Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn

Đào tạo Luận án luận văn và khóa luận Tên luận án Họ và tên NCS Chuyên ngành Người hướng dẫn [+] Hướng dẫn viết luận án [+] Hướng dẫn viết luận văn TRANG THÔNG TIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ CỦA NCS: LÊ QUỐC VIỆTNgày đăng: 24/10/2019 1. Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn 2. Thông tin về nghiên cứu sinh: Năm nhập học: 2014Năm tốt nghiệp: 2019 Chuyên ngành:Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số:9.64.01.02 Chức danh khoa học, học vị của người hướng dẫn:1. PGS. TS. Đinh Thị Bích Lân - 2. PGS. TS. Bùi Trần Anh Đào Cơ sở đào tạo:Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3. Giới thiệu về luận án Nghiên cứu tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 trên lợn khỏe tại các địa điểm giết mổ. Phân lập và kiểm tra đặc tinh sinh hóa, sinh học phân tử của chủng vi khuẩn phân lập được. Bất hoạt và chế tạo kháng thể từ chủng vi khuẩNghiên cứu tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 trên lợn khỏe tại các địa điểm giết mổ. Phân lập và kiểm tra đặc tinh sinh hóa, sinh học phân tử của chủng vi khuẩn phân lập được. Bất hoạt và chế tạo kháng thể từ chủng vi khuẩn bất hoạt. Chế tạo KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type 2.n bất hoạt. Chế tạo KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type 2.

H ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2

Ở LỢN

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

H ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2

Ở LỢN

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Ng ười hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Thị Bích Lân

PGS.TS Bùi Tr ần Anh Đào

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2019

ii

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà N ội, ngày… tháng… năm 2019

Tác gi ả luận án

Lê Qu ốc Việt

iii

L ỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc PGS.TS Đinh Thị Bích Lân và PGS.TS Bùi Trần Anh Đào đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Đặc biệt, tôi xin chân thành cám ơn tác giả Hoàng Thị Thùy Nhung, Đinh Thị Bích Lân, Đặng Thanh Long, Huỳnh Văn Chương, Lê Công Thịnh, Phùng Thăng Long, Nguyễn Xuân Hòa, Lê Đức Thạo và Bùi Trần Anh Đào đã cho phép tôi sử dụng kết quả nghiên cứu đã công bố vào một phần nội dung của luận án

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./

Hà N ội, ngày tháng năm 2019

Nghiên c ứu sinh

Lê Qu ốc Việt

iv

M ỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục chữ viết tắt vii

Danh mục bảng viii

Danh mục hình ix

Trích yếu luận án xi

Thesis abstract xiii

Ph ần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3

1.3 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Ph ần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 4

2.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên

thế giới 4

2.2 Một số đặc tính của liên cầu khuẩn lợn 7

2.2.1 Đặc điểm hình thái 8

2.2.2 Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa 9

2.2.3 Sức đề kháng 10

2.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 11

2.2.5 Khả năng gây bệnh 13

2.3 Triệu chứng và bệnh tích của bệnh do vi khuẩn S Suis gây ra 14

2.3.1 Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn 14

2.3.2 Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S suis gây ra ở người 16

2.4 Chẩn đoán 17

v

2.4.1 Chẩn đoán bằng phương pháp PCR 18

2.4.2 Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA 19

2.5 Điều trị 19

2.5.1 Điều trị bằng thuốc kháng sinh 19

2.5.2 Điều trị bệnh bằng huyết thanh 20

2.6 Giới thiệu về hạt nano vàng và kỹ thuật sắc ký miễn dịch 20

2.6.1 Tổng quan về hạt nano vàng 20

2.6.2 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 20

Ph ần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 26

3.1 Vật liệu nghiên cứu 26

3.2 Nội dung nghiên cứu 26

3.2.1 Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 26

3.2.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2 27

3.2.3 Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2 27

3.2.4 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 27

3.3.1 Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 27

3.3.2 Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S suis type 2 33

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate - kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 37

3.3.4 Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 38

3.3.5 Phương pháp phân tích số liệu 40

Ph ần 4 Kết quả và thảo luận 41

4.1 Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 2 41

4.1.1 Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ 41

4.1.2 Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S suis type 2 44

4.1.3 Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S suis type 2 55

4.2 Kết quả nghiên cứu sản xuất kháng thể đa dòng kháng S Suis type 2 57

4.2.1 Kết quả xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên 57

vi

4.2.2 Kết quả xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng đáp ứng

miễn dịch ở chuột SA 60

4.2.3 Kết quả xác định chất bổ trợ thích hợp cho khả năng sinh miễn dịch của chuột SA 63

4.2.4 Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S suis type 2 66

4.2.5 Xác định hiệu giá kháng thể sau tinh chế 71

4.3 Kết quả nghiên cứu chế tạo Conjugate – kháng thể kháng S Suis type 2 72

4.3.1 Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano 72

4.3.2 Xác định nồng độ kháng thể kháng S suis type 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano 74

4.3.3 Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp 77

4.4 Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kit chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 79

4.4.1 Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp 79

4.4.2 Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT 81

Ph ần 5 Kết luận và kiến nghị 87

5.1 Kết luận 87

5.2 Kiến nghị 88

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án 89

Tài liệu tham khảo 90

Phụ lục 103

vii

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ch ữ viết tắt Di ễn giải

dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate

E coli : Escherichia coli

xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

PCR : Polymerase Chain Reaction/ phản ứng khuếch đại gene

S suis : Streptococcus suis

X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto- pyranoside

viii

DANH M ỤC BẢNG

TT Tên bảng Trang

3.1 Thành phần phản ứng PCR phát hiện S suis type 2 29

3.2 Chu trình nhiệt cho PCR phát hiện mẫu dương tính 29

3.3 Thành phần PCR nhân đoạn gene 6PGD 30

3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gene 6PGD 31

3.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tạo dòng 31

3.6 Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối

miễn dịch 34

3.7 Bố trí thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch 34

3.8 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh 39

4.1 Tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 ở lợn tại một số lò mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế 42

4.2 Kết quả sinh hóa chủng vi khuẩn THHSS2 50

4.3 Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S suis type 2 chủng TTHSS2 phân lập được với gene 6PGD của vi khuẩn S suis type 2 chủng SC 19 trên ngân hàng gene 54

4.4 Kết quả đánh giá khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên 58

4.5 Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của

chuột SA 61

4.6 Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA 64

4.7 Kết quả chế tạo kháng thể kháng S suis type 2 67

4.8 Kết quả phát hiện vi khuẩn S suis type 2 ở các nồng độ kháng thể bắt

khác nhau 81

4.9 Ngưỡng phát hiện của KIT phát hiện nhanh vi khuẩn S suis type 2 83

4.10 Đánh giá độ đặc hiệu của KIT 85

4.11 Kết quả xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT 86

ix

DANH M ỤC HÌNH

TT Tên hình Trang

2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S suis 8

2.2 Cấu trúc KIT chẩn đoán nhanh 22

2.3 Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh 24

3.1 Cấu trúc vector pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega) 32

4.1 Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S suis type 2 42

4.2 Kết quả phân lâp vi khuẩn Streptococcus suis trên môi trường thạch máu cừu 5% 44

4.3 Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ khuẩn lạc 45

4.4 Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ canh khuẩn 46

4.5 Kết quả kiểm tra Streptococcus spp trên môi trường Bile Esculin agar 47

4.6 Kết quả lên men đường glucose và lactose của vi khuẩn S suis 48

4.7 Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn 48

4.8 Kiểm tra khả năng sinh indol của vi khuẩn S suis 49

4.9 Kết quả PCR kiểm tra chủng vi khuẩn TTHSS2 50

4.10 Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD của chủng TTHSS2 51

4.11 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli Top 10 52

4.12 Kết quả PCR nhân gen 6PGD trực tiếp từ khuẩn lạc trắng và kết quả các khuẩn lạc trắng PCR cùng cặp mồi M13 53

4.13 So sánh mức độ tương đồng của amino acid mã hóa từ đoạn gene 6PGD của chủng TTHSS2 và đoạn gene đã được công bố WP_012028448.1 54

4.14 Kết quả cấy vi khuẩn TTHSS2 bất hoạt cấy trên môi trường thạch máu

cừu 5% 56

4.15 Kết quả đánh giá tính an toàn của kháng nguyên TTHSS2 59

4.16 So sánh đáp ứng chuột khi được tiêm kháng nguyên S suis type 2 với các liều khác nhau 62

4.17 Đáp ứng miễn dịch của chuột được tiêm kháng nguyên S suis type 2 phối trộn với các chất bổ trợ khác nhau 65

4.18 Gel nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE của các mẫu kháng thể đã tinh sạch 68

x

4.19 Kết quả xác định nồng độ protein kháng thể bằng Pierce BCA Protein

Assay Kit 69

4.20 Đồ thị đường chuẩn BSA 69

4.21 Kết quả xác định nồng độ kháng thể sau tinh sạch 70

4.22 Kết quả ELISA xác định hiệu giá kháng thể sau tinh sạch 71

4.23 Kết quả xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano 72

4.24 Kết quả xác định pH dung dịch gold colloid thích hợp 73

4.25 Kết quả xác định nồng độ kháng thể thích hợp để gắn vàohạt vàng nano 75

4.26 Kết quả xác định nồng độ kháng thể thích hợp để gắn với dung dịch gold colloid 75

4.27 Kết quả sản xuất kháng thể cộng hợp 78

4.28 Kết quả chế tạo đệm conjugate kháng thể (conjugate pad) 78

4.29 Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp 80

4.30 Kết quả xác định độ nhạy của Kit 83

4.31 Kết quả xác định độ đặc hiệu của Kit 85

xi

TRÍCH Y ẾU LUẬN ÁN

Tên tác gi ả: Lê Quốc Việt

Tên Luận án: Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn

Chuyên ngành: B ệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã s ố: 9.64.01.02

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

M ục đích nghiên cứu

Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus suis type 2 (streptococcosis) ở lợn

Phương pháp nghiên cứu

Để nghiên cứu các nội dung: nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2; Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus

suis type 2; Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống Streptococcus suis type 2

và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 (S suis type 2) Luận án sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu CPS2 để xác định tình hình nhiễm vi khuẩn Streptococcus suis type 2 ở lợn khỏe tại một số địa điểm

giết mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế

Vi khuẩn S suis type 2 thuần chủng được phân lập bằng phương pháp cấy trên môi trường thạch máu cừu 5%, định danh bằng các phản ứng sinh hóa và phương pháp PCR với cặp mồi CPS2 Đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S suis type 2 phân lập được được xác định dựa trên gene bảo thủ 6PGD bằng phương pháp PCR và tạo dòng gene trong vector pGem T easy

Vi khuẩn S suis type 2 thuần được bất hoạt để chế tạo kháng nguyên thô bằng dung dịch formaldehyte 1% Kháng thể kháng S suis type 2 được chế tạo bằng phương pháp tiêm kháng nguyên và chất bổ trợ vào phúc mạc của chuột nhắt trắng Swiss abino Kháng thể kháng S suis type 2 thu từ huyết thanh chuột được tinh sạch bằng KIT Econo-Pac protein A (Bio-rad)

KIT phát hiện nhanh vi khuẩn được chế tạo dựa trên phương pháp sắc ký miễn dịch với kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng dung dịch gold colloid (DCN, 40nm) kết hợp với kháng thể kháng S suis type 2 Kháng thể kháng S suis type 2 và kháng thể

dê kháng chuột được phun lên màng nitrocellulose ở đường kiểm tra và đường đối chứng bằng máy Biodot XYZ3060D0003

xii

K ết quả chính và kết luận

Với kết quả PCR, kết quả xác định vi khuẩn S suis type 2 trên lợn khỏe tại Thừa

thiên Huế cho thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 của lợn phân lập tại lò mổ Bạch Yến

là 13,33%, lò mổ Bãi Dâu là 7,50% và lò mổ Xuân Phú là 6,67% Như vậy, tính tổng tỷ

lệ nhiễm S suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên Huế là 9,00%

Kết quả xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn S suis type 2 dựa trên gene bảo thủ 6PGD cho thấy đoạn gen 6PGD phân lập được có độ dài 1428 bp và có độ tương đồng 99% với gen 6PGD đã được công bố (gb|CP000407.1|)

Chủng vi khuẩn S suis type 2, đặt tên là TTHSS2 được bất hoạt bằng dung dịch formaldehyte 1% để chế tạo kháng nguyên Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng nguyên TTHSS2 có tính sinh miễn dịch cao, lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch ở chuột nhắt trắng swiss abino là 1,5x108CFU/chuột và chất bổ trợ thích hợp là Freund với liều tiêm là 400 µl/chuột (200 µl kháng nguyên+ 200 µl chất bổ trợ)

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy kháng thể kháng S suis type 2 có nồng độ

và độ tinh sạch cao Hàm lượng kháng thể thu được cao nhất là 2000 µg/ml và thấp nhất

là 100 µg/ml Kết quả ELISA xác định hiệu giá kháng thể sau tinh sạch cho thấy, hiệu giá các mẫu kháng thể kháng vi khuẩn S suis type 2 (nồng độ 1000 µg/ml, pha loãng ban đầu 10 lần) tương đối đồng đều, dao động từ 7log2 đến 8log2

Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp cho thấy pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano pH 8.0 và nồng độ kháng thể thích hợp là 360 µg/µl Nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp phun lên màng nitrocellulose là 2000 µg/ml Nồng độ vi khuẩn tối thiểu trong mẫu KIT có thể phát hiện là 5x 106 CFU/ml (5x

105 CFU trong 100 µl mẫu) KIT có độ đặc hiệu cao, không phản ứng chéo với các loài

E coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 và các chủng liên cầu không phải type 2 Độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT

lần lượt là 93,33% và 100,00% khi được so sánh với phương pháp PCR

xiii

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Le Quoc Viet

Thesis title: Development of rapid KIT for identification of Streptococcus suis type 2 in pig

Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 9.64.01.02

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

Manufacture KIT for rapid detection Streptococcus suis type 2 in pig

Materials and Methods

The dissertation focuses on the following subjects: Production of Streptococcus suis type 2 antigen; Production of Streptococcus suis type 2 (S suis type 2) specific antibody; Development conjugate-antibody against S suis type 2 and evaluation its sensitivity, specificity of rapid diagnosis KIT for S suis type 2 In order to perform

above subjects, PCR method using CPS2 specific primers was carried out to determine

the prevalence of S suis type 2 infection in healthy pigs in some slaughter sites in Thua

Thien Hue

S suis type 2 was isolated by culture on 5% sheep blood agar, biochemical

properties were characterized and PCR assay was performed using CPS2 primer

Molecular identification of S suis type 2 isolates was determined base on highly

conserved 6PGD gene by PCR and gene was cloned in the pGem-T easy vector

S suis type 2 was inactivated to produce crude antigen with 1% formaldehyde solution S suis type 2 antibodies were prepared by injection of antigen plus adjuvant to the peritoneal mucosa of the Swiss abino mice Antibody against S suis type 2 in serum

mice was purified by KIT Econo-Pac protein A (Bio-rad)

S suis type 2 rapid detection KIT was developed through immuno-affinity chromatography with conjugate-antibody created from a gold colloid solution (DCN,

40nm) supplemented S suis type 2 antibodies S suis type 2 antibodies and Anti-Mouse

IgG antibody produced in goat were sprayed onto the nitrocellulose membrane in the test line and control line by Biodot XYZ3060D0003 instrument

xiv

Main findings and conclusions

PCR results showed that the prevalence of S suis type 2 infection in healthy pigs

collected at slaughterhouse in Thua Thien Hue were 9,00% (13.33%, 7,50% and 6,67% from Bach Yen, Bai Dau and Xuan Phu laughterhouse, respectively)

Results on determination the molecular identification of S suis type 2 isolated

based on 6PGD gene showed that that the 6PGD gene was 1428 bp long and had 99% similarity with the 6PGD gene on GenBank database (gb |CP000407.1|)

The S suis type 2 strain, named TTHSS2, was inactivated with a 1%

formaldehyde solution to produce antigen The results showed that the antigen had highly immunogenicity Appropriate amount of antigen and adjuvant for hyperimunity

in swiss abino mice was 1,5x108 CFU/mice and Freund with injection dose of 400 μl/mice (200 μl antigen + 200 μl adjuvant)

SDS-PAGE showed that S suis type 2 antibodies had high concentration and

purity The highest antibody concentration was 2000 μg / ml and the lowest was 100

μg/ml The ELISA analysis indicated that titers of purified S suis type 2 antibodies

(concentration 1000 μg/ml, initial dilution 10 times) was similar, ranged from 7log2 to 8log2

Conjugate-antibody production resulted in suitable pH of the gold colloid solution

and S suis type 2 antibody concentration for binding between S suis type 2 antibodies

and gold nano were 8.0 and 360 µg/ml The appropriate conjugated antibodies concentration spray in nitrocellose membrane was 2000 μg/ml Minimum bacterial concentrations in sample could be detected by KIT was 5x106 CFU/ml (5x105 CFU in

100 μl samples) The KIT had high sensitivity and specificity with no cross-reaction

between E coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 Similar results were observed on other S suis serotype The

sensitivity and specificity of the KIT were 93.33% and 100,00%, respectively in compared to PCR method

1

PH ẦN 1 MỞ ĐẦU

Một trong những căn bệnh lây nhiễm từ thịt lợn có thể gây nguy hiểm cho con người là bệnh liên cầu khuẩn lợn Đây là một bệnh truyền nhiễm do loại liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S suis) gây ra Bệnh có thể xảy ra ở hầu hết các loài động vật máu nóng, trong đó lợn và người là chủ yếu

Dựa vào đặc điểm của các polysaccharid ở lớp vỏ bọc vi khuẩn, xác định

vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết thanh Trong đó, S suis type 2 thường gây bệnh ở người và động vật (Smith et al., 1999)

Vi khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi trong tự nhiên, ổ chứa là lợn nhà Cả lợn rừng, ngựa, chó, mèo và chim cũng có thể mang vi khuẩn liên cầu lợn Những loài động vật này mang mầm bệnh nhưng chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng mới gây nguy hiểm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

Bệnh ở lợn biểu hiện bằng viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm

phổi, viêm nội tâm mạc và viêm khớp Thông thường người bị nhiễm vi khuẩn

do tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh, lợn chết hoặc ăn tiết canh lợn, thịt lợn bệnh, lợn chết chưa được nấu chín kỹ (Lê Văn Tạo, 2005)

Con đường lây truyền từ lợn sang người có thể qua vết thương ở da, đường hô hấp, tiếp xúc với máu, các dịch tiết ở lợn bệnh hoặc qua đường ăn uống Ruồi, gián, chuột là những động vật trung gia làm phát tán mầm bệnh

(Vecht et al., 1992)

Vi khuẩn liên cầu lợn gây ra hai bệnh cảnh chính là viêm màng não và nhiễm khuẩn huyết, nặng có thể gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc Nếu không được phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời, người bệnh

có thể tử vong Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh vẫn có thể để lại những di chứng nặng nề như bị ù tai, giảm thính lực, điếc hoàn toàn… (Vecht et al., 1992)

Thời gian ủ bệnh ngắn, từ vài giờ đến 3 ngày Khi khởi phát, người bệnh

có các triệu chứng như sốt cao có thể kèm theo rét run; mệt, đau mỏi người; đau đầu, buồn nôn và nôn, đau bụng, tiêu chảy; có thể mê sảng, ngủ gà, hôn mê Những trường hợp nhiễm khuẩn huyết có thể xuất huyết dưới da, ban xuất huyết

của phản ứng miễn dịch là sự liên kết đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể để phát triển các phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Các phương pháp ELISA, phương pháp dot blot đã được ứng dụng rộng rãi trong việc chẩn đoán căn bệnh này ở các nước trên thế giới (Torremorell et al., 1997;

Okwumabua and Chinnapapakkagari, 2005; Mandanici et al., 2010) Trong

những năm gần đây, trên thế giới đã phát triển loại KIT chẩn đoán nhanh dựa trên phương pháp sắc kí miễn dịch (ICT) KIT có độ đặc hiệu, độ chính xác cao, không cần phòng thí nghiệm, không cần thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao, giúp phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp thời, giảm thiểu được thiệt hại cho người, động vật bị bệnh Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển KIT chẩn đó

nhanh như Sheng et al (2012) đã nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện khối u ở cá, Wang et al (2014) với nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện kháng thể kháng giun tròn Paragonimiasis skrjabini Tại Việt Nam, một số nhà nghiên cứu đã ứng

dụng kĩ thuật ICT để chế tạo KIT phát hiện nhanh kháng nguyên và kháng thể như Đinh Thị Bích Lân và cs (2009) với công trình nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh phát hiện kháng thể kháng kí sính trùng Toxoplasma gondii Nguyễn

Hoàng Lộc và cs (2015) với công trình nghiên cứu KIT phát hiện kháng nguyên bám dính F4 Thế nhưng chưa có tác giả nào nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 ở người và động vật Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 mang tính cấp thiết và có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn KIT chẩn đoán nhanh sẽ đáp ứng tốt nhu cầu phát hiện bệnh sớm cũng như kiểm soát tình trạng mang mầm bệnh ở gia súc, kịp thời

có biện pháp bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng, nâng cao hiệu quả chăn nuôi

3

Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn

Streptococcus suis type 2 ở lợn

Đối tượng nghiên cứu: lợn tại các lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis

type 2 phân lập được từ mẫu dịch mũi lợn

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017

Địa điểm nghiên cứu:

+ Các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế;

+ Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; + Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế

Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S suis type

2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế Mẫu vi khuẩn S suis type 2 phân

lập được phân tích đặc tính sinh học và sinh học phân tử KIT chẩn đoán S suis type 2 do đề tài nghiên cứu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả tương tự với KIT chẩn đoán S suis type 2 do Ju et al (2010) đã công bố

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu

về bệnh do vi khuẩn S suis type 2 gây ra ở lợn trong các Trường, Viện nghiên cứu chuyên ngành thú y

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài đã thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S suis type 2 trên lợn

khỏe tại các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế, đây là cơ sở để đánh giá

mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn type 2 gây ra ở người và động vật Sản phẩm KIT chẩn đoán vi khuẩn S suis type 2 có

độ nhạy và độ đặc hiệu cao thích hợp cho công tác chẩn đoán lâm sàng trên thực địa, từ đó cán bộ thú y và người làm công tác dịch tễ có thể đưa ra chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh do liên cầu lợn type 2 từ lợn và các sản phẩm của lợn

4

PH ẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên

th ế giới

2.1.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trên thế giới

Bệnh liên cầu khuẩn lợn do Streptococcus suis (S suis) gây nên, bệnh xảy

ra ở nhiều nơi trên thế giới và gây tổn thất lớn về kinh tế Bệnh liên cầu lợn cũng

có thể lây cho người Chính vì vậy nó được xếp vào nhóm các bệnh chung của người và động vật

Windsor and Elliott (1975) đã phân lập được chủng Streptococcus tương ứng với nhóm R do Moor phân lập và đề nghị gọi là Streptococcus suis type 2

Những chủng có phản ứng với huyết thanh của cả type 1 và 2 được gọi là type ½

S suis được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới tại những nơi chăn nuôi lợn

như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan và Trung Quốc… (Vecht et al., 1985; Touil et al., 1988; Yu et al., 2006)

Từ năm 1983 đến năm 1995 đã có 32 trong số 35 type Streptococcus được phân lập Hầu hết các chủng phân lập được từ lợn bệnh chỉ thuộc một số type nhất định, từ 1 – 8 Mặc dù type 2 phân lập được ở hầu hết các nước nhưng tỷ lệ

có sự sai khác giữa các vùng địa lý Chẳng hạn, ở Canada tỷ lệ phân lập được S

suis type 2 tương đối thấp (dưới 25%) (Higgins and Gottschalk, 2001) Ở Nhật,

tỷ lệ phân lập S suis type 2 cao nhất (28%) (Kataoka et al., 1993); ở Châu Âu thì

tỷ lệ này thấp nhất tại các nước Pháp, Ý và Tây Ban Nha (Smith et al., 1999;

Gottschalk et al., 2007)

Bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn gây ra ở người với 2 trường hợp viêm màng não và 1 trường hợp nhiễm trùng nặng đến mức tử vong đã được mô tả lần đầu tiên tại Đan Mạch (Perch et al., 1968) Sau đó, bệnh do vi khuẩn này dần được báo cáo tại Hà Lan, Anh và nhiều nước khác Từ đó đến nay, vi khuẩn này đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới Các trường hợp người mắc bệnh đã được thông báo ở các nước trên thế giới: Hà Lan, Đan Mạch, Đức, Bỉ, Anh, Pháp, Tây Ban Nha, Thụy Điển, Úc, Hungari, Hồng Kông, Croatia, Nhật, Singapore, Đài Loan, New Zealand,

Theo Perch et al (1983), vi khuẩn Streptococcus suis xâm nhập vào các đàn mới

bởi các lợn khỏe mang mầm bệnh trong amidan hay trong đường mũi Lợn khỏe

có thể bị bệnh viêm màng não sau vài tháng đã mang mầm bệnh trong amidan Việc nhập các lợn khỏe mang mầm bệnh (lợn cái giống, lợn đực giống và lợn cai sữa) hoặc lợn sinh ra ở những đàn mang bệnh lan truyền vi khuẩn S suis cho lợn con Lợn con mang mầm bệnh này khi phân vào chuồng nuôi sẽ gây nhiễm cho những lợn khác S suis ảnh hưởng tới lợn mọi lứa tuổi Nhưng hầu hết các trường hợp xảy ra ở lợn đều nằm giữa 3-12 tuần tuổi và đặc biệt là sau khi lợn cai

sữa được nhốt chung với nhau Các nhà nghiên cứu Anh phát hiện thấy đàn lợn giống có thể mang S suis trong amidan ít nhất 5-12 ngày

Vecht et al (1985) đã nghiên cứu các phương thức thông thường làm lan truyền vi khuẩn S suis giữa các đàn lợn là thông qua nhập lợn mang bệnh, vật môi giới và các xác chết mang vi khuẩn S suis sống trong ruồi ít nhất 5 ngày Khi ruồi tiếp xúc với thức ăn, nước uống của lợn hay giữa các đàn lợn với nhau Ruồi là môi giới truyền bệnh rất nguy hiểm Theo Windsor (1977), ruồi tự bay xa

và có thể bám trên các phương tiện “xe cộ” để đi xa nhiều hơn nữa, đó chính là điều kiện thuận lợi cho bệnh dịch lây lan

Trước những yếu tố gây lây lan mầm bệnh, biện pháp phòng bệnh bằng khâu vệ sinh chuồng trại chăn nuôi, chăm sóc nuôi dưỡng và quản lý đàn là yếu

tố vô cùng quan trọng đối với công việc chăn nuôi lợn (Vasconcelos et al., 1994)

Do tính chất nghiêm trọng của bệnh, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh do liên cầu lợn gây ra Với công trình nghiên cứu tạo dòng

và biểu hiện kháng nguyên bề mặt của liên cầu lợn type 2 vào năm 2008 Tan et

al. (2009) đã nghiên cứu thành công vắc xin phòng chống liên cầu lợn type 2 gây

bệnh ở lợn

Với mục đích phòng chống bệnh do liên cầu lợn gây ra, nhiều công trình nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập của vi

6

khuẩn S suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004)

Đặc biệt, để đáp ứng nhu cầu phát hiện nhanh kháng thể kháng kháng S

suis type 2, Yang et al (2007), đã phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT) với nguồn nguyên liệu điều chế kháng thể kháng S suis type 2 là lớp vỏ polysaccharide của vi khuẩn KIT phát hiện nhanh kháng thể kháng S suis type 2

có độ nhạy và độ đặc hiệu là 97,1% và 86,3% khi so với phương pháp ELISA

Cũng với mục đích phát hiện vi khuẩn S suis type 2 gây bệnh ở lợn, Ju et

al. (2010) đã thành công trong việc chế tạo KIT chẩn đoán nhanh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch

Hiện nay, đã có một số tác giả trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu vắc xin tái tổ hợp, vắc xin thô để phòng bệnh liên cầu khuẩn như: Li et al (2006); Tan et

al (2009) Tuy nhiên hiệu quả chưa được đánh giá đầy đủ

2.1.1.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước

Trước khả năng gây bệnh nguy hiểm của vi khuẩn liên cầu lợn, nhiều nhà nghiên cứu Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu nơi cư trú của vi khuẩn, sự lưu hành hay khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Nguyễn Như Thanh và cs (2001) đã xác định nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn là đường tiêu hoá và sinh dục Vi khuẩn S suis cũng thường xuyên phân lập được ở vòm họng và đường hô hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng, xoang mũi Những lợn khỏe mạnh mang trùng này khi nhốt chung với một đàn lợn mới chưa bị bệnh, có thể bệnh phát ra, lợn mẹ truyền cho lợn con qua đường

hô hấp, từ đó truyền cho những con khác lúc nhập đàn hay cai sữa

Trong nghiên cứu biện pháp phòng bệnh do S suis Phạm Sĩ Lăng và cs

(2002) đã chỉ ra rằng, để phòng bệnh, việc xác định và loại thải những lợn nái mang bệnh hoặc chia đàn, phân ô chuồng của một trang trại là rất cần thiết Cần chia lợn cai sữa thành các ô chuồng nhỏ để đạt được độ tăng trưởng tối đa của chúng Việc diệt trừ tận gốc mầm bệnh bằng cách giảm mật độ và nuôi trong các

ô chuồng sạch sẽ là điều kiện cần thiết và có hiệu quả Nên định kỳ di chuyển lợn

ở các ô chuồng nuôi, kết hợp với tẩy uế chuồng trại là rất cần thiết và vô cùng quan trọng trong công tác phòng chống bệnh Trong biện pháp quản lý đàn phải hạn chế tối đa các tác động do mật độ quá đông và hệ thống thông gió kém Chỉ

số về sự thông gió và sự lưu thông không khí trong các ô chuồng phải thích hợp

7

với mật độ đàn nuôi trong chuồng Nếu chỉ số thông gió kém thì chỉ số mắc bệnh

sẽ cao

Khi có dịch xảy ra phải cách ly và phân chia riêng biệt thành khu vực lợn

khỏe và lợn ốm để tránh lây lan Trong quá trình cách ly theo dõi, những lợn già yếu, ốm yếu không có hy vọng chữa khỏi thì phải loại sớm để tạo điều kiện thu hẹp và thanh toán sớm được đàn lợn bị bệnh Trong quá trình theo dõi, cách ly tuyệt đối không được nhập lợn mới vào, phải thường xuyên tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các loại sát trùng Crezil, dung dịch xút (Nguyen Thi Hoang Mai

et al , 2008; Tran Vu Thieu Nga et al., 2011)

Hiện có 2 type liên cầu lợn thường gây bệnh ở lợn, type 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, type 2 gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau Cả 2 type này đều cư trú ở amidal Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

Lê Văn Tạo (2005) đã công bố nghiên cứu về sự lan của vi khuẩn S Suis

type 2 từ lợn bệnh sang người và cho rằng S suis type 2 có thể tồn tại kéo dài hơn 1 năm tại amiđan của lợn mang mầm bệnh kể cả khi được điều trị bằng penicilline

Vi khuẩn S suis thường xuyên được phân lập trên lợn khỏe là một trong những cảnh báo về khả năng lây nhiễm bệnh từ lợn cho người chăn nuôi, người tham gia công tác giết mổ, cũng như người tiêu dùng

Hiện nay, các nghiên cứu tại tỉnh Thừa Thiên Huế chỉ có báo cáo về sự lưu hành của vi khuẩn S suis trên lợn khỏe Theo Bùi Thị Hiền và cs (2016), tỷ lệ nhiễm S suis trên lợn khỏe là 17,31%

Vào thập niên 1950, tại Anh và Hà Lan, các nhà nghiên cứu thuộc ngành thú y phát hiện được một tác nhân thuộc nhóm vi khuẩn S suis gây viêm màng não và viêm khớp ở lợn (Vecht et al., 1985; Sihvonen et al., 1988) Đây là nhóm liên cầu được xếp vào nhóm D theo phân loại của Lancefied và được đặt tên là

Streptococcus suis (Streptococcus nghĩa Latin là liên cầu khuẩn, suis nghĩa là

lợn) Ngày nay, nhiễm Streptococcus suis ở lợn được ghi nhận tại Mỹ, Canada,

các nước Tây Âu, Nhật, Trung Quốc, Hồng Công Streptococcus suis gây bệnh

ở lợn bao gồm triệu chứng viêm màng não mủ, nhiễm trùng huyết, viêm phổi,

Hình 2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S suis

Nguồn: Hughes et al (2009)

Các vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là dưới dạng hình cầu Ở môi trường nuôi cấy có 5% huyết thanh hình thái chuỗi được nhìn thấy rõ nhất

Vi khuẩn làm tiêu bản trực tiếp từ động vật có hình cầu Nhưng ở môi trường phân lập ban đầu, có thể nhầm với trực khuẩn ngắn Vi khuẩn bắt màu dễ dàng với một số loại thuốc nhuộm thông thường, với thuốc nhuộm Gram, chúng bắt

màu Gram (+) (Mahon et al., 2000; Tan et al., 2008a)

9

2.2.2 Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa

Vi khuẩn S suis là những vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, liên cầu khuẩn lợn mọc thành những khóm nhỏ với đường kính khoảng 0,5-1 mm, màu xanh nhạt hay trong suốt và nhầy nhưng không mọc được trong dung dịch có chứa 6,5% NaCl… (Đỗ Ngọc Thuý và cs., 2009)

Vi khuẩn S suis gây bệnh thích hợp ở nhiệt độ 37ºC (có thể phát triển rộng

từ 10ºC - 45º C, pH thích hợp từ 7 – 7.2) và phát triển trên nhiều loại môi trường:

- Môi trường nước thịt: Vi khuẩn S suis hình thành hạt hoặc những bông,

rồi lắng xuống đáy ống Sau 2 giờ nuôi cấy môi trường trong, đáy ống có cặn

- Môi trường thạch thường: Vi khuẩn S suis hình thành khuẩn lạc dạng S,

khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám

- Trên môi trường đặc: Có thể quan sát thấy khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy với kích thước khoảng 1 - 2 mm Sau 72 giờ thì kích thước khuẩn lạc lớn nhất, có thể đạt tới 3 - 4 mm Nếu được nuôi trong điều kiện có 5 - 10% CO2 thì khuẩn lạc

sẽ phát triển nhanh hơn và rộng hơn Khuẩn lạc thường tạo chất nhầy mạnh, độ nhầy càng rõ và tăng nếu như vi khuẩn được nuôi cấy vài giờ vào môi trường 32 nước thịt có bổ sung huyết thanh trước khi cấy sang môi trường đặc hoặc thạch máu Dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch thường nhỏ và khô hơn trên môi trường có bổ sung dinh dưỡng (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001; Phạm Sỹ Lăng

và cs., 2005)

- Trên môi trường MacConkey: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim (Trịnh Phú Ngọc và cs., 1999; Phạm Sỹ Lăng và cs., 2005)

- Trên môi trường thạch máu: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tròn, gọn, hơi

vồng, sáng trắng, mịn, dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy Đặc biệt, trên môi trường này, dựa vào tính chất dung huyết, người ta thấy liên cầu có 3 type khuẩn lạc khi quan sát ở độ phóng đại gấp 60 lần (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

+ Type anpha (α): khuẩn lạc được bao quanh một vòng hồng cầu còn nguyên hình nhưng màu xanh, xa khuẩn lạc một chút có một vong tròn tan máu; + Type beta (β): bao quanh khuẩn lạc là một vòng tan máu hoàn toàn trong suốt có bờ rõ ràng;

Dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch thường nhỏ và khô hơn trên môi trường có bổ sung chất dinh dưỡng Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch máu dạng nhỏ hơi vồng trắng trong, rìa gọn, màu vàng chanh hoặc vàng thẫm Đa số

vi khuẩn gây bệnh cho lợn đều gây dung huyết khi nuôi cấy trên thạch máu cừu,

bò, dê, S suistạo dung huyết dạng α và β (Biền Văn Minh, 2003)

Vi khuẩn S suis có khả năng lên men các loại đường glucoza, lactoza, saccaroza, trehaloza, maltoza, fructoza, không lên men các loại đường: sorbit, dextroza, mannit, xyloza, glycerol, innulin Tính chất không lên men đường

innulin là đặc tính để phân biệt tính chất độc của chủng gây bệnh (Smith et al.,

1999)

S suis có thể tăng trưởng ở kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng không thể tăng

trưởng ở 6,5% dung dịch NaCl S suis không chứa men catalaza và oxidaza vì

vậy phản ứng catalaza (-), oxidaza (-), phản ứng indol (-) Vi khuẩn không di động Vi khuẩn có kháng nguyên giáp mô và sinh ra hai loại men streptokinaza (diệt bạch cầu), hyaluronidaza phân hủy acid hyaluronic gây nhão mô (Biền Văn Minh, 2003)

2.2.3 S ức đề kháng

Enright et al (1987) khẳng định rằng nhóm vi khuẩn không hình thành nha

bào, đa số hình thành giáp mô, sự hình thành giáp mô có thể xác định được khi vi khuẩn sinh sống trong các mô hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh

S suis có thể sống được ở điều kiện nhiệt độ 60oC trong vòng 10 phút, ở nhiệt độ 50oC trong 2 giờ và sống trong xác súc vật đến 6 tuần ở 10oC S suis

type 2 có thể tồn tại trong phân, trong bụi Ở 0oC tồn tại trong phân đến 104 ngày

và tồn tại trong bụi 54 ngày Khi nhiệt độ ở 9oC sống trong phân là 10 ngày và sống trong bụi là 25 ngày Nhưng vi khuẩn S suis type 2 này không thể tồn tại

11

trong bụi ở nhiệt độ phòng lâu tới 24 giờ Các chất sát trùng thông thường nồng

độ thấp có thể làm cho vi khuẩn Streptococcus chết nhanh chóng hơn so với các

vi khuẩn thông thường khác (Lun et al., 2007) Cụ thể là các chất sát trùng như:

Phenol, iod, hypochloride, acid phenic 3-5%, vi khuẩn bị diệt trong vòng 3-5 phút, formol 1% vi khuẩn bị diệt trong vòng 60 phút; cồn nguyên chất không có tác dụng đối với vi khuẩn Cồn 70o vi khuẩn bị diệt trong vòng 30 phút, tím Genetian 1/300.000 có tác dụng diệt vi khuẩn (Trịnh Phú Ngọc và cs., 1999)

Vi khuẩn S suis rất mẫn cảm với các loại thuốc kháng sinh: penicillin, oreomycin, tetracylin, sulfadiazin, optoclin Vi khuẩn sống lâu trong đờm, chất bài xuất có protein, trái lại vi khuẩn chết nhanh chóng trong môi trường nuôi cấy,

vì vậy cần phải cấy chuyển luôn khi cần giữ giống cho nghiên cứu, sản xuất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987)

2.2.4 C ấu trúc kháng nguyên

Liên cầu có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Có rất nhiều loại kháng

nguyên đã tìm thấy ở các liên cầu khuẩn S suis được xếp vào nhóm D theo phân

loại của Lancefied Có tổng cộng 35 type đã được mô tả, dựa trên phản ứng huyết thanh học chống lại polysaccharide Type 2 được xem xét độc nhất và thường xuyên nhất Các chủng S suis đã được mô tả, dựa trên cấu trúc kháng nguyên polysaccharide của giáp mô (ký hiệu từ 1 đến 34 và 1/2) (Mahon et al., 2000) Trước đây có một số nhầm lẫn đến danh pháp của nhóm R và S sau nhận ra

nó thuộc nhóm D theo Lancefield và phân loại lại đó là S suis type 1 (nhóm S

trước đây) và S suis type 2 (nhóm R trước đây) Vài năm sau khi này, nhóm RS

và T cũng đã được phân loại lại như type 1/2 và 15 (Rappuoli et al., 2002)

• Kháng nguyên thân

Kháng nguyên này do Lancefield phát hiện năm 1928 (Perch et al., 1983), những liên cầu khác nhau có cấu tạo Polyozit hay chất “C” khác nhau, dựa vào

đó người ta chia liên cầu thành các nhóm A, B, C, D… R

Nhóm huyết thanh gây bệnh phổ biến ở người là là nhóm A, B, C, D và G, hiếm gặp là nhóm E, L, P, U và V

Liên cầu A: loại vi khuẩn hay gặp nhất, thường cư trú ở họng vật chủ

Liên cầu B: Cư trú ở họng, âm đạo, ruột gây nhiễm trùng nghiêm trọng cho

xương khớp (Fittipaldi et al., 2009)

Liên cầu D: Cư trú ở ruột, đề kháng với nhiều loại kháng sinh, gây nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim bán cấp, viêm tai, viêm xoang, viêm màng phổi (Reams et al., 1994)

Liên cầu G: Cư trú vùng hầu họng, da, âm đạo, gây nhiễm trùng sau đẻ, vết

thương, viêm màng trong tim (Reams et al., 1994)

Thành phần kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng, quyết định tính độc lực của vi khuẩn S suis và nó nằm ở thành vi khuẩn Thành tế bào vi khuẩn gồm

3 lớp (Reams et al., 1994)

+ Lớp ngoài chứa acid và Protein là kháng nguyên M, T, R…, Map (M-a otated protein) SOF (Serua oparty faetor) Phía ngoài cùng của lớp này thường chứa các fimbriae;

+ Lớp giữa có chứa Polysaccharide;

+ Lớp trong cùng là Peptidoglycan

• Kháng nguyên giáp mô

Ở nhóm A: Giáp mô chứa acid Hyaluronic bao gồm N - axetyl glucosamine

và acid glucoronic

Ở nhóm O: Giáp mô có thành phần Polysaccharide theo phân loại huyết thanh học gọi là Ia, Ig, II và III

• Kháng nguyên bám dính

Theo Jacques et al (1990) Vi khuẩn S suis là một trong số ít các loại vi

khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên bám dính của vi khuẩn S suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đường kính khoảng 2 nm, và dài lên đến 250 nm

Fimbriae: có Lipoteibic acid (LTA) giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu

mô và ở tế bào lympho đa nhân (P & N) có điểm tiếp nhận (receptor) tương ứng

13

với LTA trong quá trình thực khuẩn (phagocitosin) Protein M là yếu tố độc lực chống lại quá trình thực khuẩn và là kháng nguyên đặc hiệu của S suistype A Kháng nguyên T và R là yếu tố ức chế rất quan trọng trong phân loại S suis (Sihvonen et al., 1988)

2.2.5 Kh ả năng gây bệnh

2.2.5.1 Nguồn bệnh

Liên cầu lợn luôn có mặt trong môi trường và ký sinh bình thường ở lợn nhưng không gây bệnh, hoặc chỉ gây các bệnh viêm nhiễm không thành dịch như viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi Liên cầu lợn chủ yếu sống ở các loài lợn đã thuần hoá, nhưng đôi khi cũng tìm thấy ở các loài lợn rừng, ngựa, chó, mèo và chim

Nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn là ở đường hô hấp trên đặc biệt là ở mũi, đường tiêu hoá và sinh dục Hiện có 2 type liên cầu lợn thường gây bệnh ở lợn, type 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, type 2 gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau Cả 2 type này đều cư trú ở amidal Lợn trưởng thành có

tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

Vi khuẩn S suis cũng thường xuyên phân lập được ở vòm họng và đường

hô hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng, xoang mũi Những lợn khỏe mạnh mang trùng này khi nhốt chung với một đàn lợn mới chưa bị bệnh, có thể bệnh phát ra, lợn mẹ truyền cho lợn con qua đường hô hấp, từ đó truyền cho những con khác lúc nhập đàn hay cai sữa (Almeida et al., 2006)

2.2.5.2 Đường lây truyền

Vi khuẩn liên cầu lợn có thể tồn tại lâu trong phân, nước, rác Vì thế, môi trường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền bệnh của vi khuẩn Bệnh lây truyền qua đường hô hấp do lợn khoẻ hít thở không khí có mầm bệnh, do tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khoẻ, do lợn ăn phải thức ăn và nước uống có mầm bệnh Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua các vết thương, các vết trầy xước

để gây bệnh Dịch bệnh ở lợn thường bùng phát khi có các yếu tố thuận lợi như chuồng trại quá chật chội, đàn lợn quá đông, thiếu thông khí hoặc khi lợn cai sữa Tình trạng lợn lành mang mầm bệnh không có bất cứ triệu chứng gì có thể là nguyên nhân gây lây lan dịch bệnh thầm lặng và nguy hiểm Một con đường lây

người ăn tiết canh lợn… (Vecht et al., 1992; Tan et al., 2008a; Đỗ Ngọc Thuý và

2.3.1 Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn

Triệu chứng của các thể bệnh do vi khuẩn S suis gây ra rất phức tạp, khó nhận biết và khó phân biệt khi mà bệnh có hiện tượng bội nhiễm, kế phát bởi một

số vi khuẩn khác (Mahon et al., 2000)

Theo Sanford and Tilker (1982), S suis gây dung huyết kiểu β thường

xuyên phân lập được từ phổi bị viêm của lợn lớn, lợn cai sửa và lợn con đang bú,

từ lợn bị viêm phế quản phổi, viêm màng não có triệu chứng thần kinh

Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993), đã điều tra

hệ vi khuẩn đường hô hấp của 162 lợn bị bệnh ho thở truyền nhiễm thấy tỷ lệ nhiễm S suis chiếm 74%

Nghiên cứu trong gây bệnh thực nghiệm và quan sát trong các ổ dịch, thường thấy lợn từ 1-3 tuần tuổi, lợn đang bú có triệu chứng ủ rủ, ăn kém sưng hầu nuốt khó, đi lại khó khăn, lông khô dựng đứng, da mẩn đỏ và sốt Lợn ở lứa tuổi này thường gặp biểu hiện viêm màng não Triệu chứng viêm màng não làm cho con vật hoạt động khó khăn đi lại loạng choạng, khi nằm biểu hiện tư thế bơi chèo, tê liệt Tuy vậy sự thay đổi bệnh tích đại thể ở não không phải là luôn luôn

tử (Hoàng Văn Năm, 2009)

Nhiễm trùng máu Streptococcus suis ở lợn con mới sinh gây “hội chứng ủ rủ” Những lợn mới sinh hoàn toàn khỏe mạnh nhưng sau 1-2 ngày có hiện tượng ngừng bú, sờ vào thấy lạnh và chết sau 12-24 giờ sau khi sinh Hội chứng “lợn ủ rủ” có thể nhầm lẫn với đói ăn (Hoàng Văn Năm, 2009)

Lợn giống nhiễm S suis thường ít thấy triệu chứng, tuy nhiên một số đàn giảm tỷ lệ đẻ từ 85% xuống 70% Phân lập được S suis từ phôi thai chết lưu cũng như từ tử cung lợn nái bị nhiễm bệnh (Khương Thị Bích Ngọc, 1996)

Tóm lại, lợn bị liên cầu khuẩn có thể có các biểu hiện sau: da lợn có thể có các màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp

bị sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề, dịch não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có mủ, viêm phế quản, viêm phổi Vi khuẩn có thể gây các bệnh ở lợn là viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi, bại huyết, bệnh đường tiêu hoá, viêm khớp, xuất huyết ở da, gây sẩy thai và gây chết đột tử ở lợn Lợn mắc bệnh thường có triệu chứng sốt cao 40 – 41,5oC, lợn trở nên ủ rũ, biếng ăn, có biểu hiện thần kinh như run rẩy, đứng không vững, liệt, ngoài ra còn có biểu hiện khác như viêm khớp, viêm khí quản, viêm phổi và bị chết đột ngột Các lợn bệnh này khi mổ khám xét nghiệm, thấy toàn bộ cơ quan nội tạng xuất huyết, tụ huyết, viêm dính (Tan et

- Thể viêm não tuỷ: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn đục;

- Thể viêm họng, viêm phế quản, viêm phổi: hạch amidan sưng, tụ máu, niêm mạc phế quản tụ huyết, niêm mạc mũi có màng giả, tiểu phế quản và phế nang viêm có dịch thẩm xuất, có mủ và bọt khí; hạch phổi sưng, tụ huyết Lợn bị bệnh thể phổi gây ra bệnh tích ở phổi có các mức độ biểu hiện khác nhau từ viêm phổi - màng phổi dạng nhục hoá đến viêm phổi dạng fibrin có mủ (Lê Văn Tạo, 2007);

- Thể viêm hạch: hạch hầu, hạch trước vai, trước đùi sưng tụ huyết ở giai đoạn đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu

Lợn chết do Streptococcus suis type 2, bệnh tích đại thể, vi thể bao gồm một hoặc nhiều ổ viêm tương mạc hóa mủ, viêm phổi và màng phổi xuất huyết hoặc viêm tơ huyết, viêm màng não mủ, viêm cơ tim thoái hóa xuất huyết, viêm

van tim hai lá (Tan et al., 2008b) Trong trường hợp viêm màng não, dịch não tủy

bị đục, xung huyết và viêm màng não tích tụ thể trắng, ổ mủ ở vùng dưới nhện Hầu hết các trường hợp dưới võng mạc nội mô bị ảnh hưởng nặng, các mạch máu

ở tâm thất, não và tủy sống bị tắc nghẽn do dịch thẩm xuất, nhiều khi gây ra phù não Mô thần kinh của tủy sống, tiểu não và cuống não có biểu hiện thoái hóa dạng lỏng (Lê Văn Tạo, 2005)

2.3.2 Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S suis gây ra ở người

Nhiễm Streptococcus suis có thể gây ra những bệnh rất nặng và nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân S suis không chỉ là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm khớp ở lợn mà còn gây viêm nội tâm mạc ở người, một số trường hợp tiến triển tối cấp rất nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc khuẩn gây suy đa phủ tạng và tử vong mà không kịp điều trị gì Thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến 3 ngày Người mắc liên cầu lợn chủ yếu chia làm hai thể là thể tối cấp và thể viêm màng não (Arends and Zanen, 1988)

17

Ở thể tối cấp, bệnh nhân thường bị nhiễm trùng huyết, sốt cao, nhanh chóng xuất hiện các tử ban (xuất huyết hoại tử dưới da) Các tử ban này nhanh chóng lan khắp người kèm theo tình trạng choáng, sốc, tụt huyết áp, suy chức năng hô hấp, tuần hoàn, thận, gan và nhanh chóng tử vong Từ khi xuất hiện dấu hiệu bệnh đến khi tử vong có thể chỉ từ 1 – 2 ngày (Arends and Zanen, 1988)

Hội chứng sốc nhiễm độc có thể xảy ra đối với bệnh nhân nhiễm liên cầu lợn, gây tổn thương nghiêm trọng các cơ quan nội tạng trong cơ thể như gan, thận, hệ tuần hoàn, ảnh hưởng rất xấu tới việc cứu sống bệnh nhân Hội chứng sốc nhiễm độc chỉ có thể điều trị được với kháng sinh và trong điều kiện chăm sóc đặc biệt Bệnh nhân mắc thể viêm màng não thường có biểu hiện sốt cao, đau đầu, nôn (Arends and Zanen, 1988)

Kiểm tra dịch ở tủy thấy nước đục Bệnh nhân có thể đi vào hôn mê, không thấy xuất huyết bên ngoài Những bệnh nhân viêm màng não, nếu phát hiện sớm có thể điều trị kịp thời, nhưng nếu để muộn có thể dẫn đến phù não, tử vong hoặc để lại các di chứng thần kinh nặng nề như động kinh, ngớ ngẩn…

(Tan et al., 2008a)

Đối với đàn lợn bị bệnh, chẩn đoán chủ yếu dựa vào các biểu hiện trên lâm sàng cũng như đặc điểm dịch tễ học có thể gợi ý nhiễm trùng do liên cầu lợn Đối với người bệnh, chẩn đoán lâm sàng chủ yếu dựa vào các yếu tố dịch tễ học và triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng để có hướng xử trí kịp thời

Các triệu chứng lâm sàng thường thấy là: sốt cao, chết đột ngột, khó thở, có triệu chứng thần kinh do viêm não, mắt đỏ và đặc biệt là đi lại khó khăn do viêm khớp

Mổ khám thường thấy phù thủng ở não, tụ máu ở não và màng não, có nhiều dịch não tủy màu đục Xác chết thường có màu đỏ, nhu mô và các hạch bạch huyết sưng; viêm đa khớp có mủ, bao hoạt dịch có dày lên; viêm nội tâm mạc; viêm phổi (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2018)

Chẩn đoán phòng thí nghiệm về vi sinh vật học đối với liên cầu lợn hiện nay vẫn còn nhiều khó khăn Phương pháp chủ yếu là chẩn đoán trực tiếp, tiến hành lấy bệnh phẩm ở lợn bệnh như máu, dịch mũi, dịch não tủy, dịch ổ khớp…

để nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Tiến hành khảo sát trực tiếp bằng phương pháp nhuộm Gram, phát hiện cầu khuẩn Gram dương xếp thành chuỗi hoặc đứng đôi

18

Sau khi chẩn đoán xác định vi khuẩn, có thể cần tiến hành thử nghiệm PCR (TCVN 8400-2:2010)

2.4.1 Ch ẩn đoán bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR đã được Silva et al (2006) sử dụng với cặp mồi CPS2 đặc

hiệu cho việc xác định đoạn gene có kích thước 498 bp để xác định vi khuẩn

Streptococcus suis type 2 trong mẫu bệnh phẩm

Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, việc áp dụng kĩ thuật polymerase chain reaction (PCR) để chẩn đoán bệnh cho động vật ngày càng rộng rãi, phương pháp này cho sự chính xác cao (Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2007)

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng

PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase

để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng PCR cho phép khuếch đại theo

hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn ADN có chiều dài từ 200 - 3.000 bp Đoạn ADN được khuếch đại (ADN đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (Oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide

Nguyên t ắc của PCR

Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn ADN mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP

và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn ADN nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn ADN mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn ADN nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng Primer ở bên trái tác động trên sợi ADN 3’5’ được gọi là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F) Primer ở bên phải tác động trên sợi ADN 5’3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R)

Phương pháp PCR được ứng dụng nhiều trong việc chẩn đoán bệnh do liên cầu lợn type 2 gây ra như Silva et al (2006) đã ứng dụng phương pháp PCR để

xác định vi khuẩn S suis type 2 trong mẫu với cặp mồi đặc hiệu CPS2 Trong

một nghiên cứu khác về phương pháp chẩn đoán, Tran Vu Thieu Nga et al

mặt HP0245 của vi khuẩn S suis type trong nghiên cứu chế tạo vắc xin tái tổ

hợp

2.4.2 Ch ẩn đoán bằng phương pháp ELISA

Việc sử dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh đã được áp dụng rộng rãi từ lâu trong nước và trên thế giới ELISA có nhiều loại nhưng nhìn chung đều dựa theo nguyên lý kết hợp đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể Người ta dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzyme, rồi cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên (Tan et al., 2008b)

Hiện nay, trên thị trường thế giới đã có một số công ty cung KIT ELISA chẩn đoán bệnh S suis type 2 như Wuhan Unibiotest Co.,Ltd; công ty antibodies-online

2.5 ĐIỀU TRỊ

2.5 1 Điều trị bằng thuốc kháng sinh

Trước hết là điều trị hỗ trợ với các biện pháp hồi sức tích cực

Bệnh Liên cầu lợn là bệnh do vi khuẩn gây ra nên kháng sinh vẫn là thuốc điều trị đặc hiệu, trong đó penicillin là thuốc được lựa chọn để điều trị bệnh này Tuy nhiên tình trạng kháng penicillin của vi khuẩn cũng đã được ghi nhận Trong trường hợp vi khuẩn đã kháng penicillin, các kháng sinh khác thuộc nhóm beta

lactamin được thay thế để điều trị cho bệnh nhân (Tan et al., 2008b)

Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh luôn đem lại kết quả tốt Khi dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm, chỉ có hiệu quả tốt khi con vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng Nếu điều trị muộn thì hiệu quả sẽ

20

rất kém hoặc không có hiệu quả (Phạm Sĩ Lăng và cs., 2002; Hoàng Văn Năm, 2009)

2.5 2 Điều trị bệnh bằng huyết thanh

Ngoài việc dùng kháng sinh và các hóa dược để điều trị bệnh do

Streptococcus suis gây ra, thì việc dùng huyết thanh đặc hiệu để điều trị đã được các nhà khoa học trên thế giới đề cập đến từ lâu và nhiều nước đã dùng huyết

thanh đặc hiệu điều trị bệnh do S suis gây ra có hiệu quả tốt (Khương Thị Bích

Ngọc, 1996)

Huyết thanh đặc hiệu dùng để điều trị bệnh thường giá thành rất cao, cho nên trong chăn nuôi, huyết thanh thường được dùng điều trị trong những trường hợp cần thiết và đối với những con vật quý, hiếm, có giá trị kinh tế cao (Lê Văn Tạo, 2005)

2.6 GI ỚI THIỆU VỀ HẠT NANO VÀNG VÀ KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH

do trong phân tử nano vàng không hấp thụ ánh sáng có bước sóng nằm trong vùng quang phổ như các miếng vàng khối thông thường

2.6.2 K ỹ thuật sắc ký miễn dịch

2.6.2.1 Giới thiệu

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA)) dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện Đây là công nghệ được

21

mở rộng từ kỹ thuật ngưng kết hạt latex lần đầu tiên được phát triển vào năm

1956 bởi Singer and Plotz (1956) KIT chẩn đoán nhanh thực chất là một thiết bị dùng để kiểm tra thiết kế theo kiểu onestep và dễ dàng sử dụng Ưu điểm nổi bật

của thiết bị này là thời gian kiểm tra nhanh, giá thành rẻ và đặc biệt người sử dụng không đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao do đó nó phù hợp cho những ứng dụng cách xa phòng thí nghiệm Thiết bị KIT chẩn đoán nhanh cho kết quả của phép thử có hoặc không Hơn nữa, que thử có thể được bảo quản trong thời gian dài

mà không cần đến tủ lạnh, điều này mang lại hiệu quả đối với những khu vực thiếu thốn thiết bị (Singer and Plotz, 1956)

Do tiện ích sử dụng, trên cơ sở kỹ thuật ICA, người ta đã xây dựng thành bộ KIT ICT (immunochromatographic test), có hai loại KIT: loại sử dụng kháng thể gắn cộng hợp phát hiện kháng nguyên và loại sử dụng kháng nguyên gắn cộng hợp phát hiện kháng thể

Ứng dụng kĩ thuật ICT, trên thế giới có rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và chế tạo ra các loại KIT chẩn đoán nhanh phục vụ công tác phòng và trị bệnh cho người và động vật như Krajaejun et al (2009) với nghiên cứu KIT phát hiện nhanh kháng thể kháng Pythium insidiosum gây bệnh ở Sheng et al (2012) trong nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh virus gây khối u ở cá (Lymphocystis

disease virus) Wang et al (2014) đã chế tạo KIT phát hiện nhanh kháng thể

kháng giun tròn Paragonimus skrjabini ký sinh ở người

Tại Việt Nam hiện nay, việc nghiên cứu KIT phát hiện nhanh mầm bệnh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch đã được quan tâm Nhiều công trình nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh đã được thực hiện như Đinh Thị Bích Lân và cs (2009) với công trình nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh phát hiện kháng thể

kháng kí sính trùng Toxoplasma gondii Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2015) với

công trình nghiên cứu KIT phát hiện kháng nguyên bám dính F4 của vi khuẩn E

coli Phạm Đức Minh và Hoàng Văn Lương (2016) đã thành công trong công trình nghiên cứu KIT phát hiện độc tố vi khuẩn tả Vibrio cholera, KIT có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi so sánh với phương pháp ELISA Nguyễn Thị Tâm

Thư và cs (2016) đã công bố công trình nghiên cứu KIT phát hiện vi khuẩn E

coli trong nước thải sinh hoạt Tuy nhiên, chưa có công trình nào nghiên cứu về

phương pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn S suis type 2

22

2.6.2.2 Cấu tạo của KIT chẩn đoán nhanh

Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng nitroncellulose (NC), đệm mẫu (sample pad), đệm kháng thể cộng hợp (conjugate pad) và đệm hút (adsorbent pad) Màng NC được phun 2 loại kháng thể khác nhau tạo thành 2 đường song song là đường kiểm tra (vạch T) và đường đối chứng (vạch C) Có 3 loại kháng thể: i) Kháng thể 1 là kháng thể kháng lại với một epitope của kháng nguyên cần phát hiện, sản xuất trên chuột; ii) Kháng thể 2 là kháng thể kháng lại với một epitope khác của cùng kháng nguyên cần phát hiện; iii) Kháng thể 3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột, sản xuất trên dê (goat anti-mouse IgG antibody), có khả năng kết hợp với bất kỳ kháng thể nào có bản chất cấu trúc là immunoglobulin IgG Ngoài ra, thành phần tham gia KIT còn có đệm kháng thể cộng hợp (conjugate), đó là hạt vàng (colloidal gold particle), được gắn vào với cấu trúc kháng thể 1 Đệm mẫu được xếp gối lên trên đệm kháng thể cộng hợp, rồi đệm kháng thể cộng hợp được xếp chồng dính với màng nitrocellulose, đệm kháng thể cộng được hợp bố trí một lượng kháng thể gắn cộng hợp với hạt vàng

ở dạng khô; tại vạch T bố trí cố định kháng thể 2 ở dạng khô; và tại vạch C cũng được bố trí cố định kháng thể cũng ở dạng khô, bình thường cả hai vạch này đều không nhìn thấy được (hình 2.2)

Hình 2.2 C ấu trúc KIT chẩn đoán nhanh

Nguồn: O’Farrell (2008)

23

2.6.2.3 Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả

Mẫu bệnh phẩm xử lý bằng dung môi phù hợp được nhỏ vào đệm mẫu (sample pad) Toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía đệm hút (Hình 2.3) Có 2 trường hợp kết quả sẽ xảy ra

a) Nếu trong mẫu kiểm tra có kháng nguyên (KN) tương ứng thì kháng nguyên sẽ kết hợp với kháng thể trong kháng thể cộng hợp (KT1(Au)) để tạo thành phức hợp kháng thể cộng hợp-kháng nguyên (KT1(Au)KN) Sau đó huyễn dịch và phức hợp KT1(Au)KN sẽ cùng chuyển dịch đến đường kiểm tra Tại đường kiểm tra, phức hợp này kết hợp tiếp với kháng thể 2 tạo thành phức hợp KT1(Au)KN+KT2, nghĩa là kháng thể 2 được cố định ở vạch T đã tóm bắt được kháng nguyên có ở phức hợp KT1(Au)KN làm cho hạt vàng cộng hợp với kháng thể 1 tích tụ lại và hiển thị Các phân tử kháng thể cộng hợp không được gắn với kháng nguyên còn lại tiếp tục dịch chuyển đến vạch C, tại đây, phức hợp kháng thể 3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa kháng thể là kháng thể kháng lại IgG của chuột với kháng thể có bản chất là IgG của chuột Hạt vàng cộng hợp với kháng thể 1 cũng được tích tụ lại và hiển thị, về nguyên tắc, sự hiển thị này bao giờ cũng được hình thành, cho dù bệnh phẩm có kháng nguyên hay không có kháng nguyên

b) Nếu trong mẫu kiểm tra không có kháng nguyên tương ứng (KN) thì huyễn dịch dung môi trong mẫu bệnh phẩm vẫn sẽ hoạt hóa KT1(Au) và lúc này,

do không có KN để kết hợp với (KT1(Au)) nên phức hợp KN+KT1(Au) không được tạo thành KT1(Au) đi xuyên qua vạch T mà không bị KT2 giữ lại, nên tiếp tục chuyển dịch đến vạch C Tại vạch C, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột, có vai trò như là một kháng nguyên, do đó, hạt vàng cộng hợp với KT1 được tích tụ lại và hiển thị

Như vậy: khi cả hai vạch T và C hiển thị thì kết quả đánh giá là dương tính

và đã phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm; ii) khi chỉ có một mình vạch C hiển thị thì kết quả đánh giá là âm tính do trong mẫu bệnh phẩm không có mặt của kháng nguyên Trường hợp cả hai vạch không hiển thị, phản ứng không được đánh giá và cần thiết phải làm lại Không để phản ứng quá

24

lâu (trên 30 phút) mới đánh giá, vì có thể phát sinh phản ứng phụ làm sai lệch kết quả

Toàn bộ thời gian thực hiện phản ứng chính thức chỉ khoảng 5-10 phút Cho

dù là kháng nguyên hòa tan (dạng polypeptide) hay kháng nguyên liên kết bề mặt của vi sinh vật, bộ sinh phẩm ICT đều cho phản ứng hoạt động chính xác

Hình 2.3 Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh

Nguồn: Lee et al (2013)

Màng có thể được chế tạo từ nitrocellulose (Lönnberg and Carlsson, 2001;

Oku et al., 2001), polyethersulfone (Kalogianni et al., 2007) hoặc polyethylene (Khlebtsov et al., 2003) Dạng màng phổ biến nhất được sử dụng là

nitrocellulose với kích thước ống nhỏ trong màng là 0,05 đến 12 µm Đệm mẫu được gắn ở phần cuối của màng và thường được làm từ cellulose hoặc cross-linked silica Đệm kháng thể cộng hợp được gắn ở vị trí tiếp xúc với đệm mẫu và màng Chất dùng để đánh dấu hoặc các thành phần dùng cho việc nhận biết mẫu

25

phân tích được làm khô trên khu vực này, sẽ tương tác đặc hiệu với vật liệu có trong mẫu phân tích lỏng Các chất đánh dấu cho việc phát hiện có thể là các hạt nano vàng (Au), các hạt latex khô (Gussenhoven et al., 1997), selenium, carbon, hoặc liposome (Zaytseva et al., 2004)

Việc sử dụng các hạt nano được công bố lần đầu tiên bởi Leuvering vào năm 1980 và ngày nay chúng được sử dụng phổ biến cho việc đánh dấu Đối với việc phân tích một đối tượng cụ thể, hai vạch được cố định lên màng: một vạch kiểm tra (test line) cho ra kết quả kiểm tra và vạch kiểm soát (control line) dùng

để xác nhận chất phân tích đã chảy qua màng phân tích Đối với phép kiểm tra cho nhiều đối tượng khác nhau, có thể sử dụng nhiều vạch kiểm tra khác nhau Chất lỏng di chuyển ngược lên màng do lực mao dẫn của màng và dừng lại ở absorbent pad ở đầu cuối của màng (Leuvering et al., 1981)