Đề tài công nghệ lên men gluconic acid

Đề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acid

Gluconic acid

GVHD: PGS TS Lé Vin Việt Mẫn CHUONG 1: NGUYEN LIEU

Glucose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vỉ sinh vat san xuất gluconie acid Tuy nhiên trong sản xuất hầu hết các nhà máy đều không sử dung glucose tinh khiét, đa số đều sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền khác như mật rỉ hay sản phẩm từ sự thủy phân tỉnh bột Nguyên liệu sử dụng trong bài báo cáo là mật rỉ

1.1 Mat ri

Mật rỉ ( rỉ đường ): là phế liệu chứa đựng nhiều đường không kết tỉnh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường Thông thường tỷ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm 3 - 3.5% trọng lượng mía, tủy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ

Thành phần mật rỉ dao động như sau: nước: 15 - 20%, chất khô: 80 - 85%,

trong đó có 60% là đường (40% là đường saccharose, 20% là fructose và glucose, còn 40% còn lại là chất phi đường, thành phần cụ thể cho dưới bảng sau:

Bảng 1: Thành phần các hợp chất trong mật ri

Thành phần Tỷ lệ | Mậtrỉ từ củ cải đường Mat ri từ mía

Trong mật rỉ luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thường gặp nhất là

những vi sinh vật gây màng và gây chua Vì vậy trong sản xuất người ta thường dùng fluosilicate natri với nông độ 2 %o so với trọng lượng mật rỉ để dé bao quan Trước khi đưa mật rỉ vào sản xuất cần phải qua giai đoạn xử lý mật rỉ để tách tạp

chất, đồng thời ức chế hoặc tiêu điệt hệ vi sinh vật có trong mật rỉ Có nhiều quy

trình khác nhau để xử lý mật ri Ví đụ như theo Rehm và cộng sự (1996) thì đầu tiên mật rỉ sẽ được pha loãng với nước, sau đó bổ sung acid sulfuric và xử lí nhiệt

ở 90°C để ức chế vi sinh vật Tiếp theo, bổ sung phosphate với hàm lượng 1-2%

để tách cặn lắng rồi làm nguội Ở một qui trình xử lí khác, người ta sẽ pha loãng mật rỉ, gia nhiệt rồi ly tâm để tách bỏ những chất không hòa tan

Trang 3

1.2 Các phụ liệu khác

1.2.1 Nước: được sử dụng để pha loãng mật rỉ về giá trị nồng độ chất khô cho quá trình lên men Nước phải đạt các tiêu chuân như tiêu chuẩn nước uông

Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng đối với nước dùng để ăn uống,

nước dùng cho các cơ sở để chế biến thực phẩm ( QCVN 01:2009/BYT )

Hàm lượng sắt tổng số ( Fe”, Fe”) mg/l 0,3

- Chỉnh pH của rỉ đường về pH lên men 6.5 đùng tác nhân là H;SO¿

- Chỉnh pH trong quá trình lên men trong khoảng 4.5 - 6.5 dùng tác nhân trung

hòa 1a CaCO

- Acid hoa dung dịch sau lên men đề thu sản phẩm dùng H;SO¿

Bang 3: Các chỉ tiêu của CaCO; và H;SO¿a

của những diện tích tiếp xúc có bề mặt từ vài micromet tới vài milimet, kích thước của các bọt khí này phụ thuộc chặt chế vào tốc độ khuấy trộn của môi trường (tốc

độ khuấy cao đi đôi với kích thước bọt khí nhỏ) Chất phá bọt thực chất là làm giảm sức căng bề mặt của giao dién khi/ long Nhu vay, chat dé pha bot phai là một chất hoạt động bề mặt, phá hủy các bọt khí sinh ra góp phần tăng hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men

Trong môi trường lên men gluconic acid do nồng d6 glucose trong méi trường lên men lớn, dẫn đến môi trường có độ nhớt cao, khi đó các bọt không khí

dễ tái hợp lại thành những bọt không khí lớn hơn (nắm mốc không thể hấp thu)

Để tránh hiện tượng này trong sản xuất thường dùng ancol amylic 1/80.000 hay natri oleat 1/25.000 làm chất phá bọt

1.2.4 Các chất dinh dưỡng cho nắm mốc

- Nguồn N: (NH¿);SO¿ hoặc (NH¿);HPO¿,

- Nguôn P: dung dịch HạPOx 70%

- Nguôn Mg: MgSOx.7HạO

Trang 5

Chuong 2: GIONG VI SINH VAT 2.1 Giéi thigu vé Aspergillus

Đây là loài nắm mốc hiếu khí Tế bào có vỏ, trong tế bào chất có nhân và nhân con, có các tiêu thể Khi phát triển tế bào nắm mốc thành hệ sợi: khuẩn ty ăn sâu vào cơ chất — khuẩn ty khí sinh Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt Có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường và khuẩn ty đỉnh đưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gợi là khuẩn

ty co chat), Khudn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân Cuống đính bào tử không phân nhánh đài và thắng đầu, có nhiều cuống nhỏ Tùy loại có cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sỉnh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào

tử xếp thành chuỗi đài và cảng tận cùng càng lớn đần Những chuỗi đính bảo tử xếp đối xứng từng quả tròn trên chóp nang trông như đóa hoa cúc Đính bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đa hạch bề mặt xù xì Do cuống sinh bào tử

và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc Các khuẩn lạc của mốc Aspergilfus thường là: vàng, vàng lục, đen, tro, nâu

Dac diém cia giéng Aspergillus là giàu các enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease, pectinase, lipase ) Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi loài Aspergilus vào công nghiệp thực phẩm và một số ngành khác dé thu acid hữu cơ

và enzyme Một trong những chủng được nghiên cứu kỹ trong phòng thí nghiệm

và các quá trình sản xuất là Aspergilus niger Chủng này trong quá trình phân hủy các glucid có khả năng tích lũy ở môi trường một lượng acid hữu cơ và enzyme khá lớn

2.2 Giới thiệu về Aspergillus niger

Vi tri phân loại của Aspergilus niger:

+* Thuộc bộ các khuẩn (Plectascales), họ Aspergillaceae, lop Ascomycetes +* Hội nghị Utrecht năm 1952 công nhận như sau: Ở giai đoạn đỉnh bào tử - giai đoạn phát triển chính cia A niger người ta xác định chúng thuộc bộ

Moniliales, lớp nằm bất toàn (Deuteromycetes) Ở giai đoạn hình thành túi

bào tử thì chúng thuộc bộ Plecfascales, lớp nắm túi Á seomycetes

Trang 6

Gluconic acid

GVHD: PGS TS Lé Van Viét Man

Hinh 1: Nam moc Aspergillus niger

Aspergillus niger phat trién manh trén môi trường thạch malt và tạo thành

bào tử dài khoảng 7-10 micromet, khuẩn lạc màu đen, trên những cuống bào tử có

vô số những bao tir Cuống bảo tử có hai phần: phần thứ nhất dài va to, khoảng 2-3 micromet có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen

Chủng nắm mốc này có thê chịu được pH thấp 2.1-2.2, nhiệt độ thích hợp

là 30-33°C và đễ phát triển trên môi trường tỉnh bột

Aspergillus niger được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để thu

nhận các acid hữu cơ như citric acid, gluconic acid, fumaric acid Ngoài ra nó

còn ứng dụng để thu nhận các chế phẩm enzyme như: amylase, protease, pectinase, glucoseoxydase

2.3 Tiéu chan chon giéng

s* Là chủng nắm mốc thuần khiết, không lẫn các chủng vi sinh vật khác Khả năng thích ứng cao, sinh sản mạnh

Lên men đường glucose với hiệu suất cao, thời gian lên men ngắn, sản phẩm chính là gluconic acid chiếm tỷ lệ cao

# Sau khi lên men dé tách sinh khối và sản phẩm

# Khả năng bảo quán dễ dàng, các đặc tính di truyền được bảo tồn trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng

2.4 Môi trường nuôi cấy

Trong sản xuất gluconic acid môi trường nuôi cấy cần đáp ứng các yêu cầu Sau:

oe s Nong d6 glucose & mire cao: 150 — 250gL"

Hàm lượng nitơ thấp: khoáng 20 mM nito

Chương 3: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ Trong quá trình sản xuất gluconic acid tùy thuộc và tác nhân trung hòa là NaOH hay CaCO;, điều kiện lên men mà sản phẩm thu nhận có thể là các sản phẩm khác nhau như gluconic acid, calcium gluconate, sodium gluconate Vì mỗi sản phẩm đều có những vai trò hết sức khác nhau trong lĩnh vực dược phẩm hay trong lĩnh vực thực phẩm

3.1 Sơ đồ khối

Trong khuôn khô bài báo cáo chúng tôi có đưa ra 3 quy trình công nghệ

khác nhau dựa theo sản phẩm thu nhận

Chuong 4: GIAI THICH QUY TRINH CONG NGHE

4.1 Xử lý mật rí

Mục đích:

s» Tiêu diệt hệ vi sinh vật gây bệnh ngoai tri Bacillus, Clostridium

s* Tiêu diệt / ức chê các vi sinh vật khác trong môi trường

“+ Tach cdc chat không hòa tan trong mật rỉ

Các biến đối: va

s* Vật lý: có sự thay đôi về gradient nhiệt độ

s* Sinh học: các vi sinh vật bị tiêu diệt

Cấu tạo: thiết bị hình trụ, đáy côn, làm bằng thép không ri Bên trong có hệ

thống ống xoắn để gia nhiệt, bên ngoài có lớp vỏ áo để làm nguội Động cơ gắn với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu

Thông số công nghệ: thực hiện tuần tự theo các bước sau:

s» Pha loãng mật rỉ với nước (45 — 50%)

4 Môi trường được đun nóng đến một nhiệt độ nhất định (90 - 100°C)

s* Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 — 60 phút

+* Làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (33-35°C đối với đa số năm mốc)

* Sau khi làm nguội nguyên liệu được cho qua thiết bị ly tam dé tách các tạp chất không tan

Trang 10

Câu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bô trí các thanh chặn Khi

động cơ truyền động cho rôto bên trong quay, đưới tác động của lực ly tâm các

câu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn

Đường kính trong của rô(o: 1000 mm

Sô vòng quay lớn nhat: 1500 vòng/phút

Thiết bị: chọn thiết bị trộn có cánh khuấy mái chèo

Hình 4: Thiết bị khuấy trộn Cấu tạo thiết bi bao gồm 1 thùng khuấy, bên trong có gắn 2 cánh khuấy mái

chèo được đặt lệch tâm, thành thùng khuấy đặt các thanh chặn Thiết bị này dùng

Môi trường thường dùng để nuôi cây nắm mốc thường là môi trường bán rắn với thành phân: cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột kém chất lượng khác Đề làm tăng độ xốp của môi trường, thường trong sản xuất

có trộn thêm các phụ liệu khác như vó trâu (15-20%)

Quá trình nhân giống tiến hành qua nhiều cấp nhân giống trên các khay đựng canh trường đã phối trộn, thực hiện trong phòng nuôi cấy

Các biến đổi:

s* Sinh học: trong suốt quá trình phát triển của nắm mốc theo thời gian nhân giống trong môi trường bán rắn, nằm mốc thường trải qua 3 giai đoạn:

> Giai đoạn 1: kéo dài 10-14h Bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu hô

hấp do đó nhiệt độ phòng nuôi phải được duy tri 28-30°C

> Giai đoạn 2: kéo dài 14-18h Hệ nấm bắt đầu phát triển, quá trình hô hấp diễn ra mạnh, nhiệt độ phòng nuôi tăng nhanh Vì vậy phải thông gió và duy trì độ ẩm môi trường khoảng 80 — 90% trong giai đoạn này

Trang 12

Gluconic acid

GVHD: PGS TS, Lé Van Viet Man

> Giai đoạn 3: kéo đài 10-12h Cường độ hô hấp giảm, nhiệt độ môi trường bán rắn giảm Nắm mốc bắt đầu sinh bào tử

$ Vật lý: thành phần môi trường thay đối, nồng độ cơ chất tại mỗi điểm trên khay nhân giống là khác nhau

Thông số công nghệ:

¢ Dé 4m của môi trường bán rắn: 5§—60%

4 Nhiệt độ môi trường: 28-30°C

Thời gian nuôi: 36-72h, theo mỗi cấp nhân giống

Chiều dảy của lớp môi trường tốt nhất: 5—10cm

* Thời gian kết thúc quá trình nhân giống khi thu được số lượng bảo tử cần thiết cho quá trình lên men (do nhà sản xuất đặt ra)

Các biến đổi:

“+ Vat ly: quá trình lên men làm cho nhiệt độ trong thùng lên men tăng, cần phải bố trí thiết bị làm mát trong quá trình lên men

* Sinh học: sinh trưởng và trao đổi chất của nắm mốc, sinh khối tăng trong

giai đoạn đầu, giai đoạn sau quá trình trao đối chất diễn ra, hệ quả tạo ra

gluconic acid và các sản phẩm phụ khác

“+ Héa hoc và hóa sinh: chuyển hóa glucose thanh gluconic acid xúc tác enzyme glucose oxydase

Cac yeu tô ảnh hưởng: hai yếu tố ánh hưởng lớn nhất là oxy và pH

»> Oxy: là chất nên của quá trình oxy hóa glucosc

Gradient nồng độ và thể tích oxy vận chuyển qua môi trường ảnh hưởng đến sự chuyển pha của oxy từ thể khí sang thể lỏng Trong quá trình sản xuất gluconic acid đời hỏi lượng oxy hòa tan cao, điều này là rất cần thiết cho nắm mốc chuyên hóa các hợp chất hữu cơ trong môi trường thành năng lượng, sinh tổng hợp gluconic acid Vi dy, khi Sakurai et al tién hanh suc oxy véi áp suất cao lên xấp xỉ

6 bar kết quả đã duy trì được lượng oxy hòa tan 150 ppm

Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trong sản xuất gluconic acid A niger sit dụng oxy tỉnh khiết nhiều hơn so với khi chúng phát triển ngoài không khí Theo Kapat et al: khi khuấy trộn với tốc độ 420 rpm và tốc độ thông khí 0.25 vvm, nồng độ oxy hòa tan lúc này là tốt nhat cho sy san sinh glucose oxidase Theo Lee

et al: đề sản xuất đạt năng suất cao thì phải sử dung ap suat suc khi cao (2-6 bar) lúc này lượng oxy hòa tan trong môi trường có thể đạt đến 150 ppm

Nói chung trong quá trình phát triển của hệ sợi nằm lượng oxy cung cấp không đều, nguyên nhân do kích thước của các bong bóng khí ảnh hưởng nhiều bởi độ nhớt của môi trường nuôi cây Nên cần theo đõi trong suốt quá trình sản xuất

“+ pH: là yêu tố quan trọng trong việc sản xuất gluconic acid vì ở những pH khác nhau A miger cho những sản phẩm khác nhau nhu: citric acid , gluconic acid va oxalic acid

Trang 13

Việc tích lũy các sản phẩm này dựa vào các giá trị pH trung bình Ví dụ pH đưới

3,5 tạo điều kiện cho sự tích tụ citric acid, để sản xuất gluconic acid thì pH = 4,5-

7,0 (pH tối ưu là 5.5) Nghiên cứu của Franke khi thu thập dữ liệu về mức độ hoạt động của của glucose oxidase ở các cấp độ pH khác nhau và thu được kết quả : 5% (pH=2.0 ) và 35 % (pH= 3.0) hoạt tính, trên nền tảng 100 % ( pH=5.6) hoạt tính

Gluconic acid 60-7