nghiên cứu công nghệ chế tạo kit chẩn đoán nhanh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (prrs) trên lợn

“Nghiên cứu công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh hội chứng Rối loạn sinh sản và Hô hấp PRRS trên lợn” hô hấp PRRS trên lợn” năm 2010 của Trường Đại học Nông nghiệp Nội dung tham gia chủ

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS) TRÊN LỢN”

Mã số: 05/2009- ĐTĐL

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Lan

8980

Hà Nội- 2011

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS) TRÊN LỢN”

TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Hà nội, ngày tháng năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên: Nguyễn Thị Lan

Ngày, tháng, năm sinh: 10/05/1974 Nam/Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sỹ

Chức danh khoa học: Giảng viên chính

Chức vụ: Phó bộ môn bệnh lý – Khoa Thú y - ĐH Nông nghiệp Hà Nội

Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Địa chỉ tổ chức: Trâu Quỳ - Gia Lâm – Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: 31-C2 Ciputra- Tây Hồ - Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

Điện thoại: 043 8276 346 Fax: 043 8276 554

Email: webmaster@hua.edu.vn

Website: www.hua.edu.vn

Địa chỉ: Trâu Quỳ - Gia Lâm – Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Trần Đức Viên

Số tài khoản: 30101001

Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Gia Lâm

Tên cơ quan chủ trì đề tài: Bộ Giáo dục và đào tạo

II TỔ CHỨC THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài

- Theo hợp đồng đã ký kết: từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 12 năm 2011

- Thực tế thực hiện: từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 12 năm 2011

- Được gia hạn (nếu có): Không

STT Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi

Đối với đề tài:

1 Trả công lao động (Khoa học, phổ thông) 1.155 1.155 0 1.155 1.155 0

2 Nguyên, vật liệu, năng lượng 1.500 1.500 0 1.500 1.500 0

Tổng cộng 3.505 3.505 0 3.505 3.505 0

- Lý do thay đổi (nếu có)

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác

định nhiệm vụ, xét chọn phê duyệt kinh phí, hợp đồng điều chỉnh (thời gian, nội

dung, kinh phí thực hiện… nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án

(đơn, kiến nghị điều chỉnh… nếu có)

2

Số

1412/QĐ-BKHCN, Ngày

9/7/2008

Quyết định của Bộ trưởng Bộ KH và

CN về việc phê duyệt tổ chức và cá nhân chủ trì đề tài độc lập cấp nhà

nước năm 2009

3 Số

1989/QĐ-BKHCN, Ngày

12/9/2008

Quyết định của Bộ trưởng Bộ KH và

CN về việc phê duyệt kinh phí đề tài độc lập cấp nhà nước năm 2009

4 Số:

880/NNH-KH&QT

, ngày 31/07/2009

CÔNG VĂN V/v Điều chỉnh kinh phí thực hiện

2009

7 Số 1410/NNH-KH

& QT,05 /12/2009

CÔNG VĂN V/v Điều chỉnh kinh phí thực hiện

nhà nước

Mã số 05/2009 - ĐTĐL

13

Số: 1174/QĐ-NNH

ngày 20/ 07/ 2010

QUYẾT ĐỊNH V/v phê duyệt Hồ sơ mời thầu gói thầu: “ KIT và hóa chất phục vụ đề tài nghiên cứu công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên lợn” thuộc Đề tài “Nghiên cứu công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên lợn”

14

Số: 511/TTr-NNH

, ngày 20/ 05/ 2010

TỜ TRÌNH Phê duyệt Kế hoạch đấu thầu và Hồ

sơ mời thầu cho các gói thấu thuộc

Đề tài độc lập cấp nhà nước:

“Nghiên cứu công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh hội chứng Rối loạn sinh sản và Hô hấp (PRRS) trên lợn”

hô hấp (PRRS) trên lợn” năm 2010 của Trường Đại học Nông nghiệp

Nội dung tham gia chủ

yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú

và Phát triển nông thôn

- Thu thập trao đổi các thông tin tài liệu về tình hình dịch bệnh tai xanh

ở Việt Nam

- Giúp thu thập mẫu và chẩn đoán các mẫu dương tính

- Tư vấn và giúp đỡ một số kỹ thuật và chẩn đoán nghiên cứu

- Phân lập virus PRRS

- Thử nghiệm sản xuất Kit

- Chẩn đoán 10 mẫu

PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR

- Phân lập

10 chủng virus PRRS

2 Công ty

TNHH một

Công ty TNHH một

- Thu thập mẫu

- Thử nghiệm sản xuất

Kit

- Đánh giá chất lượng Kit chẩn đoán trên diện rộng

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối

hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

SốT

T

Tên cá nhân đăng

ký theo thuyết minh

Tên cá nhân đã tham gia thực hiện Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú

1 TS Nguyễn Thị Lan TS Nguyễn Thị Lan

Chủ trì đề tài, phân lập, chẩn đoán hóa miễn dịch, xác định đặc tính sinh học phân

tử, sản xuất kháng thể, chế tạo kit, đánh giá chung

-Các chủng virus PRRS phân lập được

- Đặc tính sinh học virus PRRS

- Kit chẩn đoán

2

TS Nguyễn Hữu

Nam

TS Nguyễn Hữu Nam

Thu thập mẫu, làm hóa miễn dịch bệnh lý, thử nghiệm kit

- Các mẫu bệnh phẩm, các kết quả chẩn đoán

3

TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Bá Hiên

Thu thập mẫu, phân lập virus, chế tạo kháng thể, cấu trúc phân tử của virus

- Các chủng virus PRRS, Các loại kháng thể

Thu thập mẫu, thử nghiệm kit

- Kết quả thử nghiệm Kit

5

TS Lê Huỳnh

Thanh Phương

TS Lê Huỳnh Thanh Phương

Thu thập mẫu, xác định đặc tính sinh học của virus

- Đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS

6

TS Bùi Trần Anh

Đào

TS Bùi Trần Anh Đào

Thư ký, thu thập mẫu, tham gia chẩn đoán bệnh bằng các kỹ thuật bệnh lý

- Kết quả chẩn đoán PRRS

7 GVC Lê Văn Lãnh GVC Lê Văn Lãnh Phân lập virus, thử nghiệm kit - Kết quả phân lập

virus PRRS

8

TS Tô Long Thành TS Tô Long Thành

Thu thập mẫu, chế tạo kháng thể, đánh giá chất lượng kit

9 TS Trần Xuân Hạnh

TS Trần Xuân Hạnh

Thu thập mẫu, thử nghiệm kit

- Lý do thay đổi (nếu có):

6 Tình hình hợp tác quốc tế

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1 Trường Đại học Miyazaki

4 Trường đại học Chonbuk,

Chungbuk, Seoul (Hàn Quốc)

5 Trường đại học Tokyo (Nhật

Bản)

6 Công ty Adotech (Nhật Bản)

- Một đoàn ra Nhật Bản 07 người, tháng 7 năm 2010

1 Hội thảo về PRRS, năm 2011,

kinh phí 7 triệu, địa điểm Khoa

8 Tóm tắt các nội dung công việc chủ yếu

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: hội thảo khoa học, điều

tra, khảo sát trong nước và ngoài nước)

Thời gian

(bắt đầu, kết thúc – tháng… năm)

Người, cơ quan thực hiện

1

Thu thập mẫu bệnh phẩm

(Trên các vùng dịch, các

giống lợn, tuổi lợn, cơ

quan lấy mẫu bệnh phẩm)

Tháng 1/2009 đến tháng 5/2010

Tháng 1/2009 đến tháng 5/2010

Bùi Trần Anh Đào Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Thị Lan

Tô Long Thành Trần Xuân Hạnh Cục thú y, Công ty Navetco

ĐHNN- HN

2 Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào 4/2009 đến 7/2010 4/2009 đến 7/2010

Nguyễn Thị Lan Nguyễn Bá Hiên ĐHNN- HN

4/2009 đến 7/2010

Lê Huỳnh Thanh Phương

Lê Văn Lãnh ĐHNN- HN

1/2010 đến 10/2010

Nguyễn Thị Lan Phạm Văn Tự Nguyên Hữu Nam Bùi Trần Anh Đào ĐHNN- HN

5/2010 đến 8/2010

Lê Huỳnh Thanh Phương

Nguyễn Thị La ĐHNN- HN

5/2010 đến 10/2010

Tô Long Thành Nguyễn Thị Lan Nguyễn Bá Hiên

kháng thể đa dòng) Nguyễn Hữu Nam

ĐHNN- HN Cục Thú y

7 nhanh hội chứng PRRS Chế tạo KIT chẩn đoán đến 4/2011 11/2010 11/2010 đến 4/2011

Nguyễn Hữu Nam Nguyễn Thị Lan

Lê Huỳnh Thanh Phương

ĐHNN- HN

8 Đánh giá thử nghiệm bộ KIT sản xuất 4/2011 đến 5/2011 4/2011 đến 5/2011

Huỳnh Thị Mỹ Lệ

Tô Long Thành Nguyễn Bá Hiên ĐHNN- HN Cục thú y

9 Thử nghiệm đánh giá trên diện hẹp 4/2011 đến 8/2011 4/2011 đến 8/2011

Phạm Văn Tự

Lê Văn Lãnh Nguyễn Hữu Nam Trần Văn Hạnh

Tô Long Thành ĐHNN- HN Cục thú y Công ty Navetco

10 Thử nghiệm đánh giá đại

trà trong sản xuất

8/2011 đến 10/2011

8/2011 đến 10/2011

Phạm Văn Tự Nguyễn Bá Hiên Nguyễn Hữu Nam Trần Văn Hạnh ĐHNN- HN Cục thú y Công ty Navetco

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH & CN đã tạo ra:

và tin cậy

- xây dựng được đường biểu diễn sự nhân lên 10 chủng virus

- Đăng ký 6 đoạn gen trên ngân hàng gen

2 Quy trình công nghệ

chế tạo kit

Tạo kit có độ nhạy và độ đặc hiệu cao có thể chuyển giao vào sản xuất kinh doanh

- Tạo Kit có độ nhạy và độ đặc hiệu trên 90%

- Nghiên cứu đặc các điều kiện để thương mại hóa

Được cấp có thẩm quyền đánh giá và nghiệm thu

c) Sản phẩm dạng III:

Yêu cầu khoa học cần đạt STT Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

Số lượng, nơi công bố

(tạp chí, nhà xuất bản)

lập virus gây hội

chứng rối loạn sinh

sản và hô hấp trên

lợn nái

01 02

Tạp chí KHKT Nông nghiệp

d) Kết quả đào tạo

Số lượng

STT Cấp đào tạo, chuyên

ngành đào tạo Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

(ghi rõ tên, địa chỉ nơi ứng dụng)

tốt

2 Đánh giá về kết quả do đề tài, dự án mang lại

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

Yêu cầu phát triển của ngành chăn nuôi đòi hỏi ngành thú y phải đi trước một bước để có thể sẵn sàng đáp ứng với tình hình dịch bệnh mới phát sinh hoặc các bệnh nhập ngoại Việc tạo ra đội ngũ cán bộ có khả năng ứng dụng, triển khai khoa học công nghệ mới là điều cần thiết Đề tài đã góp phần bồi dưỡng một đội ngũ cán bộ và chuyên gia lành nghề

b) Hiệu quả kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Thành công của việc chế tạo Kit chẩn đoán nhanh PRRS có ý nghĩa thực tiễn vô cùng to lớn trong việc phát hiện sớm tiến tới ngăn ngừa và khống chế dịch bệnh trong điều kiện diễn biến phức tạp Phương pháp phát hiện nhanh cho phép khoanh vùng dịch bệnh và có biện pháp xử lý kịp thời hạn chế lây lan và

IV Nghiệm thu cơ sở 12/2011

Chủ nhiệm đề tài Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

MỤC LỤC

Phần I MỞ ĐẦU 1

Phần II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 10

2.1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học 10

2.2 Phương pháp mổ khám 11

2.3 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý 11

2.4 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 13

2.5 Phương pháp tách chiết RNA 16

2.6 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 16

2.7 Phương pháp nuôi cấy tế bào 18

2.8 Phương pháp phân lập virus PRRS trên tế bào tổ chức 19

2.9 Phương pháp xác định TCID50 20

2.10 Phương pháp xác định hiệu giá virus 21

2.11 Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus 21

2.12 Phương pháp giải trình tự gen 21

2.13 Phương pháp xử lý số liệu 23

2.14 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein 23

2.15 Phương pháp chế tạo kháng thể đa dòng 24

2.16 Phương pháp ELISA 25

2.17 Phương pháp tinh chế kháng thể 26

2.18 Phương pháp chế tạo kháng thể đơn dòng 28

2.19 Phương pháp chế tạo KIT 29

2.20 Phương pháp đánh giá chất lượng KIT 35

Phần III KẾT QUẢ 39

1 Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm 39

2 Phân lập virus PRRS 58

3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập được62

3.1 Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathogenic effect) của virus PRRS 62

3.2 Xác định hiệu giá của các chủng virus phân lập được 66

3.3 Quy luật nhân lên trên môi trường tế bào Marc145 của virus PRRS phân lập được 68

4 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng PRRSV phân lập được 74

4.1 Kết quả phản ứng RT-PCR 74

4.2 Kết quả giải trình tự gen của các chủng virus PRRS nghiên cứu 75

4.3 Kết quả truy cập ngân hàng gen 76

4.3.1 Kết quả so sánh trình tự nucleotide 76

4.4 Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 80

5 Nghiên cứu chọn lọc chủng giống virus PRRS phù hợp để làm kháng nguyên82 5.1 Nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào qua 10 đời cấy chuyển 82

5.2 Hiệu giá virus ở các đời cấy truyền 84

6 Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng thể đặc hiệu 89

6.1 Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS 89

6.2 Kết quả chế tạo kháng thể đa dòng 90

6.2.1 Gây tối miễn dịch cho chuột lang 90

6.3 Kết quả chế tạo kháng thể đơn dòng 97

6.3.1 Gây tối miễn dịch cho chuột bạch balb/c: 97

6.3.2 Thu tế bào lách và lai tế bào lách với tế bào Myeloma 98

7 Chế tạo KIT chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 109

7.1 Chế tạo Gold particle: 109

7.2 Xác định pH và nồng độ protein phục vụ việc chế tạo conjugate 111

7.3 Nghiên cứu quy trình phân dải hấp phụ 115

7.4 Nghiên cứu lắp ghép các tiểu phần vào khuôn KIT 116

8 Đánh giá thử nghiệm bộ KIT sản xuất 118 8.1 Nghiên cứu lựa chọn mẫu huyết thanh âm tính và huyết thanh dương tính 118

8.2 Nghiên cứu đánh giá độ nhạy của KIT 119

8.3 Nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của KIT 121

8.4 Đánh giá giới hạn chẩn đoán của KIT 122

8.5 Nghiên cứu khả năng phát hiện chéo một số virus gây bệnh cho lợn 123

9 Thử nghiệm đánh giá KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên diện hẹp 124

9.1 Lựa chọn địa điểm thử nghiệm KIT và thử nghiệm KIT 124

9.2 Kết quả so sánh với các phương pháp chẩn đoán khác 125

10 Thử nghiệm đánh giá KIT chẩn đoán nhanh PRRS đại trà trong sản xuất 127

10.1 Lựa chọn địa điểm thử nghiệm KIT 127

10.2 Kết quả thử nghiệm 128

10.3 Kết quả so sánh với các phương pháp chẩn đoán khác 129

11 Nghiên cứu các yêu cầu của sản phẩm để có thể đủ điều kiện thương mại hoá 130

11.1 Chất lượng của KIT chẩn đoán 131

11.2 Giá thành của KIT 132

11.3 Tiện dụng trong sử dụng và bảo quản, mẫu mã sản phẩm 134

11.4 Chiến lược Marketing tốt 134

Phần IV KẾT LUẬN 136

Phần V TÀI LIỆU THAM KHẢO 138

5.1 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 138

5.2 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 142

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 39

Bảng 3.2 Bệnh tích đại thể của các lợn nghi mắc PRRS 43

Bảng 3.3 Số lượng các mẫu bệnh phẩm, block và slide dùng trong nghiên cứu 47 Bảng 3.4 Một số biến đổi vi thể của các lợn nghi mắc PRRS 50

Bảng 3.5 Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS 53

Bảng 3.6 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch các mẫu lợn mắc PRRS 54

Bảng 3.7 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào Marc 145 58

Bảng 3.8 Các chủng virus PRRS phân lập được sơ bộ lựa chọn cho nghiên cứu 60

Bảng 3.9a Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được.63 Bảng 3.9b Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được 64 Bảng 3.10 Hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được 66

Bảng 3.11 Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu đặc tính sinh học 67 Bảng 3.12 Hiệu giá virus của chủng virus 227-HY (lg TCID50) 68

Bảng 3.13 Kết quả xác định hiệu giá virus của chủng virus vacxin 69

Bảng 3.14 Hiệu giá virus và khả năng nhân lên của các chủng PRRS qua các đời73 Bảng 3.15 Các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử 74

Bảng 3.16 Mức độ tương đồng nucleotide và axit amin giữa các chủng virus PRRS phân lập chủng vacxin %) 79

Bảng 3.17 Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus qua các đời 83 Bảng 3.18 Hiệu giá của các chủng virus qua các đời cấy truyền 84

Bảng 3.19 Kết quả hiệu giá virus của các chủng virus ở các thời điểm khác nhau qua các đời cấy truyền 85

Bảng 3.20 Kết quả chọn chủng virus PRRS để chế kháng nguyên 88

Bảng 3.21 Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS 89

Bảng 3.22 Một số biến đổi bệnh lý đại thể của chuột được gây miễn dịch với kháng nguyên virus PRRS 91 Bảng 3.23 Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV 92 Bảng 3.24 Nồng độ kháng thể kháng PRRSV sau khi tinh chế 94 Bảng 3.25 Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV 95 Bảng 3.26 Khả năng phản ứng chéo của các chủng virus PRRS và kháng thể

đa dòng sản xuất ra 96 Bảng 3.27 Kết quả phản ứng ELISA đánh giá hiệu giá hỗn hợp kháng thể đa dòng 96 Bảng 3.28 Bố trí thí nghiệm tiêm chuột 97 Bảng 3.29a Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được gây miễn dịch với virus PRRS 227HY 99 Bảng 3.29b Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được gây miễn dịch với virus PRRS 182NA 100 Bảng 3.29c Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được gây miễn dịch với virus PRRS 374HN 101 Bảng 3.29d Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được gây miễn dịch với virus PRRS CL2 102 Bảng 3.29e Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được gây miễn dịch với virus PRRS Amervac 103 Bảng 3.29f Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được gây miễn dịch với virus PRRS MLV 104 Bảng 3.30 Kết quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng kháng thể kháng PRRSV 106 Bảng 3.31 Kết quả xác định nồng độ kháng thể đơn dòng sản xuất ra 107 Bảng 3.32 Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra khả năng kết hợp kháng thể đơn dòng với kháng nguyên virus PRRS 109 Bảng 3.33 Nồng độ Sodium Citrate ảnh hưởng đến kích cỡ gold particle 110

Bảng 3.34 Giá trị OD tương ứng với độ pH 111 Bảng 3.35 Xác định nồng độ protein phù hợp cho việc chế tạo conjugate 112 Bảng 3.36 Công thức chế tạo conjugate (Thể tích=60ml) 113 Bảng 3.37 Kết quả của phản ứng immunoblotting 114 Bảng 3.38 Thông tin về các lô conjugate chế tạo được 115 Bảng 3.39 Thông tin về các thành phần cần thiết cho chế tạo KIT 116 Bảng 3.40 Hồ sơ mẫu huyết thanh dương tính 118 Bảng 3.41 Hồ sơ mẫu huyết thanh âm tính 119 Bảng 3.42 Kết quả đánh giá độ nhạy của KIT chẩn đoán PRRS 119 Bảng 3.43 Kết quả độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán PRRS 121 Bảng 3.44 Kết quả đánh giá giới hạn chẩn đoán của KIT chẩn đoán PRRS122 Bảng 3.45 Kết quả thử khả năng phát hiệ chéo một số virus gây bệnh cho lợn 123 Bảng 3.46 Địa điểm được lựa chọn thử nghiệm trên diện hẹp 124 Bảng 3.47 Kết quả thử nghiệm KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên diện hẹp 125 Bảng 3.48 Kết quả so sánh các phương pháp thử nghiệm 126 Bảng 3.49 Địa điểm được lựa chọn thử nghiệm trên diện rộng 128 Bảng 3.50 Kết quả thử nghiệm KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên diện rộng 128 Bảng 3.51 Kết quả so sánh các phương pháp thử nghiệm 130 Bảng 3.52 Dự kiến giá thành KIT theo số lượng sản phẩm 132 Bảng 3.53 So sánh giá thành và thời gian cho kết quả của KIT và các phương pháp chẩn đoán khác 133

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Thuật ngữ viết tắt Thuật ngữ chi tiết

BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính

CPE Cytophathogenic Effect

DAB 3,3-diaminobenzidine

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

MLV Modifier Life Vacine

MOI Multiplicity Of Infection

NC Nitrocellulose Membrane

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSs Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Strain PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

TCID50 Tissue Culture Infective Dose

TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

Ở Trung Quốc, trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn có độc lực cao đã gây ra đại dịch

ở 10 tỉnh phía Nam, làm cho hơn hai triệu lợn ốm, trong đó chết khoảng 400.000 con Tháng 7 năm 2007, dịch tiếp tục lan rộng ở các đàn lợn thuộc 25 tỉnh, thành phố với trên 180.000 lợn ốm; chết trên 45.000 con [51]

Tại Việt Nam, năm 1997, kiểm tra huyết thanh học cho biết 10/51 lợn giống nhập từ Mỹ có huyết thanh dương tính với virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) [3] Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn bắt đầu vào tháng 3 năm

2007 [6] Sau đó dịch lây lan nhanh và rộng khắp các tỉnh miền Bắc Ngày nay hội chứng PRRS đã lan ra khắp thế giới gây thiệt hại kinh tế cho ngành công nghiệp chăn nuôi lợn [62]

Mục tiêu:

- Nghiên cứu được công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh PRRS ở lợn

- Tạo được sản phẩm có đủ điều kiện để thương mại hóa

Đối tượng:

Lợn nghi mắc PRRS nuôi ở Việt Nam

Các chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở Việt Nam

Tính cấp thiết:

Genome của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV)

là một sợi đơn RNA và virus là thành viên của họ Arteriviridae thuộc lớp Nidovirales [50] Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác nhau trên thế giới [63] PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu gen: loại

I, European genotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện là chủng Lelystad (LV), gồm 3 subtyp đã được xác định và loại II: Northern American genotype gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc

Mỹ ATCC - VR2332 PRRSV phân lập ở Trung Quốc được chỉ định là thành viên của kiểu gen II [56,77] Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide [38,44] Sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15

kb, mã hóa 9 ORFs [59,61] Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen polymerase là ORF1a và ORF1b và bảy gen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, và 7 [9] ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75% bộ gen của virus và được đặc trưng bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà

sự tự phân tách làm phát sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc polymerase [68] Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5, tất cả

mã hóa cho các protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tương ứng [42] Các ORF2b mới được định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus được chỉ định GP2b [43] ORF7 mã hóa các protein nucleocapsid không glycosyl hóa (N), chiếm 20-40% của hàm lượng protein của virion

[47] ORF6 mã hóa các protein tương tự như vậy không glycosyl hóa (M) [46] Heterodimers thành lập bởi GP5 và M đã được tìm thấy trong lưới nội chất của tế bào nhiễm bệnh [48], và đã được đề xuất được tham gia vào thụ thể tương tác với tế bào nhiễm virus

Sự hiện diện của virus PRRS có đặc tính di truyền khác nhau trong các lợn nhiễm PRRS có thể làm phức tạp việc kiểm soát bệnh bằng cách tiêm chủng, bởi vì hiệu quả vacxin phòng PRRS bị giảm khi virus đương nhiễm là một loại virus của một kiểu gen khác [7] hay của một nhóm phát sinh khác trong cùng một kiểu gen của chủng vacxin gốc [49]

Ở Trung Quốc [74], các ổ dịch đầu tiên của dịch tai xanh đã được ghi lại vào năm 1995 ở hầu hết tất cả các tỉnh (bao gồm cả Hồng Kông) Do tác động lớn tới nền kinh tế ở Trung Quốc, bệnh đã được công nhận là một trong những bệnh virus nghiêm trọng nhất cho các trang trại nuôi lợn Dòng PRRSV Trung Quốc đầu tiên được phân lập vào năm 1996, và trình tự bộ gen hoàn chỉnh của PRRSV Trung Quốc cô lập BJ-4 lần đầu tiên được báo cáo vào năm 2001 [57] PRRSV chủng độc lực cao là tác nhân gây sốt cao và tỷ lệ

tử vong cao ở lợn mọi lứa tuổi Kể từ tháng 5 năm 2006, các chủng PRRSV độc lực cao đã xuất hiện ở Trung Quốc Gần đây, đặc điểm di truyền của các chủng PRRSV phân lập được ở Trung Quốc khác với PRRSV phân lập ở Bắc

Mỹ và châu Âu [37] Người ta đã ghi nhận rằng các chủng PRRSV này khác nhau về độc lực [41] và có sự thay đổi di truyền [78] Điều này dẫn đến hệ quả là các chủng virus dùng để chế tạo vacxin hoặc kháng nguyên chiết tách

từ virus có thể không phòng bệnh được cho đàn lợn

Người ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả 2 typ loại I và loại II phân lập được khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide

và amino axit của VR-2332 so với LV là 76%( ORF-2 ); 72%( ORF-3 ); 80%(ORF-4 và 5); 91% (ORF-6); 74% (ORF-7); phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hóa đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen [58,64,75]

Các chủng virus PRRS gây bệnh cho động vật cảm thụ với biểu hiện bệnh lý giống nhau nhưng tính tương đồng về cấu trúc nucleotide của dòng I

và II sai khác khoảng 60% [38] Các chủng virus phân lập được từ các vùng địa lý khác nhau có sự khác nhau về tính di truyền Bản thân virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotide khá cao đến 20%, đặc biệt

Nghiên cứu các đặc tính sinh học của các chủng PRRSV đã được tiến hành từ khi bệnh bắt đầu xuất hiện trên thế giới nhưng cho đến nay nó vẫn được quan tâm nghiên cứu do virus luôn luôn biến đổi về cấu trúc di truyền để tăng khả năng gây bệnh Từ 2 chủng nguyên gốc ban đầu trải qua hai mươi năm tồn tại và phát triển nó đã tạo ra vô số biến chủng khác nhau theo các vùng địa lý khác nhau Các nghiên cứu của Trung Quốc [51] đã so sánh đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng PRRSV phân lập được ở Trung Quốc với chủng gốc (có độc lực cao) được sử dụng để làm vacxin sống nhược độc (Modifier life vacine-MLV) và chủng ATCC-VR2385 được biết đến có độc lực cao bằng cách gây bệnh cho các nhóm lợn khác nhau Các phân tích sinh học phân tử và đặc tính sinh học cho thấy PRRSV 98-38803 phân lập ở Trung Quốc (99,5% amino acid tương đồng dựa trên gen ORF5) gây ra các tổn thương viêm phổi tương tự như các loại virus gốc, nhưng khác nhau ở mức độ nghiêm trọng và thời gian khởi phát bệnh, nghiên cứu đã phân tích 5 gen (GP2, GP3, GP4, GP5 và NSP2) của 7 chủng PRRSV phân lập ở Trung Quốc, được chỉ định là: LS-4, HM-1, HQ-5, HQ-6, GC-2, GCH-3 và

ST-7 Năm 2008, những chủng đã được lập trình tự và phân tích Kết quả là phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự nucleotide của ORF2-5 và NSP2 cho thấy bảy chủng PRRSV phân lập ở Trung Quốc thuộc các phân nhóm di truyền giống nhau và có liên quan đến các kiểu gen ở Bắc Mỹ PRRSV Phân tích so sánh với các trình tự có liên quan của một chủng PRRSV khác đã phân lập ở Trung Quốc (BJ-4) và Bắc Mỹ (VR2332 và MLV) cho thấy rằng những virus phân lập có 80,8-92,9% tương đồng với VR-2332, và 81,3-98,8% với MLV và 80,7- 92,9% với BJ-4 Tuy nhiên, tất cả các chủng virus được nghiên cứu đều có 97% tính tương đồng với các chủng gây bệnh độc lực cao ở Trung Quốc Ngoài ra, có sự đột biến lớn về amino acid (aa) trong protein GP5 và protein Nsp2 khi so sánh với các chủng phân lập trước đó trên thế giới

Hai mươi tám chủng virus PRRSs (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome strain) được phân lập từ các trang trại nuôi lợn khác nhau tại Hàn Quốc từ năm 2002 và 2003 [71], đã giải trình tự cho khung đọc

mở ORF5 và độ dài hệ gen đầy đủ, so sánh với PRRSVs trong nhiều báo cáo

từ Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á Tất cả các chủng virus phân lập ở Hàn Quốc được kiểm tra có kiểu gen di truyền giống với dòng virus của Bắc Mỹ Đặc biệt, trình tự ORF5 của một chủng phân lập được giống với chủng virus PRRS Ingelvac MLV Trình tự nucleotide ORF5 của 27 PRRSVs còn lại của Hàn Quốc giống với chủng VR-2332 Phân tích phát sinh loài của ORF5 và

độ dài đầy đủ về trình tự gen cho thấy PRRSVs phân lập ở Hàn Quốc đã thành lập một nhánh riêng biệt so với các PRRSVs được báo cáo từ các nước châu Á khác (Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và Thái Lan) Nghiên cứu đã chứng minh rằng PRRSVs của kiểu gen ở Bắc Mỹ đã xâm nhiễm vào lợn của Hàn Quốc một thời gian trước và đã phát triển thành một nhánh độc lập so với các PRRSVs ở các nước châu Á khác, như vậy việc tách biệt về địa lý có thể ảnh hưởng đến sự tiến hóa phân tử của PRRSV Điều này phải được xem xét khi một quốc gia phòng chống dịch tai xanh và cần thiết lập chính sách kiểm soát đối với thương mại quốc tế

Các chuỗi nucleotide hoàn chỉnh trong hai chủng PRRSV phân lập được

ở Thái Lan là 01CB1 và 01NP1 về kiểu gen đã xác định [72]: 01CB1 và 01NP1 chứa 14.943 và 15.412 nucleotide, tương ứng Phân tích phát sinh loài của virus cũng cho thấy 01CB1 và 01NP1 được nhóm lại thành 2 nhóm kiểu gen tương ứng là châu Âu và Bắc Mỹ Để xác định các biến thể di truyền và quan hệ di truyền giữa các chủng PRRSV phân lập ở Thái Lan, 01CB1 và 01NP1 được so sánh với 2 chủng của EU (Lelystad, và EuroPRRSV), 6 chủng Bắc Mỹ (MLV, VR2332, PA8, 16244B, SP và HUN4) Kết quả cho thấy hệ gen của chủng 01CB1 tương đồng khoảng 99,2% nucleotide với Lelystad và 95,2% với EuroPRRSV Trong khi, bộ gen 01NP tương đồng 99,9% nucleotide với một chủng virus vaccine sống (MLV) và 99,5% và 98,5% nucleotide với 2 chủng virus khác của Bắc Mỹ là VR2332 và 16244B Ngoài

ra, trình tự nucleotide ORF5 của 9 chủng virus PRRS phục hồi ở Thái Lan trong thời gian 2002-2008 cũng đã được giải trình tự trong nghiên cứu này Phân tích phát sinh loài thông qua ORF5 cho thấy có sự giống nhau đáng kể

về kiểu gen của 01CB1 và 01NP với các chủng virus đã so sánh Như vậy 01CB1 có thể tiến hóa từ các mẫu thử nghiệm EU, virus Lelystad, trong khi 01NP1 có thể có nguồn gốc và tiến hóa từ virus vacxin sống hoặc các subtyp

có quan hệ gần gũi với nó

Các trình tự PRRSV ở Thái Lan được mô tả trước đó và kết hợp chúng vào sự đa dạng toàn cầu [66] Kết quả cho thấy PRRSVs ở Thái Lan được bắt nguồn từ nhiều chủng PRRSV khác nhau trong đó tồn tại cả hai loại: loại I và loại II Như vậy sự đa dang di truyền của các chủng PRRSV ở các quốc gia khác nhau là khác nhau rất nhiều

So sánh trình tự phân tích 2 chủng EU và chủng Bắc Mỹ cổ điển là chủng Lelystad Vivus (LV) và VR-2332 cho thấy mức tương đồng tương ứng

là 87,0-91,5% và 58,0-58,2 Đặc biệt các phân lập cũng cho thấy đặc trưng bị xóa các nucleotide đồng thời trên các protein không cấu trúc (Nsp2) và khung

đọc mở số 3 (ORF3) Kết quả từ cây phát sinh loài còn cho thấy rằng tất cả các chủng phân lập chiếm đa số là chủng châu Âu cổ điển, tuy nhiên chúng lại tiến hóa từ nguồn gốc khác nhau Những virus mới được dự báo là các sản phẩm của sự tiến hóa khác nhau của tổ tiên PRRSV phân lập được báo cáo từ châu Âu Đây là báo cáo đầu tiên của PRRSV chủng Châu Âu thực địa được phân lập tại Trung Quốc Kết quả phát hiện của nghiên cứu này đã xác nhận rằng các chủng EU Trung Quốc có cùng nguồn gốc với các chủng cổ điển nhưng có đặc tính sinh học khác nhau đã cùng tồn tại ở Trung Quốc đại lục trong nhiều năm qua

Năm 1997: PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Hoa Kỳ (10/51 con có huyết thanh dương tính) Các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% Mặc dù PRRS đã xuất hiện ở Việt Nam khá lâu, nhưng chưa có bất kỳ báo cáo nào về dịch bệnh PRRS trước tháng 3/2007

Đến ngày 12/03/2007, dịch PRRS bắt đầu bùng phát tại Việt Nam: Tại Hải Dương đã phát ra dịch, sau đó trong vòng 01 tháng dịch đã lây lan nhanh sang 06 tỉnh lân cận [2] gồm: Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Bình, Hải Phòng và Quảng Ninh Các địa phương khác đã có báo cáo về tình hình tương tự trên đàn lợn: Thanh Hoá, Hà Nội, Sơn La và Lào Cai, nhưng chỉ giới hạn ở ổ dịch ban đầu, không lây lan sang nơi khác Sau hơn 1 tháng thực hiện quyết liệt công tác phòng chống dịch, dịch bệnh PRRS tại các tỉnh nêu trên đã được khống chế

Đợt dịch thứ hai: Ngày 25/6/2007, dịch lại xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam Sau đó xuất hiện hàng loạt ổ dịch ở các tỉnh xung quanh Ngày 13/7/2007, tại Long An cũng đã xác định có bệnh tai xanh ở lợn làm 91 con mắc bệnh, 8 con chết; địa phương đã tiêu huỷ 34 con Ngày 10/8/2007, Trung

tâm CĐTYTW đã xác định lợn ốm tại Trung tâm giống cây trồng vật nuôi Quảng Trị đã mắc bệnh tai xanh Toàn bộ 76 con lợn của ổ dịch này đã được tiêu huỷ Ngày 18/9/2007, dịch đồng loạt được báo xuất hiện tại hai tỉnh: Cà Mau và Khánh Hoà

Đợt dịch thứ ba: Từ giữa tháng 3 năm 2008, dịch tai xanh xảy ra ở 775

xã, phường của 57 huyện, thị xã thuộc 10 tỉnh, thành phố là Lâm Đồng, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hoá, Ninh Bình, Nam Định, Thái Bình và Thái Nguyên Tổng số lợn mắc bệnh là hơn 255.250 con,

số tiêu huỷ là 254.242 con Sau đó, báo cáo của các địa phương cho thấy, dịch PRRS cơ bản đã được khống chế, số lợn mắc bệnh và bị tiêu huỷ tại các địa phương đã giảm So với 2 đợt dịch trước, số tỉnh, thành xảy ra dịch lần này ít hơn nhưng số xã lại nhiều gấp 2 lần so với đợt dịch thứ 2 và gấp 8 lần đợt dịch đầu tiên

Những nghiên cứu về PRRS tại Việt Nam đều tập trung về vai trò kết hợp của các mầm bệnh kế phát và tạo nên bệnh hô hấp phức hợp ở lợn như nghiên cứu của Phòng vi trùng, Viện thú y quốc gia về một số vi khuẩn thường gặp khi lợn bị bệnh tai xanh hoặc tập trung vào nghiên cứu tình hình dịch tễ của PRRS tại Việt Nam Theo báo cáo kết quả hội thảo khoa học phòng chống Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn của Cục thú y năm

2008 thì hiện tại ở Việt Nam tồn tại cả hai chủng virus PRRS thuộc dòng Bắc Mỹ: chủng cổ điển độc lực thấp và chủng biến thể độc lực cao Trong đó, chủng virus PRRS độc lực cao gây bệnh tại Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ và tương đồng với chủng PRRSV độc lực cao gây bệnh tại Trung Quốc Các mầm bệnh kế phát trong ổ dịch PRRS gồm có: virus PCV2, virus Dịch tả lợn

[34]và các vi khuẩn: Pasteurella spp, Mycoplasma spp, Streptococcus, Salmonella, Heamorphylus, E.coli, Actinobacillus pleuropneumoniae, …

Chính vì có sự kế phát của các mầm bệnh khác nên việc chẩn đoán lợn mắc Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn gặp rất nhiều khó khăn vì cần có phương pháp chẩn đoán chính xác Nếu có KIT chẩn đoán nhanh PRRS sẽ giúp cho việc phát hiện bệnh nhanh, khống chế dịch bệnh tốt hơn, giảm thiệt hại cho người chăn nuôi

về lĩnh vực nghiên cứu virus học, chế tạo KIT chẩn đoán và tiến tới chế tạo vacxin Đề tài còn là tài liệu quý cho việc giảng dạy và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh, học viên cao học và bác sỹ thú y và những người quan tâm đến lĩnh vực công nghệ sinh học trong thú y

Ý nghĩa thực tiễn:

Thành công của việc chế tạo KIT chẩn đoán nhanh PRRS có ý nghĩa thực tiễn vô cùng to lớn trong việc phát hiện sớm tiến tới ngăn ngừa và khống chế dịch bệnh trong điều kiện diễn biến phức tạp Phương pháp phát hiện nhanh cho phép khoanh vùng dịch bệnh, giúp cho công tác kiểm dịch Thú y, lưu thông gia súc và có biện pháp xử lý kịp thời hạn chế lây lan và thiệt hại

Phần II NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

I NỘI DUNG

- Thu thập mẫu bệnh phẩm (trên các vùng dịch, các giống lợn, tuổi lợn, cơ quan lấy mẫu bệnh phẩm)

- Phân lập virus PRRS (trên các đối tượng môi trường nuôi cấy)

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của các chủng PRRSV phân lập được

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử phân tử của các chủng PRRSV phân lập được

- Nghiên cứu chọn lọc chủng, giống PRRSV độc lực cao để làm kháng nguyên

- Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng thể đặc hiệu (cả kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng)

- Chế tạo KIT chẩn đoán nhanh hội chứng PRRS

- Đánh giá thử nghiệm bộ KIT sản xuất

- Thử nghiệm đánh giá trên diện hẹp

- Thử nghiệm đánh giá đại trà trong sản xuất

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của

đề tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong lĩnh vực thú y

2 1 Phương pháp quan sát, thống kê sinh học

Để xác định được các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên Đồng thời dựa vào các đặc điểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan Tiến hành phân tích, thống kê để đưa ra những kết

quả chính xác Xác định chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý

nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

2 2 Phương pháp mổ khám

Mổ khám ca bệnh nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ

quan, tổ chức của lợn mắc PRRS, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu

hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh [22] Lợn bệnh được cố định cẩn thận,

tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, thu dịch swab (các dịch tự nhiên của

cơ thể như nhử mắt, nước mũi, dịch ngoáy hầu họng) từ cơ thể nếu có [26]

Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ

thể quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, hạch,

tim, gan, lách, thận theo các mục đích nghiên cứu khác nhau

2.3 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý

Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm

trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể Cần tiến hành làm tiêu bản để xác

định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo

quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) Các bước

của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:

Cố định bệnh phẩm

Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%

Vùi bệnh phẩm

Tiến hành lần lượt các bước sau:

- Rửa focmol: Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h

- Đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động

Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình

Tãi mảnh: Dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nước ấm 480C

Sau đó để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được

+ Khử cồn: Cho dưới vòi nước chảy 15 phút

+ Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)

Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước

Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:

+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)

Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 5-10 phút, rửa nước

Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000 mỗi lọ 1 phút

+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản đi qua xylen

Gắn Baume canada

Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học

2.4 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Để phát hiện chính xác sự có mặt của virus PRRS trong tổ chức, mức

độ tập trung của virus trong các cơ quan để phục vụ cho bước phân lập virus, chúng tôi tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch hay hóa miễn dịch tổ chức (IHC)

Phương pháp nhuộm hóa miễn dịch tổ chức là phương pháp mới, có độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức [52] Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu

[39,54,76] Trong mỗi lô nhuộm IHC chúng tôi bố trí đối chứng dương (lát

cắt tổ chức của lợn bị PRRS) và đối chứng âm (lát cắt tổ chức của lợn khỏe mạnh) để đối chiếu Kết quả được đánh giá ở các mức độ nặng nhẹ khác nhau

tùy thuộc và việc xuất hiện các điểm, các đám màu nâu vàng trên tiêu bản Khi có sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đơn dòng đặc hiệu thì xuất hiện các đám nâu vàng trên tiêu bản, phản ứng dương tính hay tổ chức có virus khu trú Các đám màu này càng nhiều, màu càng đậm thì chứng tỏ mức

độ kháng nguyên tập trung tại đây càng nhiều

Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tổ chức có quy trình tẩm đúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể Các bước thực hiện:

Bước 1: Làm sạch tiêu bản

Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất

Bước 2: Hoạt hoá enzym

Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 1210C/5 phút

Bước 3: Khử peroxydase nội sinh

Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1H2O2 30% : 9 Methanol), ngâm tiêu bản trong 10 phút

Bước 4: Gắn kháng thể

Nhỏ 80 µl kháng thể PRRSV lên tiêu bản

Để tủ ấm 370C/1giờ hoặc 40C/qua đêm

Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần)

Bước 5: Gắn kháng kháng thể

Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể lên tiêu bản

Để tủ ấm 370C/1 giờ

Rửa PBS 3 lần (5phút/lần)

Bước 6: Cho cơ chất

Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 3-5 phút

Kiểm tra dưới kính hiển vi thường Nếu thấy xuất hiện màu vàng nâu trên lát cắt thì dừng phản ứng bằng nước sạch Nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB đến khi xuất hiện màu ở đối chứng dương

Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Hematoxilin, làm sạch, gắn và quan sát

bằng kính hiển vi quang học

Minh họa hình ảnh dương tính, âm tính

Ảnh 2.1 Hoá miễn dịch dương tính Ảnh 2.2 Hoá miễn dịch âm tính

2.5 Phương pháp tách chiết RNA

Từ các mẫu bệnh phẩm thu thập được của các lợn nghi mắc PRRS được chúng tôi bảo quản trong điều kiện -800C, tiến hành tách chiết RNA của virus để chẩn đoán các lợn mắc bệnh

- Quy trình tách chiết ARN virus dùng KIT của hãng Qiagen các bước thực hiện theo hướng dẫn sau:

Bước 1: Cho 560µl Buffer AVL vào ống eppendoft

Bước 2: Cho 140µl mẫu vào ống trên Votex trong 15 giây, để nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn

Bước 3: Cho 560µl Ethanol (96% - 100%) vào ống và votex trong 15 giây Bước 4: Hút 630µl mẫu trong ống vào cột QIA đậy nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại bỏ dung dịch phía dưới ống, lặp lại bước 4 một lần nữa với phần mẫu còn lại

Bước 5: Cho 500µl AW1 vào cột QIA, ly tâm 8.000 vòng/phút/2 phút, loại bỏ dịch phía dưới cột

Bước 6: Cho 500µl AW2 vào cột QIA, ly tâm 13.500 vòng/phút/3 phút, loại bỏ dịch phía dưới cột, ly tâm lại lần nữa với tốc độ tối đa trong 1 phút Bước 7: Đặt cột QIA vào ống eppendoft 1.5 ml mới, thêm 60µl AVE để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm tốc độ 8.000 vòng trong 1 phút Thu dịch qua cột và bảo quản ở -200C hoặc -800C

2.6 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR

- Tiến hành phản ứng RT- PCR

Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:

- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung

dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung

thêm 10 ul Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di

- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT-PCR

- Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE

1X đến ngập thạch