh hưởng đến tính hướng mô tế bào (affect tissue tropism), mà ảnh hưởng đến khả năng sao chép của virút Điều này có lẽ do hoạt động ức chế trong tế bào động vật hữu nhũ nhằm ngăn cản quá trình sao chép của virút có PB2-Glu 627 [31], hoặc cũng có thể do sự tương tác không hiệu quả giữa PB2-Glu 627 với protein NP để thực hiện quá trình sao chép vật liệu di truyền [42] Virút có đột biến PB2-Lys 627 sinh trưởng hiệu quả trong đường hô hấp trên của động vật hữu nhũ, điều này có lẽ được lý giải từ thực tế là: virút sở hữu đột biến PB2-Lys 627 sao chép hiệu quả ở 330C, và đây cũng chính là nhiệt độ trong đường hô hấp trên của người (upper airway in human) trong khi virút sở hữu PB2-Glu 627 không có tính

chất này Ngược lại, cả hai thể virút này lại sao chép hiệu quả ở 370C [28] Nhìn chung, những nghiên cứu này cho thấy virút sở hữu đột biến PB2-Lys

627 có khả năng sao chép hiệu quả trong cả đường hô hấp trên lẫn dưới – đặc điểm này có thể giúp cho quá trình lây nhiễm giữa các loài hiệu quả hơn Thực tế, thay thế vị trí PB2-Lys 627 bằng Glu sẽ làm giảm khả năng lây nhiễm của virút cúm người trong thí nghiệm với chuột lang (guinea-pig) [46] Axít amin ở vị trí 701 trên PB2 cũng được xem là một trong số các yếu

tố góp phần vào độc tính virút, điều này có thể do khả năng gắn kết thích hợp của PB2 đến importin α (một nhân tố hướng nhân) trong tế bào động vật hữu nhũ Trong chủng virút độc lực cao vị trí 701 là Asn (Asparagine), còn chủng độc lực thấp vị trí này là Asp (Aspartic acid) [14] Những nghiên cứu, so sánh gần đây cho thấy virút cúm đại dịch H1N1/2009 sở hữu các axít amin theo dạng “độc lực thấp” (low pathogenic-type) tại hai vị trí 627 và 701, tức là axít amin Glu và Asp (bảng 1.1) [34]

NS1 là một protein kháng interferon (INF), chúng bất hoạt các nhân tố phiên mã (transcription factors) và các sản phẩm có sự kích thích từ INF-β, NS1 gắn kết vào các RNA sợi đôi (dsRNA) để ngăn cản khả năng hoạt hóa phụ thuộc dsRNA của 2’-5’ oligo (A) synthetase, sau đó bất hoạt RNase L – một tác nhân quan trọng của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh Các thành quả đạt

Bảng 1.1 Các axít amin quan trọng trên các protein có vai trò trong độc tính

virút cúm

được trong việc nghiên cứu về cấu trúc protein những năm gần đây được hi vọng là sẽ giúp cho các nhà khoa học xác định được những vùng (domains) cấu trúc tiêu chuẩn cho chức năng sinh học của NS1

Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh được khởi động sau khi thụ thể nhận biết kháng nguyên (pathogen-recognition receptor) nhận biết được một kháng nguyên lạ xâm nhập cơ thể Có nhiều loại thụ thể nhận biết kháng nguyên như RIG-I (retinoic acid inducible gene-I) còn được gọi là DDX58, MDA5 (melanoma differentiation antigen 5) còn gọi là IFIH1 và Toll-like 3, 7, 8 (TLRs) Khi nhiễm virút cúm, các tế bào sẽ hoạt hóa tín hiệu RIG-I, nhưng tín hiệu này bị protein NS1 trung hòa [39], có lẽ bằng cách hình thành phức hệ với RIG-I Ngoài ra, nhiễm virút cúm cũng ảnh hưởng đến tín hiệu TLR7 và TLR4, và những con chuột khiếm khuyết TLR4 thì không gây thương tổn phổi cấp tính sau khi lây nhiễm với virút H5N1 Hiện tại, các nhà khoa học vẫn chưa hiểu rõ tác động của protein NS1 với các tín hiệu này [19]

Protein NS1 của virút H5N1 kháng các tác nhân kháng virút của interferon, và liên quan đến sự biểu hiện các cytokine ở mức độ cao trong giai đoạn tiền viêm (pro-inflammatory), chính tình trạng mất cân bằng của cytokine này có lẽ ảnh hưởng đến tính độc lực cao của virút H5N1 khi nhiễm trên người Nhiều axít amin trên NS1 liên quan đến độc tính virút, thường thì chủng virút độc lực thấp vị trí 92 là Aspartic acid (Asp), còn chủng độc lực cao vị trí này là Glutamic acid (Glu) (Bảng 1.1) [45] Virút cúm đại dịch H1N1/2009 sở hữu axít amin thuộc dòng độc lực thấp tại vị trí này Tuy nhiên, những dữ liệu hiện tại cũng cho thấy rằng, thay đổi axít amin tại những

vị trí này mà ảnh hưởng đến độc tính cũng còn tùy thuộc từng chủng specific manner), trong khi PB2-Lys 627 và vùng phân cắt trên HA chứa nhiều axít amin mang tính bazơ được xem như là những “yếu tố cơ bản” (universal determinants) xác định về độc tính virút cúm [34]

(strain-Khi phân tích trình tự ở quy mô lớn (large-scale), các nhà khoa học thấy bốn axít amin tại phía đầu Carboxy (C-terminal) của NS1 hình thành PDZ ligand domain motif Việc chuyển các PDZ ligand domain của chủng H5N1 độc lực cao hoặc của chủng H1N1 đại dịch 1918 vào một chủng virút cúm người khác cũng gia tăng một phần nhỏ (slightly) độc tính virút trên chuột Tuy nhiên, sự gia tăng thêm chút ít độc tính này không song hành với việc gia tăng tính kháng interferon [21] Protein NS1 của virút cúm đại dịch H1N1/2009 thiếu mất 11 axít amin ở đầu Carboxy, vì vậy không có PDZ domain motif, và đặc tính sinh học của điều này hiện tại vẫn còn là ẩn số Gene PB1 của hầu hết virút cúm A người và gia cầm mã hóa một protein thứ hai là PB1-F2 Độ dài protein PB1-F2 của các chủng virút cúm heo khác nhau và tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng Virút cúm heo truyền thống (classical swine) có đoạn PB1-F2 dài khoảng 8-11 axít amin, trong khi cúm heo có nguồn gốc từ gia cầm dòng Á-Âu (Eurasian avian-like swine virus) sở hữu đầy đủ chiều dài đoạn PB1-F2 khoảng 87-89 axít amin Virút cúm đại dịch H1N1/2009 mã hóa một đoạn PB1-F2 dài 11 axít amin PB1-F2 thúc đẩy quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào, có lẽ do tương tác với hai protein trong ti thể [8], làm tăng quá trình viêm (inflammation) trên chuột,

và gia tăng tần số cũng như mức độ nghiêm trọng khi tế bào bị xâm nhiễm bởi các vi khuẩn thứ cấp sau đó [30] PB1-F2 cũng có thể làm gia tăng độc tính bằng cách tương tác với protein PB1 để duy trì PB1 lâu hơn trong nhân tế bào nhằm tăng hiệu quả sao chép của virút Một nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, axít amin ở vị trí 66 trên PB1-F2 ảnh hưởng đến độc tính của một chủng virút H5N1 trên chuột Phát hiện này gây ra một sự quan tâm lớn lao, bởi vì chủng virút đại dịch H1N1/1918 sở hữu axít amin thuộc dòng độc lực cao tại vị trí này [11] Còn PB1-F2 của chủng H1N1 đại dịch 2009 dài 11 axít amin, vì vậy không có axít amin ở vị trí 66 này, và chức năng của PB1-F2

chủng đại dịch H1N1/2009 cũng chưa được biết Chính vì điều này, nên cũng

có ý kiến cho rằng đoạn PB2-F1 của chủng đại dịch H1N1/2009 không thể hiện tính độc lực cao

Hiệu quả điều trị bệnh nhân Cúm lệ thuộc rất nhiều vào độ chính xác và thời gian thực hiện của các phương pháp chẩn đoán Việc chẩn đoán chính xác kết hợp với thông tin dịch tễ có thể cho phép nhận biết có hay không một đợt dịch Cúm cũng như nhận diện được chủng đang lưu hành

Các phương pháp chẩn đoán Cúm được sử dụng hiện nay: phương pháp huyết thanh học, phương pháp miễn dịch, phương pháp nuôi cấy virút, phương pháp phân tử (RT-PCR, rRT-PCR) Các phương pháp này khác nhau

ở độ nhạy, độ đặc hiệu, chi phí, thời gian thực hiện, khả năng phân biệt type, subtype [5]

1.3.1 Phương pháp huyết thanh học (Serology method)

Đây là phương pháp phát hiện kháng thể Việc lấy máu bệnh nhân vào giai đoạn sớm của bệnh thường không phát hiện hoặc phát hiện rất ít kháng thể so với vài tuần sau khi khởi phát bệnh Do đó, phương pháp này thường được dùng để khẳng định lại ca bệnh (lượng kháng thể trong máu lần 2 phải

cao gấp 4 lần so với khi khởi phát bệnh hoặc có hiện tượng đảo ngược huyết thanh)

Phương pháp này đòi hỏi phải có kháng huyết thanh tương ứng, do đó ít được khuyến khích sử dụng trong chẩn đoán Tuy nhiên, nó có thể được sử dụng để phục vụ các nghiên cứu dịch tễ học và kiểm tra hiệu quả vắc xin

1.3.2 Phương pháp miễn dịch (Immunology method)

1.3.2.1 Phương pháp miễn dịch enzyme (Enzyme Immuno Assay_ EIA)

Phương pháp được sử dụng nhằm phát hiện kháng nguyên (thông thường là kháng nguyên Nucleoprotein-NP, Protein nền (Matrix protein), hoặc kháng nguyên hemagglutinin-HA) Kháng thể tương ứng với những kháng nguyên này được gắn với enzyme rồi ủ với cơ chất tạo màu cho phép phát hiện virút dựa trên sự thay đổi màu cơ chất

1.3.2.2 Phương pháp chẩn đoán nhanh (Rapid Influenza Diagnostic Test_RIDT)

Phương pháp này cho phép phát hiện kháng nguyên (thường là Nucleoprotein), được thương mại hóa rộng rãi dưới dạng kit chẩn đoán nhanh,

dễ sử dụng, có thể cho kết quả trong vòng 15-30 phút Kit chẩn đoán nhanh có

độ đặc hiệu khá cao (>95%) nhưng độ nhạy rất thấp (10-70%) so với phương pháp phân tử, do đó tỉ lệ âm tính giả cao Các kit chẩn đoán nhanh này có thể phát hiện và phân biệt cúm type A và type B, trong đó khả năng phát hiện cúm type A nhạy hơn cúm type B [6]

Độ tin cậy của chẩn đoán phụ thuộc nhiều vào mức độ gây dịch trong cộng đồng, yếu tố dịch tễ của người bệnh, độ nhạy cảm của bệnh nhân, độ nhạy và độ đặc hiệu của test kit, lượng mẫu (mẫu không đúng và không đủ dễ cho kết quả âm tính giả) Test nhanh thường được sử dụng trong trường hợp

có xuất hiện dịch bệnh trong cộng đồng, trên bệnh nhân có triệu chứng cúm rõ

rệt và trong vòng bốn ngày sau khi khởi phát bệnh Tuy nhiên, không phải bệnh nhân cúm nào cũng biểu hiện các triệu chứng trên Một số test kit có độ nhạy rất thấp (<50%) [6, 13]

Với việc cho kết quả một cách nhanh chóng (<=15 phút), các test kit chẩn đoán nhanh thường được sử dụng và hữu ích trong chẩn đoán lâm sàng giúp bác sĩ kịp thời có phương án điều trị kháng virút cũng như cách ly bệnh nhân, ngăn ngừa sự lan tràn dịch bệnh trong cộng đồng Ngoài ra, trong các đợt bùng phát dịch cúm, có thể dùng test kit chẩn đoán nhanh để sàng lọc bệnh nhân

Một số kít chẩn đoán nhanh: Quick Vue Influenza Test, Quick Vue Influenza A+B Test (Quidel), 3MTM Rapid Detection Flu A+B Test ( 3M), Directigen EZ Flu A+B (Becton-Dickinson), BinaxNOW Influenza A&B (Inverness), OSOM®Influenza A&B (Genzyme), SAS FluAlert (SA Scientific),TRU FLU (Meridian Bioscience), XPECT Flu A&B (Remel) Ưu điểm của các kít chẩn đoán này là nhanh Tuy nhiên chúng có nhiều khuyết điểm như giá thành cao, độ nhạy thấp và không thể xác định thứ type virút

1.3.2.3 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence Assay)

Gồm phương pháp nhuộm huỳnh quang kháng thể trực tiếp (Direct Immunofluorescence Assay) hoặc gián tiếp (Indirect Immunofluorescence Assay), có thể cho kết quả trong vòng 2-4 giờ

Cũng như phương pháp phát hiện nhanh kháng nguyên, phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ đặc hiệu cao (>=96%), độ nhạy tương đối cao hơn phương pháp phát hiện nhanh kháng nguyên (47-93%) nhưng thấp hơn phương pháp nuôi cấy virút và phương pháp phân tử Một số kit phát hiện nhanh kháng thể kháng virút cúm đã được thương mại hóa tuy nhiên mức độ chính xác của các kít này chưa được đánh giá cụ thể do đó cũng ít được khuyến khích sử dụng

1.3.3 Phương pháp nuôi cấy virút (Viral culture)

Nuôi cấy vẫn được xem là phương pháp vàng trong chẩn đoán virút cúm Tuy thời gian cho kết quả khá lâu (3-10 ngày) nhưng việc nuôi cấy phân lập virút hết sức hữu ích trong nghiên cứu xác định subtype cũng như chủng virút lưu hành nhằm tìm hiểu khả năng gây dịch, độc tính, tính kháng thuốc

và nhận diện chủng vaccine

1.3.4 Phương pháp phân tử (Molecular method)

Nguyên tắc của phương pháp này là khuếch đại RNA bộ gene virút dựa trên enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase và enzyme DNA polymerase Hai phương pháp được sử dụng phổ biến là RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và rRT-PCR (Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp phân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất so với các phương pháp khác Tuy nhiên chỉ được sử dụng giới hạn ở một số phòng thí nghiệm do phương pháp này đòi hỏi một số trang thiết bị đắt tiền Phương pháp này có thể cho kết quả trong vòng 2-4 giờ, tuy không nhanh bằng test nhanh nhưng độ đặc hiệu và độ nhạy cao nên được sử dụng như qui trình chuẩn thức trong việc thực hiện chẩn đoán virút cúm A

Bảng 1.2 So sánh các xét nghiệm chẩn đoán cúm hiện có [5]

Các xét nghiệm chẩn

đoán cúm

Phương pháp

Thời gian thực hiện

Độ nhạy đối với virút cúm H1N1-

2009

Khả năng phân biệt virút cúm H1N1-2009 với các cúm A khác

kháng nguyên

2 – 4 giờ 47 – 93% Không

Nuôi cấy virút (Viral

Culture)

Phân lập virút

1.4 Các phương pháp chẩn đoán Cúm A/H1N1-2009

Trong số các phương pháp chẩn đoán cúm kể trên, 2 phương pháp được

sử dụng phổ biến trong chẩn đoán Cúm A/H1N1 2009 là phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên và phương pháp phân tử, ngoài ra phương pháp nuôi cấy cũng được sử dụng Về độ nhạy, phương pháp phân tử có độ nhạy cao nhất (98%), phương pháp nuôi cấy cho độ nhạy thấp hơn nhưng cũng có thể so sánh được (94%); thấp nhất vẫn là phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên (62%)

1.4.1 Phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên (RIDT)

Tương tự trong chẩn đoán Cúm thông thường, phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên Cúm A/H1N1 2009 có độ đặc hiệu cao (>99%) và độ nhạy khá thấp Điều này có nghĩa một kết quả âm với RIDT cần phải được khẳng định lại bằng các phương pháp khác

Ngoài ra, một nghiên cứu gần đây cho thấy phương pháp này có độ nhạy cao hơn trên nhóm bệnh nhi dưới 5 tuổi (52-70%) so với nhóm đối tượng khác và do đó có ý nghĩa chẩn đoán cao hơn trên nhóm bệnh này [18]

1.4.2 Phương pháp phân tử

Do virút Cúm A/H1N1 2009 (bộ gen có nguồn gốc của virút cúm lợn, cúm gia cầm và người) có thành phần di truyền mới mẻ và khác nhiều so với dòng virút cúm khác cũng như virút Cúm A/H1N1 lưu hành trước đây, nên không thể áp dụng các phương pháp phân tử đã sử dụng trước đây Ngay khi bùng phát dịch, qui trình chẩn đoán real time RT-PCR (rRT-PCR) do Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) xây dựng đã được khẩn trương đưa vào sử dụng như là qui trình chuẩn Bên cạnh đó cũng có những qui trình phân tử của các trung tâm nghiên cứu khác được sử dụng và cho kết quả tốt như qui trình multiplex rRT-PCR cho phép phát hiện đồng thời virút Cúm A và Cúm A/H1N1 2009 [15], qui trình real-time nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) trên gen mục tiêu HA có độ nhạy cao hơn phương pháp rRT-PCR dùng TaqMan probe của CDC, cho phép phát hiện 50 coppies [56], qui trình RT-PCR khuếch đại gen NP của Viện quốc gia các bệnh truyền nhiễm Ý [25]

1.5 Tác nhân ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán virút cúm

Ngoài tác nhân điều kiện phòng thí nghiệm, tác nhân con người, còn có các tác nhân khác ảnh hưởng đáng kể đến kết quả phản ứng mà ta có thể hạn chế được như: loại mẫu bệnh phẩm, chất lượng mẫu, thời gian lấy mẫu tính từ lúc khởi phát bệnh, tuổi bệnh nhân, thời gian thực hiện chẩn đoán tính từ lúc lấy mẫu, qui trình bảo quản, xử lí mẫu

1.5.1 Loại mẫu bệnh phẩm

Mẫu phết và dịch rửa mũi (nasal) và mũi hầu (nasopharyngeal) có thể cho kết quả tốt hơn so với các mẫu lấy từ đường hô hấp trên khác như phết họng do có mật độ virút có thể phát hiện được dày hơn Phương pháp chẩn đoán nhanh có độ nhạy cao hơn nếu mẫu bệnh phẩm lấy từ trẻ em

1.5.2 Chất lượng mẫu

Chất lượng mẫu là kết quả của qui trình lấy, vận chuyển, bảo quản và

xử lí mẫu Các bước này cần thực hiện theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới: (1) Mẫu nên được lấy trong vòng 4 ngày đầu sau khi khởi phát bệnh và nên được chẩn đoán trong thời gian sớm nhất có thể; (2) Mẫu cần được vận chuyển trong môi trường vận chuyển thích hợp trong đá hay nitơ lỏng; (3) Mẫu phân lập virút nên được giữ lạnh trong gel đá ngay sau khi lấy và nên được phân lập trên tế bào hoặc trứng trong thời gian nhanh nhất có thể Nếu mẫu không thể được xử lí trong vòng 48-72 giờ, mẫu nên được trữ -700C (có thể giữ ở 0-40C trong vòng 2 ngày); (4) Mẫu không nên trữ trong đá khô trừ khi được bảo quản trong dụng cụ thủy tinh hoặc túi plastic nhiều lớp dán kín

vì CO2 có thể sẽ nhanh chóng bất hoạt virút; (5) Tránh rã đông mẫu nhiều lần

1.6 Các đặc tính quyết định việc đánh giá chính xác trong chẩn đoán [49]

Việc đánh giá các xét nghiệm chẩn phải được thực hiện và báo cáo đầy

đủ nhằm giúp người sử dụng hiểu được mục đích sử dụng, phương pháp nghiên cứu, các giới hạn liên quan và giải thích kết quả Điều này giúp tránh được hậu quả “tiền mất tật mang” liên quan đến việc chẩn đoán sai, dẫn đến việc chăm sóc bệnh nhân kém hay phức tạp hóa quá mức cần thiết, thậm chí gây tử vong

1.6.1 Các đặc tính hiệu suất (performance characteristics)

1.6.1.1 Độ nhạy và độ đặc hiệu

Các đặc tính hiệu suất cơ bản của xét nghiệm chẩn đoán được thiết kế nhằm xác định một cá nhân có nhiễm bệnh hay không chính là độ nhạy

(sensitivity) và độ đặc hiệu (specificity) Độ nhạy cho thấy khả năng thật sự

một cá nhân bị nhiễm bệnh sẽ cho kết quả dương tính Ngược lại, độ đặc hiệu cho thấy khả năng thật sự một cá nhân không nhiễm bệnh sẽ cho kết quả âm tính

Độ nhạy và độ đặc hiệu thường được xác định thông qua một phương

pháp chuẩn tham khảo (reference standard test), đôi khi được xem là “chuẩn vàng” (gold standard) Sai số khi xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của test sẽ

tăng lên nếu bản thân “chuẩn vàng” được sử dụng không có độ nhạy và độ đặc hiệu 100% Việc đánh giá một xét nghiệm chẩn đoán thật sự khó khăn khi không có phương pháp chuẩn tham khảo

1.6.1.2 Giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm

Hai thông số quan trọng khác trong thực hiện xét nghiệm chẩn đoán là

giá trị tiên đoán dương (possitive predictive value ~ PPV) và giá trị tiên đoán

âm (negative predictive value ~ NPV) Giá trị tiên đoán dương là xác suất xét

nghiệm dương tính ở người thật sự bị nhiễm bệnh Giá trị tiên đoán âm là xác suất xét nghiệm âm tính ở người thật sự không nhiễm Hai thông số này thường được biểu hiện bằng tỷ lệ phần trăm PPV và NPV không chỉ phụ thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm mà còn phụ thuộc vào tần

suất nhiễm bệnh (prevelance) của quần thể nghiên cứu

1.6.1.3 Độ lặp lại

Độ lặp lại (reproducibility) của xét nghiệm chẩn đoán là đánh giá mở

rộng nhằm xác định trên một một nhân viên xét nghiệm sử dùng cùng một

mẫu xét nghiệm cho kết quả xét nghiệm tương tự nhau trong các lần thực hiện hoặc mở rộng hơn nữa là nhân viên xét nghiệm khác nhau nhưng sử dụng cùng mẫu xét nghiệm và cho kết quả tương tự Độ lặp lại được biểu diễn bằng phần trăm số lần cho kết quả trùng nhau trong tổng số các lần thực hiện trên cùng một mẫu Do đó độ lặp lại có thể được đánh giá giữa nhiều người thực hiện hay cùng một người thực hiện hoặc các lô hóa chất khác nhau của cùng loại xét nghiệm

1.6.1.4 Độ chính xác

Độ chính xác (accuracy) của test đôi khi được sử dụng như tiêu chuẩn

chung của việc thực hiện xét nghiệm và được định nghĩa như phần trăm có cùng kết quả của một xét nghiệm chẩn đoán cần đánh giá và phương pháp chuẩn tham khảo (cả âm và dương tính)

1.6.2 Các đặc tính sử dụng (operational characteristics)

Các đặc tính sử dụng bao gồm thời gian thực hiện xét nghiệm, tính đơn giản của kỹ thuật hay tính dễ sử dụng, khả năng chấp nhận của người sử dụng,

và khả năng ổn định của test dưới các điều kiện của người sử dụng Tính dễ

sử dụng sẽ dựa trên việc yêu cầu và duy trì thiết bị khi thực hiện xét nghiệm, huấn luyện nhân viên sử dụng và đọc kết quả, và tính ổn định của test dưới các điều kiện mong muốn khi sử dụng Tất cả các đặc tính này khá quan trọng

để xác định việc tổ chức ứng dụng, huấn luyện nhân sự theo yêu cầu của xét nghiệm Thông tin về tính ổn định của test – test có thể được trữ bao lâu và trong điều kiện nào – là yếu tố quyết định chúng có được mua hay không

1.6.3 Chọn lựa phương pháp chuẩn tham khảo

Việc chọn lựa phương pháp chuẩn thích hợp là yếu tố rất quan trọng khi so sánh kết quả hợp lệ Ví như các phương pháp huyết thanh học thường không được sử dụng để so sánh với các phương pháp phát hiện vi sinh trực