PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MELAMINE

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MELAMINE tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về tất cả các lĩnh vực...

ĐỀ TÀI:

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG

MELAMINE

Nhóm thực hiện: NGUYỄN NGỌC HOÀNG ANH

PHẠM ĐỨC PHẠM LÊ TRUNG DŨNG HUỲNH VĂN HIỆU PHAN NGUYỄN MINH HIẾU

MÔN HỌC:

CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH

HIỆN ĐẠI

Lớp: 07SH1D

I GIỚI THIỆU VỀ MELAMINE

I.1 Melamine la gì?

Melamine (tên đầy đủ 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) là một bazơ hữu cơ có công thức hóa học C3H6N6 tạo thành từ 3 phân tử cyanamide (CN2H2) Nếu tính tỷ lệ các nguyên tố cacbon (C), nitơ (N) và hydro (H) thì nitơ chiếm tới 66% nếu tính theo khối lượng

Vì giàu nitrogen, nên melamine được sử dụng làm chất dập lửa Melamine thường kết hợp với chất formaldehyde để sử dụng trong qui trình sản xuất nhựa để tạo thành chất melamin-formaldehyd là một loại polyme tổng hợp chống dãn nhiệt và cháy; chất keo

và một số sản phẩm phục vụ cho việc tẩy rửa

I.2 Độc tính của melamine

Melamine (màu xanh) dễ dàng kết hợp với acid cyanuric (màu đỏ) qua liên kết hydrota5o kiểu liên kết phân tử hình thành mái ngói, lắng đọng và gây sỏi thận

Melamine tự nó không được xem là một độc chất Nhưng khi kết hợp với Acid cyanuric thì nó trở nên độc hại Khi melamine kết hợp với cyanamide sẽ cho ra melamine cyanurate có khả gây sỏi thận thậm chí dẫn tới tử vong

I.3 Quy định về sử dụng melamine

Ngày 12-12-2008, tổ chức nông lương thế giới (FAO), tổ chức y tế thế giới (WTO),

Bộ y tế Việt Nam đã thông báo chung về mức giới hạn của melamine nhiễm chéo trong thực phẩm: Trong thực phẩm cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi không quá 1mg/1kg thực phẩm (<=1ppm) Các loại thực phẩm khác không vượt quá ngưỡng 2.5mg/kg thực phẩm (<=2.5ppm) Lượng ăn vào hằng ngày chịu đựng được đối với melamine

đã được WHO thiết lập là 0.2mg/kg trọng lượng cơ thể Theo ngưỡng này, một người nặng 50kg nếu ăn 10mg melamine/ngày sẽ không bị ảnh hưởng đến sức khỏe

Ngày 28-11-2008, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã ra quyết định về việc quản lý melamine trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Theo đó ngưỡng melamine được chấp nhận có trong thức ăn chăn nuôi là 2.5mg/kg; nếu vượt ngưỡng này sẽ bị cấm nhập khẩu, sản xuất kinh doanh và sử dụng trong ngành chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản

I QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MELAMINE TRONG SỮA VÀ THỨC ĂN

GIA SÚC

II.1 Quy trình phân tích hàm lượng melamine trong sữa và các sản phẩm sữa bằng kỹ thuật LC/MS/MS

ầu hết các nước trên thế giới đều quy định sử dung LC – MS/MS để phân tích melamine, đây là một kỹ thuật hiện đại và cho kết quả phân tích đáng tin cậy Ở Việt Nam, do điều kiện trang thiết bị nhân lực còn hạn chế và do nhiệm vụ quy định, có một số ít các trung tâm tiến hành nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích melamine trong sữa và các sản phẩm từ sữa Tuy nhiên các phuơng pháp hiện nay vẫn chỉ là những phương pháp áp dụng nội bộ phạm vi phòng thí nghiệm và kết quả phân tích nhiều khi khác nhau Với mục đích kiểm tra chất lượng sữa, tham gia kiểm tra lẫn nhau giữa các phòng thí nghiệm đồng thời giúp Bộ Y Tế ban hành một phương pháp chuẩn, có độ tin cậy cao trong phân tích hàm lượng melamine trong sữa

II.1.1 Máy phân tích khối phổ

Máy phân tích khối phổ (phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion“) là thiết bị phân tích dựa trên sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích + hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc bằng các phân tử mang năng lượng cao (nhu va chạm e, ion hóa hóa học, ion hóa proton, bắn phá ion, ion hóa trường ) Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng -> số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích)

Việc ghép sắc ký lỏng HPLC vào máy khối phổ MS không thể thực hiện trực tiếp được, vì muốn đo khối phổ cần phải tạo ra các ion ở thể khí, trong khi sắc ký lỏng được áp dung cho các chất ít bay hơi Vấn đề còn phức tạp thêm ở việc khi hợp chất

đi ra khỏi cột sắc ký lỏng, hợp chất đó đang ở trong pha động lỏng, cần phải loại bỏ dung môi trước khi đưa hợp chất khảo sát vào MS

Những sự không tương thích cơ bản giữa hai loại thiết bị là :

- Máy khối phổ MS hoạt động trong điều kiện chân không sâu, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ,…

- Máy sắc kí lỏng LC hoạt động trong điều kiện áp suất cao, nhiệt độ tương đối thấp, các chất khảo sát ở thể lỏng, vận tốc dòng chảy lớn

Bộ phận kết nối (interface) ở đây đóng vai trò quan trọng Nó gồm các loại khác nhau :

- Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (DIL)

- Bộ kết nối phun nhiệt (TSP)

- Bộ kết nối phun điện (ESI)

- Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh (CF-FAB)

a/ Bộ kết nối phun điện ( Electrospray Ionizaton : ESI)

Nguyên tắc của phương pháp ion hóa phun điện là dòng chảy máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ra với tốc độ 1-40 ml/phút đi qua 1 ống capila có đường kính 0,1mm và điện trường cao 3-6KV Chất lỏng được phun ra dưới dạng hạt rất nhỏ mang điện ở ấp suất thường Các hạt này đi đến điện cực của nguồn ion hóa áp suất khí quyển (API) Dòng khí N2 thổi vào làm mẫu bay hơi nhanh biến các hạt rất nhỏ trở thành cực nhỏ trước khi đưa đến buồng ion hóa

Bộ kết nối phun điện ( Electrospray Ionizaton : ESI )

b/ Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization : APCI )

Hỗn hợp này đến một vùng có áp suất khí quyển, và xảy ra sự ion hóa hóa học khi va chạm với 1 dòng ion dương ( H2, CH4, H2O,…) hoặc âm để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hay các mảnh ion qua sự bắn phá bởi dòng electron mang năng lượng cao do que Corona tạo ra Mỗi phân tử khí có thể tạo ra các ion dương khác nhau làm tác nhân cho ion hóa hóa học

Với dòng máy Agilent 6410 Triple Quad LC-MS/MS

Đây là thiết bị và nguồn ion hoá chúng ta sử dụng để phân tich melamine

Các ion sẽ được tách biệt khỏi nhau theo số khối nhờ bộ phận từ, điện trường Có một số dạng như sau :

- Khối phổ hội tụ đơn từ trường hình quạt (sector field spectrometer)

- Khối phổ hội tụ kép ( double – focusing sector spectrometer)

- Khối phổ tứ cực (quadrupole)

- Khối phổ đo thời gian bay TOF (time of flight)

- Khối phổ giải hấp laze (maldi-ms)

Thiết bị được sử dụng để phân tích ở đây là khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)

Khổi phổ kế tứ cực sử dụng 4 thanh tròn ngắn đặt song song nhau thành 1 bó, hai đầu đặt trên 2 giá đỡ :

Từng cặp đối diện, tích điện âm hay dương của nguồn điện DC Chúng làm cho các phân

tử chuyển động quanh trục trung tâm, do đó chỉ các ion nhất định mới tới được góp, sự thay đổi về tần số và điện thế cấp đã làm cho các ion có số khối khác nhau lần lượt tới bộ phận thu góp

Thiết bị được sử dụng để phân tích ở đây sử dụng khối phổ tứ cực (quadrupole

mass spectrometer).

Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy ( cỡ fentogram ), độ chính xác

Máy khối phổ MS – MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm ( collision cell ) MS đầu tiên ( tứ cực Q1 ) được sử dụng để cô lập ion cha-mẹ ( precursor ion ), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion con ( product ion ) tiếp theo MS thứ hai ( tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu

II.1.2.Nguyên lý:

Melamine trong sữa được chiếc bằng dung dịch acid tricloacetic ở pH = 1-2 Dung dịch chiếc sau đó được làm sạch qua cột chiết pha rắn trao đổi cation và phân tích bằng máy sắc ký lỏng khối LC/MS/MS

Giới hạn phát hiện của phương pháp : 50 ppb

Giới hạn định lượng của phương pháp : 50 – 100 ppb

RSD % :3 – 10 %

R % : > 80 %

II.1.3 Dụng cụ và thiết bị :

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent 6410 Triple

- Cột sắc ký Agilent Zorbax-Rx 2.1 x 150 mm, 5µm

- Máy ly tâm

- Máy lắc vortex

- Máy rung siêu âm

- Bộ chiếc SPE với bơm hút chân không

- Cột chiếc pha rắn SPE 300 mg/3ml

- Chất chuẩn melamine 99,5 % ( Sigma )

- Acetonitril

- Acid tricloacetic ( TCA )

II.1.4 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất, thuốc thử :

- Chất chuẩn Melamine

- Acetonitril

- Methanol

- Nước cất 2 lần

- Amoni hydroxit

- Acid tricloracetic

II.1.5 Xây dựng đường chuẩn :

Dãy dung dịch chuẩn có mức nồng độ 1ng/ml ; 5ng/ml; 10ng/ml; 20ng/ml; 40ng/ml Kiểm tra độ ổn định của thiết bị : bơm dung dịch mẫu chuẩn có mức nồng độ 0,5 ng/ml cho đến khi diện tích của pic mẫu chuẩn thay đổi không lớn hơn 5%

Xây dựng đường chuẩn ( tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn ) của Melamine ở các mức nồng độ 1ng/ml ; 5ng/ml; 10ng/ml; 20ng/ml; 40ng/ml

II.1.6 Chuẩn bị mẫu:

- Lấy mẫu đại diện theo tiêu chuẩn, xử lý mẫu thích hợp

- Them TCA 1%, lắc siêu âm 10 phút ( pH = 1-2)

- Ly tâm

- Làm sạch qua SPE

II.1.7 Điều khiển chạy máy:

Điều kiện HPLC:

- Cột sắc ký Agilent Zorbax-Rx 2.1 x 150 mm, 5µm

- Thể tích bơm mẫu 20 µl

- Pha động MeOH/H20 9+1( v/v) +5 mH CH3COONH4

- Tốc độ dòng 0,25 ml/min

- Theo tiêu chuẩn của FDA :

+ Cột hấp phụ : Venusil ASBCB8 ( một loại cột hấp phụ của công ty Agela

Technology, cột này chứa silica ) kích thước :4,6 x 250mm; pha động : buffer : acetonitrile = 85 : 15 ; buffer : 10mM sodium octane, pH=3,0; tốc độ chảy : 1.0 mL/min

+ Bước sóng tia UV :240 nm

+nhiệt độ :400 C

+ Máy dò : DA (diode array)

- Theo tiêu chuẩn của bộ nông nghiệp Trung Quốc :

+ Cột hấp phụ : Venusil ABC-C18 kích thướt 4.6 x 250 mm ; buffer :10 mM citric acid, 10mM sodium heptane’ pha động : dung dịch đệm : acetonitrile = 85 :15 ; tốc

độ chảy :1,0mL/min

+ Bước sóng tia UV : 240 nm

+ Nhiệt độ : 400 C

+ Máy dò : DA

Điều kiện khối phổ :

- Ion source APCI/postitive/MRM scan

- Gas temp 320 0 C

- Vaporizer 200 0 C

- Gas flow 5l/ phút

- Nebulizer pressure 60 psi

- Vcapillary 2500 V

- Corona current 6µA

- Vcharging 2000V

III.1.8 Tính toán kết quả:

Dựa vào thời gian lưu và các mảnh phổ để định tính Melamine Dựa vào điện tích của pic mẫu và chuẩn (trên nền mẫu) để định lượng

X(ng/kg)=Cx V/M Trong đó: X: Hàm lượng Melamine trong mẫu (ng/kg)

Cx: Nồng độ Melamine trong dịch cuối tính theo đường chuẩn (ng/l)

V: Thể tích cuối (ml)

M: Khối lượng mẫu (g)

III.1.9 Kiểm soát chất lượng:

Phân tích sàng lọc 1 lần đầu, nếu mẫu có phát hiện phân tích lặp lại 2 lần lấy kết quả trung bình Kết quả của 2 lần song song không được lệch nhau quá 20%

Mẫu trắng và mẫu kiểm tra phải được chuẩn bị cho từng lần phân tích

Hiệu suất thu hồi của mẫu kiểm tra phai trong khoảng 80 – 90 %

Sắc ký đồ và phổ đồ của melamine tại 1 ng/ml II.2 Qui trình phân tích hàm lượng Melamine bằng phương pháp săc kí khí ghép khối phổ( GC/MS)

Sắc khí ghép khối phổ(GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc kí hiện đại nhất hiện nay với dộ nhạy và độ đặc hiệu cao, được

sử sụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí(GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ(MS) mô tả các hợp phần riêng lẽ bằng cách mô tả số khối Bẳng sự

kết hợp 2 kĩ thuạt này(GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry), các nhà hóa họ

có thể đánh giá, phân tích định tính định lượng và có cách giải quyết 1 số hóa chất Ngày nay, người ta ứng dụng kĩ thuật GC/MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành như y học, môi trường, nông sản, kiểm ghiêm thực phẩm…

Các từ viết tắt:

TMS – trimethylsilyl

DEA – diethylamine

II.2.1 Nguyên tắc:

Melamine trong mẫu được chiết bằng nước cất – aceonitril Mẫu được làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE amino, sau đó tạo dẫn xuất bằng cột bằng N,O-BIS (Trimethylsilyl) trifloracetamid(BSTFA) với 1% trimethylclosilan(TMCS) dẫn xuất của melamine được xác định trên máy săc kí khí ghép khối phổ

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 50ppb

II.2.2 Thiết bị và dụng cụ

 Micropipet

 Lọ đựng mẫu cho máy GC-MS

 Giấy lọc thô

 Phiễu lọc

 Tube thủy tinh nút nhám 50, 100, 150ml

 Bình định mức 20, 50, 100, 500 ml

 Cột chiết pha rắn SPE amino( Strata-NH2 500mg*3ml – phenomenex)

 Máy sắc khí ghép khối phổ ( GC-MS)-Thermo Finigan Trace GC MS có chế độ tiêm mẫu chia / không chia dòng(Split/Splitless Injector), Chương trình nhiệt độ

 Cột sắc kí phân tích DB-5MS, đường kính trong 0.25 mm, bề dày lớp phim 0.25µm, chiều dài 30m

 Cân phân tích 4 số lẻ( chíh xác đến 0.1mg)

 Bếp cách thủy

 Bể siêu âm

 Máy lắc vortex

 Máy cô quay chân không

II.2.3 Hóa chất và thuốc thử

 Chuẩn melamine(Mr.Ehrenstoefer GmbH)

 Pyridine(Merck)

 Dung dịch N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoacetamide (BSTFA) voiws 1% trimethylchlorosilane(TMCS) Alltech-18089

 Acetoonitril-tinh khiết HPLC(Merck)

 Nước cất 2 lần

 2,6 diamino-4-chlropyrimidine(DACP)-Sigma

 Pha chế dung dịch

 Dung dịch chuẩn Melamine 600ppm: cân chính xác 30mg Melamine cho vào bình định mức 50ml, thêm vào khoảng 20ml pyridine Hòa tan hòa toàn và định mức đến vạch bằng pyridine

 Dung dịch chuẩn Melamine 6ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn Melamine 600ppm cho vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch bằng pyridine

 Dung dịch chuẩn Melamine 600ppb: hút 1ml dung dịch chuẩn Melamine 6ppm cho vào bình định mức 10ml, định mức đến vạch bằng pyridine

 Dung dịch nội chuẩn -2,6 diamino-4-chloropyrimidine(DACP) 600ppm: cân chính xác 30mg DACP cho vào bình định mức 50ml, thêm vào khoảng 20ml pyridine Hòa tan hoàn toàn rồi định mức đến vạch bằng pyridine

 Dung dịch nội chuẩn -2,6 diamino-4-chloropyrimidine(DACP) 6ppm: hút 1ml dung dịch nội chuẩn DACP 600ppm cho và bình định mức 100ml, định mức đén vạch bằng pyridine

 Dung dịch nội chuẩn -2,6 diamino-4-chloropyrimidine(DACP) 6ppb: hút 1ml dung dịch nội chuẩn DACP 6ppm cho vào bìnhđịnh mức 10ml, định mức đến vạch bằng pyridine

II.2.4 Tiến hành phân tích

a Chuẫn bị mẫu

Cân 5mg mẫu cho vào cốc thủy tinh 50ml Hòa tan mẫu bằng 15ml nước cất(đối với mẫu bơ, phô mai,socola đun trên bếp cách thủy cho mẫu tan ra), đánh siêu âm cho đến khi mẫu đồng nhất Cho tất cả dịch mẫu vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch bằng acetonitril Sau đó lọc qua giấy lọc thô Lấy dịch lọc qua cột SPE amino như sau:

• Hoạt hoa cột bằng 2ml ethanol( để chảy từ từ không dùng áp suất) Cho 2ml dung dịch lọc ở trên qua cột( để chảy từ từ không dùng áp suất) Sau khi mẫu đã qua cột dùng bơm chân không hút cột cho khô hẳn

• Dịch chiết qua cột SPE được cho vào bình cô quay 50ml Cô quay tại 700C cho đến khi khô hoàn toàn Sau đó cho vào bình cô quay 2ml methanol, siêu âm 2 phút, chuyển lượng methanol này vào tube 15ml có nắp vặn, đung khí nitrơ thổi khô hoàn toàn dung dịch methanol có chứ melamine Sau đó them vào tube 100µm pyridine đập nắp kĩ tránh bay hơi

b Tạo dẫn xuất cho chuẩn và mẫu:

Lấy 100µm dung dịch chuẩn Melamine 0.6 ppm cho vào tube thủy tinh có nắp vặn hoặc 100 µm dung dịch mẫu kiểm tra, thêm vào 100 µl đungịch DACP 600ppb và

400 µl dung dịch BSTFA với 1% TMCS Đầy kín lọ, lắc đều, tạo dẫn xuất tại 700

C-45 phút Lấy ra để nguội về nhiệt độ phòng Chovào lọ đựng mẫu phân tích trên máy GC/MS

c Phân tích trên máy sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS):

+ Cột phân tích DB-5MS

+ Chế độ tiêm : không chia dòng ( splitless).Mở xả khí sau một phút Tốc độ chia

40 ml/phút

+ Nhiệt độ buồn tiêm : 2800C

+ Thể tích tiêm : 1 µl

+ Khí mang : He

+ Tốc độ khí 1.5 ml/phút

+ Áp suất : 17.5 psi

+Chế độ chạy : đẳng dòng ( constant flow)

+ Nhiệt độ ban đầu : 750C

+ Thời gian giữ : 1 phút

+ Bước tăng nhiệt : 150C/ phút