Đề tài công nghệ sản xuất insulin

Đề tài: Công nghệ sản xuất Insulin trình bày đôi nét về bệnh tiểu đường; một số loại insulin trên thị trường; cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất insulin; cấu trúc phân tử insulin; tổng hợp insulin trong cơ thể; vai trò sinh học của insulin; công nghệ sản xuất insulin; sản xuất insulin tách chiết từ động vật; sản xuất insulin từ thực vật chuyển gen.

GVHD : PGS.TS Nguyễn Thúy Hương SVTH : Phạm Ngọc Xuân

Phạm Ngọc Thiên Trần Đức Thiện Đặng Minh Châu

Hà Thanh Trúc Lớp : HC07SH2 Năm học : 2010-2011

CÔNG NGHỆ

SẢN XUẤT INSULIN

Nội dung chính

I Lời mở đầu

Đôi nét về bệnh tiểu đường

II Một số loại insulin trên thị trường

III Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất insulin

1 Cấu trúc phân tử insulin

2 Tổng hợp insulin trong cơ thể

3 Vai trò sinh học của insulin

IV Công nghệ sản xuất insulin.

1.Sản xuất insulin tách chiết từ động vật

2.Sản xuất insulin từ thực vật chuyển gen

3.Sản xuất insulin từ đối tượng vi sinh vật chuyển gen

4 Kết luận

những hướng tiếp cận mới cho việc ngăn ngừa và điều trị căn bệnh này.

Best và Banting- những người đầu tiên đã chiết suất được insulin

năm 1921

Collip và MacLeod- những người đầu tiên dùng insulin chiết suất đó để

điều trị bệnh tiểu đường type 1 cho Leonard Thomson

Vậy bạn biết gì về bệnh tiểu đường ?

Vài nét về bệnh tiểu đường

1 Khái niệm

2 Phân loại

3 Tình hình thực tế về bệnh tiểu đường hiện nay

1 Khái niệm

• Bệnh đái tháo đường, còn gọi là Bệnh tiểu đường, là một bệnh do rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong

cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao

• Bệnh tiểu đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, v.v

2 Phân loại

• Tiểu đường loại 1: (tiểu đường phụ thuộc insulin hay tiểu đường ở người trẻ )

chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân

• Nguyên nhân bệnh: cơ chế tự miễn (tuyến tụy bị tấn công và phá hủy bởi chính

cơ thể, làm cho tuyến tụy không còn khả năng sản xuất insulin nữa)

• Những triệu chứng điển hình: tiểu nhiều, uống nhiều, đôi khi ăn nhiều, mờ mắt,

dị cảm và sụt cân, trẻ em chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng

• Tiểu đường loại 2: ( tiểu đường không phụ thuộc insulin hay tiểu đường ở người trưởng thành) chiếm khoảng

90-95% trong tổng số bệnh nhân bệnh tiểu đường, thường gặp ở lứa tuổi trên 40, nhưng gần đây xuất hiện ngày càng nhiều ở lứa tuổi 30, thậm chí cả lứa tuổi thanh thiếu niên

• Tụy người bệnh vẫn còn khả năng sản xuất insulin, nhưng không đủ

• Ít có triệu chứng và thường chỉ được phát hiện bởi các triệu chứng của biến chứng(nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não), hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét nghiệm máu trước khi mổ.

• Tỷ lệ tiểu đường tăng theo tuổi, yếu tố di truyền cũng đóng vai trò quan trọng Có mối liên quan trực tiếp giữa béo phì

và tiểu đường loại 2.

II Một số loại insulin trên thị trường

Loại insulin Màu sắc Nguồn gốc Thời gian bắt đầu có tác dụng Thời gian hết tác dụng

30 phút (tiêm dưới da) 8 giờ

III Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất

nsulin

III Cơ sở khoa học của công nghệ sản xuất

nsulin

1 Cấu trúc phân tử insulin

o Insulin người là một polypeptide

o Bao gồm:

• Chuỗi A 21 acid amin

• Chuỗi B 30 acid amin

• Có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối

disufur nối giữa hai chuỗi A và B.

2 Tổng hợp insulin trong cơ thể

• Preproinsulin: là chuỗi peptid dài 110 acid amine, tổng hợp

trong các tế bào β của đảo Langerhans của tuyến tụy

• Proinsulin: Khi Preproinsulin tiến tới lưới nội chất, một protease

chuyên biệt sẽ cắt bỏ đoạn peptide tín hiệu tạo proinsulin

Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba

• Insulin: Hình thành qua quá trình phân cắt nhờ enzyme PC1/3

tại liên kết giữa chuỗi B và C và enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và C.

3 Vai trò sinh học của insulin

Sơ đồ biểu hiện sự điều hòa hàm lượng glucose máu

Gia tăng tuần hoàn insulin

Glycogen chuyển thành Glucose ở gan

Tăng lượng Glucose

trong máu

Kích thích tuyến tụy tiết ra insulin

Glucose trong máu

Hấp thu Glucose vào máu

Lượng Glucose còn lại

Tế bào hấp thu glucose

Năng lượng trao đổi chất Tổng hợp chất béo Tổng hợp Glycogen

Giảm lượng Glucose trong máu

Kích thích tuyến tụy tiết ra Glucagon

Gia tăng tuần hoàn Glucagon

Những tác động khác của insulin

- Insulin làm tăng tính hấp thụ

của các axitamin

- Insulin làm tăng tính thấm các

ion kali, magie và photphat vô

cơ tạo điều kiện cho quá trình

photphoryl hoá và sử dụng

glucoz

Insulin làm tăng tính thấm các ion kali, magie và photphat vô cơ

IV Công ngh ệ sản xuất insu lin

Insulin

Từ động vật

Từ thực vật

Từ vi sinh vật

1.Sản xuất insulin tách chiết từ động vật

• Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập

từ tuyến tụy của động vật như heo và bò và được tinh sạch

• Ngày nay loại insulin này được tinh chế bằng phương pháp sắc ký đạt độ tinh khiết hóa rất cao.

Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala

Sự thay đổi chuỗi cấu trúc amino acid của các loài động vật so với con người

(Source W.F ganong, 2004)

Sản xuất insulin từ tế bào gốc để trị bệnh tiểu đường

• Những tế bào gốc từ dây rốn có khả năng sản xuất một

hợp chất có tên là C-peptide (một chất protein tiền thân

của insulin và chỉ hiện diện khi tế bào sản xuất ra

insulin).

• Sự hiện diện C-pep  đã có một lượng insulin nhất định

được sản xuất bởi tế bào gốc được dùng thay thế cho tế

bào tụy tạng đã hư hại hoặc bị phá hủy

• Những tế bào gốc từ dây rốn có khả năng sản xuất một

hợp chất có tên là C-peptide (một chất protein tiền thân

của insulin và chỉ hiện diện khi tế bào sản xuất ra

insulin).

• Sự hiện diện C-pep  đã có một lượng insulin nhất định

được sản xuất bởi tế bào gốc được dùng thay thế cho tế

bào tụy tạng đã hư hại hoặc bị phá hủy

Các nhà khoa học Anh và Mỹ cho biết họ đã SX được insulin từ tế bào gốc lấy từ dây rốn trẻ sơ sinh để điều trị bệnh tiểu đường (Ảnh:

www.neonet.ch)

Nhược điểm

• Insulin ĐV có cấu trúc không hoàn toàn giống insulin người

• Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin người

• Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể

• Trong quá trình tách chiết không thể loại bỏ được hết các tác nhân gây bệnh ở ĐV

• Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao

• Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để SX) giá thành cao

• Khó SX lượng lớn với quy mô công nghiệp

• Insulin ĐV có cấu trúc không hoàn toàn giống insulin người

• Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn insulin người

• Có thể gây ra các phản ứng miễn dịch trong cơ thể

• Trong quá trình tách chiết không thể loại bỏ được hết các tác nhân gây bệnh ở ĐV

• Qui trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao

• Chi phí đắt (cần lượng lớn tụy để SX) giá thành cao

• Khó SX lượng lớn với quy mô công nghiệp

Sản xuất Insulin trị bệnh tiểu đường từ hoa rum

• Các nhà khoa học ĐH Calgary đã cấy một gen Insulin nhân tạo vào cây

hoa rum Khi gen này đi vào hoạt động, hoa rum sẽ bắt đầu sản sinh ra

Insulin nhanh hơn các phương pháp truyền thống được tiến hành trên lợn,

bò, men hay vi khuẩn

• Khoảng 4.000m2 hoa sẽ có sản lượng lên tới gần 1kg Insulin  6.475

ha hoa rum là có thể chiết xuất đủ Insulin cho toàn bộ những người mắc

bệnh tiểu đường trên thế giới.

Cây hoa rum dùng để chiết suất insulin

Trị bệnh tiểu đường bằng insulin từ rau diếp hoặc cây

thuốc lá

• Nghiên cứu này được thực hiện bởi giáo sư Henry Daniell, thuộc Trường Đại học Central

Florida, và các cộng sự.

• Nhóm nghiên cứu đưa các tế bào thực vật đông khô có chứa insulin dưới dạng bột vào cơ

thể chuột mắc bệnh tiểu đường Khi các tế bào này tiến vào ruột chuột, vi khuẩn đang sống

ở đó sẽ phân hủy các thành tế bào và insulin thoát ra sẽ được đưa dần dần vào máu.

• Sau 8 tuần lễ thử nghiệm, các chuyên gia nhận thấy [glucose] trong máu và nước tiểu

chuột đã trở lại mức an toàn, và các tế bào beta trong tuyến tụy của chuột đã sản xuất được

insulin ở mức độ cần thiết cho cơ thể

Giáo sư Henry Daniell (ĐH Central

Florida)

3 Công nghệ

sản xuất insu lin

Từ vi sinh vậ t

• Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp dựa trên các chủng vi sinh vật biến đổi gen, chủ yếu là vi khuẩn (E.coli, Bacillus brevis…) hoặc nấm men

(Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris…)

• Có 2 nhóm phương pháp sản xuất Insulin tái tổ hợp trong các chủng VSV biến đổi gen

là : nhóm phương pháp 2 chuỗi và nhóm phương pháp miniproinsulin

Phương pháp 1: Sinh tổng hợp insulin tái tổ hợp theo phương pháp

2 chuỗi

Nhược điểm : Hiệu suất tạo Insulin hoạt tính không cao.

Phương pháp 2: Sinh tổng hợp Insulin tái tổ hợp theo phương pháp

miniproinsulin (MPI)

Hướng nghiên cứu mới:

• Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật Trong số đó, tế bào vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng ở quy

mô sản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E coli và nấm men Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp – đó là Pichia

pastoris.

• Hơn 3 thập niên qua, E.coli được sử dụng rộng rãi như tế bào chủ cho biểu hiện protein Tuy nhiên, việc ứng dụng E.coli trong quá trình biểu hiện các protein có nguồn gốc từ eukaryote còn bị hạn chế do E.coli thiếu các bộ máy nội bào để thực hiện các quá trình biến đổi sau dịch mã

• Tế bào E.coli khi biểu hiện protein có khuynh hướng giữ lại đuôi Met, đuôi amino acid này

có thể ảnh hưởng tới sự ổn định của protein và gây đáp ứng miễn dịch, sau khi biểu hiện, việc tạo ra điều kiện gấp cuộn cho protein rất khó khăn để thực hiện, rất tốn thời gian và quá trình này không phải lúc nào cũng thành công Những điều này làm tăng giá thành sản xuất protein khi sử dụng hệ thống tế bào E.coli

Những thuận lợi của hệ thống Pichia pastoris

• Cũng như nấm men S.cerevisiae, P.pastoris là vi sinh vật đơn bào dễ nuôi cấy, dễ thao tác an toàn đối với con người

• P.pastoris là một eukaryote, có các quá trình biến đổi sau dịch mã như khả năng gấp cuộn, hình thành cầu nối disulfide, và glycosyl hóa Do đó, nhiều protein khi biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn bị bất hoạt do hình thành dưới dạng thể vùi nhưng lại có hoạt tính sinh học cao khi biểu hiện trong P.pastoris

• Có một promoter mạnh, sử dụng chất cảm ứng là methanol rẻ tiền hơn so với tế bào E.coli

• Có khả năng phát triển ở pH từ 3÷7 do đó có thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động của protease đối với protein tiết ra

• Có thể phát triển với mật độ tế bào cao hơn nhiều lần so với S.cerevisiae

• Có thể biểu hiện protein với hàm lượng từ miligram tới gram cả trong nghiên cứu phòng thí nghiệm lẫn trong sản xuất quy mô công nghiệp

• Các protein của bản thân P.pastoris được tiết ra môi trường với hàm lượng rất thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu về sau sẽ rất dễ dàng

• Thành phần môi trường nuôi cấy đơn giản, chi phí lên men thấp, các phương

pháp sử dụng được thương mại hóa, chủng và các vector biểu hiện có sẵn trên thị trường

• Hạn chế được sự nhiễm trong quá trình lên men

• Quá trình lên men có thể thực hiện nhanh chóng

3.2 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA INSULIN NGƯỜI TRÊN HỆ THỐNG TẾ BÀO PICHIA PASTORIS

 Chủng Pichia pastoris thường được sử dụng nhiều nhất là GS115 (his4), có gene mã hóa cho histidinol dehydrogenease bị đột biến nên không có khả năng tự tổng hợp histidine; chứa gene AOX1 và AOX2, phát triển được trên methanol ở mức ngang bằng với chủng hoang dại.

 Chủng E.coli DH5α hoang dại (Nanogen Biopharma)

Vector biểu hiện pPIC9K (invitrogen)

Thiết kế và tổng hợp gene mã hóa cho hMPI

• Trong nghiên cứu này, trình tự gene mã hóa cho insulin người đã được biến đổi một số acid amin so với trình tự công bố trên NCBI nhằm làm tăng khả năng biểu hiện protein, tăng hiệu quả gấp cuộn, và tăng hoạt tính sinh học

• Trong nghiên cứu này, hMPI được thiết kế bao gồm 53 amino acid: chuỗi B 29 amino acid; mini C 3 amino acid (Asp-Gly-Lys), chuỗi A 21 amino acid Sau quá trình gấp cuộn, 3 amino acid nối 2 chuỗi A và B sẽ được cắt bỏ bằng trypsin để tạo ra insulin trưởng thành Trong cấu trúc insulin, vị trí LysB29 có thể bị phân cắt khi xử lý bằng tripsin nên chuỗi B được thiết kế chỉ có 29 amino acid, ThrB30 được thêm vào sau khi quá trình xử lý tripsin hoàn tất ProB28 được thay thế

bằng AspB28, HisB10 được thay thế bằng AspB10

• Do có nhiều thay thế trong trình tự amino acid của insulin, nên thay vì tổng hợp gene bằng phương pháp PCR với khuôn mẫu từ mRNA người và với cặp mồi đặc trưng cho gene mã hóa cho insulin, sau đó tiến hành tạo đột biến điểm tại những

vị trí cần thiết, chúng tôi sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học

• Hai chuỗi oligonucleotide mã hóa cho hMPI được tổng hợp hóa học với phần overlap dài 20 nucleotide Phản ứng PCR được thực hiện với sự hiện diện của enzyme Klenow nhằm kéo dài 2 đoạn oligonucleotide tạ thành trình tự DNA mạch đôi hoàn chỉnh

Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid pCR2.1 chứa gen mã hóa

cho hMPI

• Với mục đích khuếch đại và lưu trữ gen hMPI cho các thí nghiệm tiếp theo, TA cloning

kit được dùng để dòng hóa gen hMPI vào pCR2.1 (tỉ lệ sản phẩm PCR:plasmid ~3:1) ở

160C qua đêm có sự hiện diện của T4 ligase Quá trình nối này sẽ tạo plasmid pCR2.1

tái tổ hợp mang gen hMPI(pCR2.1/hMPI)

• Plasmid này được điện biến nạp vào E.coli DH5α Trên môi trường LB chứa ampicillin

(50 μg/ml) có bổ sung X-gal (80 μg/ml) và IPTG (1mM)

• Các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có màu trắng và kiểm tra lại bằng phương pháp

PCR khuẩn lạc với cặp mồi thông dụng M13-F/R cho vector pCR2.1

• Những khuẩn lạc cho kết quả dương tính được tách chiết plasmid, và khẳng định lại lần

nữa bằng phản ứng cắt giới hạn với EcoRI và NotI

Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid pCR 2.1 chứa gene mã hóa cho hMPI

Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang plasmid pPIC9k chứa gen mã hóa

cho hMPI

• Plasmid tái tổ hợp pCR2.1/hMPI và plasmid pPIC9K cùng được cắt bởi EcoRI và

Not I gene mục tiêu được tinh sạch từ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pCR2.1/hMPI và nối vào plasmid pPIC9K bằng enzyme T4 ligase để tạo plasmid tái tổ hợp pPIC9K/hMPI

• Plasmid tái tổ hợp pPIC9K/hMPI được điện biến nạp vào E.coli DH5α và trải

trên môi trường thạch LB chứa 50μg/ml ampicillin, ủ ở 370C.các khuẩn lạc được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi AOX1-F/R đặc trưng cho vector pPIC9K

• Đồng thời vector này được đi giải trình tự để chắc chắn gen mã hóa cho hMPI

không có gì thay đổi so với khi thiết kế

Plasmid tái tổ hợp

pCR2.1/hMPI

Plasmid pPIC9K

3.3 Tạo dòng tế bào nấm men P.pastoris mang gen mã hóa cho hMPI

• Plasmid tái tổ hợp pPIC9K/hMPI được cắt bằng Sal I tại vị trí HIS4 tạo ra plasmid dạng thẳng và điện biến nạp vào tế bào P.pastoris Sau khi biến nạp, quá tình tái tổ hợp tương đồng sẽ diễn ra giữa pPIC9K/hMPI và genome của nấm men Những dòng tế bào có chứa pPIC9K/hMPI tái tổ hợp được sàng lọc trên môi trường MD Đây là môi trường chọn lọc cho các chủng đột biến khuyết dưỡng hisdidine

• Vector biểu hiện pPIC9K/hMPI có chứa các gene HIS4 có khả năng điều khiển sinh tổng hợp histidine trong khi chủng P.pastoris GS115 không có khả năng này, do đó, chỉ những dòng tế bào có sự tái tổ hợp tương đồng giữa pPIC9K/hMPI và genome của P.pastoris mới có khả năng mọc được trên môi trường này.

• Các khuẩn lạc mọc đượctrên môi trường MD được tiến hành tách chiết genomic DNA để kiểm tra sự hiện diện của gene hMPI bằng PCR với cặp mồi AOX1-F/R