nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện hiv bằng dot blot với các protein gp120, gp41, p24 tái tổ hợp

Ở trong nước đã có một số cơ sở sản xuất được kit chẩn đoán và định lượng HIV bằng kỹ thuật PCR như thuốc thử định lượng HIV của Công Ty Nam Khoa [10].. Theo chúng tôi các Hãng

………… o0o…………

NGUYỄN QUANG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN

GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

………… o0o…………

NGUYỄN QUANG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN

GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

MỤC LỤC

Mở đầu -

1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới -

1.1.1 Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS -

1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới -

1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS và nghiên cứu HIV ở Việt Nam -

1.3 Đặc điểm của HIV -

1.3.1 Giới thiệu chung -

1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc HIV. -

1.4 Phân loại HIV -

1.4.1 HIV-1 -

1.4.2 HIV-2 -

1.5 Đặc điểm sinh vật học của HIV -

1.6 Nguồn truyền nhiễm và đối tượng cảm thụ HIV -

1.7 Các phương thức lây truyền của HIV -

1.8 Sự xâm nhập tế bào và nhân lên của HIV -

1.9 Đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi nhiễm HIV/AIDS -

1.9.1 Những thay đổi miễn dịch khi nhiễm HIV -

1.9.2 Suy giảm miễn dịch do nhiễm HIV -

1.9.3 Diễn biến huyết thanh người nhiễm HIV/AIDS -

1.10 Các kĩ thuật phát hiện HIV trong cơ thể -

1.10.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV -

1.10.2 Phát hiện kháng nguyên của HIV -

1.10.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV -

1.10.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV -

1.10.5 Các bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV -

1.10.6 Nghiên cứu các protein tái tổ hợp để tạo kit chẩn đoán -

1.11 Điều trị HIV/AIDS -

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

-2.1 Đối tượng, vật liệu -

2.1.1 Đối tượng -

2.1.2 Các sinh phẩm -

2.1.3 Hóa chất vật liệu -

2.1.4 Dung dịch và môi trường -

3

5

5

7

8

10

10

10

15

15

18

18

19

19

20

23

23

24

26

28

28

29

30

31

34

35

37

40

40

40

40

40

40

2.1.5 Thiết bị và máy móc -

2.2 Phương pháp nghiên cứu -

2.2.1 Phương pháp điện di trên gel và polyacrylamide -

2.2.2 Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E coli chủng BL21 -

2.2.3 Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin -

2.2.4 Phương pháp Western blot -

2.2.5 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford -

2.2.6 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp120 -

2.2.7 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp41 -

2.2.8 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp p24 -

2.2.9 Phương pháp chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV -

CHƯƠNG III KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC -

3.1 Biểu hiện protein tái tổ hợp gp120 -

3.2 Tinh chế protein tái tổ hợp -

3.3 Nghiên cứu khả năng phản ứng gp120 tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng western blot -

3.4 Kết quả biểu hiện, tinh sạch gp41 của HIV-1 phân type CRF01_AE -

3.4.1 Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và xác định trạng thái gp41 tái tổ hợp

3.4.2 Tinh sạch gp41 tái tổ hợp -

3.5 Kiểm tra khả năng phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng western blot -

3.6 Biểu hiện và tinh sạch protein p24 -

3.7 Phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân -

3.8 Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV -

KẾT LUẬN -. -

KIẾN NGHỊ -

PHỤ LỤC -

44 45 45 46 47 50 50 53 53 54 55 57 57 58 59 61 61 62 65 66 66 66 68 75 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 87

MỞ ĐẦU

Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDS nguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chưa có vacxin phòng bệnh và chưa có thuốc điều trị đặc hiệu HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cướp đi hàng triệu sinh mạng trên thế giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã hội làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống của mỗi quốc gia Theo báo cáo của Tổ chức phòng chống AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO), đến năm 2008 trên thế giới có 33,4 triệu người đang sống chung với HIV, mỗi năm có 2,7 triệu người nhiễm mới và 2 triệu người tử vong do AIDS Tại Việt Nam, từ khi ca nhiễm đầu tiên được thông báo vào năm 1990 ở thành phố Hồ Chí Minh, số lượng người nhiễm HIV đang ngày càng tăng lên Tính đên 31/3/2009, toàn quốc có 144.483 người nhiễm HIV, 30.996 người đã chuyển sang giai đoạn AIDS còn sống, 42.447 người đã tử vong vì AIDS

Có hai type HIV gây bệnh ở người là HIV-1 và HIV-2 Tuy nhiên, HIV-2 chỉ lưu hành ở châu Phi, còn HIV-1 thì lưu hành rộng rãi và gây bệnh chủ yếu ở tất cả các châu lục Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, người ta chia HIV-1 ra thành 3 nhóm M, N và O Các nhóm này có thể được chia ra thành các phân type, mỗi phân type lại có phân vùng địa lý khác nhau Ngoài các phân type, các thể tái tổ hợp giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện ngày càng nhiều và làm cho việc nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn [41]

Hiểu được sự lưu hành của các phân type HIV cũng như các thể tái tổ hợp của chúng ở mỗi vùng địa lý khác nhau không chỉ có ý nghĩa quyết định cho việc nghiên

cứu và triển khai vắc xin phòng chống HIV mà còn có giá trị trong sản xuất kit chẩn đoán thích hợp cho từng vùng

Các công trình nghiên cứu về HIV có sự phân biệt ưu tiên theo địa lý các nước giàu nghèo Phân type C xuất hiện chủ yếu tại châu Phi, châu Á và phân type CRF01_AE lưu hành chủ yếu tại các nước khu vực Đông Nam Á, tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu về HIV hiện nay đều tập trung vào phân type B, vì phân type này lưu hành chủ yếu ở các nước phát triển

Nghiên cứu để biết rõ hơn về đặc tính di truyền và kháng nguyên của các phân typ HIV lưu hành chủ yếu ở Việt Nam từ đó chế tạo các bộ kit chẩn đoán huyết thanh học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên cơ sở các kháng nguyên tái tổ hợp GP120, GP41 và P24 biểu hiện từ các phân typ HIV lưu hành ở Việt nam là mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV bằng dot blot với các protein GP120, Gp41 và P24 tái tổ hợp”

Đề tài được đặt ra với các mục tiêu cụ thể sau:

- Tạo ra được các kháng nguyên GP120, GP41, P24 có độ tinh sạch, độ đặc hiệu đảm bảo cho chế tạo kit chẩn đoán

- Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán HIV bằng dot blot,độ đặc hiệu cao có thể sử dụng cho chẩn đoán HIV

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS TRÊN THẾ GIỚI

1.1.1 Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS

Quá trình diễn biến HIV/AIDS trên thế giới chia 3 giai đoạn [21]

- Thời kỳ “yên lặng” 1970-1981

HIV đã bắt đầu xuất hiện âm thầm từ những năm 70 của thế kỷ XX Người ta đã tìm thấy kháng thể (KT) kháng HIV trong các mẫu máu được bảo quản ở Zaire (1959) và

ở Mỹ (1970)

- Thời kỳ phát hiện virus 1981-1985

Ở thời kỳ này, các nhà khoa học đã phân lập được virus, xác định được phương thức truyền bệnh và phát triển các kỹ thuật phát hiện virus

+ Năm 1981, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) đã xác định được những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) đầu tiên trên thế giới dựa trên sự phát hiện và mô tả bệnh của bác sỹ Michạel Gottlieb về

5 thanh niên đồng tính luyến ái bị viêm phổi nặng do Pneumocystis carinii ở Los

Angeles và 226 nam thanh niên đồng tính luyến ái mắc ung thư da Sarcoma Kaposi

Điều đặc biệt là ở những bệnh nhân này đều có sự suy giảm nặng nề hệ thống miễn dịch, về cả số lượng và chức năng của tế bào miễn dịch, quan trọng nhất là sự giảm tế bào TCD4

+ Năm 1982, nhiều nơi đã công bố căn bệnh tương tự như trên ở các bệnh nhân phải truyền máu nhiều lần, ở các đối tượng nghiện chích ma tuý, ở những người mẹ và đứa con do họ đẻ ra

Cuối 1982, dựa trên những trường hợp AIDS đầu tiên được thông báo, CDC đã đưa ra tiêu chuẩn đầu tiên về các triệu chứng lâm sàng chẩn đoán bệnh AIDS khi chưa có phương pháp xét nghiệm căn nguyên

+ Năm 1985, Hội nghị danh pháp quốc tế đã thống nhất gọi tên các virus LAV (Lymphodenopathy Associated Virus), HTLV III (Human T Lymphotropic Virus III), ARV (AIDS Related Virus) là virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human Immunodefiency Virus- HIV)

+ Năm1984-1985, đã xác định kỹ thuật phát hiện KT kháng HTLV III và chuẩn hoá bộ sinh phẩm phát hiện KT kháng HIV bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzym ELISA để sàng lọc máu và phát hiện lâm sàng

- Thời kỳ 1985- nay: Đây là thời kỳ toàn thế giới chống AIDS

+ Năm 1987, thử nghiệm lâm sàng đầu tiên với AZT (Azidothymidine) như một thuốc chống Retrovirus

+ Năm 1989, đưa ra các hướng dẫn điều trị bằng AZT cho những người nhiễm HIV

và bệnh nhân AIDS trên cơ sở số lượng tế bào TCD4 của người bệnh

+ Năm 1993, CDC đƣa ra tiêu chuẩn để xác định bệnh AIDS

1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới

Đại dịch HIV/AIDS tuy xuất hiện chưa lâu, mới bắt đầu vào những năm 70-80 của thế kỷ XX nhưng đã nhanh chóng lan tràn trên toàn cầu, tấn công mọi đối tượng không phân biệt lứa tuổi, nghề nghiệp, địa vị xã hội như phụ nữ, trẻ em, thanh niên, người có tuổi, người đồng tính luyến ái, người nghiện chích ma tuý Dịch liên tục phát triển về cả không gian và thời gian trở thành đại dịch nguy hiểm Đại dịch này gồm nhiều vụ dịch xảy ra ở từng nước, từng lục địa, có phương thức lây truyền, biểu hiện lâm sàng đặc trưng riêng phụ thuộc vào nguồn gốc virus, đối tượng nhiễm, điều kiện kinh tế xã hội và tập quán từng nước Ban đầu xuất hiện, dịch chủ yếu xảy ra tại các nước công nghiệp phát triển ở Bắc Mỹ, Úc, và Tây Âu, tại các thành phố lớn, ở những người đồng tính luyến ái và người nghiện chích ma tuý Từ đó, dịch lan tràn khắp các nước, gây tác hại to lớn tại châu Phi, vùng Caribe với số lượng người nhiễm HIV rất cao Đến nay, khu vực Nam phi vẫn là vùng có số lượng bệnh nhân cao nhất trên thế giới và riêng tại khu vực Sahara đã có tới 25,8 triệu người nhiễm HIV, chiếm 64% tổng số người nhiễm HIV trên thế giới

Ở Châu Á, dịch HIV/AIDS đến muộn bắt đầu từ cuối những năm 80 của thế kỷ

XX nhưng phát triển rất nhanh với phương thức lây truyền đa dạng phản ánh tính đa dạng về xã hội, kinh tế và văn hoá.Theo dự đoán của WHO, đại dịch HIV/AIDS sẽ có

xu thế dịch chuyển về Châu Á mà điểm nóng là Thái lan, Ấn Độ, Campuchia và Indonesia.Vì vậy cần phải có các chương trình khống chế và dự phòng HIV/AIDS kịp thời, mạnh mẽ Một tình trạng đáng báo động khi 70% người dân Ontania trên đảo Bomeo, Indonesia kết quả xét nghiệm HIV dương tính

1.2 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS VÀ NGHIÊN CỨU HIV Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam, dịch HIV/AIDS đến muộn hơn các quốc gia khác nhưng đang trở thành một trong những nguyên nhân chính gây tử vong cho cộng đồng

Kể từ trường hợp nhiễm HIV đầu tiên được phát hiện tháng 12/1990, đến tháng 12/1992 mới chỉ có thêm 11 trường hợp bị nhiễm HIV nhưng đến tháng 06/1999, toàn quốc đã có 13.623 trường hợp nhiễm HIV, 2.532 bệnh nhân AIDS và 1.320 người đã tử vong vì AIDS Theo thống kê của Uỷ ban Quốc gia phòng chống AIDS, tính đến cuối tháng 7/2007, toàn quốc có 123.775 người nhiễm HIV, 26.214 bệnh nhân AIDS

và 38.648 người đã tử vong [1]

Ban đầu, dịch chỉ có ở thành phố Hồ Chí Minh, đến tháng 6/1995 đã có 34/53 tỉnh thành báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS và hiện nay, tất cả các tỉnh thành trên cả nước đều có người nhiễm HIV/AIDS Dịch liên tục lan rộng ra các xã, phường với 95% số huyện, 49% số xã có người nhiễm HIV/AIDS và mỗi năm có trên 10.000 trường hợp nhiễm mới [26]

Phương thức lây truyền HIV ở nước ta chủ yếu là qua đường tình dục và tiêm chích

ma tuý Sự gia tăng của dịch HIV/AIDS ở đối tượng nghiện chích ma tuý tại Việt Nam là điều thực sự đáng quan tâm vì số người sử dụng ma tuý ngày càng có chiều hướng gia tăng với mức độ khó kiểm soát Theo Cục phòng chống tệ nạn xã hội, hiện nay, nước ta có khoảng 185.000 đến 200.000 người nghiện ma tuý, điều này nhấn mạnh nguy cơ tăng tỷ lệ nhiễm HIV ở đối tượng nghiện chích ma tuý cũng như nguy

cơ lan truyền từ người tiêm chích ma tuý sang các nhóm khác trong cộng đồng Bên cạnh đó, hình thức lây nhiễm HIV qua đường tình dục cũng đang có dấu hiệu gia tăng Theo thống kê của Bộ Y tế, từ năm 1994-2002, tỷ lệ nhiễm HIV trong nhóm gái

mại dâm đã tăng gấp 10 lần (từ 0,6% lên đến 6%) [8] Tình hình lây nhiễm HIV ngày càng trở nên phức tạp bởi sự lây lan giữa hai nhóm đối tượng có nguy cơ cao này

Các công trình nghiên cứu về HIV ở Việt Nam thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau, nhưng có lẽ tập trung nhiều vào việc thống kê về tình hình nhiễm HIV tại các cơ sở điều trị và tại các địa phương khác nhau [17], [27], [22] Ngoài ra các công bố về dịch tễ học, đặc điểm lâm sàng của các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS đến điều trị tại các bệnh viện cũng được đề cập nhiều [25], [10], [16] Nghiên cứu về sự kháng thuốc của HIV cũng được đặc biệt quan tâm trong những năm gần đây [14] Dịch tễ học phân tử của HIV lưu hành ở Việt Nam và các phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán, phát hiện, định loại HIV cũng được quan tâm và đưa vào ứng dụng tại Việt Nam [1], [15], [11], [23] Các kit chẩn đoán HIV hiện nay chủ yếu vẫn là nhập của nước ngoài

Ở trong nước đã có một số cơ sở sản xuất được kit chẩn đoán và định lượng HIV bằng kỹ thuật PCR như thuốc thử định lượng HIV của Công Ty Nam Khoa [10] Trong khuôn khổ của đề tài KC.10.08/06-10, Phan Tuấn Nghĩa và cs đã tạo ra được bộ kit Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời HBV, HCV and HIV trong các mẫu máu Tuy nhiên, tất cả các kit chẩn đoán huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng HIV trên cơ sở các kháng nguyên của HIV, hiện tại chúng ta vẫn phải nhập ngoại Để xây dựng được panel chuẩn cho tất cả các kit nhập ngoại thì không phải là điều dễ dàng Theo chúng tôi các Hãng trên thế giới không cho biết các kit của họ được chế tạo từ phân typ nào, do đó đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu khi phát hiện kháng thể kháng các chủng HIV lưu hành trong nước cần phải tiếp tục được thực hiện để xây dựng được panel chuẩn trong chẩn đoán HIV

1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA HIV

1.3.1 Giới thiệu chung

HIV là virus gây AIDS ở người, thuộc nhóm Lentivirus họ Retroviridae vì vậy HIV

có những đặc điểm chung của cả retrovirus và lentivirus [21]

Đặc trưng của một retrovirus:

- Là một RNA virus có enzym sao chép ngược, enzym sao chép ngược này có bản chất là DNA polymerase phụ dựa vào khuôn RNA của virus HIV tổng hợp DNA

2 mạch trong tế bào bị retrovirus xâm nhập DNA này gọi là cDNA

- cDNA mới tạo ra này có những đoạn tự lập lại với kích thước khác nhau

được gọi là đoạn cuối dài tự lập lại (long terminal repeat), nhờ vậy genom của virus gắn ổn định trong DNA của tế bào nhiễm virus và trở thành một tiền virus (provirus)

- Provirus này sẽ tồn tại như một gen của tế bào nhiễm virus, tồn tại thầm lặng không phát triển và truyền sang cho thế hệ khác khi có phân bào, hoặc được chuyển thành mRNA trực tiếp tham gia quá trình sinh tổng hợp protein của virus để hình thành những virus hoàn chỉnh

Đặc trưng của lentivirus: Phát triển chậm, hướng động tới các tế bào bạch cầu đơn nhân (monocyte) và đại thực bào (macrophage) Không có khả năng làm bất tử hay biến đổi nhưng lại làm tiêu huỷ tế bào nhiễm virus Nucleotide có trình tự

(sequence) giống virus VISNA, là virus tiêu biểu cho hạ tộc lentivirus

1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc của HIV

Dưới kính hiển vi điện tử, HIV có dạng hình cầu với đường kính khoảng 80-120 nm Cấu trúc từ ngoài vào trong gồm 3 lớp [21]:

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của HIV [21]

Lớp này là một màng lipid kép có kháng nguyên (KN) chéo với màng sinh chất tế

bào, đƣợc bao phủ bởi các gai nhú

Gai nhú có bản chất là glycoprotein (gp) dài 9-10nm, rộng 14 nm, trọng lƣợng phân tử (TLPT) 160 kDa (kilodalton) ký hiệu là gp 160 với HIV1 và 165 kDa với HIV2, gồm 2 gp:

+ gp120 với HIV-1 hoặc gp125 với HIV-2: là phần KN bên ngoài dễ biến đổi nhất, gây khó khăn cho việc tạo KT và việc sản xuất vacxin phòng bệnh

+ gp41 với HIV-1 hoặc gp36 với HIV-2: là gp xuyên màng gắn với gp120 hoặc gp125 với HIV-2 giúp cho HIV xâm nhập được vào tế bào đích

+ Nhóm gen cấu trúc gồm gen gag, pol và env

+ Nhóm gen điều hoà sinh trưởng là tat, nef, vif, vpr, vpu, vpx

Nhóm gen cấu trúc:

- Gen gag (group specific antigen) là gen mã hoá KN đặc hiệu nhóm cho các protein p17/p18, p24/p25 ở lớp vỏ capsid của HIV Ban đầu, nhóm gen gag này sẽ

tổng hợp nên một protein lớn là p55 Khi virus trưởng thành, protein này sẽ được cắt

ra tạo nên các protein con là: MA(p17), CA(p24), NC(p9) và p6

Protein lõi p24 được mã hoá bởi nhóm gen gag là 1 KN đặc biệt có ý nghĩa

trong chẩn đoán nhiễm HIV vì P24 là protein có vai trò tạo nên lõi hình nón bên trong

của virus và là vị trí mà cycophilin A gắn với nhóm protein gag Điều này rất quan

trọng trong quá trình nhân lên của virus vì nếu sự kết hợp này bị cản trở thì quá trình nhân lên của virus cũng bị dừng lại

P24 được sản xuất ra trong tế bào nhiễm virus và có thể được giải phóng ra ngoài bằng nhiều cách do đó người ta có thể đo lượng p24 nội bào và ngoại bào để đánh giá số lượng HIV trong cơ thể

+ Gen pol (polymerase) mã hoá cho các enzym:

Reverse transcriptase (RT) p64/p67, p51/p53 là enzym sao chép ngược đảm nhiệm

mã hoá bộ gen virus thành DNA bổ xung (cDNA) Người ta đã thí nghiệm dùng các thuốc như Zidovudin (ZDV), ddI và Nevirapin để ức chế RT nhằm ngăn chặn sự nhân lên của virus nhưng HIV đã phát sinh biến dị làm thay thế các axit amin ở nơi tác động của thuốc nên có tác dụng kháng lại thuốc Enzym này còn được ứng dụng phát hiện HIV bằng kỹ thuật RT-PCR

Protease (p10) của HIV có tác dụng tách các protein được mã hoá bởi gen gag và pol

thành các phân tử hoạt động

Endonuclease p31/p34 đảm nhiệm sự tích hợp DNA của virus vào nhiễm sắc thể của

tế bào chủ Protease và endonuclease còn gọi là enzym tích hợp (integrase)

+ Gen env (envelop) mã hoá cho gp110/120, gp41 ở lớp vỏ peplon của virus

Nhóm gen điều hoà :

+ Gen tat (transactivateur): là gen phát động sự tăng trưởng các gen khác của

virus Nơi tác động là đoạn TAR (transactivateur responsive) trong đoạn 5LTR Tế

bào nhiễm HIV mà provirus có gen tat sẽ kích hoạt các HIV hoạt động gấp 1000 lần các provirus không có gen tat Gen tat kích hoạt các gen mã hoá protein cấu trúc, protein điều hành (kể cả gen tat)

+ Gen rev ( regulation gene) có chức phận điều chỉnh quá trình nhân lên của

virus thông qua tat và nef Rev điều hoà mã hoá 1 protein rev có hai đầu trong đó

một đầu có nhiệm vụ ức chế (CRS) và một đầu giải ức chế (CAR)

+ Gen nef (negative regulator factor) chịu trách nhiệm làm chậm phát triển virus, tăng

cường khả năng lây nhiễm của virus

+ Gen vif (virion infectivity factor) mã hoá protein vì làm tăng tính thâm nhập của

virus vào tế bào cảm nhiễm

Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc gen của HIV [95]

1.4 PHÂN LOẠI HIV

HIV là virus có độ biến đổi cao, đột biến dễ dàng Điều này có nghĩa là trong một cơ thể của một người nhiễm bệnh cũng có nhiều chủng HIV Dựa trên những điểm tương tự về di truyền, HIV được chia làm 2 loại là: HIV-1 và HIV-2 Hai loại này cùng gây nên AIDS trên người với bệnh cảnh lâm sàng không thể phân biệt được và đường lây hoàn toàn giống nhau Tuy nhiên, HIV-1 là loại gây bệnh chủ yếu và là nguyên nhân chính gây AIDS ở tất cả các châu lục trên thế giới, khi nói nhiễm HIV mà không kèm theo type HIV tức là nói đến HIV-1 HIV-2 chỉ lưu hành ở châu Phi, có khả năng gây bệnh và tiến triển bệnh lâu hơn, khó lây hơn HIV-1 [41]

1.4.1 HIV-1

Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, người ta chia HIV-1 ra thành 3 nhóm là nhóm

M (major), nhóm N (new) và O (outlier) Các nhóm này có thể khác nhau 30-40% trong trình tự các axit amin nằm ở gp120 Ba nhóm này đại diện cho đợt du nhập riêng rẽ của SIV gây suy giảm miễn dịch từ khỉ sang người Nhóm O hầu như chỉ khu trú tại Tây Phi, nhóm N rất hiếm gặp và chỉ mới được phát hiện tại Cameroon (1998) còn lại là trên 90% các trường hợp nhiễm HIV-1 đều thuộc nhóm M

Nhóm M là nhóm lớn nhất và được chia làm 8 phân type [(A1, A2), (B), (C), (D), (CRF01_AE), (F1, F2, K) (G, J), (H)]; mỗi phân type có phân vùng địa lý khác nhau [40]

Ngoài các phân type, các thể tái tổ hợp giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện ngày càng nhiều và làm cho các việc nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn Sự hình thành các thể tái tổ hợp là do 2 virus thuộc 2 phân type khác

nhau cùng hiện diện trong tế bào người nhiễm và hòa trộn các chất liệu di truyền để tạo thành một virus lai mới, mặc dù đa số virus thuộc chủng mới này không sống sót lâu được, nhưng nếu chủng nào lây nhiễm tồn tại được sẽ tạo ra thể tái tổ hợp Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được khoảng 30 CRF CRF A/E được coi là sự lai tạo giữa phân type A và một phân type gốc E, cho đến nay người ta vẫn chưa tìm thấy được phân type E ở dạng riêng rẽ vì vậy CRF A/E có thể được coi là phân type E [41]

Hình 1.3: Sơ đồ phân bố các phân type HIV [104]

Kết qủa nghiên cứu phân tích mức độ lưu hành của các phân type HIV -1 toàn cầu năm 2004 cho thấy [41], [39]:

+ Về tỷ lệ %: Phân type C chiếm đa số (47,2%), phân type A 27%, phân type B chiếm 12,3%, phân type D chiếm 5,3%, phân type E chiếm 3,2%, các phân type còn lại (F,

G, H, J,) và các CRF khác chỉ chiếm 5 %

+ Về phân vùng địa lý: Các phân type HIV-1 và các CRF được phân bố không đều trên thế giới, trong đó các phân type B và C phân bố rộng rãi nhất Phân type B xuất hiện chủ yếu tại Bắc Mỹ, châu Âu và châu Úc Tuy nhiên, hiện nay tại châu Âu đang dần có sự du nhập của các phân type khác, khoảng 25% những trường hợp nhiễm HIV tại châu Âu không phải do phân type B Điều này có thể được giải thích là

do sự lai tạp về dân số vì đã có một số lượng lớn dân di cư du nhập đến châu Âu kể từ sau thế chiến thứ 2

Phân type C là phân type thường gây ra các vụ dịch HIV nặng nề chủ yếu tại châu Phi, châu Á, Ấn Độ, Nepal và là nguyên nhân của khoảng một nửa các trường hợp nhiễm HIV hiện nay trên thế giới

Phân type A xuất hiện nhiều tại Nga và châu Phi, chủ yếu tại Tây Phi và Trung Phi còn phân type D lại thường khu trú tại Đông Phi

Phân type F được tìm thấy tại Trung Phi, Nam Mỹ và Đông Âu nhưng phân type G và CRF A/G lại là nguyên nhân gây bệnh chủ yếu tại Tây Phi, Đông Phi và tại Trung

Âu

Phân type H chỉ tìm thấy tại Trung Phi; phân type J chỉ có tại Trung Mỹ; và phân type

K chỉ có tại Cộng hòa Dân chủ Congo và Cameroon

Theo các công bố gần đây của các nước khu vực Đông Nam Á thì phân type lưu hành chủ yếu ở khu vực này lại là CRF01_AE (nhưng nguồn gốc từ Trung Phi) Tại Việt

nhóm đối tượng ví dụ như HIV-1 phân type CRF01_AE lây truyền chủ yếu trong

nhóm đối tượng là những người tiêm chích

1.4.2 HIV- 2

Các chủng HIV-2 ít gặp hơn HIV-1, thường chỉ gặp ở Tây Phi mà hiếm khi thấy ở nơi khác HIV-2 được chia thành 8 phân typ là A, B, C, D, E, F, G, H

Hình 1.4: Sơ đồ phân type của HIV [41]

1.5 ĐẶC ĐIỂM SINH VẬT HỌC CỦA HIV

Khi HIV đã xâm nhập vào trong tế bào của cơ thể sẽ tồn tại mãi trong cơ thể nhưng khi ở ngoài cơ thể thì HIV cũng giống như các loại virus có vỏ ngoài là lipid khác, dễ bị bất hoạt bởi các yếu tố lý, hoá và chất khử khuẩn thông thường Trong dung dịch, HIV bị phá huỷ ở 56oC trong 20 phút và ở môi trường đông khô, HIV bị mất hoạt tính

ở 68o

C trong 2 giờ HIV cũng bị bất hoạt bởi các hoá chất khử khuẩn, tuy nhiên, màng lipid có thể bảo vệ cho virus không bị mất nước giúp nó có thể sống vài ngày ở bên ngoài cơ thể trong điều kiện đông khô, thậm chí có thể sống vài tuần trong dung dịch ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, do đó các dụng cụ y tế bị nhiễm các dịch cơ thể có HIV cần phải được xử lý bằng các chất sát khuẩn có hiệu lực [18]

1.6 NGUỒN TRUYỀN NHIỄM VÀ ĐỐI TƯỢNG CẢM THỤ

Bệnh nhân AIDS và người nhiễm HIV là nguồn truyền nhiễm duy nhất cho cộng đồng, không có ổ chứa nhiễm trùng tự nhiên ở động vật Tất cả mọi người đều có khả năng cảm nhiễm HIV, không phân biệt tuổi tác, nghề nghiệp, giới tính nhưng dịch lây lan mạnh ở nhóm người có nguy cơ cao như bệnh nhân có bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD), đồng tính luyến ái, nghiện chích ma tuý

HIV đã được phân lập từ máu, tinh dịch, dịch tiết âm đạo, nước mắt, sữa mẹ và các dịch khác của cơ thể, tuy nhiên chỉ có máu, tinh dịch và dịch tiết âm đạo đóng vai trò chính trong lây truyền HIV [21]

1.7 CÁC PHƯƠNG THỨC LÂY TRUYỀN CỦA HIV

Có 3 phương thức lây truyền đã được xác định đó là: lây truyền qua đường tình dục, lây truyền theo đường máu và lây truyền từ mẹ sang con

Lây truyền HIV có thể xảy ra qua đường tình dục đồng giới (15%) hoặc khác giới (71%) với người nhiễm HIV Những tổn thương ở âm đạo, dương vật, miệng hay hậu môn sẽ là đường xâm nhập của virus vào máu HIV có thể gắn và xâm nhập vào tinh trùng, tồn tại dưới dạng DNA virus hoặc gây nhiễm tế bào Langerhans trong dịch nhầy của âm đạo và hậu môn Nguy cơ lây nhiễm HIV qua một lần giao hợp với một người nhiễm HIV là 1%-10% [8], người nào nhận tinh dịch trong giao hợp thì có nguy cơ lây nhiễm HIV cao hơn, và càng quan hệ tình dục với nhiều người thì nguy

cơ lây nhiễm càng cao, đặc biệt là người có STD thì nguy cơ lây nhiễm HIV có thể lên gấp 20 lần [18]

HIV có thể lây qua truyền máu, các chế phẩm máu, trong ghép tạng không được kiểm soát và sàng lọc HIV hoặc có được làm xét nghiệm sàng lọc bằng các phương pháp huyết thanh học nhưng không phát hiện được KT kháng HIV (giai đoạn cửa sổ sinh học) HIV cũng có thể truyền qua việc sử dụng chung bơm kim tiêm bị nhiễm HIV

mà không được tiệt trùng cẩn thận, đặc biệt ở người nghiện chích ma tuý

Phòng tránh lây truyền HIV từ mẹ sang con là một mắt xích không thể thiếu được trong chiến lược toàn cầu nhằm ngăn chặn sự lan tràn của đại dịch HIV/AIDS Người phụ nữ nhiễm HIV nếu sinh con thì con của họ cũng có thể bị nhiễm HIV Sự lây truyền HIV từ mẹ sang thai nhi hay sang sơ sinh gọi là lây truyền chu sinh hoặc lây truyền dọc Sự lây truyền HIV từ mẹ sang con có thể xảy ra trong thời kỳ mang thai, lúc sinh con hoặc khi cho con bú [18], [21]

1.8 SỰ XÂM NHẬP TẾ BÀO VÀ NHÂN LÊN CỦA HIV

Quá trình xâm nhập và nhân lên của HIVcó thể được chia làm 2 thời kì quan trọng là thời kỳ tạo ra tiền virus và thời kỳ nhân lên [24]

HIV xâm nhập vào cơ thể qua đường da niêm mạc và mạch máu Virus di chuyển đến các hạch bạch huyết bằng cách tấn công có lựa chọn vào tế vào Lympho TCD4 là tế bào điều hòa hệ miễn dịch, có thụ thể đặc hiệu phù hợp với gp120 Ngoài ra, HIV còn xâm nhập và nhân lên ở nhiều loại tế bào khác như lympho bào B, đại thực bào, bạch cầu đơn nhân lớn, tế bào nguồn, tế bào xơ non, tế bào thần kinh, tế bào nội mạc

Sau khi đã gắn vào receptor của tế bào chủ, phân tử gp41 của HIV cắm sâu vào màng

tế bào giúp cho genome và enzyme sao mã ngược của HIV chui vào bên trong tế bào chủ, tiến hành quá trình sao mã ngược tạo thành chuỗi cDNA DNA 2 sợi này sẽ di chuyển về nhân của tế bào chủ và nhờ enzyme sao chép ngược endonuclease để gắn

đoạn cuối 3‟ DNA virus với đoạn cuối 5‟ DNA của tế bào chủ, như vậy sợi RNA và chuỗi cDNA kết hợp thành chuỗi kép DNA để tích hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, lúc này, HIV trở thành một bộ phận của bộ gen di truyền trong tế bào người, tránh được sự phòng vệ của cơ thể, tác dụng của thuốc và có thể gây bệnh Tế bào bị nhiễm HIV không hồi phục

HIV tồn tại trong tế bào dưới hai trạng thái, trạng thái tiềm tàng hoặc sinh sản Ở trạng thái tiềm tàng, DNA của HIV tồn tại dưới dạng tiền virus (provirus), không tạo

ra hoặc chỉ tạo ra ít RNA virus Nhưng khi tế bào đã nhiễm virus bị hoạt hoá bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể, như khi bị đồng nhiễm loại nhiễm trùng khác thì provirus đựơc hoạt hoá và chuyển sang trạng thái sinh sản, HIV nhân lên

Sự nhân lên của HIV qua 4 giai đoạn:

- Sao mã: cDNA provirus sao mã tạo thành RNA genome của HIV và mRNA

- Dịch mã: Nhờ mRNA, tế bào vật chủ tổng hợp các protein tạo ra virus mới

- Lắp ráp: Từ các thành phần được tổng hợp sau quá trình sao mã và dịch mã, các hạt HIV mới được lắp ráp ở bào tương tế bào

- Nảy chồi giải phóng virus mới: Các hạt virus mới gần màng sinh chất nảy chồi (budding) và HIV giải phóng ra ngoài, tạo nên thế hệ virus mới nhờ sự hoạt động của protease HIV mới tiếp tục xâm nhiễm vào tế bào mới khác để tiếp tục nhân lên, còn các tế bào đã giúp HIV nhân lên thì bị phá huỷ

Mức sinh sản của virus tuỳ thuộc vào từng loại virus, loại tế bào bị nhiễm và gen điều hoà sự nhân lên của virus.Các gen điều hoà là yếu tố tác động trực tiếp đến

sự sinh trưởng HIV, nếu gen tat hoạt động mạnh, gen nef hoạt động yếu thì provirus

sẽ phát triển nhanh và ngược lại tat hoạt động yếu, gen nef hoạt động mạnh thì

provirus sẽ ở trạng thái nằm yên Ngoài sự tồn tại của provirus còn có các tác động ngoài gen như: lympho bào bị nhiễm HIV sẽ bị kích hoạt sinh trưởng HIV do yếu tố hoại tử của u (TNF), hoặc do nhiễm Cytomegalo virus, Epstein Baar virus… Các tác nhân này được gọi chung là đồng yếu tố kích hoạt sự sinh trưởng của HIV

Hình 1 5: Vòng đời của HIV

1.9 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CƠ THỂ KHI NHIỄM HIV/AIDS

1.9.1 Những thay đổi miễn dịch khi nhiễm HIV

HIV có khả năng xâm nhập vào nhiều loại tế bào nhƣ tế bào máu, tế bào não, tế bào da nhƣng chủ yếu tấn công vào tế bào TCD4 và đại thực bào

Khi HIV xâm nhập vào cơ thể, hệ miễn dịch của cơ thể sẽ phản ứng theo 3 trạng thái sau [8]:

- HIV ở trạng thái provirus kéo dài trong nhiều tháng, nhiều năm: cDNA của virus tích hợp vào DNA tế bào chủ Khi virus tồn tại ở trạng thái này, cơ thể chưa có

KT kháng HIV trong huyết thanh nên không thể phát hiện HIV bằng các phản ứng huyết thanh học mà chỉ có thể nhận biết HIV bằng cách phân lập virus hoặc bằng kỹ thuật PCR Vì vậy, người nhiễm HIV ở trạng thái này là nguồn lây nhiễm rất nguy hiểm

- Hệ thống miễn dịch kiểm soát được tình trạng nhiễm HIV (Hệ thống miễn dịch có khả năng loại trừ HIV): số lượng và chức năng tế bào TCD4 còn đảm bảo Ở trạng thái này, có thể phát hiện được HIV bằng phản ứng huyết thanh học vì KT kháng HIV đã xuất hiện trong huyết thanh Một số người có thể khỏi bệnh, một số trở lại tình trạng provirus

- HIV phát triển nhanh hay chậm tuỳ thuộc vào khả năng kiềm chế của hệ thống miễn dịch Đa số trường hợp HIV phát triển chậm, tế bào bị nhiễm tiêu huỷ rất chậm Số ít trường hợp HIV phát triển nhanh, tế bào bị nhiễm tiêu hủy nhiều, nồng độ RNA-HIV tăng và số lượng tế bào TCD4 giảm nhiều và nhanh, các biểu hiện lâm sàng (nhiễm trùng cơ hội) xuất hiện sớm Vì vậy, những cơ thể ở trạng thái này có thể phát hiện được HIV bằng các kỹ thuật phát hiện KT đặc hiệu Nhờ đáp ứng miễn dịch của cơ thể mạnh hay yếu mà triệu chứng của HIV/AIDS xuất hiện muộn hay sớm

1.9.2 Suy giảm miễn dịch do HIV

Khi HIV xâm nhập vào cơ thể, nó không chỉ làm giảm về số lượng mà còn làm suy giảm chức năng của các tế bào miễn dịch đặc biệt là tế bào lympho T, lympho B

và đại thực bào Tuy nhiên, do HIV có ái tính đặc biệt với phân tử CD4 nằm trên bề mặt của tế bào lympho T (tế bào đóng vai trò nhạc trưởng quan trọng chỉ huy và điều

hòa quá trình đáp ứng miễn dịch) làm ly giải hoặc bất hoạt chức năng của tế bào này dẫn đến suy giảm tất cả các loại đáp ứng miễn dịch

Cơ chế giảm tế bào TCD4 do tác động trực tiếp của HIV [8]:

- Tế bào TCD4 bị phá hủy do HIV xâm nhập và nhân lên làm tăng tính thấm màng tế bào, gây ứ đọng calci và nước

- Khi virus nhân lên sẽ giải phóng một lượng lớn cDNA, RNA tự do trong bào tương tế bào, gây độc cho tế bào

- Dưới tác động của HIV làm tế bào TCD4 chết theo chương trình nhanh hơn bình thường

- Các phân tử CD4 mới hình thành trong bào tương chưa hiện diện trên bề mặt

tế bào đã bị liên kết với gp120 và sản phẩm gp120-CD4 trong bào tương sẽ làm chết

tế bào

Cơ chế suy yếu của tế bào TCD4 dưới tác động gián tiếp bởi HIV

- HIV phong bế quá trình chín của TCD4 chưa bị nhiễm thông qua

cytokine của tế bào bị nhiễm

- Do KN gp120 trên bề mặt tế bào TCD4 đã bị nhiễm lại tiếp tục gắn với CD4 của TCD4 chưa bị nhiễm tạo thành hợp bào là tế bào khổng lồ nhiều nhân có đời sống ngắn không quá 48 giờ

- Do cơ chế tự miễn, gp120 của virus bong ra từ tế bào TCD4 đã bị nhiễm HIV lại gắn với phân tử CD4 của tế bào chưa bị nhiễm nên trong máu xuất hiện KT kháng

gp120 của virus làm huỷ hoại tế bào T có cấu trúc bề mặt tương tự gp120 theo cơ chế gây độc tế bào (ADCC) hoặc theo cơ chế kết hợp bổ thể

- Do HIV phá hủy cả tế bào nguồn, tế bào non để biệt hoá thành tế bào lympho

Do TCD4 giảm cả về số lượng và chất lượng, các cytokine của TCD4 bị thiếu hụt làm giảm khả năng hỗ trợ hoạt hoá với các tế bào lympho B, đại thực bào và tế bào lympho T khác dẫn dến hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm về cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào

1.9.3 Diễn biến huyết thanh người nhiễm HIV/AIDS

Sau khi HIV chui vào trong tế bào chủ, diễn biến huyết thanh người chia làm 3 giai đoạn [3]:

- Giai đoạn nhiễm trùng khởi phát (Primary infection): Sau nhiễm HIV 1-2 tuần, chưa tìm thấy KN và KT kháng HIV trong huyết thanh nhưng từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6 sau nhiễm HIV, thường thấy KN p24 xuất hiện và sự hình thành KT kháng HIV typ IgM (IgM-anti-HIV) Sau đó KN p24 giảm dần đồng thời với sự xuất hiện

KT kháng p24 và KT kháng HIV typ IgA KT IgM và IgA xuất hiện sớm nhưng không qua được nhau thai nên không truyền sang cho thai nhi

- Thời kỳ nhiễm trùng tiềm tàng (Latent infection):

Ở giai đoạn này, KT kháng p24 mất dần đồng thời với sự giảm dần của nồng độ IgM anti-HIV để thay thế bằng sự hình thành IgG anti-HIV Thời kỳ này có thể kéo dài từ

3 tháng đến 10 năm thậm chí có thể kéo dài lâu hơn nữa tuỳ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể IgG anti-HIV xuất hiện muộn sau khi nhiễm HIV 6-8 tuần nhưng lại tồn tại lâu dài, ổn định trong suốt quá trình nhiễm HIV nên đã được sử dụng

để xét nghiệm sàng lọc IgG anti-HIV trong máu người mẹ nhiễm HIV có thể qua nhau thai để sang thai nhi và nó có thể tồn tại trong máu con tới 15-18 tháng vì vậy nên xét nghiệm tìm IgG anti-HIV ở trẻ trước 18 tháng tuổi luôn dương tính Ngoài ra,

ta có thể tìm thấy RNA-HIV và KN gp120 trong máu người bệnh

- Giai đoạn nhiễm trùng cấp: (Acute infection):

Giai đoạn này có sự xuất hiện của hội chứng AIDS Thời kỳ đầu có biểu hiện suy giảm miễn dịch do sự giảm sút tế bào TCD4 cũng như sự rối loạn miễn dịch của tế bào lympho B và đại thực bào nên lâm sàng có hạch sưng ở nhiều nơi kéo dài 2-4 tháng nhưng điều trị viêm không tác dụng Sau đó, hệ miễn dịch suy giảm trầm trọng, hội chứng AIDS xuất hiện toàn diện, người bệnh suy mòn và dẫn đến tử vong Trong huyết thanh bệnh nhân thấy sự xuất hiện trở lại của KN p24 và có thể thấy sự xuất hiện của KN gp41, KT kháng gp41, KT kháng gp120 và KT kháng p18

Hình 1.6 Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV

1.10 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN HIV TRONG CƠ THỂ

Phát hiện HIV là một việc rất quan trọng trong chẩn đoán, điều tra dịch tễ học, theo dõi diễn biến của bệnh và giúp cho điều trị hiệu quả [2], [5]

1.10.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV

Các phương pháp phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV có thể là phát hiện bản thân virus ở dạng hoàn chỉnh, RNA/cDNA virus hoặc phát hiện những KN đặc trưng của virus [6]

* Phân lập virus hoàn chỉnh

Bệnh phẩm có thể là: máu, dịch não tuỷ, dịch sinh dục, sữa mẹ, mảnh cắt tổ chức nhưng phổ biến nhất là sử dụng bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi

Sau khi phân lập, bạch cầu đơn nhân của người bệnh được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo có thêm những bạch cầu của người lành (có CD4) để virus thâm nhiễm, nhân lên đạt đủ mật độ để phát hiện ra bằng các kỹ thuật riêng như tìm KN hay enzyme đặc trưng của virus

Đây là một kỹ thuật có giá trị nhưng cho kết quả chậm sau khoảng 15 ngày nuôi cấy, trang bị hiện đại tốn kém nên chỉ sử dụng trong nghiên cứu, xác định chủng virus được phân lập, đánh giá tính kháng lại thuốc chống Retrovirus của HIV, chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh và ở những bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bất thường Độ nhạy của xét nghiệm chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh khi mới sinh khoảng 43% và khi trẻ trên 3 tháng có thể đạt 90-95% [18]

* Phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử kết hợp với phương pháp miễn dịch

Giá trị: Phát hiện được vị trí khư trú của HIV nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại đắt tiền

1.10.2 Phát hiện KN của HIV

KN HIV, đặc biệt KN vỏ nhân p24 có trong huyết thanh, huyết tương, dịch não tuỷ có thể được phát hiện bằng phương pháp ELISA tóm bắt kháng nguyên (Capture ELISA) hoặc bằng kỹ thuật RIA

Nguyên lý chung của các kỹ thuật này là dùng KT đa dòng (polyclonal antibody) kháng HIV cố định trong các giếng nhựa hoặc trên các viên bi polystyrene tiếp xúc với bệnh phẩm cần thử, sau đó, ủ tiếp phức hợp này với KT kháng HIV có gắn enzym hoặc chất phóng xạ Enzym sẽ làm biến đổi màu cơ chất Khi đo màu cơ chất hoặc đo hoạt tính phóng xạ có thể định tính và định lượng KN

Về lý thuyết người ta có thể phát hiện tất cả các KN của virus nhưng trên thực

tế, do tính đặc hiệu và ái lực của các KT chủ yếu hướng tới các protein chính trong

vỏ nhân (nucleocapsid) như p24 Vì vậy, kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện

KN p24 Dấu hiệu mất KN p24 ở những người đã có phản ứng huyết thanh học HIV dương tính là dấu hiệu nói lên sự khởi đầu của AIDS lâm sàng [24]

Đây là xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (98-99%) nhưng độ nhạy chỉ đạt 10-25%

ở trẻ sơ sinh và 50% ở trẻ lớn hơn

1.10.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV

Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được áp dụng rộng rãi trong công tác xét nghiệm, theo dõi điều trị và nghiên cứu sinh học di truyền của virus và là công cụ hữu

hiệu trong chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi tiến triển bệnh, chỉ định và theo dõi hiệu quả điều trị thuốc, nghiên cứu tính kháng thuốc

+ Các kỹ thuật định tính

- Kỹ thuật PCR

PCR thường ít được sử dụng hơn so với chẩn đoán huyết thanh học và chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nghi là mới nhiễm HIV còn đang trong giai đoạn cửa sổ và chưa thể phát hiện được kháng thể bằng phương pháp huyết thanh học [32]

+ Các kỹ thuật định lượng

Định lượng virus, RNA huyết tương hoặc DNA provirus là thông số quan trọng để theo dõi mức độ xâm nhập và nhân lên của HIV, chỉ định điều trị và theo dõi, đánh giá kết quả điều trị

- Kỹ thuật AMPLICOR

Kỹ thuật dùng để định lượng RNA HIV trong huyết tương Nhờ enzyme RT (Revese Transcriptase), sao chép ngược RNA thành cDNA Sản phẩm PCR sẽ được lai ghép với các mẫu dò đặc hiệu với DNA đích đã được cố định trên giá đỡ và được phát hiện với mẫu có gắn các tín hiệu cho phép đọc được bằng phương pháp so màu

- Kỹ thuật Real Time PCR

Đây là phương pháp cho phép khuếch đại và xác định số lượng các chuỗi DNA được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt Sau mỗi chu kỳ nhiệt, số lượng các bản sao DNA được tổng hợp tăng lên sẽ cho các tín hiệu phát quang tăng tỷ lệ thuận Dựa vào một gam mẫu chuẩn có số lượng DNA đích xác định tiến hành đồng thời cùng mẫu thử để xây dựng một đường chuẩn dựa trên số liệu bản sao DNA đích và giá trị Ct của từng mẫu tương ứng (Ct là thời điểm ở chu kỳ n của PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt so với tín hiệu nền) Nếu số lượng DNA bản đích càng lớn thì Ct càng nhỏ Có nhiều phương pháp sử dụng phép phát quang để xác định số lượng bản sao DNA được nhân lên Thông thường người ta thường dùng: SYBR Green 1 hoặc mẫu dò đặc hiệu

1.10.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV

Các kỹ thuật phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV thông qua các thành phần đặc hiệu kháng lại các thành phần cấu trúc của virus [2]

+ Kỹ thuật ngưng kết (agglutination)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý ngưng kết thụ động, những hạt như gelatin (SERODIA test), latex hoặc hồng cầu người làm giá đỡ cho các protein virus Khi cho tiếp xúc với KT kháng HIV, các hạt này tạo thành một mạng lưới ngưng kết có thể nhận định bằng mắt thường

Đây là kỹ thuật đơn giản, nhanh, không đòi hỏi trang bị cao có thể tiến hành hàng loạt nên có ý nghĩa điều tra dịch tễ, sàng lọc máu tuy nhiên có phản ứng dương tính giả

+ Kỹ thuật miễn dịch enzyme pha rắn ELISA

ELISA là phương pháp cho phép phát hiện hầu hết các mẫu xét nghiệm có KT kháng HIV Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do đó có thể cho những kết quả dương tính giả Để hạn chế nguy cơ này, cần phải có phương pháp kết hợp để khẳng định chẩn đoán của ELISA Western Blot (WB) là phương pháp hỗ trợ phổ biến nhất để khẳng định kết quả dương tính của ELISA, IFA cũng được dùng như một phương pháp thay thế cho WB

ELISA được ứng dụng để phát hiện các KT IgG anti-HIV, IgA anti-HIV hoặc IgM anti-HIV bằng 3 kỹ thuật sau:

- Kỹ thuật ELISA gián tiếp

KT kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng trên hạt nhựa) Phức hợp KN-KT được nhận biết bởi một cộng hợp là KT kháng Ig người có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng hiện

màu với một cơ chất thích hợp Giá trị mật độ quang của phản ứng màu tỷ lệ thuận với lượng KT kháng HIV hiện diện trong mẫu thử

Đây là xét nghiệm có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu không cao do thường bị dương

tính giả

- Kỹ thuật ELISA Sandwich

KT kháng HIV được cố định trong giếng để tóm bắt các KN virus trong mẫu thử và được phát hiện bởi kháng thể 2 gắn enzyme Giá trị mật độ quang của phản ứng màu

tỷ lệ thuận với lượng KN hiện diện trong mẫu thử ELISA sandwich thường được sử dụng để phát hiện KN p24 của HIV trong chẩn đoán sớm HIV

+ Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFA)

Nguyên lý của IFA cũng tương tự ELISA nhưng chất gắn đánh dấu là chất màu

huỳnh quang và kết quả được đọc dưới kính hiển vi huỳnh quang Phản ứng dương tính được thể hiện bằng những tế bào bị nhiễm HIV phát quang ở ngoại vi

+ Kỹ thuật Western Blot (WB)

Nguyên tắc: là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiện trên băng giấy, cho phép xác định KT kháng các thành phần khác nhau của protein virus Có WB riêng cho HIV-1 và HIV-2

HIV được ly giải và điện di trên gel polyacrilamide để phân tách các thành phần KN virus theo trọng lượng phân tử, sau đó được chuyển lên màng nitrocellulose hoặc PVDF (Polyvinylidene Difluoride) và được cắt thành từng dải băng để sử dụng Mỗi dải băng dùng cho một mẫu thử nghiệm Ủ huyết thanh của mẫu thử với băng giấy

Nếu trong mẫu thử có KT kháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là KN tương ứng và được phát hiện bằng cộng hợp là KT kháng IgG người đã được đánh dấu bằng enzyme cho màu phản ứng với cơ chất Vị trí các băng màu tương ứng với thành phần protein virus gắn với KN đặc hiệu

Giá trị: Xét nghiệm khẳng định WB có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được thực hiện trong trường hợp các kết quả xét nghiệm phát hiện sàng lọc không phù hợp và khó biện luận

1.10.5 Các bộ sinh phẩm (Kit) chẩn đoán HIV:

Có rất nhiều hãng trên thế giới đã sản xuất và bán các bộ sinh phẩm (kit) chẩn đoán HIV Các bộ kit đã được chuẩn y bao gồm:

Các bộ kit chẩn đoán bằng ELISA với các tên thương mại: MUREX HIV-1.2.0 (GE94/95) của Hãng MUREX BIOTECH LTD U.K., HIV-1/HIV-2 GO EIA của Hãng ABBOTT GMBH & CO GERMANY, HIV ½ ELISA TEST KIT (HIVASE ½) của Hãng GENERAL BIOLOGICALS CORP TAIWAN, GENEDIA HIV ½ ELISA 3.0 TEST KIT của Hãng GREEN CROSS LIFE SCIENCE CORP KOREA, VIRONOSTIKA HIV-I ANTIGEN MICROELISA SYSTEM của Hãng ROCHE MOLECULAR SYSTEMS INC USA v.v

Các bộ chẩn đoán bằng Western blot bao gồm: HIV BLOT 2.2 của Hãng GENE LABS DIAGNOSTIC PTE LTD SINGAPORE, NEW LAV BLOT I của Hãng STANDARD DIAGNOSTICS KOREA, HIV WESTERN BLOT TEST của Hãng IMMUNETICS INC USA v.v

Các bộ chẩn đoán bằng phương pháp thử nhanh bao gồm: IMMUNOCOMB II HIV 1 & 2 BI-SPOT của Hãng ORGENICS LTD ISRAEL, HIV 1/2 RAPID TEST KIT của Hãng STANDARD DIAGNOSTICS KOREA, HIV ½ RAPID TEST KIT của Hãng ACON BIOTECH (HANGZHOU) CO CHINA, PAREEKSHAK HIV ½ SPOT TEST của Hãng BHAT BIOTECH INDIA (P) LTD., BANGALORE INDIA v.v

Các bộ chẩn đoán bằng phương pháp PCR bao gồm: AMPLICOR HIV-I MONITOR KIT của Hãng ROCHE MOLECULAR SYSTEMS INC USA, COBAS AMPLICOR HIV-I MONITOR KIT của Hãng ROCHE MOLECULAR SYSTEMS INC USA

Nói chung hầu hết các nước trên thế giới đều có các Hãng sản xuất sinh phẩm chẩn đoán HIV Tuy nhiên họ có bản quyền của họ và không bao giờ cho biết họ chế kháng nguyên hoặc thiết kế phản ứng theo phân typ nào của HIV Vì vậy việc nghiên cứu tự sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp và tự sản xuất các kit chẩn đoán HIV dựa trên sự lưu hành của các phân typ HIV ở nước mình là hết sức cần thiết

1.10.6 Nghiên cứu các protein tái tổ hợp để tạo kit chẩn đoán:

Từ năm 1984, sau khi có công trình công bố của nhóm tác giả về phát hiện, phân lập và nuôi cấy được HIV trên tạp chí Science, thì việc nghiên cứu để tạo ra các kit chẩn đoán HIV cũng được nhiều phòng thí nghiệm quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên, chế tạo kit chẩn đoán HIV bằng các kháng nguyên tự nhiên có các điều bất lợi sau đây:

- Nuôi cấy HIV là một công việc làm có nguy cơ lây nhiễm cao cho người trực tiếp sản xuất

- Quá trình tinh chế là rất khó khăn và khó thu được lượng lớn kháng nguyên tự nhiên nên giá thành kit chẩn đoán cao

- Rất khó có thể tách riêng các kháng nguyên đặc hiệu có tính sinh miễn dịch cao vì vậy cần phải phân tách protein bằng điện di gel polyacrylamide rồi chuyển sang màng và dùng để phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng HIV (kỹ thuật Western blot)

Chính vì vậy việc nghiên cứu tạo ra các protein tái tổ hợp có tính đặc hiệu cao để tạo kit chẩn đoán HIV đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm Ngay

từ những năm của thập niên 1980, đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo protein tái tổ

hợp của HIV trong E coli Ví dụ như nhóm nghiên cứu của Ghrayeb J et al [36] đã tạo ra được kháng nguyên P24 tái tổ dạng tinh chế từ E coli và ứng dụng để phát hiện

được kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân Năm 1987, các kháng

nguyên tái tổ hợp P24, GP120 và GP41 cũng đã được biểu hiện thành công trong E

coli Các kháng nguyên tái tổ hợp tinh chế đã được sử dụng để phát hiện kháng thể

kháng HIV bằng ELISA [44] Nhóm của các tác giả Shoeman RL et al cũng đã biểu

hiện trong E coli, thu nhận và tinh sạch các protein P24, Gp41 và GP120 và chế tạo

thành công các bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV bằng ELISA và Western blot Chỉ

những peptide được biểu hiện trong E coli từ những epitope chọn lọc từ các vùng nhất định của gen p24, gp120 và gp41 cũng có ái lực và tính đặc hiệu cao với kháng

thể kháng HIV và được sử dụng để phát hiện HIV bằng ELISA Các tác giả Nhật Bản cũng đã thành công trong việc tạo ra một lượng lớn protein P24 tái tổ hợp tinh sạch

biểu hiện từ E coli để chế tạo kit chẩn đoán Bằng việc cải tiến hệ vector biểu hiện,