Ôn Tập Ptvsh Tp.docx

Chương 1 1 Coliform ● Đặc điểm − Trực khuẩn, Gram ( ) − Không tạo bào tử − Lên men lactose và sinh hơi − Nước có nhiễm phân hoặc nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân − Coliform chịu nhiệt = coiliform +[.]

Chương 1:

1 Coliform

● Đặc điểm

− Trực khuẩn, Gram (-)

− Không tạo bào tử

− Lên men lactose và sinh hơi

− Nước có nhiễm phân hoặc nguyên liệu thực phẩm có nhiễm phân

− Coliform chịu nhiệt = coiliform + lên mên lactose và sinh hơi trên canh E.coli ở 440C trong 24 giờ

− Coliform phân = Coliform chịu nhiệt + sinh Indol trong môi trường Tryptone Water (TW) ở 44.50C trong 24giờ

− E.coli = coliform phân + IMViC (++- - )

2 E.coli

− Đặc điểm: Trực khuẩn, Gram (-), không tạo bào tử, hiếu khí tùy ý

− Phân bố: có mặt trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môitrường, trong các loại thực phẩm như cá hồi,pho-mai, thịt, sữa.4

− Độc tố có 4 dòng bệnh gây bệnh nguy hiểm nhất

+ Enteropathogenic E.coli (EPEC)+ Enteroinvasive E.coli ( EIEC)

+ Enterotoxigenic E.coli (ETEC)

+ Enteroheamorrhagic E.coli (EHEC)

+ Chúng có khả năng tạo entorotoxin và có khả năng gây bệnh rất nặng cho người Độc tố của chúng rất nhạycảm với nhiệt, ngoài ra chúng còn có khả năng loại độc tố bền nhiệt Những bệnh thường gặp: Nhiễm khuẩnđường tiểu, nhiễm khuẩn máu và viêm màng não

3 Salmonela

− Đặc điểm

+ Lên men được glucose và manitol sinh acid

+ Không lên men saccharose và lactose

+ Trực khuẩn Gram (-), không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc Hầu hết các chủng điều sinh H2S

− Phân bố

+ Trong ruột phân các loài động vật

+ Thịt bò, thịt heo, thịt gà, trứng gà, sữa

− Độc tố

+ Sốt thương hàn do S.typhi gây ra đáng sợ nhất

+ Nhiễm trùng máu do S.cholear-suis

+ Rối loạn tiêu hóa do S.typhymurium và Senteritidis

4 Shigella

+ Shigella là căn nguyên đứng đầu gây bệnh lụy trục trùng

+ Viêm mãng tính, thủng ruột, xuất huyết tiêu hóa, viêm loét đại tràng

5 Clostridium ( botulinum, perfringens)

− Đặc điểm

+ Trục khuẩn Gram (+)

+ Yếm khí (kỵ khí)

+ Tạo bào tử, bào tử rất chịu nhiệt

− Phân bố rộng trong đất, trong nước cống, bùn, chất lắng cặn của đầm, hồ và các thủy vực gần bờ biển

− Độc tố chỉ sản xuất trong điều kiện không có không khí như thực phẩm đóng hộp

6 Bacillus cereus

− Đặc điểm:

+ Trục khuẩn Gram (+), hiếu khí hay kỵ khí tùy ý.

+ Dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng trong tự nhiên và trong thực phẩm.

+ Lên men glucose, sinh hơi.

− Phân bố: trong đất bụi, trong các loại thực phẩm ( sữa, thịt, trứng, rau quả, hỗn hợp, gia vị, sản phẩm khô)

− Độc tố gây tiêu chảy và độc tố nôn mửa là 2 độc tố có thể gây hại cho tính mạng.Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm

8 Staphy lococus aureus (tụ cầu vàng)

+ Trong tự nhiên: da, mũi, tóc, lông, các loại động vật máu nóng

+ Trong thực phẩm: thịt, trứng, sữa, các loại thủy sản

− Các loại độc tố:

+ Độc tố gây sốt (sốt, vết đỏ ngoài da)

+ Độc tố gây tróc vẩy (nốt phòng ngoài da)

+ Độc tố ruột (A-F) bền nhiệt

− Bệnh

+ Nhiễm trùng ngoài da, niêm mạc

● Viêm nang lông, viêm mũi họng, mụn nhọt,nhiễm trùng vết thương

+ Nhiễm trùng huyết

+ Viêm phổi

+ Ngộ độc thức ăn và viêm ruột cấp

9 Virbrio sp (phẩy khuẩn)

− Đặc điểm

+ Phẩy khuẩn, Gram (-), hiếu khí tùy ý

+ Di động nhanh nhờ đơn mao ở một đầu

− Đặc điểm:

+ Xoắn khuẩn, Gram (-), không sinh bào tử

+ Sống ở điều kiện vi hiếu khí, tăng trưởng tối ưu ở 5% O2, nhiệt độ tối ưu 450C

− Phân bố:

+ Trong các sản phẩm sữa, trứng, rau, nấm ăn

+ Trong nước, nước cống, rau và thực phẩm có nguồn gốc động vật (thịt bò, thịt cừu, thịt heo, thịt gà, thịt gàtây…)

+ Trong các loại thực phẩm hút chân không

11.Nấm men và nấm mốc

− Đặc điểm

+ Nhiệt độ thích hợp 20 – 280C ( giúp nó phát triển tốt nhất)

+ pH thích hợp 2 – 9, pH tối ưu 4 – 6,5

+ Thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số ít thuộc nhóm vi hiếu khí

+ Khi phát triển trong thực phẩm làm đổi màu, tạo mùi lạ, làm hư hỏng, thay đổi cấu trúc thực phẩm, một số loạicòn sinh độc tố

− Ngộ độc do độc tố của nấm mốc

Aspergillus flavus

Aspergillus parasiticus

� Aflatoxin

+ Nhiễm thể như nghêu, sò,…

+ Thức ăn chế biến không kỹ

+ Rau quả bón bằng phân tươi

+ Nguồn nước ô nhiễm

- Yêu cầu cơ bản:

● Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

● Có độ pH thích hợp.

● Có độ nhớt nhất định

● Không chứa các yếu tố độc hại

● Tuyệt đối vô trùng

- Các bước chuẩn bị môi trường dinh dưỡng:

6 Làm thạch nghiêng, thạch đứng và đổ vào đĩa petri

7 Bảo quản và kiểm tra môi trường

Chương 4: THỬ NGHIỆM SINH HÓAS

cơ bản tạo acid (hoặc acid và hơi)

Môi trường: môi trường phenol red base

Cần phải thực hiện lại thử nghiệm với ống nghi ngờ.

1 số vsv có khả năng lên men các loại CHOđặc hiệu tạo ra acid làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu chỉ thị phenol red trong môi trường acid có màu vàng

Đồng thời CO2 được tạo thành trong quá trình lên men sẽ được giữ lại tạo bọt khí làm nổi ống Dulham(mt lỏng), vỡ thạch (mtrắn)

Môi trường: môi trường Leifson.

Hugh-(+): Bị acid hóa cả trên mặt và phần sâu

(-): Kỵ khí: bị acid hóa khắp thạch sâu

Hiếu khí: ko bị trên bề mặt, chỉ bịphần đáy

🡪 vi sinh vật biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi hóa.

3 Bile Esculin

Thử nghiệm này phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculi thành esculetin vàglucose khi có sự hiện diện của muối mật

Môi trường: môi trường Aesculinhay Edwards

(+): Môi trường chuyển thành

đen hay nâu đen

(-): Môi trường không đổi màu

Esculetin+muối sắt 🡺 tạo thành phức hợp màu đen hay màu nâu đen

4 Citrate

Nhằm xác định khả năng của một vi sinh vật sử dụng citratenhư nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường

Môi trường: Simmon citrate(+): Môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương (mt kiềm)

(-): xanh lục (màu ban đầu)

Sự thay đổi pH của môi trường được nhận

biết nhờ chỉ thị màu Bromothymol blue

Vsv sử dụng citrate trong mt có natri nitrate

→ ion Na+

Hoặc sd muối amonium vô cơ →NH3Làm tăng pH từ đó đổi màu chỉ thị bromothymol blue

5 Malonate

Nhằm xác định khả năng của

vi sinh vật sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường

Môi trường: môi trường lỏng malonate

(+):Môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương

enzyme catalase (+): Sủi bọt khí xung quanh sinh

khối (-): Không sủi bọt

7 Decarboxylase

Đánh giá hoạt tính enzyme của vi sinh vật khử nhóm carboxyl của acid amin sinh một amin tạo tính kiềm

Môi trường: môi trường decarboxylase basal chứa chỉ thị

bromocresol tím (+): Đục, tím

Môi trường: huyết tương thỏ hay người đông khô dạng thương phẩm

(+): Huyết tương đông (sau 4h, 8h, 12h, 24h)

(-): Lỏng (sau 24h)

Vsv đặc biệt là Staphylococcus có enzyme

coagulase làm kết tụ các thành phần của huyết tương tạo khối đông làm đông tụ huyết tương

9 Urease Xác định khả năng của vi sinh

vật phân giải urea tạo hai phân

Môi trường urea lỏng(rắn), chứa chỉ thị phenol đỏ

Urea bị phân giải bởi enzyme urease thành

2 phân tử ammonia làm kiềm hóa mt đổi

tử ammonia do tác dụng của enzyme urease làm kiềm hóa môi trường.

(+): Vàng → Đỏ cánh sen

1

0

Gelatinase Xác định khả năng phân giải

gelatin của vi sinh vật

Môi trường: môi trường canh NB

bổ sung 10% gelatin(+): Hóa lỏng

(-): Đông đặc

Thủy phân Gelatin bởi enzyme gelatinase

→ polypeptid +aa →Mất tính đông → Hóa lỏng

1

1 Sinh H2S

Một số vi sinh vật tổng hợp được enzyme desulfohydrase xúc tác sự chuyển hóa trong điều kiện kỵ khí các acid aminchứa lưu huỳnh như cysteine, cystin, methione và phóng thích H2S

Môi trường: các loại môi trường

có thể được sử dụng cho thử nghiệm sinh H2S là KIA, TSI, BSA

(+): Đen

(-): Không chuyển màu

Vsv có enzyme desulfohydrase trong điều kiện kị khí chuyển protein thành aa chứa lưu huỳnh và phóng thích H2S H2S tạo tủamàu đen vs chỉ thị sulfide

Tryptophan bị oxh bởi tryptophanase thành

sp chứa indolPhyrol của indol chứa nhóm CH2 +nhân

(Kiểm tra xem vsv có enzyme tryptophanase hay ko).

Dimethylaminobenzaldehyde DMABA))

(p-(+):Bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ cánh sen

vi sinh vật sẽ sử dụng Glucose để lên men nên khiến toàn bộ môi trường trở nên axit (màu vàng) trong khoảng 8-12 giờ Phần gốc vẫn giữ trạng thái axit thậm chí sau khi ủ khoảng 18-24 giờ bởi vì sự có mặt axit hữu

Môi trường: môi trường KIA hoặc TSI

- Màu đen: sinh H2S

- Vỡ thạch: sinh hơi từ glucose

Lên men glucose tạo acid giảm pH chỉ thị phenol red màu vàng

H2S sinh ra tạo tủa màu đen vs chỉ thị sulfide

Sinh hơi do tạo CO2

Nếu sinh vật lên men glucose nhưng lại không lên men lactose và/hoặc sucrose, sau đó mặt nghiêng sẽ trở thành màu đỏ và phần gốc vẫn màu vàng (K/A) trong khoảng

18 đến 24 giờ

Nếu bên cạnh việc lên men glucose sinh vật

cơ từ việc lên men glucose dưới điều kiện kỵ khí trong phần đáy ống Mặt nghiêng của môi trường trở về trạng thái kiềm, được chỉ thị bằng màu đỏ vì các sản phẩm lên men bị oxy hóa thành CO2 và

H2O và peptone trong điều kiện hiếu khí, phần mặt nghiêng trải qua oxy hóa giải phóng các amine kiềm

Mặt nghiêng:

Lactose và/hoặc Sucrose (+):

Màu vàng (lactose và/hoặc sucrose được sử dụng)Lactose và Sucrose (-): Màu

đỏ/không đổi màu (lactose và

sucrose không được sử dụng)

còn lên men lactose và/ hoặc sucrose, sản phẩm lên men được hình thành trên mặt nghiêng sẽ trung hòa hơn amine kiềm chuyển mặt nghiêng thành axit (màu vàng) (A/A), hiện tượng này sẽ xuất hiện sau khoảng 18 tới 24 giờ

(+): có màu hồng đỏ Nếu ko có màu: tt thêm bột Zn(+): Ko chuyển màu

(-): Màu hồng đỏ

Lần 2: định tính nitrate (bổ sung ít Zn)Nếu không màu hoặc k có kn khử NO3- hoặ xảy ra nhưng NO2- bị khử thành N2Nếu đỏ có nghĩa là còn NO3- tác dụng vs

Zn tạo NO2- sau đó pứ vs nitrate tạo màu đỏ🡺 không có sự khử NO3-

Không đổi màu nghĩa là hết NO3- trong mt🡺 có sự khử NO3-

1

5

Oxidase Xác định sự hiện diện của hệ

enzyme oxidase (A) ở vi sinh vật

Thuốc thử: Giấy tẩm para phenylenediamine hoặc dung dịch 1% tetramethyl-p-phenylenediamine (màu hồng)

N-dimethyl-A + B → indolphenol (màu xanh dương)

(B)(+): Xanh dương đậm(-): Hồng

Có khả năng lên men lactose

1

7

MR

(Methyl Red)

Kiểm tra khả năng của vi sinh

vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid

Môi trường và thuốc thử: môi trường lỏng MR-VP, thuốc thử methyl red

(+): Đỏ(-): Đỏ → Vàng

Lên men glu thành acid pyruvic sau đó chuyển hóa thành ethanol, acid acetic, acid lactic,… giảm pH (4~4,5) nên MR có màu đỏ

pH cao hơn (mt kiềm) có màu vàng

do lên men glucose

Môi trường và thuốc thử: MR (chỉ thị) - VP

(+): Đỏ cam pH acid????

(-): Vàng or Nâu đất

Vsv chuyển hóa glu thành acid pyruvic 🡺 acetoin (AMC) trong mt kiềm → diacetyl kết hợp vs α-naphtol tạo hợp chất màu đỏ cam

- Nhằm xác định cũng hiện tượng tan huyết do phối hợp như trên giữa nhân tố CAMP

và α-hemolysin của Clostridium perfringens

Môi trường: môi trường thạch máu

Cơ chất β-lysine: Dùng S aureus

hoặc bất kỳ chủng nào tạo nhiều β-lysine

Vi sinh vật chứng: Streptococcus

spp đã định danh(+): Có vùng tan huyết hình mũi tên

(+): Lan ra khỏi đường cấy

(-): Chỉ mọc theo đường cấy

● CH

CHƯƠNG 5: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT (Sách)

Chương 6: QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VSV THEO PP TRUYỀN THỐNG

(Này bảng thành phần, bảng tóm tắt file excel)

❖ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG Thioglycolat

trường

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG TSC

Pepton từ protein 15g Cung cấp dinh dưỡng nuôi cấy VSV

Pepton từ đậu tương 5g Cung cấp dinh dưỡng nuôi cấy VSV

Dinatri disunfit, dạng khan 1g Chất khử

Amoni sắt(III) xitrata 1g Điều chỉnh độ axit

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LS

Cao nấm men 2.5g Thành phần dinh dưỡng nuôi cấy

VSV, vitamin

môi trường

L-Xystin hydroclorua 0.3g Khử hóa

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NITRAT

0,999-0,955

Kali nitrat 1.0g Giảm thiểu sự thoát hơi nước

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LACTOSE-GELATIN

Cao nấm men 10g Thành phần dinh dưỡng nuôi cấy

VSVGelatin 120g Tạo gel, nhũ hóa, tạo bọt và độ nhớt

❖ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA

Môi trường- Hóa chất Mục đích

NaOH 10%

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG VRB

Thành phần Vai trò

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG BGBL

❖QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIAECE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM

Peptone Nguồn cung cấp N

Sodium chloride NaCl Cân bằng áp suất thẩm thấu

Bile Salts No.3 muối mật Ức chế các vi khuẩn gram dương

MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG TSA

Pancreatic Digest of Casein: pepton cung cấp nitơ hữu cơ, đặc biệt amino acid và các peptide chuỗi dài

Peptic Digest of Soybean Meal cung cấp nitơ hữu cơ, đặc biệt amino acid và các peptide chuỗi dài

Sodium Chloride NaCl duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

❖ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS GIẢ ĐỊNH

SPW

Pepton Cung cấp dinh dưỡng ( Nito ) cho VSV, là chất

đêm để VSV phục hồi và phát triển

MYP AGAR BASE ( MANNITOL-EGG YOLK-POLYMIXI )

Tryptone: là nguồn cung cấp nitrogen(N), vitamin và amino acid(N,C)

Meat extract: Cung cấp dinh dưỡng ( Nito ) cho VSV

Mannitol: chất chỉ thị, C

Phenol red: màu chỉ thị

Polymyxin B: Thành phần ức chế, ngăn chặn sự phát triển của nhiều VSV không mong muốn

Egg Yolk: Lecithin có trong lòng đỏ trứng [màu đen – có vòng sáng]

Agar: làm đông cứng môi trường

Với nồng độ pH khoảng 7.0 – 7.2 ( trung tính )

Môi trường này chứa hệ thống chỉ thị là mannitol, phenol red và lecithin long đỏ trứng

Các vi khuẩn thuộc các nhóm khác sẽ lên men mannitol để tạo ra acid và hình thành màu vàng môi trường

Đối với Bacillus cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên môi trường xung quanh khuẩn lạc

không thay đổi hoặc bị mất màu do kiềm hóa nhẹ tạo khuẩn lạc màu hồng eosin Và tiếp tục Lecithin được phân cắt bởiBacillus cereus-lecithinase, dẫn đến sự hình thành vùng kết tủa trắng đục bao quanh khuẩn lạc màu hồng

❖QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨA

TRYPTONE BILE GLUCURONIC AGAR ( TBX )

Tryptone: là nguồn cung cấp nitrogen(N), vitamin và amino acid(N,C)

Bile salts: tác nhân chọn lọc chống lại VK gram dương, đặc biệt là trực khuẩn( bacillus và các liên cầu khuẩn

streptococcus).

X-β-D-glucuronide (thuốc thử): gồm 2 thành phần là 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide và X-glucuronide

Agar: làm đông cứng môi trường

Với nồng độ pH khoảng 7.0 – 7.2 (trung tính)

Enzyme β – glucuronidase

E.coli thủy phân các steroid β-glucuronide, cũng như nhiều loại glucoronides như benzodiazepine, opioid và canna binoid

và sinh ra được enzyme β – glucuronidase

• E.coli sẽ hấp thụ cơ chất màu của thuốc thử (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide và X-glucuronide) và enzyme

β-glucuronide trong e.coli sẽ phân tách mối liên kết nhân màu của 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide và glucuronide

X-🡺 4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide bị thủy phân bởi enzyme β – glucuronidase để tạo ra sản phẩm là 4-chloro-3-indolyl

🡺 việc tích lũy nhân màu trong tế bào sẽ được xảy ra 🡺 khuẩn lạc e.coli có màu xanh (blue)

Sau 24 giờ ủ lấy số đĩa ra nếu:

+ Dương tính có sự xuất hiện của vi khuẩn e.coli thì khuẩn lạc trên đĩa sẽ có màu xanh (blue)

+ Âm tính không có sự xuất hiện của vi khuẩn e.coli thì khuẩn lạc trên đĩa sẽ trong suốt, không màu.

Ta sẽ đếm các đĩa có số khuẩn lạc khoảng 50<KL<200 Và tính giá trị trung bình từ các độ pha loãng để qui về số e.colitrong 1g mẫu

❖ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone

Selenit xystin/ Tetrathionat (TT)

Hektoen Entric Agar (HE)

Salmonella

Voges-Proskauer (VP)

Ure Broth

Tryptone Water

Kliger Iron Agar (KIA)/TSI

Đĩa giấy ONPG

MÔI TRƯỜNG BUFFERED PEPTONE WATER (BPW):

Proteose peptone (cao thịt) Cung cấp dưỡng chất (acid amin,vitamin ,khoáng,…)

Sodium chloride (Nacl) Duy trì áp suất thẩm thấu

Disodium phosphate,anhydrous Giúp duy trì hoạt động đệm của môi

MÔI TRƯỜNG XYLOSE LYSINE DESOXYCHOLATE(XLD)

Lactose

Lên menSucrose