MỤC ĐÍCH Pha chế môi trường nhằm thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống VSV,đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.. Biết cách bao gói, làm nút bông,
PHÂN LẬP VI SINH VẬT
Tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng khuẩn thuần khiết.
II Tiến hành – phương pháp thực hiện:
Nguồn phân lập được thực hiện bằng cách sử dụng 0,5 gam bánh men đã được giã nhuyễn Tiến hành pha loãng với nước cất vô trùng để đạt được nồng độ N -3, N -4 và N -5 Sau đó, chọn hai nồng độ liên tiếp để tiếp tục thực hiện thí nghiệm.
- Môi trường phân lập: Hansen.
Phương pháp ria để trải mẫu bao gồm việc sử dụng que cấy vòng đã được khử trùng bằng cồn để lấy dịch nấm men đã pha theo nồng độ Sau đó, dịch này được ria trên đĩa petri chứa môi trường Hansen theo hình zíc-zắc Cuối cùng, đĩa petri được gói lại và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
Trải mẫu bằng que gạt là một bước quan trọng trong quy trình nuôi cấy nấm men Đầu tiên, cho 0,1ml dịch nấm men đã pha loãng vào đĩa petri chứa môi trường Hansen Sử dụng que gạt đã được khử trùng bằng cồn để gạt dịch đều lên bề mặt thạch cho đến khi cảm thấy khô, sau đó tiếp tục gạt lên đĩa thứ hai.
2, 3) Cuối cùng gói các đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
Hình 1: Phân lập nấm men trên môi trường Hansen lần
Sau hai ngày ủ ở nhiệt độ phòng, các khuẩn lạc đã xuất hiện trên môi trường Hansen Chọn những khuẩn lạc có đặc điểm điển hình của nấm men, như khuẩn lạc lớn, màu đục sữa, khô và gồ cao.
Sử dụng que cấy để chuyển khuẩn lạc sang đĩa petri chứa môi trường Hansen khác nếu đĩa đầu tiên có nhiều nhiễm khuẩn, hoặc cấy trên ống thạch nghiêng nếu khuẩn lạc rời và ít nhiễm.
Tiếp tục cấy nhiều lần cho đến khi các khuẩn lạc đồng nhất.
Hình 2: Phân lập nấm men trên môi trường Hansen lần 2
Hình 3: Phân lập nấm men trên môi trường Hansen lần 3
2 Phân lập nấm mốc ( Aspergillus orryzae, Aspergillus niger, Mucor) Nguồn phân lập: cơm nguội
Môi trường phân lập: PGA
Sử dụng que cấy móc đã được khử trùng, nhẹ nhàng gạt lên hệ sợi tơ hoặc bào tử đính dạng bụi phấn, sau đó chuyển sang ống nghiệm thạch nghiêng Đánh ngược phần lưng móc lên thành bên trong ống nghiệm để bào tử rơi xuống, hoặc cắm đầu móc xuống mặt thạch thành ba điểm theo chiều dọc Cuối cùng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
Hình 4: Phân lập nấm mốc ở môi trường PGA lần 1
Sau hai ngày, lấy ra quan sát Nếu trên mặt thạch chỉ có một loại tơ hoặc bào tử nấm mốc phân lập là đạt.
Còn nếu lẫn nấm mốc khác hoặc vi khuẩn, thì cần tiếp tục cấy chuyền cho đến khi thuần khiết (chỉ còn loại nấm mốc mong muốn).
Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện.
+ Mốc có màu trắng: có thể là Mucor hay Rhizopus
+ Mốc có màu đen có thể là Aspergillus niger
+ Mốc có màu xanh lục có thể là Aspergillus oryzae hay Penicillium
Hình 5: Phân lập nấm mốc trên môi trường PGA lần 2
Hình 6: Phân lập nấm mốc trên môi trường PGA lần 3
3 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis: Nguồn phân lập: cỏ khô đã đun ngâm 2 ngày Môi trường: peptone –agar
Tiến hành phân lập và làm thuần mẫu bằng cách sử dụng phương pháp gạt hoặc phương pháp ria Sau 2-3 ngày ủ trong tủ ấm, lấy ra và chọn các khuẩn lạc riêng rẽ để thực hiện cấy chuyền.
Hình 7: Phân lập cỏ khô ở môi trường peptone lần 1
Hình 8: Phân lập cỏ khô trên môi trường peptone lần 2
4 Phân lập Staphylococcus: Nguồn phân lập: trên da
Môi trường phân lập: BPA, MSPR
Tiến hành trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc ria, sau đó để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 độ C trong khoảng 7 đến 15 ngày Sau thời gian này, chọn các khuẩn lạc riêng lẻ để thực hiện cấy chuyền.
Hình 9: Phân lập môi trường trên da trên môi trường BPA lần 1
Hình 10: Phân lập môi trường trên da trên môi trường BPA lần 2
Hình 11: Phân lập môi trường trên da trên môi trường MSPR lần 1
Hình 12: Phân lập môi trường trên da trên môi trường MSPR lần 2
Hình 13: Phân lập môi trường trên da trên môi trường MSPR lần 3
6 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus: Nguồn phân lập: sữa chua
Môi trường phân lập: môi trường MRSA
Tiến hành trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc ria, sau đó ủ trong tủ ấm ở 37 độ C trong 48 giờ Tiến hành chọn lọc vi khuẩn lactic dựa trên đặc điểm hình thái của khuẩn lạc để thực hiện cấy chuyền.
Hình 14: Phân lập sữa chua trên môi trường MRSA lần 2
Hình 15: Phân lập sữa chua trên môi trường MRSA lần
3 III Thực hành và báo cáo kết quả
Thực hành phân lập và làm thuần vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn
1 Mục đích của việc phân lập?
Tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng khuẩn thuần khiết.
2 Nêu các bước tiến hành phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật từ tự nhiên? ( Đã trình bày mục trên)
3 Quan sát và ghi nhận kết quả thu được? ( Đã trình bày mục trên)
NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT
Mục đích của việc nuôi cấy vi sinh vật là phát triển và duy trì một mẫu vi sinh vật phù hợp cho các thí nghiệm Quá trình này không chỉ kéo dài tuổi thọ của tế bào hoặc vi sinh vật mà còn cho phép duy trì lâu dài và quan sát hiệu quả quá trình nuôi cấy.
II Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
Quá trình nuôi cấy vi sinh vật thực chất gồm 2 khâu : nuôi và cấy
- Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật.
- Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng.
Hai khâu này không thể tách rời nhau trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng của vi sinh vật.
2 Mục đích của việc nuôi cấy:
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật
- Tiến hành việc nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng
- Cấy chuyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống
- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của vi sinh vật
- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm.
- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để.
- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển.
4 Các phương pháp nuôi cấy a Phương pháp chung của việc cấy chuyền
Gồm các thao tác chính sau:
- Tay trái cầm 2 ống nghiệm: ống giống nằm ở ngoài, ống môi trường ở trong, giữ cả hai ống hơi nghiêng.
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy.
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút bông ra và giữ trên tay đến khi đậy lại.
- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống nghiệm môi trường để thực hiện thao tác cấy chuyền.
- Rút que cấy ra, khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông lại.
- Để các ống nghiệm vào giá, đốt lại que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗ cũ.
- Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy, tên môi trường vào thành ống nghiệm b Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
Phương pháp này dùng để cấy chuyền các vi sinh vật hiếu khí.
Thông thường, quy trình sử dụng que cấy vòng sẽ tương tự như đã mô tả Tuy nhiên, sau khi lấy được giọt canh trường vi sinh vật vào đầu que cấy, chúng ta sẽ tiếp tục thực hiện các bước tiếp theo.
- Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm
- Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở đáy ống nghiệm.
- Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theo các kiểu như sau:
+ Theo kiểu hình chữ chi
+ Theo đường vạch ngang song song. c Cấy đâm sâu trên thạch đứng
Phương pháp này được sử dụng để cấy vi sinh vật kị khí, trong đó que cấy nhọn được đâm sâu vào môi trường Cách tiến hành tương tự như trước, chỉ có một số thay đổi nhỏ.
- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm hướng xuống dưới để tránh nhiễm lúc cấy.
Đưa que cấy vi sinh vật vào ống thạch cho đến đáy ống nghiệm, có thể thực hiện từ 1 đến 3 đường cấy tùy theo yêu cầu, và có thể cấy chính giữa ống.
Khi cắm và rút que cấy, cần giữ que cấy thẳng và thực hiện nhẹ nhàng để tránh làm nứt nẻ môi trường Phương pháp cấy trên đĩa petri là một kỹ thuật quan trọng trong quá trình này.
Cấy trên đĩa petri có thể thực hiện bằng hai phương pháp: que cấy vòng hoặc pipet Bài viết này sẽ tập trung vào phương pháp cấy bằng que cấy vòng và trình tự thực hiện sẽ được mô tả chi tiết.
- Để đĩa petri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thư tự và yêu cầu vô trùng như đã nêu phần trên.
- Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: + Theo hình chữ chi trên toàn bộ bề mặt thạch.
+ Theo những đường song song.
+ Theo 4 hình chữ chi ở bốn góc của đĩa thạch.
Trong quá trình cấy, số lượng vi sinh vật giảm dần theo chiều dài đường cấy, dẫn đến việc khi vi sinh vật phát triển, mật độ khuẩn lạc sẽ thưa dần ở gần cuối đường.
Để vi sinh vật phát triển tốt, cần chú ý đến các điều kiện nuôi dưỡng sau khi cấy Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, nhưng những điều kiện quan trọng nhất cần được xem xét.
Tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật, cần chọn và duy trì nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Dựa vào nhiệt độ tối ưu này, vi sinh vật được phân chia thành ba nhóm chính.
+ Vi sinh vật ưa ấm có nhiệt độ tối thích 20 – 37 0 C.
+ Vi sinh vật ưa nóng có nhiệt độ tối thích 55 – 60 0 C.
Vi sinh vật ưa lạnh phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 10 đến 15 độ C Để đảm bảo duy trì nhiệt độ lý tưởng này, cần sử dụng các tủ hoặc phòng ấm được trang bị bộ phận điều chỉnh nhiệt độ tự động, giúp giữ nhiệt độ ổn định ở mức cần thiết.
2 Độ ẩm Để đảm bảo độ ẩm cho vi sinh vật phát triển ta có thể thực hiện bằng các cách sau:
- Khi chuẩn bị môi trường phải đảm bảo đủ lượng nước.
- Phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm.
3 Điều kiện hiếu khí và yếm khí:
Cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy cho vi sinh vật có thể thực hiện bằng các biện pháp:
+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải (2 – 8cm) có thể nuôi trong ống nghiệm, khay, bình tam giác.
+ Các bình chứa canh trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật.
+ Nếu nuôi cấy sâu trong môi trường lỏng, thì phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ.
Ngăn cách không cho vi sinh vật tiếp xúc với oxy bằng cách:
Sau khi hoàn tất quá trình cấy, hãy phủ lên bề mặt môi trường một lớp dầu paraphin, dầu vazơlin hoặc một lớp thạch dày khoảng 2 cm Phương pháp này rất đơn giản và dễ thực hiện.
Chú ý: dầu và thạch phải vô khuẩn, dầu phải trung tính.
+ Cấy đâm sâu trong môi trường đặc.
+ Nuôi cấy trong bình hút chân không, có thể dùng những ống nghiệm đặc biệt gieo cấy xong hút hết không khí rồi hàn kín lại.
+ Đun sôi môi trường 20 – 30 phút rồi làm nguội nhanh để đuổi hết oxy trong đó.
+ Dùng hóa chất để loại trừ oxy của không khí trong dụng cụ nuôi.
+ Có thể nuôi vi sinh vật hiếu khí cùng vi sinh vật kỵ khí Phương pháp này thì khó áp dụng.
IV QUAN SÁT ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT NUÔI CẤY
Vi sinh vật phát triển trên môi trường tạo thành các khuẩn lạc và có những đặc điểm sinh lý riêng biệt Quan sát các đặc điểm này rất quan trọng cho việc phân loại và nghiên cứu sinh hóa, di truyền của loài vi sinh vật Việc quan sát có thể thực hiện bằng mắt thường, kính lúp hoặc kính hiển vi quang học.
1 Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc
Khi quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc cần ghi nhận các đặc điểm sau đây:
- Hình dạng khuẩn lạc (dạng tròn, dạng rễ cây, dạng không đều hay dạng bầu dục…)
- Kích thước khuẩn lạc (tính bằng mm) Nếu là dạng khuẩn lạc tròn ta đó
- Màu sắc: ghi màu sắc khuẩn lạc tạo thành, và màu của môi trường
- Bề mặt khuẩn lạc: ghi nhận bề mặt khuẩn lạc bóng, xù xì, gấp nếp hay gồ ghề…
- Mép khuẩn lạc: bằng phẳng, lượn sóng hay răng cưa….
- Độ đặc: dạng mỡ, bột nhão, dạng nhớt, dạng màng
2 Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng
Sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng dưới điều kiện nuôi cấy ổn định thường đồng nhất hơn so với môi trường đặc Khi quan sát sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng, cần chú ý ghi nhận các yếu tố quan trọng.
- Sinh trưởng yếu, vừa, hay mạnh mẽ.
- Đục môi trường: đục đồng đều, dạng bông,
- Khả năng tạo váng: dạng váng vòng hay dạng kín, váng mỏng hay dày, phẳng hay xù xì, nhẵn nhụi hay gấp nếp, khô hay nhày, nổi hay chìm.
- Khả năng tạo thành cặn tủa: ít hay nhiều, xốp hay đặc.
V THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ
Thực hành cấy chuyền vi khuẩn và nấm men từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng, đĩa petri và môi trường lỏng Quá trình này bao gồm việc nuôi ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của chúng.
Thực hành cấy chuyền nấm mốc từ ống giống sang môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng bằng phương pháp cấy 3 điểm Sau đó, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của nấm mốc.
1 Nêu rõ nguyên tắc và mục đích của việc cấy chuyền vi sinh vật từ ống giống sang môi trường?
Mục đích của việc nuôi cấy:
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật
- Tiến hành việc nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng
- Cấy chuyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống
- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của vi sinh vật
- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm.
- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để.
- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển.
2 Trình bày tóm tắt thao tác cấy chuyền vi sinh vật từ ống giống sang môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa?
- Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm
- Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở đáy ống nghiệm.
- Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theo các kiểu như sau:
+ Theo kiểu hình chữ chi
+ Theo đường vạch ngang song song.
Hình 1: Phân lập nấm mốc trên môi trường PGA thạch nghiên
Hình 2: Phân lập nấm men trên môi trường Hansen thạch nghiên
Hình 3: Phân lập cỏ khô trên môi trường Peptone thạch nghiên
- Để đĩa petri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thư tự và yêu cầu vô trùng như đã nêu phần trên.
- Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:
+ Theo những đường song song.
+ Theo 4 hình chữ chi ở bốn góc của đĩa thạch.
ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá số lượng vi sinh vật trong một thể tích hoặc trọng lượng mẫu cụ thể thông qua các phương pháp xác định trực tiếp và gián tiếp.
II THU VÀ PHA LOÃNG MẪU
Để xác định số lượng tổng thể của các nhóm vi sinh vật cũng như số lượng riêng lẻ của từng nhóm trong một mẫu vật, cần phải tiến hành đếm số lượng tế bào của chúng.
Khi xác định số lượng vi sinh vật trong đất, nước, không khí, dịch nuôi cấy hoặc các vật phẩm khác, có nhiều phương pháp được sử dụng Hai phương pháp phổ biến thường được áp dụng là
- Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng buống (phòng) đếm hồng cầu
- Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.
Cả 2 phương pháp trên đều phải tiến hành qua 2 giai đoạn sau đây:
Tùy thuộc vào loại vật phẩm cần xác định, việc lấy mẫu để nghiên cứu cần được thực hiện với số lượng và khối lượng phù hợp Quá trình thu mẫu phải đảm bảo đáp ứng các yêu cầu nhất định.
- Lấy mẫu có tính chất đại diện.
- Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hóa, sinh học.
- Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng.
Sau khi lấy mẫu, cần phải tiến hành phân tích ngay lập tức và không được để quá 24 giờ Mẫu lấy phải được ghi rõ vào nhãn ký hiệu và ghi chép lại những đặc điểm của mẫu cũng như địa điểm thu mẫu.
Chuẩn bị một số bình tam giác với 99ml nước cất vô trùng, cùng với một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng và một số ống hút vô trùng có dung tích 1ml Điều này là cần thiết khi mẫu nghiên cứu ở trạng thái lỏng.
- Hút 1ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có 9ml nước cất vô trùng
- Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3 – 5 lần ta được độ pha loãng 1/10 hay 10 -1
- Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng thứ 2.
- Trộn đều dung dịch như trên ta có độ pha loãng 1/100 hay 10 -2
- Tiếp tục như vậy hút từ ống 2 sang ống 3 sang ống 4 ta sẽ có các độ pha loãng tương ứng 10 -3 ,10 -4 …. b Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc
- Chuẩn bị 2 bình tam giác có dung tích 250ml + Bình 1 chứa 99 ml nước cất vô trùng
+ Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì
- Khử trùng cối chày sứ bằng 1 ít cồn vào và đốt lên Sau đó để nguội
- Cân 1g mẫu cho vào cối sứ và nghiền nát mẫu
- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2
- Lắc đều khoảng 5 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như mẫu ở trạng thái lỏng.
- Tùy theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít.
Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định số lượng tế bào vi sinh vật.
III XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT
1 Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu
Phòng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bao tử nấm mốc).
Người ta thường dùng 2 loại phòng đếm hồng cầu Thomas và phòng đếm Geriep.
Nguyên tắc cấu tạo của hai loại phòng đếm này tương tự nhau, bao gồm một phiến kính dày hình chữ nhật được chia thành ba khoảng ngang Khoảng giữa được chia thành hai khoảng nhỏ, mỗi khoảng có một lưới đếm với 400 ô vuông, tổng diện tích là 1 mm² Diện tích mỗi ô vuông là 1/400 mm² và chiều cao là 1/10 mm, dẫn đến thể tích của một ô nhỏ là 1/4000 mm³ Phòng đếm được thiết kế với kính dày để bảo vệ.
Cách tiến hành thí nghiệm:
- Lắc cho mẫu vật tan đều trong bình, sau đó lấy ống hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm 1.
- Tại ống nghiệm 1, lắc đầu sao cho mẫu vật vừa cho vào tan đều, dùng ống hút 1ml mẫu ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2.
- Ống nghiệm 2 cũng làm tương tự rồi lấy ống hút 1ml mẫu cho vào ống 3.
- Đặt lá kính lên lưới đếm
Sử dụng ống hút vô trùng để lấy mẫu từ ống nghiệm 3, sau đó cho một giọt mẫu vào mép lá kính Đặt phóng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 35 phút, sau đó tiến hành đếm tế bào trong 5 ô lớn, bao gồm 4 ô ở góc và 1 ô ở trung tâm.
Hình 1: Mẫu nấm men pha loãng ở 4 nồng độ khác nhau
- Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được xác định bằng công
Số tế bào/ml = a ∗ 4000 ∗ 10 3 * 1/10 -n b a: Số tế bào trong ô lớn (80 ô con) b: Số ô con trong 5 ô lớn (16*5 ô con)
10 3 : Số chuyển mm 3 thành ml (1000 mm 3 = 1ml)
Chú ý: Số tế bào trong 5 ô lớn phải trên 200 mới đảm bảo được mức độ chính xác của phương pháp.
2 Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.
+ Cấy 1 thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa petri
Để xác định số lượng tế bào, ta cần đếm số khuẩn lạc xuất hiện sau thời gian nuôi cấy, vì mỗi khuẩn lạc đại diện cho sự phát triển của một tế bào.
+ Ghi độ pha loãng và ngày cấy trên nắp petri
+ Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10 -3 ,10 -4 , …
+ Chuẩn bị môi trường trong các ống nghiệm đã khử trùng
+ Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch pha loãng mẫu cho đĩa petri vô trùng
+ Sau đó đổ môi trường thạch từ ống nghiệm sang Dùng tay xoay tròn đĩa cho mẫu hòa đều vào môi trường
Chờ cho môi trường đặc lại, sau đó lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian phù hợp Cuối cùng, lấy ra để kiểm tra kết quả.
+ Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp mỗi nồng độ cấy 2 đĩa petri hoặc 2 nồng độ liên tiếp mỗi nồng độ 3 đĩa petri Lấy kết quả trung bình
Hình 2: Mẫu lacto pha loãng ở nồng độ 10 -1
Kẻ 2 đường kính giao nhau ở đáy đĩa petri Đếm số khuẩn lạc từng vùng và đánh dấu khuẩn lạc đã đếm.
Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g mẫu được tính như sau:
Số tế bào / gam mẫu = M
M: số khuẩn lạc trung bình trong 1 đĩa petri
N: hệ số tính theo khối lượng khô tuyệt đối của mẫu
Độ pha loãng tối ưu để cấy trên thạch đĩa là nồng độ cho phép tạo ra từ 50 đến 150 khuẩn lạc đối với vi khuẩn và xạ khuẩn, trong khi đối với nấm mốc, số khuẩn lạc nên nằm trong khoảng 30 đến 50.
IV BÁO CÁO KẾT QUẢ
1 Tại sao khi kiểm tra số lượng tế bào vi sinh vật trong một lại mẫu nào đó người ta phải pha loãng mẫu?
Vì pha loãng sẽ giúp mẫu giam mât đô vi sinh vât trong mâu đên ngương co thê dễ dàng đêm đươc.
Kiểm tra số lượng tế bào nấm men trong dịch nuôi cấy có thể thực hiện bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu Đối với bánh men cơm rượu, phương pháp đếm số khuẩn lạc được sử dụng để xác định số tế bào nấm men Từ những kết quả này, ta có thể tính toán số tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy và 1 g mẫu bánh men.
Số lượng tế bào nấm men trong dịch nuôi cấy bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu.
Hình 3: Nấm men soi dưới kính hiển vi (vật kính 4x)
Số tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy:
Nồng độ 10 -1 (do mẫu có sẵn ở PTN số lượng tế bào ít)
Để xác định số lượng tế bào vi khuẩn ở hai nồng độ pha loãng, cần đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch Từ đó, tính toán số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 ml mẫu ban đầu.
(Mẫu của tổ bị nhiễm nấm mốc nên tổ không tính được số lượng tế bào)
QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI
- Biết cách làm tiêu bản (tạm thời), tiêu bản cố định, tiêu bản phòng ẩm.
- Nắm rõ cách sử dụng kính hiển vi và quan sát được một số đặc điểm của vi sinh vật dưới kính hiển vi ở vật kính 10, 40, 100 ( vật kính dầu).
Chuẩn bị như tài liệu giáo trình thực hành Vi sinh vật học (GVHD Võ Thị Xuyến)
III QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT
1 Quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống – làm tiêu bản tạm thời
Mục đích: quan sát vi sinh vật ở trạng thái tự nhiên về hình dạng, cấu tạo, sự chuyển động, sự tăng trưởng và phát triển….
1.1 Cách làm làm tiêu bản giọt ép a Đối với nấm mốc và nấm men:
- Cho một giọt nước vô trùng lên phiến kính sạch
- Dùng que cấy vòng lấy một vòng dịch nấm mốc/nấm men hòa vào giọt nước
- Đậy lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ để tránh không tạo bọt khí
- Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi.
Quan sát dưới vật kính 10x và 40x, phương pháp nuôi cấy phòng ẩm giúp giữ nguyên cấu trúc hệ sợi của nấm mốc, đặc biệt là các cơ quan sinh sản như cuống sinh bào tử và cách đính bào tử Để thực hiện, cần chuẩn bị tiêu bản theo các bước cụ thể.
Chuẩn bị sẵn môi trường PGA ( phòng thí nghiệm đã chuẩn bị )
Cho vào đĩa petri một tờ giấy thấm, đặt vào đĩa 1 phiến kính.
Mở nắp petri gần ngọn lửa đèn cồn, sau đó dùng pipet nhựa để hút môi trường PGA đã làm lỏng và cho lên phiến kính 2 điểm Đợi cho môi trường khô.
Lấy nước cất vô trùng nhỏ vào phần giấy thấm, để nước thấm đều tờ giấy( không cho tràn lên phiến kính).
Dùng que cấy móc, khều nhẹ khuẩn lạc nấm mốc rồi chấm lên phần thạch trên phiến kính trong môi trường ẩm.
Gói đĩa lại, quấn màng bọc sxung quanh đĩa sau đó ủ ở nhiệt độ thường 2-3 ngày.
Sau 2-3 ngày mở hộp petri lấy phiến kính ra quan sát.
Sử dụng giấy thấm để lau mặt đáy phiến kính, sau đó đậy lá kính lên khu vực có khuẩn lạc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát với độ phóng đại 10x và 40x.
1.2 Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu:
- Nguyên tắc: phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với
C vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm.
+ Nhỏ một giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính
+ Nhỏ một giọt canh trường lên giọt thuốc nhuộm
+ Đậy lá kính lên giọt dịch
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính 10x rồi 40x
2 Quan sát vi sinh vật ở trạng thái chết – làm tiêu bản cố định (tiêu bản vi sinh vật chết nhuộm màu)
Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật học vì nó có ưu điểm sau:
- Thao tác tuy phức tạp nhưng tiêu bản có màu sắc đẹp, giữ được lâu.
- Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng và một số cấu tạo của tế bào cũng như dễ dàng đếm số lượng tế bào vi sinh vật….
- Không sợ bị lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh
Quá trình làm tiêu bản cố định thường qua các bước sau: a Làm vết bôi
- Chọn phiến kính sạch và khô Nếu chưa sạch phải rửa lại.
Sử dụng bút chì màu để khoanh một vòng tròn có đường kính từ 1 đến 2 cm trên một bên của phiến kính Sau đó, lật ngược phiến kính lại và đặt lên giá Nếu bạn đã quen với quy trình này, có thể bỏ qua bước lật kính.
Sử dụng que cấy để lấy một giọt canh trường và cho vào vòng đã khoanh Nếu canh trường đặc, hãy dùng que cấy để lấy một giọt nước vô trùng và cho lên vòng đã khoanh, sau đó hòa đều một ít khuẩn lạc vi sinh vật với nước.
- Nghiêng que cấy 10 –15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra khắp diện tích đã khoanh, không sát mạnh.
- Khử trùng que cấy và để vào giá.
- Để vết bôi khô tự nhiên.
+ Lượng vi sinh vật lấy vừa phải
Vết bôi tròn cần phải gọn gàng và thật mỏng, đảm bảo rằng vi sinh vật không tập trung tại một điểm hay chồng chất thành nhiều lớp, mà phải được phân phối đều trên bề mặt vết bôi.
+ Kích thước vết bôi vừa phải khoảng 1- 2 cm 2 , bé quá khó quan sát, lớn quá mất thời gian, tốn thuốc nhuộm. b Cố định vết bôi
Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
+ Giết chết vi sinh vật để an toàn khi tiếp xúc
+ Gắn chặt vi sinh vật vào phiến kính để lúc nhuộm thì rửa không bị trôi + Làm cho vi sinh vật dễ bắt màu
Có nhiều phương pháp cố định mẫu, trong đó phương pháp đơn giản nhất là sử dụng đèn cồn Cách thực hiện là kẹp phiến kính giữa hai ngón tay cái và ngón trỏ, sau đó đưa qua lại 4-5 lần trên phần không quá nóng của đèn cồn, cần tránh để tiêu bản bị nóng quá mức.
Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào, việc cố định bằng cách hơ nóng không hiệu quả; thay vào đó, cần sử dụng hóa chất, thường là rượu và axêton, để cố định tế bào.
+ Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu 95 0 ngâm vết bôi từ 5 – 15 phút Với rượu metylic ngâm khoảng 2 – 5 phút.
+ Ngâm vết bôi vào dung dịch axêton trong 5 phút.
+ Nhỏ vài giọt rượu 90 – 95 0 lên vết bôi Đốt cháy và dập tắt ngay Làm như vậy vài lần rồi để khô. c Nhuộm màu tiêu bản
Nguyên tắc sử dụng thuốc nhuộm là chọn những loại có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào, kết hợp với các thành phần khác nhau trong tế bào để tạo ra các hợp chất màu đặc trưng và bền vững.
- Tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cho phù hợp.
- Có hai cách nhuộm chính:
+ Nhuộm phức tạp (nhuộm kép): dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản Ví dụ: nhuộm gram, nhộm bào tử, nhuộm tiêm mao…
Như vậy, tùy mục đích nghiên cứu mà ta áp dụng phương pháp nhuộm thích hợp.
Vết bôi đã cố định phải để khô mới đem nhuộm
- Đặt tiêu bản có vết bôi lên cầu thủy tinh (được đặt nằm ngang miệng một bôcan)
- Đặt miếng giấy lọc phủ lên toàn bộ vết bôi
Sử dụng ống nhỏ giọt để nhỏ thuốc nhuộm lên vết bôi một cách đều đặn Cần chú ý không cho quá nhiều thuốc nhuộm và luôn đảm bảo rằng trong suốt quá trình nhuộm, vết bôi được phủ đều một lớp thuốc nhuộm.
- Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và thuốc nhuộm
- Thường nhuộm ở nhiệt độ phòng Để tăng cường tác dụng của thuốc nhuộm hoặc rút ngắn thời gian ta hơ nóng trên đèn cồn
Sau khi hoàn tất quá trình nhuộm, hãy rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính và sử dụng bình xịt để cho dòng nước chảy nhẹ nhàng qua vết bôi cho đến khi nước chảy ra không còn màu sắc.
- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn.
- Quan sát tiêu bản ở vật kính 40x rồi chuyển sang vật kính 100x có dầu.
2.2 Các phương pháp nhuộm tế bào vi sinh vật a Nhuộm đơn giản
Là phương pháp hay dùng trong phòng thí nghiệm, nó cho phép ta nhận định nhanh chóng về hình dạng của vi sinh vật.
Tiến hành nhuộm tế bào vi khuẩn E coli, Bac.subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobicillus plantarum, tế bào nấm men theo trình tự như sau:
- Làm vết bôi, để khô tự nhiên
- Cố định bằng cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn
- Đặt giấy lọc lên vết bôi đã cố định
- Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm Fuchsin loãng trong 2 – 3 phút hoặc xanh metylen trong 3 – 5 phút
- Thấm khô bằng giấy thấm
- Quan sát dưới vật kính 100x (có dầu) b Nhuộm phức tạp (nhuộm kép)41
Phương pháp này dựa trên đặc tính cấu tạo hóa học của tế bào, giúp nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của tế bào, cũng như sự khác biệt giữa các loài vi sinh vật.
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà chia thành 2 nhóm lớn.
Nhóm vi khuẩn gram dương có khả năng giữ lại phức chất tạo thành giữa tinh thể tím và iod khi được xử lý bằng cồn.
Nhóm vi khuẩn gram âm không giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iod khi được xử lý bằng cồn.
Tiến hành nhuộm tế bào E coli và Bac subtilis, Staphylococcus aureus,
- Làm vết bôi, để khô
- Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá)
- Đặt giấy lọc lên vết bôi
- Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong 1 – 2 phút
- Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên để trong 1 phút
- Nhúng vào cồn 95 0 trong 30 giây Cần làm cẩn thận vì kết quả phụ thuộc nhiều vào động tác này.
- Nhuộm bổ sung bằng Funshin loãng 1 phút
- Xem tiêu bản dưới vật kính dầu
Kết quả: Bac.subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobicillus plantarum bắt màu tím, E coli bắt màu hồng.
NHUỘM BÀO TỬ (NHA BÀO)
Nguyên tắc nhuộm bào tử dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử dày và chắc, khiến chúng khó bắt màu Do đó, cần sử dụng thuốc nhuộm đặc và xử lý tế bào chất bào tử bằng nhiệt và axit để dễ dàng bắt màu hơn.
Có nhiều phương pháp nhuộm bào tử, nhưng tất cả các phương pháp đều dựa trên nguyên tắc: loại thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh
- Làm mất màu tế bào (nhưng bào tử vẫn còn màu)
- Nhuộm lại tế bào bằng một loại thuốc nhuộm khác
Nhờ vậy mà tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu khác nhau.
Làm tiêu bản và nhuộm (Theo phương pháp Ogietska)
- Làm vết bôi với Bac.subtilis đã nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống thạch nghiêng, và để khô tự nhiên
- Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn cồn cho bốc hơi, giữ 2 phút rồi rửa nước
- Đặt giấy lọc lên vết bôi
- Nhỏ Fuchsin Ziehl 3 – 5 phút Trong khi nhuộm hơ nóng cho đến bốc hơi nhẹ Nếu thuốc nhuộm cạn phải thêm vào, không để bị khô.
- Rửa vết bôi, để khô
- Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H2SO4 1% trong 1 đến 2 phút
- Nhuộm vết bôi bằng xanh metylen Loeffler trong 1 – 2 phút
- Quan sát tiêu bản dưới vật kính dầu
Kết quả: bào tử màu đỏ, tế bào chất màu xanh.
IV THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ
1 Làm tiêu bản tạm thời quan sát hình dạng tế bào nấm mốc, nấm men Cách làm: đã trình bày nội dung trên ( nội dung III -> 1 -> 1.1 -> a) Quan sát:
Nấm mốc:có dang hinh sơi, dai, sơi nâm la môt ông hinh tru dai, có bào tử
Vật kính 40x Nấm men: co dang hinh bâu duc, không có bào tử
2 Quan sát hình dạng tế bào nấm men, Bac.subtilis, E coli ở vật kính dầu khi nhuộm đơn.
Cách làm: đã trình bày nội dung trên ( nội dung III -> 2 -> 2.2 -> a) Quan sát:
Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin Nấm men ( ở trạng thái sống):
Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin
Bac.subtilis: có hình que,có bào tử, có khuyh hướng phình ra ở 1 đầu.
Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin
Vật kính 100x, thuốc nhuộm Fuchsin
3 Thực hành làm tiêu bản phòng ẩm Quan sát sợi khuẩn ty và cuống sinh bào tử của nấm mốc trên tiêu bản đã được chuẩn bị sẵn.
Cách làm: đã trình bày ở trên ( nội dung số III -> 1 -> 1.1 -> b ).
Quan sát: Nấm mốc thường phát triển tốt nhất trong điều kiện ẩm ướt, nấm mốc sinh sản bằng cách tự phân đôi, tạo ra các bào tử.
4 Thực hành làm tiêu bản nhuộm gram:
Cách làm: đã trình bày ở trên ( nội dung III -> 2 -> 2.2 -> b) Quan sát:
Bac.subtilis:vi khuẩn bắt màu tím -> gram dương
Quan sát vật kính 100x, bắt màu tím.
E coli: khi nhuộm fuchsin vi khuẩn bắt màu hồng -> vi khuẩn gram âm
Quan sát vật kính 100x Bắt màu hồng -> là vi khuẩn gram âm.
Cách làm: đã trình bày ở trên ( nội dung III -> 2 -> 2.2 -> b)
Bac.subtilis: nhận thấy bảo tử có màu đỏ và tế bào chất có màu xanh do được đặt trong điều kiện môi trường khắc nghiệt.
Phương pháp Ogietska, quan sát dưới vật kính 100x.
1 Cho biết ý nghĩa của việc nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi sinh vật?