BÁO cáo THỰC HÀNH VI SINH vật bài 2 PHÂN lập VI SINH vật bài 3 NUÔI cấy, QUAN sát sự PHÁT TRIỂN của VI SINH vật

MỤC ĐÍCH Pha chế môi trường nhằm thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống VSV,đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.. Biết cách bao gói, làm nút bông,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN LANG

KHOA CÔNG NGHỆ ỨNG DỤNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT

Lớp: K27CNTM01 Nhóm 1 – Tổ 1 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Phương Thi - 2174202070046 Nguyễn Ngọc Phương Lê - 2174202070031

Lê Thị Minh Ngọc - 2174202070005

MỤC LỤC

BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH

VẬT……… 1

BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT 11

BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT………20

BÀI 4: ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT……….31

BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI…… 37

BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

NUÔI CẤY VI SINH VẬT

I MỤC ĐÍCH

Pha chế môi trường nhằm thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống VSV,đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng Môi trườngcần phải đủ lượng và đủ chất mới đảm bảo được sự phát triển của vi sinh vật

Biết cách bao gói, làm nút bông, khử trùng dụng cụ, biết các bước thực hiệnpha chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật

cụ được khử khuẩn và duy trì được tình trạng nguyên vẹn của gói đồ Thời hạn bảoquản dụng cụ phụ thuộc vào loại giấy gói sử dụng

1.3 Phương pháp bao gói dụng cụ

Việc bao gói dụng cụ gồm hai khâu:

- Làm nút bông: đối với ống nghiệm, bình tam giác, pipet…

- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh

1.4 Cách làm nút bông

Dùng một miếng gòn không thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống nghiệm

- Đầu nút phải tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm

- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng

Cách làm nút gòn này cũng được áp dụng cho các chai lọ, bình cầu, bình tamgiác… cách làm cũng tương tự như đối với ống nghiệm Nhưng lượng gòn sử dụngphải nhiều hơn và có thể được bọc bằng một lớp vải gạc

1.5 Cách bao gói dụng cụ

Với các dụng cụ sau khi làm nút bông, cần được bao gói phần có nút bôngbằng giấy dầu hay giấy báo để sau khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt và đảmbảo vô trùng tốt hơn Cách làm như sau:

- Cắt các mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần baogói

- Quấn giấy quanh phần đầu của nút bông

- Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên

- Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào bên trong

Yêu cầu:

+ Phần giấy bao ngoài phải chặt và kín

+ Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt

+ Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng

Với các dụng cụ như pipet, đĩa petri, que gạt phải dùng giấy bao kín toàn bộ

Có thể thay giấy báo bằng 1 hộp nhôm kín đựng tất cả các dụng cụ trên để khử trùng

Hình 1: làm nút bông và bao gói dụng cụ

2 Phương pháp khử trùng

2.1 Mục đích

Làm chết hoàn toàn mọi mầm mống vi sinh vật, kể cả các vi sinh vật có bào tử.Đây là khâu quan trọng nhất Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môitrường, dụng cụ, thiết bị để tránh sự phát triển lẫn lộn các hệ vi sinh vật ngoại lai vàogiống vi sinh vật đang nghiên cứu.

2.2 Các phương pháp khử trùng

Có thể khử trùng bằng một số tác nhân lý hóa như nhiệt độ, bức xạ, lọc và hóachất Tác nhân khử trùng được chọn tùy mục đích và vật liệu cần khử trùng - Cácdụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường được khử trùng bằng phương pháp nhiệtkhô trong tủ sấy Các thanh gạt thủy tinh được khử trùng bằng cách đốt với cồn 700C

và các que cấy kim loại được khử trùng bằng cách đốt trực tiếp trên ngọn lửa

- Trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương phápnhiệt ẩm bằng nồi hấp áp lực (autoclave, 1atm, 1210C) thường được sử dụng để cácthành

phần hữu cơ của môi trường không bị cháy, biến tính và môi trường không bị mấtnước

- Trường hợp môi trường chứa các chất phân tử lượng nhỏ không bền với nhiệtnhư vitamin, amino acid, hoặc huyết thanh chứa các protein là nhân tố tăng trưởng,phương pháp nhiệt ẩm có thể làm biến tính các thành phần này nên thường được khửtrùng riêng bằng phương pháp lọc qua màng

2.1 Khử trùng dụng cụ, môi trường bằng nồi hấp áp lực

Phương pháp này thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao Là thiết bịlàm bằng kim loại, chịu được nhiệt độ và áp suất cao, có khả năng tự động điều chỉnh

áp suất và thời gian khử trùng theo yêu cầu của người sử dụng

- Nguyên tắc hoạt động

Làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suấtbình thường của khí quyển Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theonhờ hệ thống van rất chặt chẽ

Mối quan hệ giữa áp suất ghi trên áp kế với nhiệt độ trong nồi biểu hiện quabảng sau đây:

Áp suất Nhiệt độ (0C)

121128134

Phương pháp khử trùng bằng nhiệt ẩm cho phép diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫnbào tử của vi sinh vật

- Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp lực như sau

+ Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy định

+ Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên trong nồi hấp, khôngnên xếp quá chặt để hơi nước lưu thông dễ dàng

+ Đậy kín nắp nồi hấp Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từngcặp đối xứng nhau

+ Mở van thông hơi giữa 2 nồi (trường hợp nồi hấp 2 lớp)

+ Bật công tắc, đun nồi hấp

+ Khi nhiệt độ lên đến 800C hoặc 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết khôngkhí ra khỏi nồi trong vòng 3 – 5 phút cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục,đóng van lại

+ Khi áp suất lên đến mức cần thiết thì bắt đầu tính thời gian khử trùng

+ Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống giá trị

0 mới được mở nắp để tránh gây ra tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hưmôi trường

Một số nồi hấp hiện đại có thể tự kiểm soát thời gian, áp suất và tự đuổi khí rakhỏi nồi, cho phép bỏ qua một số thao tác tương ứng ở phần trên

Chú ý: để đảm bảo an toàn và hiệu quả của việc hấp khử trùng, ngoài việc thận

trọng thực hiện đúng qui trình đã chỉ dẫn, người làm thí nghiệm cần phải:

+ Kiểm tra mực nước và bổ sung lượng nước cần thiết trước khi sử dụng + Với nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần phải xiết ốc theo từng cặp đối xứng để đảmbảo độ kín, tránh làm nắp nồi bị chênh hoặc hư vòng đệm cao su

+ Tuyệt đối không mở nắp nồi khi kim chỉ nhiệt độ và áp suất chưa trở về 0 + Trực tiếp theo dõi quá trình hấp khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện.Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi được khử trùng

bằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt nhưng đảm bảo cho phép không khí vàhơi nước thông qua

Thông thường, các hộp petri hoặc nút bông còn được bao gói bằng giấy hoặcgiấy nhôm để tránh nguy cơ bị nhiễm sau khi khử trùng Sau khi hấp, các hộp petricần được sấy khô trước khi dùng

2.2 Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng phương pháp nhiệt khô

Các hộp petri, ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể được khử trùng bằngphương pháp sấy ở 1700C trong 2 giờ trong tủ sấy Trong trường hợp này, các ống hútcần được nhét nút bông không thấm nước ở đầu hút Hộp petri, ống hút, các dụng cụcần khử trùng khác được gói kín bằng giấy hoặc giấy nhôm trước khi sấy

III PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

1 Khái niệm chung

Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất cónhiệm vụ duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH củamôi trường

2 Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng

Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào để nuôi cấy vi sinh vật cũng cần đạtđược các yêu cầu cơ bản sau đây:

- Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết

- Có độ pH thích hợp

- Có độ nhớt nhất định

- Hoàn toàn vô khuẩn

- Không chứa các yếu tố độc hại

3 Phương pháp làm môi trường

3.1 Nguyên tắc

Tùy theo mục đích khảo cứu mà ta điều chế loại môi trường cho hợp lí

Khi điều chế môi trường, ta dựa trên các nguyên tắc sau đây:

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các

- Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của visinh vật.

3.2 Các bước làm môi trường dinh dưỡng

a Pha chế

Cân, đong chính xác từng thành phần của môi trường và pha chế đúng theotrình tự đã hướng dẫn

+ Với môi trường lỏng: các chất cân đong xong cho hòa tan vào nước

+ Với môi trường đặc: là môi trường lỏng có bổ sung thêm agar (1,5 – 2,5%).Cân hóa chất cho hòa tan vào nước, bổ sung lượng nước đủ theo công thức Cho agarvào, đun sôi và khuấy đều cho đến khi agar vừa tan

b Làm trong môi trường

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật – nhất là môi trường lỏng cần phải hoàn toàntrong để dễ quan sát sự phát triển của chúng Có thể làm trong môi trường bằng nhữngphương pháp sau:

+ Với môi trường lỏng: người ta lọc qua vải màn nhiều lớp, qua bông thấmnước hoặc qua giấy lọc

+ Với môi trường đặc thường lọc qua vải màn 2 lớp hoặc giấy lọc trong điềukiện có phễu lọc nóng

c Điều chỉnh pH của môi trường

Độ pH của môi trường tùy theo đối tượng vi sinh vật nuôi cấy và tùy theo yêucầu khảo cứu Vì vậy khi làm môi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp Muốnđiều chỉnh pH của môi trường, người ta dùng HCl, NaOH 0,1N hoặc nồng độ 10%.Cũng có thể dùng các chất khác như H3PO4, H2PO4, H2SO4, KOH…

Để kiểm tra pH của môi trường tốt nhất là dùng máy đo pH Phương pháp nàynhanh nhạy và độ chính xác cao Trong phòng thí nghiệm, người ta thường dùng chỉthị màu xanh bromotinol (ở pH = 7,3 chỉ thị màu xanh có màu lam lục Ở pH ≤ 6 cómàu vàng, ở pH ≥ 7,6 có màu lam lục) hay giấy quỳ để đo pH Phương pháp này tiệnlợi, nhanh nhưng độ chính xác không cao

d Phân phối môi trường vào dụng cụ

Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tamgiác Nếu là môi trường đặc, cần phải đun cho agar vừa tan rồi mới phân phối vàodụng cụ Khi phân phối môi trường vào các dụng cụ thì cần phải chú ý:

+ Đối với ống nghiệm: nếu dùng làm môi trường thạch nghiêng thì lượng môitrường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích ống nghiệm + Nếu dùng làm thạch đứngthì lượng môi trường là 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm

+ Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm1/2 - 2/3 thể tích của bình

+ Các thao tác phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệngdụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bịđông đặc

+ Phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vô khuẩn

+ Phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao

f Phương pháp làm môi trường đặc

- Làm thạch nghiêng

Sau khi khử trùng xong, ta lấy các ống nghiệm còn lỏng đặt nghiêng trên thước

gỗ hoặc que thủy tinh sao cho thạch trong ống nghiêng tới 2/3 chiều dài của ống.Tuyệt đối không để thạch chạm vào nút bông Để yên cho đến khi thạch đông đặc.Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, không bị đứt

- Làm thạch đứng

Cho các ống nghiệm với lượng môi trường đặc chiếm ½ đến 2/3 ống nghiệm.Thạch còn nóng ta để đứng ống thạch vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội

và đông đặc

- Đỗ thạch vào đĩa petri

Trong toàn bộ qui trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vôtrùng và gồm các thao tác sau:

+ Nghiêng bình và rót nhẹ môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắptrên của đĩa

+ Đậy nắp trên lại, xoay tròn đĩa petri để môi trường được phân phối đều trênmặt đĩa

+ Để yên cho môi trường nguội và đông đặc

+ Lật ngược hộp cho đáy lên trên

Chú ý:

Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm visinh vật

Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm

Sau 1 – 2 ngày kiểm tra xem môi trường có nhiễm khuẩn không rồi mới sửdụng

Nhớ viết vào nhãn tên môi trường, ngày pha chế

g Bảo quản và kiểm tra môi trường

Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánhsáng, nhiệt độ từ 0o – 5oC và không để môi trường bị khô

Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường người ta thườngđặt chúng vào tủ ấm 37oC, trong 48 – 72h Sau lấy ra quan sát loại bỏ các môi trường

có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môitrường đạt tiêu chuẩn

3.3 Pha chế một số môi trường thông dụng

Môi trường PGA (potato glucose agar): dùng phân lập và nuôi cấy nấm mốcMôi trường Hansen: dùng để phân lập và nuôi cấy nấm men

Môi trường Pepton lỏng và đặc: nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường Baird Parker Agar (BPA) và môi trường mannitol salt phenol red:

dùng để phân lập và nuôi cấy Staphylococcus

Môi trường MRSA: dùng để phân lập và nuôi cấy Lactobacillus

Môi trường MSPR

IV BÁO CÁO KẾT QUẢ

1 Trình bày mục đích và nguyên tắc cơ bản của việc bao gói dụng cụ? (đã

trình bày ở trên)

2 Trình bày nguyên tắc hoạt động và các bước sử dụng nồi hấp vô trùng?

Nguyên tắc hoạt động

Làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suấtbình thường của khí quyển Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theonhờ hệ thống van rất chặt chẽ Phương pháp khử trùng bằng nhiệt ẩm cho phép diệt cả

tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật

Các bước sử dụng

- Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy định

- Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên trong nồi hấp, khôngnên xếp quá chặt chẽ để hơi nước lưu thông dễ dàng

- Đậy kín nắp nồi hấp Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từngcặp đối xứng nhau

- Mở van thông hơi giữa 2 nồi (trường hợp nồi hấp 2 lớp)

- Bật công tắc, đun nồi hấp

- Khi nhiệt độ lên đến 80oC hoặc 0.5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết khôngkhí khỏi nồi trong vòng 3 – 5 phút cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục, đóngvan lại

- Khi áp suất lên đến mức cần thiết thì bắt đầu tính thời gian khử trùng

- Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống giá trị 0mới được mở nắp để tránh gây ra tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hưmôi trường

Một số nồi hấp hiện đại có thể tự kiểm soát thời gian, áp suất và tự đuổi khí rakhỏi nồi, cho phép bỏ qua một số thao tác tương ứng ở phần trên

3 Trình bày những nguyên tắc và yêu cầu cơ bản của việc pha chế môi trường dinh dưỡng? (đã trình bày ở trên)

4 Trình bày các bước chế môi trường dinh dưỡng mà nhóm được phân công?

Nhóm được phân công đổ môi trường Baird Parker Agar (BPA)

Hình 2: Bình tam giác chứa môi trường BPA

Bước 3: Đổ môi trường vào đĩa petri (Vì môi trường có agar (đặc) nên phải

làm môi trường lỏng ra bằng cách cho vào lò vi sóng đun cho môi trường tan ra)

Hình 3: Làm lỏng môi trường Hình 4: Đổ môi trường vào

đĩa

Bước 4: Xoay tròn hộp petri để cho môi trường có thể phân phối đều trên mặt

đĩa Để yên cho môi trường được nguội và đông đặc lại Lập ngược hộp petri lại đểcho hơi nước bốc ra và khô dần đi

Sau khi đổ môi trường vào hộp, để 1 – 2 ngày để xem môi trường có bị nhiễmhay không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập

Bước 5: Ghi tên môi trường và ngày pha chế.

BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT

- Nguồn phân lập: dùng 0,5 gam bánh men giã nhuyễn Dùng nước cất vô trùng để

pha loãng nồng độ tới N=10-3/ N=10-4/ N=10-5 Sau đó chọn 2 nồng độ liên tiếp nhau

Dùng que cấy vòng tách khuẩn lạc nói trên sang petri chứa môi trường Hansenkhác (nếu đường cấy trên petri đầu tiên nhiễm nhiều) hoặc ria trên ống thạchnghiêng (nếu khuẩn lạc rời và ít nhiễm)

Tiếp tục cấy nhiều lần cho đến khi các khuẩn lạc đồng nhất

Hình 2: Phân lập nấm men trên môi trường Hansen lần 2

Hình 3: Phân lập nấm men trên môi trường Hansen lần 3

2 Phân lập nấm mốc ( Aspergillus orryzae, Aspergillus niger, Mucor) Nguồn phân lập: cơm nguội

Môi trường phân lập: PGA

Tiến hành phân lập:

- Dùng que cấy móc (đã khử trùng), gạt nhẹ lên hệ sợi tơ hoặc trên bào tửđính (dạng bụi phấn), chuyển sang ống nghiệm thạch nghiêng Đánh ngượcphần lưng móc lên thành bên trong của ống nghiệm cho bào tử rơi xuống haycắm đầu móc xuống mặt thạch thành ba điểm theo chiều dọc mặt thạch Ủ ởnhiệt độ phòng trong 2 ngày

Hình 4: Phân lập nấm mốc ở môi trường PGA lần 1

Sau hai ngày, lấy ra quan sát Nếu trên mặt thạch chỉ có một loại tơ hoặcbào tử nấm mốc phân lập là đạt

Còn nếu lẫn nấm mốc khác hoặc vi khuẩn, thì cần tiếp tục cấy chuyền chođến khi thuần khiết (chỉ còn loại nấm mốc mong muốn)

Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện

+ Mốc có màu trắng: có thể là Mucor hay Rhizopus

+ Mốc có màu đen có thể là Aspergillus niger

+ Mốc có màu xanh lục có thể là Aspergillus oryzae hay Penicillium

Hình 5: Phân lập nấm mốc trên môi trường PGA lần 2

Hình 6: Phân lập nấm mốc trên môi trường PGA lần 3

3 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis:

Nguồn phân lập: cỏ khô đã đun ngâm 2 ngày

Môi trường: peptone –agar

Tiến hành phân lập và làm thuần: trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương

pháp ria Sau đó để trong tủ ấm ở nhiệt độ sau 2- 3 ngày lấy ra chọn khuẩn lạc riêng

rẽ để cấy chuyền

Hình 7: Phân lập cỏ khô ở môi trường peptone lần 1

Hình 8: Phân lập cỏ khô trên môi trường peptone lần 2

4 Phân lập Staphylococcus:

Nguồn phân lập: trên da

Môi trường phân lập: BPA, MSPR

Tiến hành: trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương pháp ria Sau đó để trong

tủ ấm 280C từ 7 – 15 ngày mới lấy ra chọn khuẩn lạc riêng rẽ để cấy chuyền

Hình 9: Phân lập môi trường trên da trên môi trường BPA lần 1

Hình 10: Phân lập môi trường trên da trên môi trường BPA lần 2

Hình 11: Phân lập môi trường trên da trên môi trường MSPR lần 1

Hình 12: Phân lập môi trường trên da trên môi trường MSPR lần 2

Hình 13: Phân lập môi trường trên da trên môi trường MSPR lần 3

6 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus:

Nguồn phân lập: sữa chua

Môi trường phân lập: môi trường MRSA

Tiến hành: trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương pháp ria Sau đó để trong

tủ ấm 370C trong 48 giờ Chọn lọc vi khuẩn lactic dựa vào đặc điểm hình thái khuẩnlạc để cấy chuyền

Hình 14: Phân lập sữa chua trên môi trường MRSA lần 2

Hình 15: Phân lập sữa chua trên môi trường MRSA lần 3

III Thực hành và báo cáo kết quả

Thực hành phân lập và làm thuần vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn

1 Mục đích của việc phân lập?

3 Quan sát và ghi nhận kết quả thu được?( Đã trình bày mục trên)

BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN

CỦA VI SINH VẬT

I Mục đích:

Để phát triển và duy trì một mẫu vi sinh vật thích hợp cho các thí nghiệm Việcnuôi cấy con sẽ kéo dài tuổi thọ của tế bào hoặc vi sinh vật, cho phép duy trì lâu dài

và quan sát quá trình nuôi cấy

II Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

1 Khái niệm

Quá trình nuôi cấy vi sinh vật thực chất gồm 2 khâu : nuôi và cấy

- Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho

sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật

- Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sangmôi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng

Hai khâu này không thể tách rời nhau trong quá trình nghiên cứu và ứngdụng của vi sinh vật

2 Mục đích của việc nuôi cấy:

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật

- Tiến hành việc nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng

- Cấy chuyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của vi sinh vật

3 Nguyên tắc

- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng đểtránh tạp nhiễm

- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để

- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển

4 Các phương pháp nuôi cấy

a Phương pháp chung của việc cấy chuyền

Gồm các thao tác chính sau:

đỏ dây cấy.

- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ,kéo nút bông ra và giữ trên tay đến khi đậy lại

- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạctrong ống giống

- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưavào ống nghiệm môi trường để thực hiện thao tác cấy chuyền

- Rút que cấy ra, khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồiđậy nút bông lại

- Để các ống nghiệm vào giá, đốt lại que cấy trên đèn cồn rồi để vào chỗcũ

- Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy, tên môi trường vào thànhống nghiệm

b Phương pháp cấy trên thạch nghiêng

Phương pháp này dùng để cấy chuyền các vi sinh vật hiếu khí

Thông thường dùng que cấy vòng, trình tự tiến hành giống như trên.Nhưng sau khi lấy được giọt canh trường vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiếptục như sau:

- Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm

- Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ởđáy ống nghiệm

- Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theocác kiểu như sau:

+ Theo kiểu hình chữ chi

+ Theo hình vòng xoắn

+ Theo đường vạch ngang song song

c Cấy đâm sâu trên thạch đứng

Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí Khi cấy ta dùng quecấy nhọn và đâm sâu vào môi trường Cách tiến hành tương tự như trên, chỉthay đổi một ít như sau:

- Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm hướng xuống dưới

để tránh nhiễm lúc cấy

- Đưa que cấy đã có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đếntận đáy ống nghiệm Tùy yêu cầu mà có thể đâm 1 – 3 đường, có thể đâm chính

- Khi cắm que cấy vào cũng như khi rút ra, chú ý giữ que cấy thẳng, làmnhẹ nhàng không làm cho môi trường bị nứt nẻ.

d Phương pháp cấy trên đĩa petri

Có thể cấy trên đĩa petri theo một trong hai cách: dùng que cấy vòng,dùng pipet Trong phạm vi bài này chúng ta chỉ thực hiện theo cách dùng quecấy vòng và trình tự được thực hiện như sau:

- Để đĩa petri lên bàn.

- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thư tự và yêu cầu vô trùng

như đã nêu phần trên

- Tay trái hé mở nắp hộp vừa đủ để cho đầu que cấy vào.

- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:

+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ bề mặt thạch

+ Theo những đường song song

+ Theo 4 hình chữ chi ở bốn góc của đĩa thạch

Trong quá trình cấy, vì lượng vi sinh vật sẽ bị giảm dần theo đường cấy nênkhi vi sinh vật phát triển, càng gần cuối đường số khuẩn lạc càng thưa dần

III CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI VI SINH VẬT

Để đảm bảo vi sinh vật phát triển tốt, sau khi cấy xong phải quan tâm đếncác điều kiện nuôi dưỡng Có nhiều điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của

vi sinh vật, nhưng đáng chú ý nhất là những điều kiện sau:

1 Nhiệt độ

Tùy loài vi sinh vật, chọn nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chúng vàduy trì sự ổn định nhiệt độ đó Dựa vào nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của

vi sinh vật, người ta chia chúng làm 3 nhóm sau đây:

+ Vi sinh vật ưa ấm có nhiệt độ tối thích 20 – 370C

+ Vi sinh vật ưa nóng có nhiệt độ tối thích 55 – 600C

+ Vi sinh vật ưa lạnh có nhiệt độ tối thích 10 – 150C

Để duy trì nhiệt độ thích hợp, ta sử dụng các tủ hoặc phòng ấm có bộ phậnđiều chỉnh nhiệt độ tự động luôn luôn duy trì nhiệt độ ở mức nhất định nào đó

2 Độ ẩm

3 Điều kiện hiếu khí và yếm khí:

+ Các bình chứa canh trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi

để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật

+ Nếu nuôi cấy sâu trong môi trường lỏng, thì phải tiến hành sục khíthường xuyên hay định kỳ

- Nuôi kỵ khí

Ngăn cách không cho vi sinh vật tiếp xúc với oxy bằng cách:

+ Sau khi cấy xong ta đổ lên bề mặt môi trường một lớp dầu paraphin, dầuvazơlin hoặc lớp thạch dày khoảng 2 cm Cách này đơn giản dễ áp dụng

Chú ý: dầu và thạch phải vô khuẩn, dầu phải trung tính

+ Cấy đâm sâu trong môi trường đặc

+ Nuôi cấy trong bình hút chân không, có thể dùng những ống nghiệm đặcbiệt gieo cấy xong hút hết không khí rồi hàn kín lại

+ Đun sôi môi trường 20 – 30 phút rồi làm nguội nhanh để đuổi hết oxytrong đó

+ Dùng hóa chất để loại trừ oxy của không khí trong dụng cụ nuôi

+ Có thể nuôi vi sinh vật hiếu khí cùng vi sinh vật kỵ khí Phương phápnày thì khó áp dụng

IV QUAN SÁT ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT NUÔI CẤY

Vi sinh vật khi phát triển trên môi trường thường hình thành các khuẩnlạc, và các đặc điểm sinh lý khác đặc trưng cho loài vi sinh vật đó Việc quansát này hết sức quan trọng trong việc phân loại và những nghiên cứu về sinhhóa, di truyền của loài đó Việc quan sát có thể thực hiện bằng mắt thường,kính lúp, kính hiển vi quang học

1 Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc

Khi quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường đặc cần ghinhận các đặc điểm sau đây:

- Hình dạng khuẩn lạc (dạng tròn, dạng rễ cây, dạng không đều hay dạng

bầu dục…)

- Kích thước khuẩn lạc (tính bằng mm) Nếu là dạng khuẩn lạc tròn ta đó

đường kính khuẩn lạc Nếu không phải hình tròn ta đo chiều dài nhất

- Màu sắc: ghi màu sắc khuẩn lạc tạo thành, và màu của môi trường

- Bề mặt khuẩn lạc: ghi nhận bề mặt khuẩn lạc bóng, xù xì, gấp nếp hay

gồ ghề…

- Mép khuẩn lạc: bằng phẳng, lượn sóng hay răng cưa….

- Độ đặc: dạng mỡ, bột nhão, dạng nhớt, dạng màng

2 Quan sát đặc tính phát triển của vi sinh vật trong môi trường lỏng

Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường lỏng ở điều kiện nuôi cấy

ổn định có tính chất đồng nhất hơn trong môi trường đặc Khi quan sát vi sinhvật phát triển trong trong môi trường lỏng cần ghi nhận:

- Sinh trưởng yếu, vừa, hay mạnh mẽ.

- Đục môi trường: đục đồng đều, dạng bông,

- Khả năng tạo váng: dạng váng vòng hay dạng kín, váng mỏng hay dày,

phẳng hay xù xì, nhẵn nhụi hay gấp nếp, khô hay nhày, nổi hay chìm

- Khả năng tạo thành cặn tủa: ít hay nhiều, xốp hay đặc.

V THỰC HÀNH VÀ BÁO CÁO KẾT QUẢ

- Thực hành thao tác cấy chuyền vi khuẩn, nấm men từ ống giống sang

môi trường thạch nghiêng, đĩa petri và môi trường lỏng Nuôi ủ ở nhiệt độphòng và theo dõi sự phát triển

- Thực hành thao tác cấy chuyền nấm mốc từ ống giống sang môi trường

thạch đĩa và thạch nghiêng (cấy 3 điểm) Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi

sự phát triển

Câu hỏi:

1 Nêu rõ nguyên tắc và mục đích của việc cấy chuyền vi sinh vật từ ốnggiống sang môi trường?

Mục đích của việc nuôi cấy:

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật

- Tiến hành việc nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng

- Cấy chuyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của vi sinh vật

Nguyên tắc

trường thạch nghiêng và thạch đĩa?

Môi trường thạch nghiên:

- Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm

- Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ởđáy ống nghiệm

- Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theocác kiểu như sau:

+ Theo kiểu hình chữ chi

+ Theo hình vòng xoắn

+ Theo đường vạch ngang song song

Hình 1: Phân lập nấm mốc trên môi trường PGA thạch nghiên