Báo cáo thực hành vi sinh vật học

BÀI 1: MỞ ĐẦU I. Mục tiêu II. Nội dung 1. Nguyên tắc làm việc an toàn trong phòng thí nghiệm. 2. Nguyên tắc làm việc với vi sinh vật. 3. Nguyên tắc làm việc với hóa chất. 4. Các cấp độ an toàn phòng tí nghiệm. 5. Chuẩn bị dụng cụ. 6. Các phương pháp khử trùng. Câu 1: Tìm hiểu phương pháp khử trùng Tyndal? Giải thích cơ ở khoa học của phương pháp? Trả lời Phương pháp khử trùng Tyndal: Phương pháp này sẽ tiêu diệt tất cả các bào tử của VSV. Môi trường được hấp 34 lần ở nhiệt độ không quá 100oC3040 phút, cách nhau 24 giờ. Giữa 2 lần hấp ủ môi trường ở 2832oC24 giờ để cho bào tử nảy mầm. Các bào tử nào còn lại sống sót nảy mầm sẽ bị diệt ở lần hấp tiếp theo. Ưu điểm của phương pháp nóng ẩm: tiêu diệt được các vi khuẩn và nha bào trong một thời gian ngắn; tiệt khuẩn được nhiều dụng cụ và vật dụng khác nhau; dễ kiểm soát được nhiệt độ. Nhược điểm: nếu sử dụng không đúng, không thành thạo dễ gây tai nạn nguy hiểm. Cách tiến hành: Chất cần khử trùng được đun sôi (thường dùng nồi hấp Arnol hoặc Kock) 20 phút , sau đó được giữ ở 37oC trong 24 giờ. Lặp lại quy trình này 3 lần ta sẽ có môi trường vô trùng. Phương pháp này không diệt được các prion, thường dùng để khử trùng các môi trường nuôi cấy ở những nơi không có điều kiện sử dụng nồi áp suất cao. Cơ sở khoa học: Nguyên lí của phương pháp khử trùng Tyndall là tế bào dinh dưỡng của tế bào vi khuẩn sinh bào tử sẽ bị chết sau khi đẫ bị xử lí bằng phương pháp đun sôi , các bào tử còn sót lại được ủ thêm một thời gian để chúng nảy mần thành các tế bào dinh dưuoxng, sau đó tiếp tục đun sôi để diệt các tế bào dinh dưỡng vừa được nảy mầm các bào tử chịu nhiệt này. BÀI 2: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I. Mục tiêu Củng cố và nâng cao kiến thức về loài nguyên tố dinh dưỡng dành cho vi sinh vật. Phân biệt được các loại nguyên tố dinh dưỡng. Pha chế môi trường dinh dưỡng. Củng cố kiến thức khử trùng. II. Nội dung 1. Giới thiệu về môi trường dung dịch a. Khái niệm Môi trường dung dịch gồm các chất dinh dưỡng và yếu tố vật lý cần thiết cho sự sinh trưởng của vi sinh vật (pH, nước, hàm lượng O2, hòa tan). b. Yêu cầu môi trường dinh dưỡng Đủ dinh dưỡng – vô trùng. Không chứa thành phần gây độc. c. Phân loại môi trường dinh dưỡng Dựa vào TP đ của môi trường Dựa vào trạng thái vật lí Dựa theo mụ đích sử dụng. Câu 2: Trong môi trường dinh dưỡng, tại sao lại có độ nhớt? Nhớt quá thì sao? Không có thì sao? Trả lời Trong môi trường dinh dưỡng cần có độ nhớt vì độ nhớt phụ thuộc hàm lượng nước, lực liên kết và cấu dạng phân tử protein. Độ nhớt thay đổi theo pha phát triển của tế bào thực vật chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, thành phần ion khoáng hấp thụ,.. Độ nhớt tỉ lệ nghịch với mức độ trao đổi chất và tỉ lệ thuận với khả năng chống chịu. Khi độ nhớt giảm thúc đẩy sự di chuyển của các phân tử hữu cơ trong tế bào, kéo theo đó thì quá trình trao đổi chất sẽ tăng lên. Độ nhớt giảm thì cường độ trao đổi chất tăng lên. Khi độ nhớt tăng, thì khả năng chống chịu tăng, nhưng cường độ trao đổi chất giảm. Câu 3: Môi trường nuôi cấy mô thực vật gồm thành phần dinh dưỡng gì? Có gì giống và khác so với môi trường nuôi cấy vi sinh vật? pH nuôi cấy mô thực vật là bao nhiêu? Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật? Tại sao các chất sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô? Có những hormone nào? Tìm hiểu cách khử trùng mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trả lời Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật: Các chất khác: + Dịch chiết tự nhiên (chiết khoai tây, nước dừa, nước cam, nước cà chua, chiết nấm men)… + Chất làm đặc MT: agar 0,510% + Bổ sung than hoạt tính 0,2 – 0,3% (để tạo MT tối, hướng đất kích thích tạo rễ, dùng cho phôi vô tính, cây gỗ) Sự khác nhau giữa nuôi cấy vi sinh vật và nuôi cấy mô thực vật: • Nuôi cấy vi sinh vật: Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp nhân lên các vi sinh vật bằng cách cho chúng sinh sản trong môi trường nuôi cấy định trước trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát • Dực vào sự khác nhau về mặt hình thái (rắn, lỏng) và thành phần,tuỳ thuộc vào vi sinh vật được nuôi cấy và mục đích nuôi cấy:chia làm 2 loại môi trường chính + môi trường tự nhiên (dựa trên kinh nghiệm), môi trường tổng hợp (dựa trên các thành phần hoá học). • Nuôi cấy mô tế bào thực vật: là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng, không khí lọc qua HEPA, được thực hiện trong tủ cấy pH nuôi cấy mô thực vật là 5.66.0. Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật: + Tiến hành pha Skoog I, II, III cảu môi trường MS + Pha Stock vitamin Morel, Glycin, inosytol + Pha các stock chất điều hòa sinh trưởng Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR plant growth regulator) để đạt được các đặc tính sinh trưởng mong muốn cho loài thực vật giống cây trồng mục tiêu. Có bốn nhóm chính của PGR: auxin, cytokinin, gibberellins và axit abscisic. + Auxin: Kích thích sự dãn tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo (callus), hình thành rễ bất định. Các auxin thường dùng: 2,4Diclo phenoxi axetic axit (2,4D), a naphtil axetic axit (aNAA), pindol axetic axit (IAA), p—indol butyric axit (IBA). Tuỳ theo mục đích mà nồng độ sử dụng từ 10“5 1CT6M. + Xytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi. Vì vậy, tỉ lệ sử dụng auxin xytokinin sẽ quyết định sự phân hoá chồi hay phân hoá rễ. Các chất thường sử dụng: benzyl adenin (BA), benzyl amino purin (BAP), kinetin (fufuryl amino purin), zeatin. + Axit gibberellic được sử dụng để kích thích sự kéo dài chồi và axit abscisic có thể thúc đẩy và tăng chất lượng tổng thể của phôi soma. Cách khử trùng mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật: Quy trình khử trùng mẫu cây + Rửa mẫu sạch (xà phòng) dưới vòi nước + Tráng cồn 70 độ + Ngâm mẫu ngập trong dung dịch khử trùng + Rửa bằng nước cất vô trùng nhiêu lần BÀI 3: PHÂN LẬP VI SINH VẬT VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT I. Mục tiêu Phân lập được các vsv Nuôi cấy mô tế bào thực vật Khử trùng II. Nội dung

BÀI 1: MỞ ĐẦU

I Mục tiêu

II Nội dung

1. Nguyên tắc làm việc an toàn trong phòng thí nghiệm

2. Nguyên tắc làm việc với vi sinh vật

3. Nguyên tắc làm việc với hóa chất

Ưu điểm của phương pháp nóng ẩm: tiêu diệt được các vi khuẩn và nhabào trong một thời gian ngắn; tiệt khuẩn được nhiều dụng cụ và vật dụng khácnhau; dễ kiểm soát được nhiệt độ

Nhược điểm: nếu sử dụng không đúng, không thành thạo dễ gây tai nạnnguy hiểm

Cách tiến hành: Chất cần khử trùng được đun sôi (thường dùng nồi hấpArnol hoặc Kock) 20 phút , sau đó được giữ ở 37oC trong 24 giờ Lặp lại quytrình này 3 lần ta sẽ có môi trường vô trùng Phương pháp này không diệt đượccác prion, thường dùng để khử trùng các môi trường nuôi cấy ở những nơikhông có điều kiện sử dụng nồi áp suất cao

- Cơ sở khoa học: Nguyên lí của phương pháp khử trùng Tyndall là tế bào dinhdưỡng của tế bào vi khuẩn sinh bào tử sẽ bị chết sau khi đẫ bị xử lí bằng phươngpháp đun sôi , các bào tử còn sót lại được ủ thêm một thời gian để chúng nảymần thành các tế bào dinh dưuoxng, sau đó tiếp tục đun sôi để diệt các tế bàodinh dưỡng vừa được nảy mầm các bào tử chịu nhiệt này

BÀI 2: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

- Củng cố và nâng cao kiến thức về loài nguyên tố dinh dưỡng dành cho visinh vật.

- Phân biệt được các loại nguyên tố dinh dưỡng

- Pha chế môi trường dinh dưỡng

- Củng cố kiến thức khử trùng

II Nội dung

1 Giới thiệu về môi trường dung dịch

a Khái niệm

- Môi trường dung dịch gồm các chất dinh dưỡng và yếu tố vật lý cầnthiết cho sự sinh trưởng của vi sinh vật (pH, nước, hàm lượng O2, hòa tan)

b Yêu cầu môi trường dinh dưỡng

- Đủ dinh dưỡng – vô trùng

- Không chứa thành phần gây độc

c Phân loại môi trường dinh dưỡng

- Dựa vào TP đ của môi trường

- Dựa vào trạng thái vật lí

Khi độ nhớt giảm thúc đẩy sự di chuyển của các phân tử hữu cơ trong tế bào,kéo theo đó thì quá trình trao đổi chất sẽ tăng lên Độ nhớt giảm thì cường độtrao đổi chất tăng lên

Khi độ nhớt tăng, thì khả năng chống chịu tăng, nhưng cường độ trao đổi chấtgiảm

Câu 3: Môi trường nuôi cấy mô thực vật gồm thành phần dinh dưỡng gì?

Có gì giống và khác so với môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

- pH nuôi cấy mô thực vật là bao nhiêu?

- Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật?

- Tại sao các chất sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô?

 Nuôi cấy vi sinh vật: Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp nhân lêncác vi sinh vật bằng cách cho chúng sinh sản trong môi trường nuôicấy định trước trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát

 Dực vào sự khác nhau về mặt hình thái (rắn, lỏng) và thànhphần,tuỳ thuộc vào vi sinh vật được nuôi cấy và mục đích nuôicấy:chia làm 2 loại môi trường chính + môi trường tự nhiên (dựatrên kinh nghiệm), môi trường tổng hợp (dựa trên các thành phầnhoá học)

 Nuôi cấy mô tế bào thực vật: là tổng hợp những kỹ thuật được sửdụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vậttrong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng,không khí lọc qua HEPA, được thực hiện trong tủ cấy

- pH nuôi cấy mô thực vật là 5.6-6.0.

- Cách pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật:

+ Tiến hành pha Skoog I, II, III cảu môi trường MS

+ Pha Stock vitamin Morel, Glycin, inosytol

+ Pha các stock chất điều hòa sinh trưởng

- Môi trường nuôi cấy mô thực vật thường được bổ sung các chất điều hòasinh trưởng thực vật (PGR- plant growth regulator) để đạt được các đặctính sinh trưởng mong muốn cho loài thực vật / giống cây trồng mục tiêu.

Có bốn nhóm chính của PGR: auxin, cytokinin, gibberellins và axitabscisic

+ Auxin: Kích thích sự dãn tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo(callus), hình thành rễ bất định

Các auxin thường dùng: 2,4Diclo phenoxi axetic axit (2,4D), a naphtil axetic axit (a-NAA), p-indol axetic axit (IAA), p—indol butyricaxit (IBA) Tuỳ theo mục đích mà nồng độ sử dụng từ 10“5 - 1CT6M + Xytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoáchồi Vì vậy, tỉ lệ sử dụng auxin/ xytokinin sẽ quyết định sự phân hoáchồi hay phân hoá rễ

-Các chất thường sử dụng: benzyl adenin (BA), benzyl amino purin(BAP), kinetin (fufuryl amino purin), zeatin

+ Axit gibberellic được sử dụng để kích thích sự kéo dài chồi và axitabscisic có thể thúc đẩy và tăng chất lượng tổng thể của phôi soma.

- Cách khử trùng mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Quy trình khử trùng mẫu cây

+ Rửa mẫu sạch (xà phòng) dưới vòi nước+ Tráng cồn 70 độ

+ Ngâm mẫu ngập trong dung dịch khử trùng+ Rửa bằng nước cất vô trùng nhiêu lần

BÀI 3: PHÂN LẬP VI SINH VẬT VÀ NUÔI CẤY MÔ TẾ

- Bước 1: Pha chế môi trường theo công thức ở phần chuẩn bị

- Bước 2: Thu mẫu đất tại Khoa Sinh Học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

- Bước 3: Pha loãng mẫu

- Bước 4: Nuôi cấy, tạo ra các khuẩn lạc riêng lẻ từ quần thể VSV trên các

môi trường phân lập

- Bước 5: Thu nhận chủng

- Bước 6: Kiểm tra độ thuần khiết

- Bước 7: Giữ giống VSV sau phân lập

- Bước 8: Hoạt hóa giống

2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

a Quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật từ phôi

Khử trùng phôi lúa: bóc vỏ lúa: 10 hạt/sv

B1 Rửa bằng nước cất vô trùng

B6 Ngâm nước cất vô trùng, 10 phút, cấy vào môi trường nuôi cấy.

b Quy tình nuôi cấy mô tế bào từ cơ quan rời

B1: Mở các dụng cụ đã khử trùng như: giấy báo, panh, kéo,…

B2: Dùng kéo cắt mẫu lá, cắt thành các miếng nhỏ với kích thước 0,5x1cm, cắt 4 cạnh

B3: Cấy mẫu lá vào bình khoảng 2 -3 mẫu Đặt mẫu lá sao cho các mép của mẫu lá tiếp xúc với thạch

B4: Chụp túi bóng đã thanh trùng lên và nuôi cấy trong phòng chiếu sáng 12 -16 giờ/ ngày ở 250C

Câu 1: Trong kĩ thuật vào mẫu cần chú ý cái gì ?

- Đeo găng tay vô trùng

- Sát khuẩn tay bằng dung dịch cồn 70%

- Sát trùng bàn làm biệc trước và sau khi làm việc bằng dung dịch hỗn hợp cồn isopropanol

- Thực hiện trong 1 không gian vô trùng bởi ngọn lửa đèn cồn

- Que cấy, que trang, pipet phải được khử trùng nước và sau khi lấy mẫu vsv

Câu 2: Sau thời gian nuôi cấy phân biệt mẫu nuôi cấy đúng kĩ

thuật và mẫu chưa đúng kĩ thuật

Tạo phôi vô tính Nuôi cấy tế bào đơn và tách

tế bào trần Tạo cây có biến dị soma Đặc điểm Cây con có thể có những tính

trạng, kiểu gene khác cây mẹ ban đầu.

Cây con có kiểu gene giống với cây mẹ.

Giải thích Phôi từ hạt đã có sự thụ tinh

BÀI 4: QUAN SÁT HÌNH THÁI VÀ ĐẾM SỐ LƯỢNG

VSV

I Mục tiêu

- Phân biệt được một số hoạt động vi khuẩn lạc, vi khuẩn, xạ khuản, nấm men, nấm mốc

- Đếm được số lượng tế bào vsv bằng phương pháp khác nhau

- Thành thạo kính hiển vi quang học quan sát hình thái vsv

- Quan sát phân biệt và vẽ hình được hình thái vsv ( nấm mốc, xạ khuẩn)

II Nội dung

D f là hệ số pha loãng CFU là số khuẩn lạc đếm được trong hộp lồng

V là thể tích cho vào hộp lồng (0,1mL)

Ta có kết quả phân lập VSV ở 4 môi trường như sau:

- Môi trường Hansen: 8 KL, D f = 10 -5  Áp dụng CT 1: N = 80.000.000 (tế bào/ mL)

- Môi trường Czapek-Dox: 19 KL, D f = 10 -5  Áp dụng CT 1: N = 190.000.000 (tế bào/ mL)

- Môi trường Gauze I: 23 KL, D f = 10 -4  Áp dụng CT 1: N = 23.000.000 (tế bào/ mL)

- Môi trường MPA: 15 KL, D f = 10 -5  Áp dụng CT 1: N = 150.000.000 (tế bào/ mL)

1.2 Đếm trực tiếp bằng buồng đếm

- Cách đếm: Tiến hành đếm 4 ô ở bốn góc và 1 ô ở giữa; thực hiện

đếm từ trái sang phải, từ trên xuống dưới theo đường ziczac Cả ô lớn đếm được khoảng 150-200 tế bào là đạt yêu cầu.

Số tế bào: N = A x 25 : V : n

Trong đó:

N: số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù A: số tế bào trung bình trong 1 ô lớn V: thể tích 1 ô lớn

n: độ pha loãng mẫu 25: số ô lớn trong buồng đếm

- Kết quả:

N = (10 x 25) : 1 x 10−6 : 641 = 4 x 10−6 tế bào/ml

1.3 Đếm số lượng bằng phương pháp đo độ đục

- Đo độ đục bằng máy quang phổ với bước sóng 620 (600) nm

- Mật độ quang đạt yêu cầu: 0,1 < OD < 0,8

- Pha loãng mẫu (µL):

2 Quan sát và nhận biết khuẩn lạc VSV

hình tròn hình tròn, có

các phóng xạ đối xứng tâm

đa dạng về hình thái: tròn, méo;

Hình dạng (nhìn

nghiêng) bông xù, bụi bột không bông xù,

bụi bột lồi lên

Xanh, đỏ, tím vàng Vàng cam, Đa dạng

xanh đỏ Mùi lạc khuẩn Mùi mốc Mùi thơm

3 Nuôi cấy VSV

- Nấm mốc: Aspergillus (Asp) và Penicillium (Peni) nuôi cấy trên môi trường Czapek – Dox.

- Xạ khuẩn: Thoàn và NĐ 9 nuôi cấy trên môi trường Gauze I.

- Vi khuẩn: Bacillus subtilis và E.Coli trên môi trường MPA.

- Nấm men: MN 7 nuôi cấy trên môi trường Hansen.

BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI CẤU TRÚC TẾ BÀO

- Thành thạo kĩ năng nhuộm kép

- Sử dụng thành thạo kính hiển vi quang học

II Nội dung

1 Quan sát hình thái và cấu trúc tế bào vsv

1.1 Làm tiêu bản cố định vsv

 Bước 1: Lấy 1 giọt nước bằng đầu que cấy lên lam kính

• Bước 2: Khử trùng đầu que cấy để lấy mẫu VSV: hơ nóng và ho vào miệng ống nghiệm cho nguội đi và chỉ lấy một ít VSV

• Bước 3: Dàn đều VSV lên giọt nước huyền phù (dàn 1cm) và khử trùng đầu que cấy để giết chết VSV

• Bước 4: vết bôi khô thì chúng ta cố định

• Bước 5: Nhuộm và quan sát

1.2 Làm tiêu bản nhuộm đơn

- Mẫu vsv quan sát:

Vi khuẩn: B.Sub, E.coli, Lactobacillus Nấm men: Mn7

- Các bước tiến trình làm tiêu bản cố định, nhuộm đơn:

1 Làm vết bôi: cho 1 giọt nc lên lam kính, lấy sinh khối vsv chuẩn

bị giọt huyền phù, dàn mỏng giọt huyền phù

2.Cố định: làm khô vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn

3 Nhuộm: lấy 1 giọt thuốc nhuộm tím geltian(1p) sau đó rửa nước -> thấm khô tiêu bản -> nhỏ dầu set và soi

- Kết quả quan sát (hình ảnh hoặc hình vẽ VSV quan sát được):

E.coli

Vi khuẩn Bacillus (bào tử không bắt

màu, trong suốt, nằm trong phần

nguyên sinh chất bắt màu.)

Lactobacillus

Nấm men Mn7 (màng nhầy không

màu, trong suốt)

2 Quan sát và phân biệt thành tế bào vi khuẩn

- Mẫu VSV quan sát:

B.Sub + E.coli E.coli + LactoBacillus

- Các bước tiến trình làm tiêu bản cố định, nhuộm Gram:

Làm tiêu bản nhuộm kép

 B1: lập vết bôi

 B2: cố định vết bôi

 B3: Nhuộm tím gentian sau 2 -3 phút rửa bằng nước

 B4: Nhuộm Lugol từ 0,5 -1p Sau đó rửa bằng nước

 B5: Tẩy màu bằng cồn 90 độ khoảng 15 -20 giây Sau đó rửa bằng nước

 B6: Nhuộm Safranin khoảng 30 giây rồi rửa lại bằng nước

 B7: Thấm khô được tiêu bản nhuộm kép

 B8: Soi kính dầu

Kết quả quan sát (hình ảnh hoặc hình vẽ VSV quan sát được):

B.Sub + E.coli E.coli+ LactoBacillus

B.Sub (VK Gram [+] + E.coli

(VK Gram [-]) [-]), Màu tím: LactoBacillus (VK (Màu hồng: E.coli (VK Gram

Gram [+])

BÀI 6: ĐỘNG THÁI SINH TRƯỞNG VÀ LÊN MEN CỦA VSV

I MỤC TIÊU

- Củng cố lí thuyết một số vsv cùng với quá trình sinh trưởng của vsv

- Phân tích được cơ chế sinh hóa quá trình lên men

- Thiết lập thành công thí nghiệm về men và động thái sinh trưởng của vsv, phântích và giải thích được kết quả của thí nghiệm

II NỘI DUNG

1 Quá trình lên men rượu

Bước 3: Tính hiệu suất quá trình lên men.

Giấm có mùi chua, thơm và màu vàng nhạt

3 Quá trình lên men lactic

c Thí nghiệm làm sữa chua

Sữa đặc + 1,2L H2O sôi 45oC quấy đều để nguội + 2 hộp sữa chua -> trộn đều -> ủ

4 Nhuộm đơn

Rượu

Nước dưa chua

BÀI 8: ĐỊNH LOẠI VI SINH VẬT

- Thực hiện thí nghiệm định lượng VSV bằng hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc và bằng phản ứng hóa sinh

- TH các bước tách chiết mẫu DNA từ vi khuẩn E.coli và các bước của phản ứngPCR từ DNA tổng số

- Cách kiểm tra kết quả của phản ứng PCR mẫu DNA tổng số bằng kĩ thuật điện di

II Nội dung

1 Kiểm tra kết quả của Enzym, kháng sinh, kháng kháng sinh.

1.1 Kiểm tra Enzym

 2 loại: amylase + protease

- Tế bào ( xanh tím ) không có xanh tím -> vùng phân giải

- Đo đường kính phân giải

Vi sinh vật nguyên cứu Tinh bột tan Gelatin

Xạ khuẩn Thoàn 18 – 10 = 8

Xạ khuẩn NĐ9 22 – 10 = 12

Câu hỏi: Trong 3 chủng nghiên cứu, chủng nào có amylase mạnh nhất ?

- Hoạt tính emzym amylase của vk V37 là mạnh nhất, Xạ khuẩn NĐ9 mạnhthứ 2 và cuối cùng là xạ khuẩn Thoàn

1.2 Kiểm tra kháng sinh

 2 nhóm sinh vật kiểm định: Bacillus + Ecoli

1.3 Kiểm tra kháng kháng sinh

Vi sinh vật nguyên

Câu hỏi: VSV nào có khả năng kháng kháng sinh?

- Hoạt tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Bacillus subtilis mạnh nhất với

hình tròn hình tròn, có

các phóng xạđối xứng tâm

đa dạng về hìnhthái: tròn, méo;

Hình dạng

(nhìn

nghiêng)

bông xù, bụibột không bông xù,bụi bột

lồi lên

không bông xù,bụi bột

Màu sắc Trắng, xanh,

đỏ, tím, vàng Trắng trong,Đơn điệu

vàng nhạt

Xanh, đỏ, tímvàng Vàng cam, xanhĐa dạng

2.2 Định loại bằng hóa sinh

Catalase

Ecoli có nhiều bọt khí xuất hiện, catalase dương

Lactozo và Bacillus catalase dương, nhưng ít bọt khí hơn

 Vi sinh vật ecoli có hoạt tính mạnh, sau dần bacillus cuối cùng là lactozo

Potacium hydroxide test

- Gram (-) : E.coli nhớt

- Gram (+): Lactozo không nhớt

BÀI 9: ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG ĐIỆN DI VÀ

THỰC HÀNH Ở THPT

I Mục tiêu.

- Củng cố lý thuyết về công nghệ gen và ứng dụng trong định loại vsv

- Thực hiện được thí nghiệm điện di để kiểm tra kết quả PCR và mẫu DNA tổng số

- Thiết kế bài thí nghiệm ở trường phổ thông

II Nội dung.

1 Kiểm tra kết quả phản ứng PCR bằng điện di.

- Chuẩn bị mẫu: Sản phẩm của phản ứng PCR

- Hóa chất:

+ Agarose

+ Đệm chạy điện di (TAE 1X)

+ Nước siêu sạch MQ

+ Thang DNA chuẩn 1Kb

+ Dung dịch màu trộng mẫu (Loading dye)

+ Dung dịch hiển thị gel (Red-safe)

+ Pipetman các loại từ 1-10uL và 10-100uL

- Các bước tiến hành thí nghiệm:

+ Cân Agarose, chuẩn bị dịch agarose 0,8-1%, đun tan trong lò vi sóng

+ Chuẩn bị khuân đổ gel điện di ngang và đổ bản gel agarose

+ chuẩn bị bể điện di

+ Lấy bản gel đưa vào dung dịch đệm TAE trong bể điện di

+ Vào mẫu điện di trên bản gel agarose; thang DNA chuẩn và mẫu phản ứng PCR

+ Vận hành bể điện di với nguồn điện 100V trong 30 phút

+ Dừng thiết bị điện di và lấy bản gel ra

+ Soi gel trên bàn UV, đọc kết quar bản gel điện di

Bảng tra mẫu vào giếng điện di

2 đến 7 Mẫu PCR của từng nhóm 6 uL (5+ 1uL loading dye)

Câu hỏi:

1 Đổ bản gel agarose cần lược để làm gì?

- Cần lược để tạo giếng

2 Khi đưa mẫu vào trong bản gel cần chú ý gì?

- Cần chú ý đưa vào từng giếng tránh bị tràn ra ngoài

3 Red – safe có vai trò gì? Loading dye có vai trò gì? Vai trò của thang chuẩn DNA?

- Dung dịch nhuộm axit nucleic RedsafeTM(20,000x) là một chấtnhuộm axit nucleic mới và an toàn để phát hiện ra axit nucleic tronggel agarose Nó sẽ phát xạ huỳnh quang màu xanh khi liên kết vớiDNA hoặc RNA Chất nhuộm mới này có 2 điểm kích thích pháthuỳnh quang cực đại khi liên kết với axit nucleic, một điểm có trungtâm ánh sáng ở 309nm và điểm còn lại ở 419nm

- DNA gel loading dye bao gồm chất chỉ thị bromophenol blue, cácchất keo như Ficoll 400, Glycerol và chất đệm EDTA… có thể giúptheo dõi sự di chuyển của các sản phẩm điện di Đặc biệt, các chất keo

có thể kéo mẫu ADN lắng xuống đáy giếng khi tra nên sẽ giúp hạn chếviệc khuếch tán ra bên ngoài và làm băng điện di gọn, đẹp hơn Sửdụng DNA gel loading dye cho phép theo dõi quá trình di chuyểnDNA, thông qua đó làm tăng tính linh hoạt trong phân tích DNA củabạn

- Thang chuẩn ADN được định nghĩa là hỗn hợp các đoạn phân tửADN có kích thước khác nhau, chúng được sử dụng trong điện dinhằm đánh giá kích thước và nồng độ mẫu ADN chưa biết

4 Phân tích kết quả trên bản gel có hay không có sản phẩm, tại sao?

- Mẫu 1,2,3 và 5 có sản phẩm DNA vì có vạch phát sáng Các mẫu còn lại không có vạch phát sáng -> không có DNA, có thể do thao tác trong quá trình hút mẫu DNA để chạy phản ứng PCR xảy ra sai sót; mẫu đối chứng âm không có vạch sáng, không có DNA -> quá trình thao tác không xảy ra tạp nhiễm