Completed Ver2 (Form Mới) Đacn - Dương Diệu Linh - 20190346 .Docx

0 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM *** ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT SINH HỌC Đề tài Xây dựng quy trình công nghệ lên men bề mặt sản xuất enzyme xylanase từ nấm mốc[.]

Đề tài: Xây dựng quy trình công nghệ lên men bề mặt sản xuất

enzyme xylanase từ nấm mốc Aspergillus niger

ThS Lê Thị Lan Chi

Sinh viên thực hiện:

MSSV:

Dương Diệu Linh 20190346

Hà Nội, 2023

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Xylan 3

1.1.1 Xylan 3

1.1.2 Tính chất của xylan 5

1.2 Enzyme phân giải xylan – Xylanase 6

1.2.1 Khái niệm về Xylanase 6

1.2.2 Phân loại và cấu trúc của Xylanase 6

1.2.3 Nguồn thu enzyme Xylanase 8

1.2.4 Cơ chế phản ứng của Xylanase 11

1.2.5 Ứng dụng của Xylanase 13

1.2.6 Vị trí của enzyme xylanase trong tế bào 14

1.3 Thực trạng sản xuất enzyme xylanase 15

1.3.1 Một số sản phẩm enzyme xylanase có trên thị trường 15

1.3.2 Các phương pháp sản xuất enzyme xylanase 16

CHƯƠNG 2: LỰA CHỌN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 18

2.1 Lựa chọn quy trình công nghệ 18

2.1.1 Lựa chọn chủng 18

2.1.2 Lựa chọn phương pháp lên men 20

2.1.3 Lựa chọn nguyên liệu và cách xử lý nguyên liệu 20

2.1.4 Lựa chọn phương pháp thu hồi enzyme 20

2.2 Lựa chọn thiết bị 22

2.2.1 Thiết bị đảo trộn 22

2.2.2 Thiết bị tiệt trùng 23

2.2.3 Thiết bị nhân giống các cấp 24

2.2.4 Thiết bị lên men 24

2.2.5 Thiết bị trích ly 26

2.2.6 Thiết bị ly tâm 26

2.2.7 Thiết bị lọc màng 28

2.2.8 Thiết bị sấy phun 29

2.2.9 Thiết bị đóng gói 30

CHƯƠNG 3: THUYẾT MINH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 32

3.1 Chuẩn bị môi trường lên men 32

3.1.1 Xử lý nguyên liệu 32

3.1.2 Tiệt trùng và làm nguội 33

3.2 Chuẩn bị giống cho lên men 34

3.2.1 Hoạt hoá giống 34

3.2.2 Nhân giống 34

3.3 Lên men 38

3.4 Quá trình thu hồi enzyme 39

3.4.1 Trích ly enzyme 39

3.4.2 Ly tâm 40

3.4.3 Lọc màng 40

3.4.4 Sấy phun 41

3.4.5 Đóng gói 42

KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Sự phát triển của enzyme thức ăn, như xylanase, phytase và protease … cùng vớinhững tiến bộ về miễn dịch học và công nghệ sinh học, đã cho phép các nhà khoa họchiểu rõ hơn về tác động của enzyme đến sức khỏe đường ruột, khả năng tiêu hóa chất dinhdưỡng và năng suất của vật nuôi Enzyme xylanase giúp cải thiện khả năng tiêu hóa cácthành phần thức ăn có nguồn gốc thực vật và giảm độ nhớt của chất tiêu hóa, làm cho vậtnuôi hấp thu tốt

Xylanase (endo-1,4-β-xylanase) có tác dụng phân giải xylan, xylanase được tạo rabởi các vi sinh vật và cũng được tìm thấy từ tảo, động vật nguyên sinh, ốc sên, động vậtgiáp xác và các loại hạt thuộc nhóm ngũ cốc Xylan là hợp chất phổ biến thứ hai trên thếgiới và hiện nay chưa được khai thác ứng dụng nhiều Bên cạnh đó rác thải của các ngànhcông nghiệp khác như: bã mía từ nhà máy sản xuất đường, bã đậu tương từ nhà máy épdầu,… bị thải ra môi trường Đây được coi là nguồn cơ chất tiềm năng để sản xuấtenzyme xylanase

Nhận thấy, thị trường enzyme xylanase ở Việt Nam chủ yếu là nhập khẩu từ nướcngoài với giá thành tương đối cao Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, trong Đồ án chuyên

ngành Kĩ thuật sinh học này, với kiến thức đã học và dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn

Tiến Thành và ThS Lê Thị Lan Chi, em xin trình bày đồ án với đề bài thiết kế như sau:

“Xây dựng quy trình công nghệ lên men bề mặt sản xuất enzyme xylanase từ nấm

mốc Aspergillus niger”.

Với thực trạng hiện nay, enznyme xylanase ở Việt Nam chưa được sản xuất côngnghiệp phổ biến và giới hạn về kiến thức cũng như sai sót trong quá trình làm đồ án, emrất xin nhận được sự góp ý của quý thầy cô để có thể hoàn thiện hơn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Xylan

1.1.1 Xylan

Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose, là polysaccharidechiếm tỉ lệ lớn thứ hai sau cellulose ở thành tế bào thực vật, tồn tại ở dạng liên kết hoặckhông liên kết với cellulose, lignin, pectin hay những polysaccharide khác để duy trì tínhnguyên trạng của thành tế bào Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhómphụ là các gốc acetyl, 4-O-methyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộkhung được tạo bởi các gốc xylopyranose Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểuβ-1,4- glycozit Lignin bao quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng các gốccủa axit 4-O-methyl-D-glucuronic

Hình 1.1 Cấu trúc của xylan (a) Cấu trúc của monome, (b) Cấu trúc của xylan trong tự nhiên

Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose được tìm thấy trongthành tế bào thực vật là polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose, chiếm gần một phần bacarbon hữu cơ có thể phục hồi trên trái đất Xylan là thành phần chính của hemicelulose, một phứchợp polysaccharide gồm: xylan, xylanglucan, glucomannan, galactoglucomannan vàarabinogalactan Phức hợp này cùng với cellulose và lignin hình thành nên thành phần polymer củavách tế bào thực vật Xylan được tìm thấy lượng lớn trong gỗ cứng từ thực vật hạt kín (15-30%),

trong gỗ mềm từ thực vật hạt trần (7- 10%) và trong cây hàng năm (30%) Đặc biệt trong cây lárộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng chất khô của thực vật.

có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại môtrong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó

Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ

có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan Các polysaccharide nhưmanan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở cácthành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ,…

Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vậttrong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-xylopyranose, lànguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ởtrục chính và chuỗi bên Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốcacetyl, arabinosyl và glucuronosyl Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóatrị và không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác.

Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là khác nhau Xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm, hay thành phần cấu tạo xylan là axit D-

glucuronic, có hoặc không có liên kết ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc

Hình 1.3 O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng

Hình 1.4 Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm

1.1.2 Tính chất của xylan

Xylan không mùi, không vị Nhiệt độ hòa tan của xylan phụ thuộc vào nguồn gốc.Xylan có nguồn gốc từ gỗ cứng có nhiệt độ hòa tan là 150 – 200oC; còn đối với gỗ mềm,nhiệt độ hòa tan của nó là 70-130oC Trong gỗ cứng, cấu trúc của xylan có chứa các nhómacetyl, còn trong gỗ mềm nó không chứa nhóm acetyl Do đó, xylan trong gỗ cứng tantrong nước tốt hơn

Hình 1.5 Cấu trúc xylan trong cây gỗ; (a) gỗ mềm; (b) gỗ cứng

1.2 Enzyme phân giải xylan – Xylanase

1.2.1 Khái niệm về Xylanase

Xylanase là glycoxidase (O- glycoside hydrolase, EC 3.2.1.x) xúc tác quá trình thủyphân endohydro hóa các liên kết 1,4-β-D-xylosidic trong xylan, có nghĩa là thủy phânmạch hemicellulose nhưng lại không ảnh hưởng gì đến cellulose, từ đó tạo ra không giangiải phóng lignin bị giữ lại ở trong gỗ Chúng là một phức hệ các enzyme cần thiết, thamgia vào sản xuất xylose, một nguồn cacbon chính cho quá trình trao đổi chất của tế bào vàtrong quá trình lây nhiễm tế bào thực vật bởi các mầm bệnh thực vật, và được tạo ra bởirất nhiều sinh vật bao gồm vi khuẩn, tảo, nấm, động vật nguyên sinh, động vật chân bụng

và nhân trắc

Phát hiện về xylanase được báo cáo đầu tiên vào năm 1955, ban đầu chúng được gọi

là pentosanase và được Liên minh Hóa sinh và Sinh học phân tử quốc tê (IUBMB) côngnhận vào năm 1961 khi chúng được gán mã enzyme EC 3.2.1.8 tên chính thức của chúng

là endo- 1,4- β- xylanase, nhưng các thuật ngữ đồng nghĩa thường được sử dụng bao gồm

xylanase, endoxylanase, β- D- xylan- xylanohydrolase, endo- β- xylanase, β- xylanase và β- xylanase.

1,4-1.2.2 Phân loại và cấu trúc của Xylanase

Xylanase thuộc nhóm các enzyme thủy phân liên kết glycoside (glycoside hydrolase,GH), thủy phân xylan Glycoside hydrolase là một nhóm enzyme phân bố rộng rãi, thủyphân 5 các liên kết glycoside trong chuỗi polysaccharide hoặc oligosaccharide Do cấutrúc phức tạp của các carbonhydrate trong tự nhiên, nên các enzyme đặc hiệu cơ chất khácnhau cũng tồn tại số lượng lớn song song với nó GH từ các nguồn khác nhau được phânloại thành các họ khác nhau dựa vào trình tự axit amin tương đồng Nguyên tắc cơ bản là

từ trình tự axit amin bậc một có thể thấy được mối liên kết trực tiếp giữa cấu trúc bậc này

và sự cuộn gấp của các enzyme đối với các thành viên trong một hệ nhất định

Dựa vào sự tương đồng trình tự acid amin và các kết quả phân tích về cấu trúckhông gian, xylanase chủ yếu được xếp vào họ 10 và 11 của hệ enzyme thủy phânglycoside (Collin & cộng sự, 2005; Jeya & cộng sự, 2009; Sibtain & cộng sự, 2009).Xylanase cả hai họ 10 và 11 đều thủy phân xylan bằng cơ chế thay thế hai lần liên quanđến hai acid glutamic (Sinnot, 1990) Hai phân tử acid này nằm tại trung tâm hoạt độngcủa enzyme và quyết định một phần đến sự hình thành cấu trúc của xylanase Một phân tửacid hoạt động như một chất xúc tác bằng cách thêm proton vào cơ chất, trong khi phân tửacid thứ hai có ái lực mạnh với nhân, có vai trò mở đầu cho phản ứng phân cắt và trong sựhình thành enzyme α-glycosyl (Collin & cộng sự, 2005)

Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc (α/β)8 barrel và trọng lượng phân tử xấp

xỉ 48 kDa, pI thấp, và thủy phân các liên kết glycoside với sự giữ được hình thể nguyênvẹn, trong khi đó, họ xylanase 11 có cấu trúc mạch β gập hình bánh sandwich gần giốngvới cấu trúc bàn tay phải và có khối lượng phân tử nhỏ hơn, vào khoảng 20 kDa, pI cao vàthủy phân các liên kết glycoside với cơ chế xúc tác đổi chỗ hai lần (Hakylinen & cộng sự,2003; Zhou & cộng sự, 2009)

Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase Xylanase thuộc hệ GH11 thuộcnhóm alkaline xylanase.

Hình 1.6 Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 10 từ Bacillus harodurans

Hình 1.7 Cấu trúc không gian 3 chiều của Xylanase họ 11

1.2.3 Nguồn thu enzyme Xylanase

Xylanase có mặt khắp nơi trong tự nhiên và và được tìm thấy trong nhiều các sinh vậtsống như: vi khuẩn biển, trên cạn và dạ cỏ, nấm ưa nhiệt và nấm ưa, động vật nguyênsinh, giáp xác, ốc sên, côn trùng, tảo, thực vật và hạt giống (hạt dưa chuột chưa trưởng

thành và lúa mạch đang nảy mầm) Vi khuẩn và nấm phổ biến dùng để sản xuất xylanasetrong công nghiệp Một số nguồn vi sinh vật của xylanase được phân loại trong bảng sau:

Bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase 1.2.3.1 Thu enzyme Xylanase từ vi khuẩn

Trong số các vi khuẩn, loài Bacillus đã được báo cáo rộng rãi như là nhà sản xuất enzyme xylanolytic mạnh nhất chẳng hạn như Bacillus sp., B halodurans (Gupta et al 2015), B pumilus (Thomas et al 2014), B subtilis (Banka et al 2014), B.

amyloliquefaciens, B circulans và B stearothermophilus (Chakdar et al 2016) Xylanase

ổn định ở nhiệt độ cao, ổn định axit/kiềm và khả năng thích ứng lạnh đã được phân lập vàtinh chế từ một phạm vi rộng của vi khuẩn được tìm thấy trong môi trường khắc nghiệt

Xylanase chịu nhiệt hoạt động ở nhiệt độ rất cao 60–70 °C đã được báo cáo từ Bacillus

spp Bacillus Halodurans TSEV1 (Kumar và Satyanarayana 2014), Clostridium thermocellum (Fernandes et al 2015), Rhodothermus marinus (Karlsson et al 2004), Streptomyces sp (Sukhumsirichart et al 2014), Stenotrophomonas maltophila (Raj và

cộng sự 2013), Thermotoga thermarum (Shi và cộng sự 2013) Xylanase ưa lạnh không

phổ biến lắm nhưng được phân lập từ một số vi khuẩn như Clostridium sp PXLY1 (Akila

và Chandra 2003), Flavobacterium sp MSY-2 và Flavobacterium frigidarium (Humphry

et al 2001; Dornez và cộng sự 2011) Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3A (Van Petegem và cộng sự 2002) Một số xylanase bền với kiềm đã được phân lập từ firmicutes như B pumilus (Thomas et al 2014), B.halodurans TSEV1 (Kumar và Satyanarayana 2014) và Geobacillus thermoleovorans (Verma và Satyanarayana 2012b) và xạ khuẩn như

Actinomadura sp Cpt20 (Taibi et al 2012) và Streptomyces althioticus LMZM (Luo et al.

2016)

1.2.3.2 Thu enzyme Xylanase từ nấm mốc

Các loại nấm ưa ấm thuộc chi Aspergillus và Trichoderma được biết đến là những

loài sản xuất xylanase mạnh và được sử dụng rộng rãi nhất cho sản xuất thương mại

Thielavia terrestris, (Garcia-Huante và cộng sự 2017), Talaromyces thermophilus (Maalej

et al 2009), Paecilomyces ưa nhiệt (Fan et al 2012), Achaetomium sp X2-8 (Chadha et

al 2019), Rhizomucor pusillus (Hüttner et al 2018), Rasamsonia emersonii, (Martínez và cộng sự 2016) T Leycettanus (Wang và cộng sự 2017), Melanocarpus albomyces (Gupta

et al 2013) và Aspergillus oryzae LC1 (Bhardwaj et al 2019) được phát hiện là nhà sản

xuất siêu ưa nhiệt xylanaza hoạt động Một số xylanase bền với kiềm đã được thu được từ

các chủng nấm khác nhau như Paenibacillus barcinonensis (Valenzuela et al 2010),

Aspergillus fumigatus MA28 (Bajaj và Abbass 2011), Cladosporium oxysporum (Guan et

al 2016) và Aspergillus oryzae LC1 (Bhardwaj và cộng sự 2019).

1.2.4 Cơ chế phản ứng của Xylanase

Quá trình thủy phân xylan bởi xylanase có thể xảy ra bởi hai cơ chế khác nhau: Cơchế giữ lại và cơ chế đảo ngược

1.2.4.1 Cơ chế giữ lại

Quá trình này được thể hiện bằng sự dịch chuyển kép cơ chế với sự hình thành trunggian α-glycosyl và oxo-carbonium sau đó là quá trình thủy phân tiếp theo của nó Dưlượng glutamate đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác Đầu tiên, hai dư lượngaxit cacboxylic có trong vị trí hoạt động dẫn đến sự hình thành enzym trung gian α-glycosyl Sự hình thành trung gian xảy ra thông qua proton của chất nền bởi dư lượng axitcacboxylic hoạt động như một chất xúc tác axit và sự ra đi của nhóm rời do để tấn côngnucleophilic gây ra bởi một axit cacboxylic khác Điều này dẫn đến sự nghịch đảo từ βđến α do sự hình thành trung gian enzyme α-glycosyl Thứ hai, các nhóm carboxylate đầutiên hút một proton từ phân tử nước nucleophilic và tấn công carbon dị thường dẫn đến sựthay thế thứ hai, trong đó cacbon dị thường tạo ra sản phẩm có cấu hình β (α thành đảo

ngược β) thông qua trạng thái chuyển tiếp của oxo-carbonium ion (Hình 1.8) (Collins et

al 2005; Lombard et al 2014) Các enzym thuộc họ 5, 7, 10 và 11 chủ yếu hoạt động trênnguyên tắc giữ lại.

Hình 1.8 Cơ chế hoạt động của xylanase; Cơ chế giữ lại 1.2.4.2 Cơ chế đảo ngược

Các enzym của họ 8 và 43 hoạt động thông qua sự đảo ngược của trung tâm dịthường với glutamate và aspartate như dư lượng xúc tác chính Đây là một cơ chế dịchchuyển đơn, trong đó chỉ có một ion carboxylate cung cấp cho toàn bộ nhóm được xúc tác

axit (Hình 1.9) Cái này enzyme cũng đóng vai trò là cơ sở để kích hoạt một nucleophilic

phân tử nước để tấn công carbon dị thường (tùy thuộc vào khoảng cách giữa hai phân tử)

để phá vỡ các liên kết glycosid và gây ra sự đảo ngược của carbon cấu hình dị thường

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động của xylanase; Cơ chế đảo ngược

1.2.5 Ứng dụng của Xylanase

1.2.5.1 Ứng dụng trong sản xuất thức ăn gia súc

Xylanase thường được bổ sung trong thức ăn cho gia súc cùng với glucanase,pectinase, cellulose, protease, amylase, phytase, galactosidase và lipase Những enzymenày phá vỡ cấu trúc của arabinoxylan trong thành phần thức ăn làm giảm độ nhớt củanguyên liệu tươi (Twomey et al.,2003) Bổ sung xylanase vào thức ăn gia súc làm tăngkhả năng hấp thu dưỡng chất của hệ tiêu hóa, giúp quá trình sử dụng thức ăn hiệu quảhơn

Sản phẩm đa enzyme gồm glucoamylase 100 UG/g, protease 100 UP/g và xylanase

100 UX/g được sản xuất bởi chủng Aspergillus niger trên cơ chất cám mì bằng phương

pháp lên men bán rắn, được ứng dụng trong sản xuất ethanol và thức ăn gia súc

1.2.5.2 Ứng dụng trong sản xuất bánh mì, thực phẩm và ăn uống

Xylanase bổ sung vào bột bánh mì cùng với amylase, glucose oxidase, protease.Cũng giống như các hemicellulase khác, xylanse phá vỡ cấu trúc hemicellulose trong bột

mì, giúp tái sắp xếp lại các cấu tử nước làm cho bột nhào mềm hơn và dễ dàng nhào trộnhơn Việc bổ sung xylanase vào bột làm bánh mì còn giúp cho bánh mì nở to hơn và xốphơn Bổ sung xylanase trong quá trình làm bánh quy giúp bề mặt bánh nhẵn hơn và làmgia tăng vị ngon của bánh

Ngoài ra, xylanase còn đóng vai trò khá quan trọng trong công nghiệp sản xuấtnước ép trái cây Sử dụng kết hợp với cellulose, pectinase, amylase trong công nghệ nước

ép trái cây giúp giá tăng hiệu suất hóa lỏng của trái cây và rau củ, tận thu được hương vị,

tinh dầu, vitamin, khoáng chất, màu sắc… giảm độ nhớt, độ đục của nước ép, giúp choviệc lọc trong của nước ép dễ dàng hơn.

Trong công nghiệp sản xuất bia, xylanase được sử dụng để thủy phân arabinoxlanantrong lúa mạch làm giảm độ nhớt và độ đục của bia

1.2.5.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt

Ở Trung Quốc, người ta ủ sợi gai với xylanase để tạo ra những sợi cellulose nguyênvẹn và đồng đều Sau khi tẩy sợi bằng enzyme, người ta không cần phải thực hiện bướctẩy hóa chất tiếp theo

1.2.5.4 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột cellulose và giấy

Ứng dụng chính của xylanase trong công nghiệp sản xuất bột cellulose và giấy là tẩybột cellulose và tẩy trắng Trước đây, để loại bỏ lignin và giữ lại cellulose, người ta dùnghỗn hợp chlorine- bazơ để tẩy bột giấy Ngày nay, dựa vào khả năng xylanase có hoạt tínhphá vỡ cấu trúc hemicellulose kết dính lignin trong mạng cellulose, người ta có xu thể sửdụng xylanase trong tẩy bột giấy để thay thế cholorin gây ô nhiễm môi trường

1.2.5.5 Ủ xilo thức ăn gia súc

Mục đích của việc ủ cỏ xanh là để bảo quản nguồn cỏ hoặc các chế phẩm nôngnghiệp khác (cây bắp và cây họ đậu) duy trì được giá trị dinh dưỡng của chúng giống nhưlúc mới thu hoạch, giảm thất thoát sau thu hoach và cung cấp đủ nguồn thức ăn chấtlượng cao cho vật nuôi sau khi kết thúc vụ mùa hoặc khi nguồn thức ăn tự nhiên cạn kiệt

do thời tiết xấu

Ủ thức ăn gia súc là một quá trình động học bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Trong

đó, có yếu tố bổ sung phụ gia từ bên ngoài như: tác nhân kích thích lên men (vi sinh vật,các loại enzyme, cơ chất có thể lên men), chất ức chế lên men (các loại acid, các chất bảoquản khác), chất dinh dưỡng (ammonia và urea)

Hiện nay, việc sử dụng các loại enzyme trong ủ thức ăn chăn nuôi rất được quantâm, vì giá thành có thể chấp nhận đượckhi sử dụng enzyme với liều lượng cao Các sảnphẩm enzym trên thị trường dùng cho ủ cỏ thường chứa cellulase, hemicellulase,xylanasse, amylase và pectinase là enzyme thủy phân phần xơ của nguyên liệu ủ, amylasethủy phân tinh bột Mỗi loại enzyme được kết hợp với vi sinh vật khởi động (Hiyama,1986)

Hãng Huls AG (Đức) sản xuất tế bào L plantarum làm nguồn vi sinh vật khởi độngcho quá trình ủ cỏ Chế phẩm vi sinh vật khởi động được thương mại hóa chứa 2,5×1011 tếbào/g và được cấy với tỉ lệ 10-20g/tấn nguyên liệu, tương ứng với mật độ ủ 2,5×106 tếbào/g nguyên liệu thực vật

Để sản xuất silage chất lượng cao, các yêu cầu sau phải được thỏa mãn:

- Cỏ chất lượng cao (ra hoa 10%), thân bắp có độ ẩm <70%, cây ngũ cốc giai đoạn

có bột xốp đến cứng Giai đoạn sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến số lượng protein vànăng lượng để tiêu hóa

- Độ ẩm cỏ thích lợp từ 55-70%, nếu thu hoạch ở giai đoạn trưởng thành, cỏ nênđược làm héo trước khi ủ Cây ngũ cốc ở giai đoạn bột xốp đến cứng không cần làm héo,

độ ẩm tốt nhất là 55 đến 65% Cây bắp nên thu hoạch ở độ ẩm 62- 70% tốt nhất giữa 68% Độ ẩm trên 70% hoặc mất ẩm do rỉ nước dẫn đến sự lên men không chính xác Độ

65-ẩm thấp dẫn đến tăng nhiệt qua mức, vì khó đóng chặt để lọai khí

- Chặt cỏ thành các đoạn có kích thước ngắn đồng nhất: trung bình 1- 2 cm, nếu độ

ẩm thấp hơn 55% hoặc cỏ quá già thì kích thước cắt nên ngắn hơn

- Hạn chế không khí xâm nhập vào khối ủ

1.2.6 Vị trí của enzyme xylanase trong tế bào

Hình 1.10 Sơ đồ vị trí của enzyme được sản xuất bởi vi sinh vật

Có ba khu vực mà enzyme khu trú đó là nội bào (bên trong tế bào), trong xoangngoài tế bào chất (periplasmic enzyme) và ngoại bào (được tiết ra ngoài tế bào)

Enzyme xylanase thuộc loại enzyme ngoại bào

1.3 Thực trạng sản xuất enzyme xylanase

1.3.1 Một số sản phẩm enzyme xylanase có trên thị trường

Danisco Xylanase 8000 G

 Tên TACN: Danisco Xylanase 8000 G

 Số đăng ký nhập khẩu: 174-6/12-CN/17

 Dạng và màu sắc: Dạng hạt nhỏ mịn, màu nâu nhạt.

 Doanh nghiệp sản xuất: Finnfeeds Oy (trading as Danisco Animal

Nutrition)

 Thành phần chính:

- Thành phần nguyên liệu: Enzym Endo-1,4-beta xylanase (EC γ.β.1.8) (từTrichoderma reesei), chất bảo quản (calcium propionate) và chất mang (bột lúamỳ).

- Chỉ tiêu chất lượng: Độ ẩm ≤ 10,5 %; Endo-1,4-beta xylanase (EC γ.β.1.8) ≥8.000,0 U/g

- Chỉ tiêu vệ sinh: E.coli < 10 CFU/g; Salmonella không phát hiện trong β5g; Pb <5,0 ppm; As < β,0 ppm; Cd < 0,5 ppm; Hg < 0,1 ppm

Danisco Xylanase 40000 G

- Thành phần: β-1,4-xylanase, β-xylosidase, α-D-glucuronidase, α-L-furan

arabinosidase, acetyl xylanase và feruloyl esterase

- Điều kiện hoạt động:

Xylanase - Biotekco

 Cảm quan: Bột màu nâu nhạt

 Mùi: mùi lên men

 Thành phần: xylanase và chất mang

1.3.2 Các phương pháp sản xuất enzyme xylanase

Hiện nay, xylanase được sản xuất bằng quá trình lên men ở trạng thái rắn (SSF)hoặc quá trình lên men chìm (SmF) Mặc dù hầu hết các nhà sản xuất xylanase sản xuấtcác enzyme này bằng kỹ thuật lên men chìm (SmF) (gần 90% tổng doanh số bán xylanasetrên toàn thế giới) nhưng năng suất enzyme thông qua quá trình lên men ở trạng thái rắn(SSF) thường cao hơn nhiều so với quá trình lên men chìm Việc sử dụng các kỹ thuật lênmen trạng thái rắn (SSF) để sản xuất nhiều loại enzyme, bao gồm cả xylanase từ nguồngốc nấm ngày càng tăng, chủ yếu là do những lợi thế về kinh tế và kỹ thuật của quy trìnhnày

Việc lựa chọn phương pháp lên men còn phụ thuộc vào chủng sử dụng Khi chủngxản xuất là vi khuẩn, nấm men thì nên lựa chọn phương pháp lên men chìm, còn khichủng sử dụng là nấm mốc thì nên lựa chọn phương pháp lên men bề mặt (lên men rắn)

Ưu điểm của quy trình SSF so với SmF bao gồm: chi phí cho quá trình lên men thấp,nguy cơ nhiễm tạp thấp hơn, cải thiện tính ổn định của enzyme, enzyme sản xuất ra cóhoạt tính đặc hiệu cao hơn và quá trình thu hồi tiếp theo của các enzyme được tạo ra dễdàng hơn, Hơn nữa, quá trình lên men rắn giống với quá trình sinh trưởng và phát triểncủa nấm mốc trong tự nhiên Các điều kiện SSF đặc biệt thích hợp cho sự phát triển củanấm, vì những sinh vật này có thể phát triển ở mức hoạt độ nước tương đối thấp, ngượclại với hầu hết vi khuẩn và nấm men, chúng sẽ không sinh sôi nảy nở trong các điều kiệnnuôi cấy này

Ngược lại, lên men chìm cho phép kiểm soát tốt hơn các điều kiện trong quá trìnhlên men Quá trình lên men chìm của vi sinh vật hiếu khí là một phương pháp nổi tiếng vàđược sử dụng rộng rãi để sản xuất cellulase và xylanase SmF là phương pháp sản xuất ưathích khi các chế phẩm cần nhiều enzyme tinh khiết hơn, trong khi tác dụng đồng thời từmột nhóm enzyme phân hủy xylan có thể dễ dàng tìm thấy trong các chế phẩm thu được

từ SSF sử dụng cơ chất phức tạp, mặc dù phương pháp này thường được sử dụng trongcác ứng dụng nhằm mục đích cải thiện thức ăn chăn nuôi

CHƯƠNG 2: LỰA CHỌN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

2.1 Lựa chọn quy trình công nghệ

2.1.1 Lựa chọn chủng

Loài vi sinh vật lựa chọn trong quy trình công nghệ này là Aspergillus niger Đây là

loài nấm mốc sản sinh nhiều loại enzyme trong đó có xylanase, dễ nuôi cấy và có thể tồn

tại ở dải nhiệt độ và pH rộng Hoạt độ enzyme xylanase do Aspergillus niger tương đối

cao so với các loài khác

Aspergillus niger có một số đặc điểm sau:

2.1.1.1 Vị trí phân loại của Aspergillus niger

Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729 Năm 1901 Wehmer đã

cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này Raper và Fennell (1965)

chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần Như vậy,

Aspergillus niger có vị trí phân loại theo bảng sau :

Loài Aspergillus niger

Bảng 1.2 Phân loại khoa học của Aspergillus niger

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuốngsinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 5 – 6 x 20 – 30 µm, đôi khi

6 – 10 x 60 – 70 µm, màu nâu đen

Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai;bào tử đính xòe ra, có hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến đen than, đườngkính 4 – 5µm

2.1.1.2 Đặc điểm sinh học của Aspergillus niger

Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-8oC và tối đa 45-47oC,tối ưu ở 28-35oC, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23% Độ ẩm môi trường thích

hợp để lên men bán rắn Aspergillus niger là 60-65%, nó chỉ sinh trưởng và phát triển khi

có mặt O2 ở pH tối ưu là 4-6,5 Tuy nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng

Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2 Sự thay đổi pH môi trường nuôi cấy từ 3 đến

6,5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus niger.

2.1.1.3 Đặc điểm sinh hoá của Aspergillus niger

* Khả năng lên men đường

Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi như

glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose Aspergillus niger đồng hóa được

galactose, sorbose và lactose ở mức độ kém hơn

* Khả năng tổng hợp enzyme

- amylase (1,4 glucan- glucanhydrolase): Aspergillus niger có khả năng tổng hợp

α-amylase ngoại bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose vàglucose

Tinh bột α-amylase Dextrin (nhiều) + maltose (ít) + glucose (ít)

α-amylase của Aspergillus niger hoạt động tối ưu ở pH từ 4,5 – 4,7, trong khi để

đường hóa tinh bột, pH thích hợp nhất là 5 – 5,5, ở 50oC Enzym bị mất hoạt tính sau

30 phút ở pH = 2,5

Aspergillus niger có khả năng tạo glucoamylase nhiều hơn α-amylase (Lê Văn

Nhương, 1978) để thủy phân tinh bột thành dextrin và sau đó thành glucose ở pH vànhiệt độ tối thích tương ứng là 4 và 50oC Park Y.K (1970) đã sử dụng Aspergillus

niger để sản xuất sirô glucose từ khoai mì.

- Protease: Theo Lương Đức Phẩm, Aspergillus niger có khả năng tạo hai loại

protease Protease thứ nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton, còn proteasethứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin PH và nhiệt độ tốithích cho hoạt động của chúng tương ứng là 3 – 4 và 50oC

- Cellulase: Cellulase là một phức hợp nhiều enzym, chủ yếu là cellulase Cl, cellulase

Cx và β-glucosidase hay cellobiase Cellulase có tác dụng thủy phân cellulose thànhcellobiose rồi thành glucose theo trình tự như sau:

Cellulose cellulas Cellobiose cellobiase Glucose

Cellulase của Aspergillus niger có pH và nhiệt độ hoạt động tối thích tương ứng là

4-5 và 40oC trên cơ chất là giấy lọc hoặc CMC (carboxyl methyl cellulose)

- Pectinase: Aspergillus niger có khả năng tạo pectinase ở nhiệt độ tối thích 25oC và

pH 5,6 Tuy nhiên enzym thể hiện hoạt tính trong khoảng pH 2,5-6,8

- Xylanase: Aspergillus niger có khả năng tạo xylanase ở nhiệt độ và pH tối thích là

25oC và 5,6

Ngoài ra, Aspergillus niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzyme khác như: lipase,

mananase, α- galactosidase, carboxypeptidase, α- mannosidase, β- glucanase,…

* Lên men rượu

Theo Menezes (1978), loài Aspergillus niger có khả năng lên men rượu trong điều

kiện kỵ khí và tác giả đã tiến hành nghiên cứu sử dụng bã khoai mì để sản xuất rượuethanol

2.1.2 Lựa chọn phương pháp lên men

Chủng sử dụng trong sản xuất là nấm mốc nên lựa chọn phương pháp lên men bềmặt (lên men rắn – SSF) vì phương pháp này có điều kiện giống với điều kiện sinhtrưởng và phát triển của nấm mốc trong tự nhiên Ngoài ra phương pháp này còn ít tiêutốn năng lượng, giảm khả năng nhiễm tạp trong quá trình,…

2.1.3 Lựa chọn nguyên liệu và cách xử lý nguyên liệu

Hiện nay, có rất nhiều rác thải nhà máy vẫn còn giá trị sử dụng như bã mía từ nhàmáy sản xuất đường, bã đậu nành từ nhà máy ép dầu,… Đây là nguồn cơ chất tiềm năng

để sản xuất enzyme xylanase

Bã mía và bã đậu nành thu gom về sẽ được nghiền nhỏ bằng máy băm nghiền vàbảo quản lạnh chuẩn bị cho quá trình lên men

2.1.4 Lựa chọn phương pháp thu hồi enzyme

Enzyme xylanase do Aspergillus niger sinh tổng hợp là enzyme ngoài bào Vì vậy

quá trình thu hồi enzyme khá đơn giản, không cần phá vỡ tế bào Trích ly môi trường lênmen và ly tâm ta sẽ thu được dung dịch chứa enzyme xylanase

Những cách để cô đặc enzyme:

- Sử dụng dung dịch muối có nồng độ cao để kết tủa enzyme bằng sulfat amon 80%,thu kết tủa và hoà tan kết tủa

- Sử dụng màng siêu lọc để cô đặc enzyme

Phương pháp cô đặc enzyme bằng kết tủa là phương pháp rẻ tiền, tuy nhiên khi kếttủa enzyme bằng nồng độ muối cao thì kết tủa thu được sẽ có hàm lượng ion lớn, cần cóquá trình thẩm tích rồi mới hoà tan được kết tủa Phương pháp này cũng có khả năng làmgiảm hoạt tính của enzyme Với quy mô sản xuất lớn, để kết tủa lượng dịch chứa enzymelớn cần nhiều sulfat amon 80%, xét về kinh tế thì phương pháp này chưa chắc đã làphương pháp rẻ, hiệu quả

Trong quy trình công nghệ sản xuất enzyme xylanse này, em lựa chọn phương pháp

cô đặc enzyme bằng màng lọc tuyến tính Phương pháp này có thể thu enzyme nhanh,không cần nhiều bước như phương pháp kết tủa, không làm biến tính enzyme, tiết kiệmthời gian

2.1.5 Lựa chọn phương pháp hoàn thiện sản phẩm

Sản phẩm cần thu ở dạng bột, dịch enzyme sau khi cô đặc cần được sấy Nhữngphương pháp sấy và đặc điểm của từng phương pháp được thể hiện ở bẳng sau:

Rẻ Nhanh Vật liệu chịu

nhiệt và khôngchịu nhiệt, sảnphẩm ở dạng hạtSấy thùng

quay Sấy bằng nhiệt cóđảo trộn Rẻ Tương đối Vật liệu chịunhiệtSấy phun Sấy ở nhiệt độ cao,

dịch sấy được đưavào thiết bị ở dạngsương, có sử dụngchất mang bảo vệ

Tương đối Rất nhanh Vật liệu chịu

nhiệt và khôngchịu nhiệt ở danghuyền phù, dịch,gel,…

Sấy đông khô Làm đông nước và

thăng hoa nước đá ởđiều kiện chân không

Rất cao Lâu Phù hợp cho sản

phẩm dễ biến đổibởi nhiệt

Trong quy trình công nghệ sản xuất enzyme xylanse này, em lựa chọn phương phápsấy phun vì chi phí tương đối, thời gian sấy nhanh, sản phẩm sau khi sấy không thay đổinhiều hoạt tính vì đã được sấy cùng với chất mang để bảo vệ

Như vậy sau khi lựa chọn em đưa ra được sơ đồ quy trình công nghệ như sau: