Báo Cáo Thực Hành Vi Sinh Vật Học.docx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM −−−−−−−−−− NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM MÔN VI SINH VẬT HỌC Tên đề tài PHÂN LẬP VÀ QUAN SÁT VI SINH VẬT Lớp GVHD NGUYỄN[.]

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM −−−−−−−−−−

NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM MÔN : VI SINH VẬT HỌC Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ QUAN SÁT

VI SINH VẬT

Lớp : GVHD: NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG

SVTH:

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 12 năm 2020

NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM Tên vấn đề : Phân lập và quan sát hình thái vi thể, đại thể của các vi sinh

vật trong mẫu

 Gồm :

 Nấm mốc

 Nấm men

 Trực khuẩn gram âm

 Trực khuẩn gram dương

QUY TRÌNH THỰC HIỆN :

KẾ HOẠCH :

Tuần 1 ( 13/11/2020) : Tìm hiểu và nghiên cứu các công việc cần làm để

phân lập và quan sát các vi sinh vật

Tuần 2 ( 20/11/2020) : Pha môi trường, đổ môi trường vào đĩa petri, cấy

mẫu nghiên cứu lên môi trường dinh dưỡng

Tuần 3 (27/11/2020) : Quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi, cấy truyền

tạo dòng thuần, đổ thêm môi trường

Tuần 4 (04/12/2020) : Tiếp tục cấy truyền, nhuộm màu và quan sát vi

sinh vật dưới kính hiển vi để xem hình dạng ,màu sắc

Tuần 5 (11/12/2020) : Pha tiếp môi trường, đổ môi trường thạch nghiêng

và cấy trên ống nghiệm để lưu mẫu

Tuần 6 (18/12/2020) : Nộp kết quả và thi vấn đáp.

Nuôi cấy vi sinh

vật

Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển

Nhật ký thí nghiệm ngày 14 tháng 11 năm 2020

CÔNG VIỆC THỰC HIỆN :

+ Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất để đổ môi trường

+ Pha chế và đổ môi trường vào đĩa petri

Bước 2 : Chuẩn bị giấy báo để gói đĩa petri

Bước 3 : Đặt đĩa petri vào giấy báo bằng cách xếp chồng khoảng 5 đĩa

Bước 4 : Gói giấy báo chứa đĩa cẩn thận và chặt

Bước 5 : Đưa đĩa petri đã gói giấy báo vào tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 180độ Ctrong vòng 30 phút

Lưu ý : + Gói kĩ đĩa bằng giấy báo (không được cột dây cao su để tránh bị chảy và tránh để giấy báo chạm vào thành tủ sấy gây cháy giấy báo) + Đợi khi tủ sấy lên 180 mới bắt đầu tính thời gian sấy ( sấy 30’ ).℃ mới bắt đầu tính thời gian sấy ( sấy 30’ )

Hình ảnh đĩa petri được gói Đĩa petri đã được gói

bằng giấy báo đem đi sấy

Pha chế và đổ môi trường

Mỗi nhóm pha một môi trường rồi chia cho tất cả các nhóm còn lại trong lớp sửdụng

+ Nhóm 1 : Pha môi trường Cao thịt – Peptone

+ Nhóm 2 : Pha môi trường PGA

+ Nhóm 3 : Pha môi trường Hansen

+ Nhóm 4 : Pha môi trường Cao thịt - Peptone

Nhóm chúng em pha 100ml môi trường Cao thịt – Peptone

trộn theo nguyên tắc thể tích tăng dần, khuấy đều, sau đó thêm nước cất đến cho

đủ 100ml, tiếp tục khuấy, rồi đổ sang ca nhựa

- Đem vào lò vi sóng nấu sôi nhẹ để agar tan hết toàn (cách 1 phút lấy ra kiểmtra 1 lần, thấy sắp sôi thì set 30s tránh để bị sôi tràn ra ngoài )

b Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa

- Lấy môi trường ra khỏi lò vi sóng, nhanh tay đổ môi trường vào bình thủytinh

- Dùng bông gòn không thấm đậy kín nắp bình và lấy giấy báo bọc ngoài, cộtdây su lại cho chắc chắn

- Hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp cao áp trong vòng 30 phút, nhiệt độ

121 độ C, 1 atm

Hình ảnh môi trường sau khi đổ vào bình chứa

Sử dụng nồi hấp cao áp Bước 1: Kiểm tra nồi hấp, khóa các van thông giữa 2 nồi và van xả khí Kiểm

tra mực nước, mực nước phải đạt từ 1/2 đến 2/3 ống nước

Bước 2: Bật cầu giao

Bước 3: Đợi đồng hồ dưới lên 1 atm cho dụng cụ môi trường cần hấp vào nồi.

Khóa nắp theo nguyên tắc đối xứng 2 bên, mở van thông giữa 2 nồi ( cho khí ởnồi bên ngoài tràn vào nồi bên trong )

Bước 4 : Chờ đồng hồ trên lên 1 atm, mở van xả khí ( 3-5 phút ) sau đó đóng

van xả khí chờ đồng hồ lên 1atm rồi mới bắt đầu tính giờ Hấp trong vòng 30phút ( thời gian hấp phụ thuộc vào thể tích môi trường nuôi cấy)

Bước 5: Sau 30 phút đóng van thông giữa 2 nồi , tắt cầu giao, xả khí để đồng hồ

trên xuống 0 atm, mở nắp lấy môi trường ra khỏi nồi hấp

Hình ảnh nồi hấp cao áp

c Đổ môi trường vào đĩa petri

Tắt quạt Chọn bề mặt thích hợp trống trãi, không có các vật dễ cháy xungquanh để tránh cháy, nổ

Bước 1 : Khử trùng tay và xung quanh mặt bàn bằng cồn 70 độ

tránh bị nhiễm vi sinh vật khác) , hơ

10cm

Bước 5 : Mở hé nắp đĩa, đổ từ từ môi trường vào đĩa cho đến khi lớp thạch

được trải đều (thể tích môi trường khoảng 12-15ml mỗi đĩa và độ dày khoảng2mm) Cầm đĩa petri song song với mặt bàn khéo léo đặt nhẹ xuống bàn tránhđụng vào những đĩa đã đổ môi trường

Lưu ý : thực hiện các thao tác phải trong vòng vô trùng của ngọn lửa đèn cồn,

bán kính khoảng 10cm

Hình ảnh đổ môi trường vào đĩa petri

- Đợi môi trường trong đĩa đông lại , ta tiến hành viết nhãn trên đĩa gồm : tênmôi trường, người đổ, ngày đổ

Nhật ký thí nghiệm ngày 15 tháng 11 năm 2020

CÔNG VIỆC : cấy vi sinh vật lên đĩa môi trường NGƯỜI THỰC HIỆN : cả nhóm

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :

Cấy vi sinh vật từ :

+ Mẫu có sẵn

+ Mẫu không khí ( Ban đầu nhóm dự định làm mẫu nước mía , nhưng cuối cùngnhóm quyết định làm mẫu không khí )

Các bước tiến hành đối với mẫu có sẵn

Bước 1 : Chuẩn bị đĩa petri đã đổ môi trường ( đã đông lại ).

Bước 2 : Khử trùng tay và xung quanh mặt bàn bằng cồn 70 độ.

Bước 3 : Hơ lửa xung quanh đĩa petri, mở hé nắp đĩa Dùng micropipette và đầu

tuýp vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chữa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri

Bước 4 : Nhúng đầu que trải thủy tinh vào cồn 96°, hơ qua ngọn lửa (3 lần) để

tiệt trùng que trải Sau đó, để đầu que trải nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa

Bước 5 : Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trải lên bề mặt thạch đĩa petri Dùng

đầu que trải xoay, trải đều dịch lên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô hoàn toàn

Bước 6 : Rút que trải ra khỏi đĩa , đậy đĩa và hơ lửa xung quanh đĩa petri

Lưu ý : các thao tác phải được thực hiện trong vòng vô trùng của ngọn lửa đèncồn ( bán kính khoảng 10 cm)

Các bước tiến hành đối với mẫu tự chọn ( không khí ) Bước 1 : Chuẩn bị đĩa petri đã đổ môi trường ( đã đông lại ).

Bước 2 : Mở đĩa petri để ngoài không khí trong khoảng 20’.

Bước 3 : Đậy nắp đĩa petri lại, đem đi gói giấy báo.

KẾT QUẢ :

NHẬN XÉT :

Có vi sinh vật phát triển trên các mẫu , mật độ vi sinh vật khá nhiều Có thể tiến hành phân lập vi sinh vật

Nhật ký thí nghiệm ngày17 tháng 11 năm 2020

CÔNG VIỆC : Quan sát và cấy truyền vi sinh vật

NGƯỜI THỰC HIỆN : cả nhóm

+ Làm tiêu bản , quan sát vi sinh vật :

+ Cấy truyền vi sinh vật :

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :

Làm tiêu bản giọt ép

Tạo không gian vô trùng

Bước 1 : Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lam kính đã được làm sạch.

Bước 2 : Dùng que cấy đã được tiệt trùng chuyển giống vi sinh vật từ đĩa

petri lên phiến kính

Bước 3 : Hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước muối sinh lý.

Bước 4 : Đặt lamelle lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo bọt

khí giữa 2 tấm ( Để 1 mép lamelle tiếp xúc với phiến kính nghiêng khoảng 45 độ rồi từ từ hạ lamelle xuống )

Bước 5 : Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10, rồi chuyển

sang x40

Lưu ý : Dùng que cấy móc đối với tiêu bản nấm mốc, que cấy tròn đối với tiêu

bản nấm men và vi khuẩn

- Môi trường Cao thịt- Peptone : phân

lập và nuôi cấy vi khuẩn

- Môi trường Hansen : phân lập và nuôi cấy nấm men

- Môi trường PGA : phân lập và nuôi cấy nấm mốc

Ảnh hiển vi của nấm mốcẢnh hiển vi của nấm men

Cấy truyền vi sinh vật bằng phương pháp cấy ria, cấy điểm, cấy gõ

- Đối với nấm men và vi khuẩn: cấy truyền bằng phương pháp cấy ria (ria zíchzắc, ria chữ T, ria 3 góc, ria 4 góc) bằng que cấy đầu tròn

Bước 4 : Tay phải cầm que cấy tròn cho vào trong đĩa, để que cấy đụng nắp đĩa,

dùng tay trái sờ bên ngoài để kiểm tra xem que cấy đã nguội hay chưa

Bước 5 : Khi que cấy đã nguội thì tiến hành lấy một ít sinh khối vi sinh vật, đậy

nắp đĩa và hơ xung quanh qua ngọn lửa đèn cồn Úp ngược đĩa lại rồi đặt đĩaxuống bàn

Bước 6 : Que cấy sau khi đã lấy sinh khối vi sinh vật tiến hành cấy vào đĩa petri

có chứa môi trường

Bước 7 : Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo phương pháp cấy ria Bước 8 : Khi cấy xong , đậy nắp đĩa petri và hơ xung quanh đĩa , rồi tiệt trùng

lại que cấy

Hình : cấy ria trên đĩa thạch

- Đối với nấm mốc: cấy truyền bằng phương pháp cấy điểm hoặc cấy gõ, cấytruyền bằng que cấy móc

Bước 1 : Khử trùng tay và mặt bàn bằng cồn 70 độ.

Bước 2 : Dùng que cấy móc đốt trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng que cấy đến

khi đỏ que

Bước 3 : Tay trái cầm đĩa chứa mẫu vi sinh vật hơ xung quanh đĩa, sau đó mở

hé đĩa

Bước 4 : Tay phải cầm que cấy móc cho vào trong đĩa, để que cấy đụng nắp

đĩa , dùng tay trái sờ bên ngoài để kiểm tra xem que cấy đã nguội hay chưa

Bước 5 : Khi que cấy đã nguội thì tiến hành móc một ít bào tử hoặc sợi nấm ,

đậy nắp đĩa và hơ xung quanh qua ngọn lửa đèn cồn rồi nhẹ nhàng đặt đĩaxuống bàn

Bước 6 : Dùng que cấy tiến hành cấy vào đĩa petri có chứa môi trường PGA

bằng phương pháp cấy điểm (cấy 3 điểm hoặc một điểm)

KẾT QUẢ :

NHẬN XÉT :

- Đã quan sát được tế bào nấm mốc và nấm men, biết được hình dạng của từng

tế bào, cấy truyền chưa được đẹp và mật độ vi sinh chưa giảm sau mỗi đườngcấy ( chưa thấy được các khuẩn lạc đơn lẻ)

- Nguyên nhân do trong quá trình cấy truyền chưa đốt que cấy sau mỗi lần ria vàđường ria sau bị chồng lên quá dày so với đường ria trước

- Cách khắc phục: Xem lại video hướng dẫn của cô đã quay lại và tập cấy ria lạinhiều lần

Nhật ký thí nghiệm ngày 21 tháng 11 năm 2020

CÔNG VIỆC :

+ Hấp bỏ môi trường bị hư hỏng

+ Đổ môi trường và tiếp tục cấy truyền làm thuần

NGƯỜI THỰC HIỆN : cả nhóm

+ Hấp bỏ và đổ môi trường :

+ Cấy truyền và làm thuần :

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :

Pha chế và đổ môi trường :

+ Dụng cụ : cốc thủy tinh , ống đong , đũa thủy tinh, ca nhựa, cân kỹ thuật + Hóa chất : Cao thịt, Peptone, NaCl, Agar, Glucose, K2PO4, MgSO4.7H2O ,

- Pha 150 ml môi trường Cao thịt- Peptone

- Pha 100 ml môi trường PGA

- Pha 150 ml môi trường Hansen

Cấy truyền vi sinh vật

- Đối với nấm mốc: cấy truyền bằng phương pháp cấy điểm hoặc cấy gõ, cấytruyền bằng que cấy móc

- Đối với nấm men và vi khuẩn: cấy truyền bằng phương pháp cấy ria bằng quecấy đầu tròn

KẾT QUẢ :

Đĩa Hansen cấy nấm men bị

nhiễm vi khuẩn và nấm mốcĐĩa PGA cấy nấm mốc thuầnchủng

Đĩa CT-PT cấy vi khuẩn bịnhiễm vsv khác

Đĩa CT-PT cấy vi khuẩn bịnhiễm vsv khác

Đĩa CT-PT cấy cầu khuẩn bị

nhiễm vsv khac

Nhật ký thí nghiệm ngày 25 háng 11 năm 2020

CÔNG VIỆC :

- Tiếp tục cấy truyền trên đĩa thạch petri

- Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi quang học

NGƯỜI THỰC HIỆN: cả nhóm

- Cấy truyền và làm thuần :

- Làm tiêu bản và quan sát :

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :

Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi

Cấu tạo kính hiển vi quang học

Quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi

- Kiểm tra kính, dùng khăn lau các bộ phận

- Chuẩn bị kính: cấm điện, bật công tắc, điều chỉnh ánh sáng

- Đặt tiêu bản vào mâm kính : Tay mở kẹp tiêu bản, dùng ốc xe đẩy sao chomẫu vật nằm đúng vào trục

- Quan sát: ở vật kính x10, x40

- Xem chi tiết, hình dáng, màu sắc nấm mốc thấy được nội bào tử, xem hìnhdạng nấm men, hình dạng của vi khuẩn

LÀM TIÊU BẢN GIỌT ÉP

Tạo không gian vô trùng

Bước 1 : nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lam kính đã được làm sạch.

Bước 2 : dùng que cấy đã được tiệt trùng chuyển giống vi sinh vật từ đĩa

petri lên phiến kính

Bước 3 : hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước muối sinh lý.

Bước 4 : đặt lamelle lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo bọt

khí giữa 2 tấm ( Để 1 mép lamelle tiếp xúc với phiến kính nghiêng khoảng 45 độ rồi từ từ hạ lamelle xuống )

Bước 5 : đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi chuyển

khối, đậy lamelle

Tế bào nấm mốc

Tế bào nấm men

Nhật ký thí nghiệm ngày 2 tháng 12 năm 2020

Cuốngsinh bào tử

Thể

bình

Bào

CÔNG VIỆC :

- Tiếp tục cấy truyền và làm thuần

- Làm tiêu bản nhuộm màu vi sinh vật và quan sát

NGƯỜI THỰC HIỆN :

- Cấy truyền và làm thuần :

- Làm tiêu bản nhuộm màu vi sinh vật và quan sát : Hân, Diễm, Ánh

LÀM TIÊU BẢN NHUỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH

-> Nấm mốc: Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm Safranin O hoặc Methylen

Bước 1 : Khử trùng mặt bàn và tay bằng cồn 70 độ.

Bước 2 : Nhỏ 1 giọt màu lên lam kính trong không gian vô trùng của ngọn lửa Bước 3 : Dùng que cấy móc lấy 1 ít sinh khối sợi nấm mốc cho vô lame kính

một cách nhẹ nhàng

Bước 4 : Đặt lamelle lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo bọt

khí giữa 2 tấm ( Để 1 mép lamelle tiếp xúc với phiến kính nghiêng khoảng 45 độ rồi từ từ hạ lamelle xuống ), để trong vòng 1 phút cho ngấm màu

Bước 5 : Nhỏ nước muối sinh lý để đuổi màu ra cho nền lame trở nên trắng ,

sau đó đem đi quan sát ở vật kính X10 và X40

Nấm mốc nhuộm Safranin O-> Nấm men, vi khuẩn : Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm Safranin O

Bước 1 : Khử trùng mặt bàn và tay bằng cồn 70 độ.

Bước 2 : Nhỏ 1 giọt màu lên lam kính trong không gian vô trùng của ngọn lửa Bước 3 : Dùng que cấy đầu tròn lấy 1 ít sinh khối vi sinh vật hòa vào giọt màu,

tán nhẹ

Bước 4 : Đặt lamelle lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo bọt

khí giữa 2 tấm ( Để 1 mép lamelle tiếp xúc với phiến kính nghiêng khoảng 45 độ rồi từ từ hạ lamelle xuống ), để trong vòng 1 phút cho

ngấm màu

Bước 5 : Nhỏ nước muối sinh lý để đuổi màu ra cho nền lame trở nên trắng ,

sau đó đem đi quan sát ở vật kính X10 và X40

- Nhóm em nhuộm màu vi sinh vật bằng phương pháp nhuộm gram

LÀM TIÊU BẢN NHUỘM MÀU VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH

Bước 1 : Tạo vết bôi : Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lame kính, dùng que

cấy tròn lấy 1 ít sinh khối hòa tan vào giọt nước muối

Bước 2 : Cố định vết bôi bằng nhiệt ( để trên ngọn lửa đèn cồn tránh để gần quá

sẽ làm vi sinh vật bị co cụ, biến dạng và chết ) Lau nhẹ bên ngoài bằng giấy, hơ qua đèn cồn cho khô vết bôi

Bước 3 : Tiến hành nhuộm :

 Nhỏ khoảng 3 giọt dung dịch tím kết tinh ( Crytal violet) lên vết bôi Giữ khoảng 1 phút sau rửa lại bằng nước cất

 Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất

 Tẩy màu bằng cồn 96° trong khoảng 5-10s ( đến khi nào dòng cồn trong lại thì dừng ) , rửa lại bằng nước cất

 Nhỏ lên vết bôi dung dịch màu bổ sung Safranin O trong 1 phút rồirửa lại bằng nước cất

Bước 4 : Hong khô vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn , sau đó nhỏ lên đó 1 giọt dầu

soi kính rồi đem đi quan sát ở vật kính X100

* Sau

khiquan sát xong, vệ sinh kính bằng giấy lau

kính với dung dịch xylen

Nhỏ dd Safranin O 1’

Rừa bằng nước cất Hong khô vết bôi

Quan sát trên KHVNhỏ 1 giọt dầu soi kính

Cách nhận biết Gram : sau khi nhuộm

+ Vi khuẩn Gram ( + ) có màu xanh đen hoặc tím

+ Vi khuẩn Gram ( - ) có màu đỏ hồng hoặc hồng nhạt

Cấy truyền vi sinh vật :

- Đối với nấm mốc: cấy truyền bằng phương pháp cấy điểm hoặc cấy gõ, cấy truyền bằng que cấy móc

- Đối với nấm men và vi khuẩn: cấy truyền bằng phương pháp cấy ria bằng que cấy đầu tròn

KẾT QUẢ :

Nấm mốcNấm men

Trực khuẩn gram âmTrực khuẩn gram dương

Nhật ký thí nghiệm ngày 7 tháng 12 năm 2020

CÔNG VIỆC :

- Đổ môi trường thạch nghiêng trên ống nghiệm để lưu mẫu

- Cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng để lưu mẫu

NGƯỜI THỰC HIỆN :

- Chuẩn bị ống nghiệm :

- Đổ môi trường thạch nghiêng :

- Cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng :

 Dụng cụ : Ống nghiệm ( 5 cái ) que cấy , đèn cồn,…

 Hóa chất : Cồn 96°, Cồn 70°, cao thịt, peptone, NaCl, Agar, nước cất

PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :

Pha và và đổ môi trương thạch nghiêng :

- Tiến hành pha môi trường Cao thịt- Peptone, PGA, Hansen Sau khi pha xong,

đổ vào 1/3 ống nghiệm rồi đem đi hấp tiệt trùng

- Sau khi hấp tiệt trùng xong lấy ra khỏi nồi hấp dùng giá cố định để nghiên ốngnghiệm sao cho đáy là thạch đứng từ 0,5-1cm Đỉnh nghiêng cách nút đậy 3-5cm