Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh streptococcus suis type 2 ở lợn tt

suis type 2 trên lợn khỏe tại các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế, đây là cơ sở để đánh giá mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn type 2 gây ra

H ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ QU ỐC VIỆT

1

Công trình hoàn thành t ại:

H ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: 1 PGS.TS ĐINH THỊ BÍCH LÂN

2 PGS.TS BÙI TR ẦN ANH ĐÀO

Ph ản biện 1: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên

Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên

Ph ản biện 2: TS Trần Thị Lan Hương

H ội Thú y

Ph ản biện 3: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam

Lu ận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam Vào h ồi giờ, ngày tháng năm 2019

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

1

PH ẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH C ẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Một trong những căn bệnh lây nhiễm từ thịt heo có thể gây nguy hiểm cho con người là bệnh liên cầu khuẩn lợn Đây là một bệnh truyền nhiễm do loại liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S suis) gây ra Bệnh có thể xảy ra ở hầu hết các loài động vật máu nóng, trong đó lợn và người là chủ yếu

Dựa vào đặc điểm của các polysaccharid ở lớp vỏ bọc vi khuẩn, người ta

đã xác định vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết thanh Trong đó, S suis type

2 thường gây bệnh ở người và động vật (Smith et al., 1999)

Vi khuẩn gây hai bệnh cảnh chính là viêm màng não và nhiễm khuẩn huyết, nặng có thể gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc Nếu không được phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời thì người bệnh có thể tử vong Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh vẫn có thể để lại những di chứng nặng

nề như bị ù tai, giảm thính lực, điếc hoàn toàn… (Vecht et al., 1992)

Các phương pháp chẩn đoán bệnh do liên cầu khuẩn lợn gây ra thường dùng là phương pháp nhuộm gram, phương pháp phân lập vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng, phương pháp PCR Trong những năm gần đây, trên thế giới đã phát triển loại KIT chẩn đoán nhanh dựa trên phương pháp sắc kí miễn dịch có độ đặc hiệu, độ chính xác cao, không cần phòng thí nghiệm, không cần thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao, giúp phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp thời, giảm thiểu được thiệt hại cho người bệnh Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có tác giả nào nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 ở người và động vật

Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên cầu khuẩn type 2 mang tính cấp thiết và có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn KIT chẩn đoán nhanh sẽ đáp ứng tốt nhu cầu phát hiện bệnh sớm cũng như kiểm soát tình trạng mang mầm bệnh ở gia súc, kịp thời có biện pháp bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng, nâng cao hiệu quả chăn nuôi

1.2 M ỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn S suis type 2 ở lợn

1.3 PH ẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: lợn tại các lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis

type 2 phân lập được từ mẫu dịch mũi lợn

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017

Địa điểm nghiên cứu:

+ Các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế;

+ Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam;

2

+ Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế

1.4 NH ỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S suis type

2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế Mẫu vi khuẩn S suis type 2 phân lập được phân tích đặc tính sinh học và sinh học phân tử KIT chẩn đoán S suis type 2 do đề tài nghiên cứu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả tương tự với KIT chẩn đoán S suis type 2 do Ju et al (2010) đã công bố

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu

về bệnh do vi khuẩn S suis type 2 gây ra ở lợn trong các Trường, Viện nghiên cứu chuyên ngành thú y

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài đã thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S suis type 2 trên lợn

khỏe tại các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế, đây là cơ sở để đánh giá mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn type

2 gây ra ở người và động vật Sản phẩm KIT chẩn đoán vi khuẩn S suis type 2

có độ nhạy và độ mẫn cảm cao thích hợp cho công tác chẩn đoán lâm sản trên thực địa, từ đoán cán bộ thú y và người làm công tác dịch tễ có thể đưa ra chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh do liên cầu lợn type

2 từ lợn và các sản phẩm của lợn

PH ẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 T ỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

2.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên

th ế giới

2.1.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trên thế giới

S suis được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới tại những nơi chăn nuôi lợn

như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan và Trung Quốc… (Vecht et al., 1985; Touil et al., 1988; Yu et al., 2006)

Từ năm 1983 đến năm 1995 đã có 32 trong số 35 type Streptococcus được phân lập Hầu hết các chủng phân lập được từ lợn bệnh chỉ thuộc một số type nhất định, từ 1 – 8

Với mục đích phòng chống bệnh do liên cầu lợn gây ra, nhiều công trình nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập của vi khuẩn S suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004), phương pháp chẩn đoán bệnh liên cầu lợn type 2 (Yang et al., 2007; Tan et al., 2008a; Lomthaisong et

al , 2010; Mandanici et al., 2010) Nghiên cứu các protein kháng nguyên bề mặt

nhằm tạo vắc xin (Li et al., 2006; Li et al., 2011)

3

2.1.1.2 Tìn h hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), Nguyễn Như Thanh và cs (2001), vi khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi trong tự nhiên, ổ chứa là lợn nhà Cả lợn rừng, ngựa, chó, mèo và chim cũng có thể mang vi khuẩn liên cầu lợn Hiện có 2 type liên cầu lợn thường gây bệnh ở lợn, type 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, type 2 gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau Cả 2 type này đều

cư trú ở amidal Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

S suis type 2 có thể tồn tại kéo dài hơn 1 năm tại amiđan của lợn mang mầm bệnh kể cả khi được điều trị bằng penicilline Ngo Thi Hoa et al (2011) cho biết rằng, ở miền nam Việt Nam, lợn giết mổ mang vi khuẩn S suis lên đến

41%, trong đó 8% là S suis type 2

2.2 M ỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN LIÊN CẦU LỢN

2.2.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn S suis có hình cầu, hình trứng, đường kính có khi đến 1 μm, chúng được xếp thành chuỗi như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau, có thể từ hai vi khuẩn tạo thành song cầu khuẩn cho đến chuỗi có 6 - 10 vi khuẩn hay dài hơn Vi khuẩn bắt màu dễ dàng với một số loại thuốc nhuộm thông

thường, với thuốc nhuộm Gram, chúng bắt màu Gram (+) (Mahon et al., 2000; Tan et al., 2008a)

Hình 2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S suis

Nguồn: Hughes et al (2009)

2.2.2 Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa

Vi khuẩn S suis có khả năng lên men các loại đường glucoza, lactoza, saccaroza, trehaloza, maltoza, fructoza, không lên men các loại đường: sorbit, dextroza, mannit, xyloza, glycerol, innulin Tính chất không lên men đường

innulin là đặc tính để phân biệt tính chất độc của chủng gây bệnh (Smith et al.,

1999)

S suis có thể tăng trưởng ở kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng không thể tăng

trưởng ở 6,5% dung dịch NaCl S suis không chứa men catalaza và oxidaza vì

vậy phản ứng catalaza (-), oxidaza (-), phản ứng indol (-) Vi khuẩn không di động Vi khuẩn có kháng nguyên giáp mô và sinh ra hai loại men streptokinaza (diệt bạch cầu), hyaluronidaza phân hủy acid hyaluronic gây nhão mô (Biền Văn Minh, 2003)

4

2.2.3 S ức đề kháng

Những nghiên cứu của các tác giả khẳng định rằng nhóm vi khuẩn không hình thành nha bào, đa số hình thành giáp mô, sự hình thành giáp mô có thể xác định được khi chúng sinh sống trong các mô hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh(Enright et al., 1987)

Vi khuẩn dễ bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường như cồng, phenol, iod, formol, tím genetian (Trịnh Phú Ngọc và cs., 1999)

Vi khuẩn S suis rất mẫn cảm với các loại thuốc kháng sinh: penicillin, oreomycin, tetracylin, sulfadiazin, optoclin (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987)

2.2.4 C ấu trúc kháng nguyên

• Thành phần kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng, quyết định tính

độc lực của vi khuẩn S suis và nó nằm ở thành vi khuẩn;

• Kháng nguyên giáp mô;

• Kháng nguyên bám dính

Theo Jacques et al (1990) Vi khuẩn S suis là một trong số ít các loại vi

khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên bám dính của vi khuẩn S suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đường kính khoảng 2 nm và dài lên đến 250 nm

2.2.5 Kh ả năng gây bệnh

2.2.5.1 Nguồn bệnh

Liên cầu lợn luôn có mặt trong môi trường và ký sinh bình thường ở lợn nhưng không gây bệnh, hoặc chỉ gây các bệnh viêm nhiễm không thành dịch như viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi Nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn

là ở đường hô hấp trên đặc biệt là ở mũi, đường tiêu hoá và sinh dục

Vi khuẩn S suis cũng thường xuyên phân lập được ở vòm họng và đường hô hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng, xoang mũi (Almeida et al., 2006)

2.2.5.2 Đường lây truyền

Bệnh lây truyền qua đường hô hấp do lợn khoẻ hít thở không khí có mầm bệnh, do tiếp xúc giữa lợn ốm và lợn khoẻ, do lợn ăn phải thức ăn và nước uống

có mầm bệnh Vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua các vết thương, các vết trầy xước để gây bệnh Điều cần đặc biệt quan tâm là bệnh liên cầu khuẩn có thể lây truyền từ lợn ốm sang người và ngược lại Vi khuẩn xâm nhập cơ thể người nếu

có sự tiếp xúc với lợn, thịt lợn nhiễm bệnh chưa nấu chín kỹ Vi khuẩn liên cầu lợn đi vào người qua các vết thương hở trên da hoặc niêm mạc mũi, miệng Hiện nay chưa có bằng chứng nào về việc bệnh liên cầu khuẩn có thể lây trực tiếp từ

người sang người (Tan et al., 2008a)

2.3 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH CỦA BỆNH DO VI KHUẨN S SUIS GÂY RA

2.3.1 Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn

Lợn bị liên cầu khuẩn có thể có các biểu hiện sau: da lợn có thể có các màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp bị

5

sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề, dịch não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có mủ, viêm phế quản, viêm phổi, sốt cao

2.3.2 Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S suis gây ra ở người

Nhiễm Streptococcus suis có thể gây ra những bệnh rất nặng và nguy hiểm

đến tính mạng bệnh nhân S suis không chỉ là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu,

viêm màng não, viêm khớp ở lợn mà còn gây viêm nội tâm mạc ở người, một số trường hợp tiến triển tối cấp rất nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc khuẩn gây suy đa phủ tạng và tử vong mà không kịp điều trị gì Thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến

3 ngày Người mắc liên cầu lợn chủ yếu chia làm hai thể là thể tối cấp: nhiễm trùng huyết, sốt cao, nhanh chóng xuất hiện các tử ban (xuất huyết hoại tử dưới da); và thể viêm màng não: sốt cao, đau đầu, nôn (Arends and Zanen, 1988)

2.4 CH ẨN ĐOÁN

Chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm Gram, phát hiện cầu khuẩn Gram dương xếp thành chuỗi hoặc đứng đôi Sau khi chẩn đoán xác định vi khuẩn, có thể cần tiến hành thử nghiệm PCR (TCVN 8400-2:2010), ELISA

2.4.1 Ch ẩn đoán bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR đã được Silva et al (2006) sử dụng với cặp mồi CPS2 đặc

hiệu cho việc xác định đoạn gene có kích thước 498 bp để xác định vi khuẩn

Streptococcus suistype 2 trong mẫu bệnh phẩm

2.4.2 Ch ẩn đoán bằng phương pháp ELISA

Hiện nay, trên thị trường thế giới đã có một số công ty cung KIT ELISA chẩn đoán bệnh S suis type 2 như Wuhan Unibiotest Co.,Ltd; Công ty antibodies-online

2.5 ĐIỀU TRỊ

2.5 1 Điều trị bằng thuốc kháng sinh

Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh luôn đem lại kết quả tốt Khi dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm, chỉ có hiệu quả tốt khi con vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng Nếu điều trị muộn thì hiệu quả

sẽ rất kém hoặc không có hiệu quả (Phạm Sĩ Lăng và cs., 2002; Hoàng Văn Năm, 2009)

2.5 2 Điều trị bệnh bằng huyết thanh

Ngoài việc dùng kháng sinh và các hóa dược để điều trị bệnh do

Streptococcus suis gây ra, thì việc dùng huyết thanh đặc hiệu để điều trị đã được các nhà khoa học trên thế giới đề cập đến từ lâu và nhiều nước đã dùng huyết

thanh đặc hiệu điều trị bệnh do S suis gây ra có hiệu quả tốt (Khương Bích

2.6.2.2 Cấu tạo của KIT chẩn đoán nhanh

Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng nitroncellulose (NC), đệm mẫu (sample pad), đệm kháng thể cộng hợp (conjugate pad) và đệm hút (adsorbent pad) Màng NC được phun 2 loại kháng thể khác nhau tạo thành 2 đường song song là đường kiểm tra (vạch T) và đường đối chứng (vạch C) (hình 2.2)

Hình 2.2 C ấu trúc que thử nhanh

Ngu ồn: O’Farrell (2008)

2.6.2.3 Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả

Mẫu bệnh phẩm xử lý bằng dung môi phù hợp được nhỏ vào đệm mẫu (sample pad) Toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía đệm hút (Hình 2.3), có 2 trường hợp xảy ra:

a) Nếu trong mẫu kiểm tra có kháng nguyên thì sẽ xuất hiện màu ở vạch T

và vạch C

b) Nếu trong mẫu kiểm tra không có kháng nguyên thì chỉ xuất hiện màu ở vạch C

Hình 2.3 Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh

Nguồn: Lee et al (2013)

7

PH ẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 V ẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Chuột nhắt trắng swiss albino (SA) 10 tuần tuổi, có khối lượng 30-32g/con được nuôi trong chuồng nhựa có lớp trấu đã hấp khử trùng, nhiệt độ phòng nuôi duy trì ở 25oC Chuột được cho uống nước vô trùng và ăn thức ăn tổng hợp AniFood (Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế)

Các chất bổ trợ khác nhau dùng trong sản xuất vắc xin: Freund's adjuvant (Sigma Aldrich), Montanide ISA 201 VG (Seppic, Pháp), Montanide ISA 50V2 (Seppic, Pháp)

Các hóa chất và vật dụng chế tạo Kit chẩn đoán nhanh: Gold colloid 40nm (DCN, Mỹ), Đệm mẫu và đệm hút (whatman, Anh), sợi thủy tinh (whatman, Anh), màng nitrocellulose (whatman, Anh)

Vật liệu, dụng cụ, máy móc phòng thí nghiệm: Tăm bông vô trùng lấy mẫu, ống falcon 15 ml, máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D), máy PCR (PTC-100) của MJ Research Inc (Mỹ), máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), tủ

ấm CO2, tủ cấy vô trùng, Máy ELISA tự động BIO-RAD Coda Automated EIA,

Bộ tinh sạch kháng thể IgG Econo-Pac protein A Kit (Bio-Rad, Mỹ) máy phun Biodot XYZ3060D0003, máy Strip Guillotine Cutter ZQ4000

Môi trường, hóa chất thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Brain heart infusion (BHI, Eiken chemical), thạch máu, môi trường bile esculin agar, môi trường Todd Hewitt Broth (THB), thuốc thử Kovac (Biomerieux, Pháp), môi trường Kligler iron agar (KIA – Biomerieux, Pháp), dung dịch 3% H2O2, môi trường kiểm tra tính

di động của vi khuẩn (Pepton: 10g, cao thịt: 3g, NaCl: 5g, agar: 4g, genlatin: 80g, nước cất: 1000ml)

3.2 N ỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2

+ Xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ;

+ Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S suis type 2;

+ Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S suis type 2

3.2.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2

+ Xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên;

+ Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm;

+ Xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm;

+ Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S suis type 2

3.2.3 Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2

+ Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng;

+ Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp

để phản ứng với dung dịch gold colloid;

+ Chế tạo kháng thể cộng hợp

8

3.2.4 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh

Streptococcus suis type 2

+ Xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng NC;

+ Xác định độ nhạy của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S suis type 2;

+ Xác định độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S suis type 2

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2 3.3.1.1 Phương pháp xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ

Mẫu dịch mũi lợn tại các lò mổ (Bạch Yến, Bãi Dâu và Xuân Phú) được thu thập bằng cách lấy tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào mũi và cho mẫu vào 5

ml môi trường BHI, nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 16 giờ rồi tiến hành

tách ADN

a Chuẩn bị dung dịch lysis mẫu

- Dung dịch 1: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM KCl, 2,5 mM MgCl2;

- Dung dịch 2: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 2,5 mM MgCl2, 1% Tween 20,

1% Triton X-100, 0,01% Nonidet P-10 (Marois et al., 2004)

b Ti ến hành tách ADN

Ly tâm ống nuôi 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn, sau đó giết vi khuẩn bằng cách cho ống fancol 15 chứa dịch vi khuẩn vào 100oC ủ trong 10 phút Mẫu được hút cho vào ống eppendorf để tiến hành tách ADN

d Thành ph ần phản ứng và chu trình nhiệt cho PCR

ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gene Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt độ bắt mồi là 58oC

3.3.1.2 Phương pháp phân lập, và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S suis type 2

a Phương pháp phân lập vi khuẩn S suis type 2

Dịch nuôi của mẫu được xác định dương tính với S suis type 2 bằng phương pháp PCR được cấy ria trên môi trường thạch máu cừu 5%, nuôi 16 giờ trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC Sau khi nuôi, chọn ngẫu nhiên vài khuẩn lạc tròn lồi, khô, màu xám, nhỏ đặc trưng của Streptococcus spp để kiểm tra bằng phản ứng catalase và thử nghiệm bile esculin và các phản ứng sinh hóa khác Bảo quản mẫu vi khuẩn để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo

b Phương pháp PCR xác định đặc tính sinh học phân tử

+ Trình t ự primers 6PGD

Primers 6PGD được thiết kế dựa vào trình tự ADN trên ngân hàng gene

(gb/CP000407) (Tan et al., 2008b)

9

Primer 6PGD F: 5- GCG GAT CCA TGA CTA AAG CAA ATT TTG-3; Primer 6PGD R: 5- CCG TCG ACC TAT TTT GAT TCG CTA TAC-3

+ Ph ản ứng PCR với Gotaq Green Mastermix Kit (promega, Mỹ)

Với các cặp mồi được thiết kế ở trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài khoảng 1428 bp ADN của mẫu sau khi tinh sạch thì được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gene Phản ứng PCR được thực hiện với 30 chu kỳ và nhiệt

độ bắt mồi là 55oC

c Tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi thực hiện phản ứng PCR, một số lượng lớn các phân tử ADN của vùng cần nghiên cứu đã được nhân lên Sản phẩm tinh sạch có thể được dùng để giải trình trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa vào plasmid vector với hiệu suất tiếp nhận cao hơn Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng KITWizard®SV Gel and PCR CleanUp System của hãng Promega (Mỹ) (xem Phụ lục 1)

d Phương pháp tạo dòng và phân tích trình tự gene

+ Tạo vector tái tổ hợp

Sản phẩm PCR sẽ được gắn vào vector pGEM® -T Easy Vector System theo phương pháp dòng hóa TA (TA-cloning), có enzyme T4 ADN ligase làm enzyme nối Phản ứng nối ADN ngoại lai - sản phẩm của PCR được thực hiện ở 16ºC trong 16 giờ

+ Biến nạp vào tế bào

Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt

+ Tách ADN plasmid tái tổ hợp

Sử dụng bộ hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp của hãng Invitrogene (Mỹ) (PureLink® Quick Plasmid ADN Miniprep Kits) được sử dụng hiện nay (xem Phụ lục 2)

+ Kiểm tra ADN tái tổ hợp

Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi M13 và cặp mồi 6PGD được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của ADN ngoại lai trong plasmid

+ Phương pháp kiểm phân tích trình tự của gene 6PGD

Trình tự nucleotide của gene 6PGD được gửi phân tích ở Công ty 1st BASE, Malaysia thông qua Công ty TNHH phát triển Công nghệ ứng dụng Việt Nam VNDAT bằng phương pháp dideoxy terminator trên máy 3031 Analysis Kết quả giải trình tự gene được phân tích bằng phần mềm BioEdit và so sánh mức độ tương đồng với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene NCBI

3.3.1.3 Phương pháp chế tạo kháng nguyên từ vi khuẩn S suis type 2

Chủng vi khuẩn S suis 2 thuần được nuôi trong môi trường Todd Hewitt Broth trong 7 giờ, sau đó được thu và tái huyền phù với nước cất vô trùng; cấy lên đĩa thạch máu để đếm khuẩn lạc Phần vi khuẩn còn lại được bất hoạt trong 1% formaldehyde ở 37oC trong 7 ngày (Ju et al., 2010) Vi khuẩn đã bất hoạt

được thu và rửa 3 lần với PBS để loại bỏ formaldehyde

10

3.3.2 Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S suis type 2

3.3.2.1 Thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên S suis 2 bất hoạt

Để kiểm tra tính sinh miễn dịch của kháng nguyên S suis 2, thí nghiệm

được thực hiện trên 2 nhóm chuột chuột, mỗi lô 5 con;

Nhóm được tiêm kháng nguyên: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp vi khuẩn (1x108CFU) và montanide ISA 50V2 (200µl);

Nhóm đối chứng: tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp PBS và montanide ISA 50V2; Chuột được tiêm 2 lần cách nhau 14 ngày, và tiến hành lấy máu kiểm tra vào ngày thứ 19 tính từ mũi tiêm lần 1

3.3.2.2 Thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch

Xác định lượng kháng nguyên thích hợp gây tối miễn dịch được thực hiện trên 3 nhóm chuột SA (4 con/nhóm) được tiêm phúc mạc 400 µl hỗn hợp kháng nguyên với liều khác nhau (2x108 CFU/chuột, 1,5x108 CFU/chuột và 1x108 CFU/chuột)và chất bổ trợ montanide ISA 50V2 (200µl) Chuột được tiêm 3 lần, cách nhau 14 ngày/lần

B ảng 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp

để gây tối miễn dịch

Lượng kháng nguyên

Chất bổ trợ Montanide ISA 50V2 Montanide ISA 50V2 Montanide ISA 50V2

3.3.2 3 Thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch

Xác định chất bổ trợ thích hợp (Freund's, Montanide ISA 201 VG và Montanide ISA 50V2) được thực hiện trên ba nhóm chuột SA (4 con/nhóm) với liều kháng nguyên được xác định căn cứ vào kết quả của thí nghiệm xác định lượng Chuột được tiêm 3 lần, cách nhau 14 ngày/lần

3.3.2.4 Phương pháp tách chiết và định lượng kháng thể kháng S suis type 2

a Phương pháp chế tạo kháng thể kháng S suis type 2

Kháng thể kháng S suis type 2 được chế tạo bằng cách tiêm vào phúc mạc

chuột 15 con chuột SA 400 µl huyễn dịch gồm 200 µl kháng nguyên và 200 µl chất bổ trợ Lượng vi khuẩn bất hoạt và chất bổ trợ thích hợp được xác định theo các thí nghiệm trên (mục 3.3.2.2 và mục 3.3.2.3) Nhóm đối chứng gồm 3 con chuột được tiêm tiêm 400 µl/chuột hỗn hợp gồm 200 PBS và 200 chất bổ trợ tương tự Chuột được tiêm 3 lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày

b Tách chiết kháng thể kháng S suis type 2

Để tinh chế kháng thể IgG kháng S suis type trong huyết thanh chuột,

nghiên cứu này sử dụng KIT Econo-Pac protein A (Biorad) (xem phụ lục 3)

c Phương pháp định lượng kháng thể kháng S suis type 2 sau tinh sạch

+ Phương pháp định lượng kháng thể BCA

Sau khi tách chiết, hàm lượng kháng thể được xác định bằng Pierce BCA Protein Assay Kit của hãng Thermo

11

+ Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể

Hiệu giá kháng thể kháng S suis type 2 được xác định bằng phương pháp ELISA gián tiếp Mẫu kháng thể được pha loãng dẫn theo cấp số 2 Hiệu giá kháng thể được xác định bằng độ pha độ pha loãng cao nhất của mẫu mà ở đó vẫn xuất hiện phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể

c Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể

Độ tinh sạch của kháng thể sau lọc được kiểm tra bằng điện di polyacrylamide gel 15% có SDS ở 80 V Sau đó, gel được nhuộm với dung dịch Coomassie Blue R250 Phân tích kết quả điện di dựa theo sự xuất hiện và kích thước của các băng protein được nhuộm so mới thang protein chuẩn (marker)

d Phương pháp ELISA gián tiếp

Phủ đĩa với kháng nguyên vi khuẩn S suis 2 bất hoạt đã được pha loãng với dung dịch carbonate-bicarbonate buffer (Sigma) với nồng độ 2,5x107 vi khuẩn/ml Cơ chất được sử dụng là OPD Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 492 nm theo đề nghị của nhà sản xuất cơ chất OPD

Mẫu dương tính khi giá trị OD> giá trị giới hạn (Cut off) Giá trị giới hạn = trung bình OD của nhóm đối chứng + (3x Sai số chuẩn của nhóm đối chứng)

(Classen et al., 1987)

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống

Streptococcus suis type 2

3.3.3.1 Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng

pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano được xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid (pH từ 6.5 - 8.5) với 25

µl dung dịch kháng thể kháng S suis type 2 (C= 500 µg/ml), lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10% Ủ 10 phút và quan sát pH thích hợp để gắn là pH mà ở đó hỗn hợp dung dịch trên vẫn giữ được màu hồng tươi Màu hồng

tươi được phát hiện ở bước sóng 520 nm (Paek et al., 2000)

3.3.3 2 Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp để phản ứng với dung dịch colloidal gold

Nồng độ kháng thể kháng S suis 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano vàng trong dung dịch đươc xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid với

25 µl dung dịch kháng thể kháng S suis type 2 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600 µg/ml) lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10% Ủ 10 phút và quan sát ống có nồng độ thấp nhất không bị đổi từ màu hồng sang màu xanh (đo ở bước sóng 520 nm) Nồng độ protein của ống đó chính là nồng độ protein tối thiểu cần để gắn với gold colloid

3.3.3.3 Phương pháp chế tạo kháng thể cộng hợp

Kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng cách ủ kháng thể kháng S suis 2, với gold colloid (DCN, 40 nm, Mỹ) với tỷ lệ (1:10, vol/vol) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Sau đó thêm 10% albumin huyết thanh bò (BSA) để cố định các phân tử đã gắn kết Ly tâm 12.000 vòng trong 30 phút ở 40C, bỏ dịch nổi Phần cặn được rửa bằng hỗn hợp 10mM Tris-HCl (pH 8.2) chứa 1% BSA, 5% sucrose Sau khi ly tâm bỏ dịch nổi, kháng thể cộng hợp được pha loãng trong

100 µl hỗn hợp rửa (Chaudhuri and Raychaudhuri, 2001) Cuối cùng kháng thể