Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định

Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định Đề tài lên men ethanol bằng phương pháp chu kỳ sử dụng nấm men cố định

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

BO doa

Giáo viên hướng dẫn

{ký tên)

MỤC LỤC

SOÍBG8

LỜI MỞ ĐẦU

ao doaNhư chúng ta đã biết, Ethanol đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực, như:tổng họp chất hữu cơ; dược phẩm; nhiên liệu sinh học; đặc biệt là lĩnh vực sản xuất thựcphẩm

Trong sản xuất thực phẩm, Ethanol dùng làm nguyên liệu sản xuất đồ uống có cồn,dùng làm dung môi, chất diệt khuẩn, nhìn chung Ethanol được biết đến nhiều nhất như làmột loại đồ uống

Lên men Ethanol là một quy trình sản xuất đã có lịch sử lâu đời, và phổ biến trênkhắp thế giới

Có nhiều phưomg pháp lên men Ethanol và sử dụng nhiều loài vi sinh vật khácnhau, ứng với mỗi phưomg pháp, mỗi loại nấm men cho một hiệu suất và giá trị cảm quankhác nhau Để có được sản phẩm Ethanol tốt nhất, về mặt kinh tế, cảm quan, trên thế giới

đã có rất nhiều nghiên cứu về dòng sản phẩm này Bài báo cáo của nhóm chúng em sẽ tìmhiều về lên men Ethanol theo phưomg pháp chu kỳ, sử dụng nấm men cố định, đặt biệt về cácyếu tố ảnh hưởng và từ đó rút ra kết luận chung nhất cho phưomg pháp này

1 TỔNG QUÁT:

1.1 Ethanol:

Ethanol được gọi là rượu etylic, rượu nguyên chất, rượu ngũ cốc, hay rượu uống, làmột chất lỏng không màu, dễ bay hơi, dễ cháy Nó được biết đến nhiều nhất là loại đồ uống cócồn, ngoài ra còn được dùng làm dung môi, nhiên liệu từ cồn Theo cách dùng thông thường

nó được gọi là rượu uống, hay rượu mạnh

Ethanol là một rượu mạch thẳng, công thức phân tử: C2H5OH

Lên men Ethanol còn được gọi là quá trình lên men rượu, là một quá trình sinh họcữong đó các loại đường như glucose, fructose, và sucrose, được chuyển đổi thành nănglượng cho tế bào và do đó sản sinh ra ethanol, khí C02, cũng như các sản phẩm trao đổi chấtkhác

1.2 Phương pháp lên men chu kỳ:

Flow Diagram for Ethyl Alcohol Production

Hình 1 Mô hình lên men chu kỳ sử dụng nấm men cố định

Lên men chu kỳ hay còn gọi là lên men gián đoạn (lên men theo mẻ) ừong đó: mengiống và dịch đường ban đầu có thể bơm song song để nấm men được đảo đều ngay từ đầu.Lượng men giống thường chiếm khoảng 10% so với thể tích thùng lên men, nhưng dịchđường không bơm đầy thùng lên men ngay mà thời gian đổ đầy một thùng lên men kéo dài từ6- 8h Nhờ đó tỷ lệ men giống lúc đầu tăng và hạn chế được phát triển của tạp khuẩn

1.3 Nấm men cố định.

1.3.1 Sơ lược về kỹ thuật cố định tế bào:

Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tếbào còn nguyên vẹn lên một “vùng không gian nhất định” nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tácmong muốn”

Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế bào

có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên Uong các cấu trúc của nguyên liệu có trong tự nhiên

1.3.2 Một số tính chất của nấm men cố định:

•S Sự thay đổi về sinh trưởng, hình thái tế bào:

Như chúng ta đã biết, quá trình sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm mennói riêng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường quanh nó Khi cố định tế bào, do sựtương tác giữa tế bào - chất mang và giữa các tế bào bới nhau mà khả năng sinh trưởng và

Theo một số tác giả khả năng sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so vớinấm men tự do.

Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy rằng nấm men cố định luôn sinh trưởng đạt đếnmột số lượng tế bào không đổi và giữ nguyên như vậy cho đến khi kết thúc quá trình lên men

Bên cạnh đó Melzoch và cộng sự ( năm 1994), cũng thấy rằng 80% tế bào cố địnhtrong gel alginate đều duy trì hoạt tính trao đổi chất và khả năng phát triển khi nuôi cấy trongthời gian dài Saccharomyces cerevisiae cố định trong gel alginate có thể duy trì khả năng sửdụng đường của chúng ở mức độ tương đối cao và ổn định, chỉ giảm khoảng 20% sau 1122giờ nuôi cấy, [1]

Hình thái của nấm men cố định cũng thay đổi nhiều so với nấm men tự do

■S Sự thay đổi về hoạt động trao đổi chất của tế bào:

Nhiều nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng nấm men cố định có tốc độ sửdụng glucose, tốc độ sinh tổng họp Ethanol và glycerol cao hơn nhiều so với nấm men tự domặc dù diện tích bề mặt tế bào của nấm men cố định dùng để vận chuyển chất dinh dưỡngnhỏ hơn so với của nấm men tự do

Kết quả nghiên cứu của thầy Lê Văn Việt Mẩn và cô Bùi Thanh Huyền( 2008), vềquá trình lên men cồn sử dụng nấm men cố định trên canxi alginate cho thấy nấm men cố định

có tốc độ sử dụng đường cũng như tốc độ sinh tổng hợp Ethanol cao hơn hẳn nấm men tự do,[2]

V Những thay đổi về khả năng chống lại các yếu tố bất lợi của môi trường:

Lượng cơ chất càng cao hoặc lượng sản phẩm càng cao thì càng ức chế hoạt độngsống của tế bào nấm men Tuy nhiên, so với nấm men tự do thì nấm men cố định khả năngchịu sự ức chế cơ chất và sản phẩm cao hơn

1.3.3 Nấm men dùng trong lên men Ethanol theo phương pháp chu kỳ bằng nấm men cố định:

Thường sử dụng nấm men Saccharomyces cerevỉsỉae cho phương pháp lên men này

> Yêu cầu về dinh dưỡng của nấm men Saccharomyces cerevỉsỉe:

Tất cả các chủng của s cerevỉsỉae có thể phát triển trên glucose, maltose vàtrehalose, không phát triển trên lactose và cellobiose Tuy nhiên sự sinh trưởng trên các loạiđường khác nhau thì khác nhau

thuộc vào môi trường hiếu khí hoặc kỵ khí Một vài chủng không thể phát triển kỵ khí trongmôi trường sucrose và trehalose.

Tất cả các chủng có thể sử dụng ammoniac và urê là nguồn nitơ duy nhất, nhưngkhông thể dùng nitrat, vì chúng thiếu khả năng phân giải nitrat thành các ion amoni Chúng cóthể sử dụng hầu hết các amino axit, peptit ngắn mạch, và đạm cơ bản như nguồn nitơ Một sốchủng s cerevìsìae không có enzyme protease vì vậy không thể chuyển hóa được proteinngoại bào

Nấm men cũng cần photpho, được dùng như là một ion dihydrogen phosphate, lưuhuỳnh, có thể chuyển hóa như một ion suníate, hoặc lượng sulíur hữu cơ như amino axitmethionine và cysteine Một số kim loại, như magiê, sắt, canxi và kẽm, cũng cần thiết cho sựtăng trưởng tốt của nấm men

1.4 Chất mang cố định sử dụng trong sản xuất ethanol:

Kỹ thuật cố định nấm men trong sản xuất rượu đã được nghiên cứu rộng rãi, tuynhiên việc ứng dụng kỹ thuật này trong công nghiệp vẫn còn hạn chế Mục đích của việc sửdụng nấm men cố định là để cải thiện năng suất sinh Ethanol cũng nhu chất lượng sản phẩm

Để có thể ứng dụng thành công trong công nghiệp, chất mang được sử dụng để cố định phảiđạt được độ an toàn thực phẩm, có nhiều trong tự nhiên, giá thành thấp và không làm ảnhhưởng đến tính chất cảm quan của rượu

Các chất mang thường được sử dụng gồm [3,4]:

- Chất mang hữu cơ: Alinate, PVA (polyvinil Alcohol) K-carrageenan, Aga, DCMDCM (Deligniíìed Cellulosic Material),

- Chất mang thực phẩm: miếng lê, miếng mộc qua, miếng táo, nho khô, vỏ nho,

- Chất mang vô cơ: y-alumina, Hydromica, Kissir,

- Chất mang dạng màng: màng membrane, màng vi lọc sinh học (biocapsule)

♦í* Cơ chế sinh học của lên men rượu:

Lên men rượu gồm các quá trình sinh hóa và sinh học rất phức tạp, xảy ra dưới tácdụng của nhiều enzyme Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào rồithẩm thấu vào bên trong Ở đó các enzyme sẽ xúc tác các phản ứng khác nhau để cuối cùng

bào chất vào môi trường lên men Rượu do rất linh động nên hòa tan nhanh trong dịch lênmen, còn khí carbonic hòa tan kém.

(3) Phospho- fructokinase-1

(D Triose phosphate isomerase

o

®—o— CH 2 — C H —

OH H (p)—o—CH 2 —c—CH 2 OH

0

íorming reaction /O*

(substrăte-level ^ ^ 2 ATP phosphorylation)

® glycerate mutase

kinase

Glucose glycolysis (10 successive reactions) hypoxic or

anaerobic

conditions

aerobic

conditions V 2CO,

anaerobic conditions

Fermentation to lactatein vigor- ously contracting muscle, in erythro- cytes, in some other cells, and ĩn some micro- organisms

4C0 2 + 4H 2 0 Animal, plant, and many microbia!

❖Phương trình tổng quát của lên men rượu:

Trong quá trình lên men rượu, mỗi phân tử gam glucose sẽ giải phóng ra khoảng50kcal Năng lượng này sẽ được nấm men sử dụng khoảng 20kcal số còn lại sẽ thải ra canhtrường do đó làm tăng nhiệt độ dịch lên men

Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là rượu và C02, còn tạo ra nhiều chấtkhác Bằng phân tích sắc ký người ta phát hiện ưên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành

4 nhóm chính: acid, este, aldehyl, và rượu bậc cao hay rượu có số carbon lớn hon hai

THEO PHƯƠNG PHÁP CHU KỲ sử DUNG NẤM MEN CÓ ĐINH:

-€

cerevisiae cố định ừong gel alginate

Chu kỳ II, kéo dài hon chu kỳ 11 vì sự gia tăng nồng độ đường ban đầu làm cho thờigian lên men bị kéo dài Ngoài ra khi nồng độ đường ban đầu tăng cao, tốc độ sử dụng đườngcũng giảm Tuy nhiên, sự thay đổi trong canh trường dùng nấm men cố định là không nhiềunhư canh trường dùng nấm men tự do

So sánh giữa nấm men cố định và nấm men tự do; nấm men cố định, thời gian lênmen luôn kéo dài hon, nhưng nồng độ đường sót thấp hon, nồng độ cồn từ 8.4-11.7%, cao gấpđôi trường hợp dùng nấm men tự do Lý do có thể nấm men cố định đã được bảo vệ, không bịảnh hưởng bởi các thay đổi bất lợi như pH, tích lũy cồn, các yếu tố này đều làm giảm hoạtđộng trao đổi chất của nấm men

Một khảo sát khác của Irfana Ikram và cộng sự (2009), [5], khảo sát ảnh hưởng củanồng độ đường ban đầu tới quá ưình lên men Kết quả như sau:

(c) 18 %

s cerevỉsìa GC-IIB31 tự do và cố định , nhiệt độ 30 độ c, pH 4.5

Nồng độ đường dao động ừong khoảng 12- 21% và thực hiên lên men từ 24-120h

Ta thấy rằng ở nồng độ đường 12%, nấm men tự do đạt hiệu suất sinh Ethanol2,34%, tiêu thụ 8,08% đường Tuy nhiên đối với nấm men cố định thì đạt hiệu suất sinhEthanol là 4,13% và tiêu thụ 11,04% đường

Hiệu suất tối đa thu nhận được khi nồng độ đường là 15% ở trong cả 2 trường hợp sử dụng

nấm men tự do hay cố định Nấm men tự do cho 6,49% etanol,

tiêu thụ hết 14,92% đường trong khi đó đối với nấm men cố định thì tạo ra 5,85% Ethanol và tiêuthụ hết 14.9% đường.

Ở hai nồng độ 18% và 21% còn lại thì hiệu suất thu nhận Ethanol giảm xuống rất thấp.Khi nồng độ đường lên cao, làm cho độ nhớt tăng cao, làm giảm quá trình trao đổi chất, giảm hiệusuất tổng hợp ethanol

Kết quả nghiên cứu của Irfana Ikram [5] cho thấy nồng độ đường cho hiệu suất sinhEthanol cực đại chỉ đạt 15%, thấp hon so kết quả thu được của thầy Lê Văn Việt Man Có thể sự sailệch này là do kỹ thuật thực hiện khác nhau như mật độ nấm men, tạp nhiễm, V, V

Nồng độ đường cũng có ảnh hưởng quyết định tới quá trình lên mên và ảnh hưởng tới tốc

độ tạo thành sản phẩm và năng suất cuối cùng khi được bổ sung vào trong thời kỳ sinh trưởng pháttriển của nấm men Nồng độ đường ban đầu nó ảnh hưởng tới lượng Ethanol thành phẩm Theohình trên ta thấy sản phẩm Ethanol tối đa thu nhận được ở môi trường có chứa 15% đường ở trong

cả 2 trường hợp lên men sử dụng nấm men s cerevỉsỉae cố định hay tự do Khi nồng độ đườngtiếp tục tăng dẫn đến làm giảm lượng Ethanol là do hàm lượng đường tăng dẫn đến làm tăng độnhớt môi trường dẫn đến việc làm giảm quá trình trao đổi chất do đó mà làm giảm hiệu suất tạothành ethanol

Maziar Safaei Asli ( 2009), cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường vào quá trìnhsản xuất Ethanol theo chu kỳ, sử dụng chủng nấm men Saccharomyces Cerevesỉae SCI, kết quảthể hiện trên hình 5 và 6, [6],

Hình 5 Ảnhhưởng củanồng độđường đầu

vào quá trình sản xuất ethanol

Hình 6 Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu vào quá trình chuyển hóa

đường

Từ hình 5 và 6 cho ta thấy nồng độ đường ban đàu ảnh hưởng tới nồng độ Ethanol vàquá trình chuyển hóa đường trong suốt quá trình lẽn men Căn cứ theo kết quả, nồng độ Ethanoltăng khi tăng nồng độ cơ chất nhưng có sự biến đổi rộng trong khoảng thời gian diễn ra lên men.Những nồng độ Ethanol tối đa là 23, 46.1 và 95.1 g/1 thu nhận được ở 48, 72 và 120h với các dungdịch đường tương ứng là 50, 100 và 250 g/1

Như ta đã thấy, với nồng độ đường thấp, sản phẩm Ethanol được tạo ra trong giai đoạnphát triển tăng trưởng của nấm men chỉ trong một thời gian ngắn và do đó cần ít thời gian lên men.Trong bài nghiên cứu của Pramanik (2003) cho thấy khi nồng độ Ethanol đạt đến khoảng 95g/l thì

nó trở thành chất ức chế, nhưng trong bài nghiên cứu này không cho thấy hiện tượng trên [7]

Cũng theo kết quả của nghiên cứu này sản lượng Ethanol tối đa và tối thiểu thu nhậnđược ở dung dịch đường ban đầu là 100 và 250 g/1

Tốc độ sinh trưởng và lượng sinh khối đạt cực đại khi dùng nấm men cố định sẽ caohom khi dùng nấm men tự do Vỉ khi lên men với nồng độ cơ chất cao,

dùng nấm men cố định, trên bề mặt chất mang sẽ xuất hiện một gradient nồng độ, vàgiúp cho nấm men làm quen dần với môi trường

3.1.2 Ảnh hưởng của khoáng chất:

Khoáng chất đóng vai trò vô cùng quan trọng trong hoạt động của tế bào men, đặc biệt

là phospho Phospho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có trong thành phần của photphatit,nucleoproteit cũng như axit nucleic Phospho, Magie và lưu huỳnh có tác dụng làm hoạt hóaphotphataza trong quá trình lên men Lưu huỳnh và sắt đều tham gia phản ứng oxy hóa khử, ngoài

ra sắt cùng với các chất vô cơ khác như Zn, Mn, Cu, Mg đều là những chất không thể thiếu đốivới nhiều enzym oxy hóa) oxydaza, katalaza peroxydaza) Canxi còn giúp và loại bỏ các chất độcthải ra khi lên men, đồng thời giúp cho tổng hợp protit, làm tăng quá trình oxy hóa và có tác dụngtạo thành một số vitamin

Bảng 2 Ảnh hưởng của các chất khoáng bổ sung vào môi trường trong quá trình lênmen Ethanol bởi nấm men cố định S.cerevỉsỉae trong gel alginate

Điều kiện lên men: pH= 5, nhiệt độ 30°c, tốc độ khuấy trộn 100 rpm, nồng độ đường

ban đầu là 150 g/1, mật độ tế bào nấm men ban đầu khoảng 2.5* 107CFU/ml, [8]

Từ kết quả của bảng 2 cho ta thấy tàm quan ừọng của việc bổ sung thêm khoáng chấttrong môi trường lên men đối với chủng nấm men s cerevisiae. Nhìn chung, việc bổ sung các

không có bổ sung thêm khoáng.

S.cerevisìae với việc bổ sung các loại khoáng chất khác nhau Mau được phân tích sau 48h lênmen Điều kiện lên men giống bảng 2

Như chúng ta đã biết thì các muối khoáng tham gia vào quá trình trao đổi chất của nấmmen như là chất hoạt hóa của các enzym, hoặc nó là một phàn của enzym, là một phàn của trungtâm hoạt động enzym Từ hình 8 cho ta thấy việc bổ sung khoáng chất đều làm tăng hiệu quả củaquá trình lên men (trừ trường hợp bổ sung CuCl2 (2 mg/L), và hiệu quả quá trình lẽn men đạt giá trịtối đa ở trường họp bổ sung hỗn hợp MgS04 (2g/L) và ZnS04 (0.3 g/L) Cũng theo nghiên cứu nàythì ion Magie đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc giảm thiểu những ảnh hưởng có hại củađặc tính độc của Ethanol và sốc nhiệt vào chủng s cerevisiae. Cả stress nhiệt và Ethanol có thểgây ra rối loạn trong nội cân bằng ion trong tế bào, dẫn đến làm giảm các hoạt động ữao đổi chất vàcuối cùng là tế bào chết Tuy nhiên, ion magie làm giảm proton, và đặc biệt là tính thấm aninon củamàng tế bào bằng tương

tác qua lại với màng phospholipit, kết quả làm ổn định màng Như vậy, rõ ràng là việc bổ sungthêm magie đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình lên men có nồng độ cơ chất và sảnphẩm cao Tương tự như vậy, việc bổ sung thêm Zn cũng rất quan trọng trong quá trình traođổi chất của nấm men, đặc biệt trong quá trình lên men với các cơ chất thiếu Zn

Các ion Cu cũng làm tăng sản lượng Ethanol và sự sinh sản của nấm men với nồng

□ lmmobilized yeast-no supplemerct □ ^GuGl^yíl mg/L)

ion Cu cao sẽ gây độc đối với nấm men, do đó mà làm giảm hiệu quả quá trình lên Mặc dùvậy, việc bổ sung ion Cu rất cần thiết trong các quá trình đường hóa và lên men của quá trìnhlên men từ tinh bột thủy phân, khi đó Cu có thể hoạt hóa các enzym tham gia quá trình thủyphân tinh bột, ví dụ như enzym a-amylase, làm cho hiệu quả quá trình đường hóa và lên mentăng lên rõ rệt Bên cạnh các ion Cu, các ion Ca và Mg cũng đóng vai trò như những chất hoạthóa enzym a-amylase và do đó cũng làm tăng hiệu quả của quá trình đường hóa và lên men từ

cơ chất là tinh bột

3.1.4 Ảnh hưởng của vitamin:

Để đảm bảo cho sự sống, nấm men cần các vitamin BI có trong thành phần củacoenzym cacboxylaza B2 có ở dạng este phosphoric, axit nicotin có trong coenzymaza Biotin và axit paraaminobenzoic là những chất kích thích cho sinh trưởng của nấm men

Bảng 3 Anh hưởng việc bổ sung vitamin trong môi trường lên men Ethanol từ dịch

lõi ngô thủy phân bởi nấm men s cerevisiae cố đinh trong alginate

Hình 9 Hiệu suất của quá trình lên men của dịch lõi bắp thủy phân được lên men bởinấm men cố định s cerevỉsiae có bổ sung vitamin

Từ kết quả trên cho ta thấy hiệu quả quá trình lên men đạt cao nhất là 82,08% khi bổsung Ca- pantothenate( lg/L), khi bổ sung Ca- pantothenate vào thì hiệu quả quá trình lên mentăng gần 8% (từ 76,79 lên 82,08%) Anh hưởng của Ca- pantothenate mạnh hơn nhiều so vớiảnh hưởng của hỗn họp vitamin B (thiamin, pyridoxine và biotin), hổn họp vitamin này chỉlàm táng khoảng 2% so với mẫu đối chứng (từ 76.79% lên 78.7%) Ca-pantothenate, hỗn hợpvitamin và Inositol đều làm tăng khả năng chịu đựng của nấm men đối với cồn, từ đó nó kíchthích sự tổng họp các chất béo vì vậy sẽ làm giảm sự rò rỉ của màng tế bào của nấm men

Bổ sung khoáng và Vitamin

Dựa ưên những kết quả đã thu được, tiếp tục lên men bổ sung đồng thời vitamin vàkhoáng chất như sau: MgS04 (2g/L), ZnS04 (0.3g/L), CuCl2 (lmg/L), Ca-pantothenate (lg/L) vàInositol (lg/L) Dựng đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của bổ sung vitamin và khoáng chất tớisản phẩm Ethanol và việc tiẽu thu đường như

□ Immobiliỉsd yeast-no supplernentation

□ ^inosttoiy(1 g/L)

H j<Ca-panltotenateý(t g/L)

-14 12

Hình 11 Số lượng tế bào thu nhận được trong quá trình lên men

trình lẽn men Ethanol

-Á- Gỉucose vvithout mineraỉs and vitamins Glucose

minerals and vitamins Ethanol VYÍth miíierals and

vitamins

16

R 10

sau: