TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER TRÊN MÔI TRỪỜNG LÊN MEN BÁN RẮN

TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Công Nghệ Sinh Học Ch

TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG

TÁCH CHIẾT VÀ TINH

SẠCH ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC

ASPERGILLUS NIGER TRÊN

MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

BÁN RẮN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Công Nghiệp

®

TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG

TÁCH CHIẾT VÀ TINH

SẠCH ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC

ASPERGILLUS NIGER TRÊN

MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

BÁN RẮN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Công Nghiệp

®

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa Học Ứng Dụng và Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng em trong suốt quá trình học tại trường

 Gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất và luôn là chỗ dựa vững chắc cho chúng con trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như thực tập tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới

 PGS TS NGYỄN TIẾN THẮNG, CN ĐỖ THỊ TUYẾN đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp

 Ban Giám đốc Viện Sinh Học Nhiệt Đới

 Các anh chị công nhân tại Xưởng Thực Nghiệm Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp

 Bạn Bùi Văn Trình, Phạm Ngọc Vinh, Đào Nguyễn Thuận, Huỳnh Lê Thiên Tứ

đã giúp đỡ tôi và sẻ chia những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình cùng nhau thực tập tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới

 Các bạn bè thân yêu của lớp 07SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt thời gian học tập cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập

Sinh viên thực hiện

Cao Đình Vũ

Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Aspergillus niger và có nhiều ứng dụng

quan trọng Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát tách chiết, tinh sạch enzyme

cellulase từ Aspergillus niger, tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm để xác định các điều

kiện tối ưu nhất về: tỷ lệ môi trường bán rắn, nồng độ dinh dưỡng, thời gian nuôi cấy

và nhiệt độ ban đầu để nấm mốc Aspergillus niger phát triển tốt nhất và sinh tổng hợp

enzyme cellulase có hoạt tính CMCase cũng như hàm lượng protein cao nhất

Kết quả thí nghiệm thu được:

- Tách enzyme bằng nước ở tỷ lệ CT : DM = 1 : 4 cho hoạt tính CMCase là 157,022 (UI/g CT) và hàm lượng protein là 105.235 (mg/g CT) cao hơn tách enzyme bằng đệm acetate pH = 5 và nước muối sinh lý

CMCase là 298.56 (UI/g CP) và hàm lượng protein là 115.11 (mg/g CP) cao hơn phương pháp tủa bằng acetone và cồn

- Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel đạt độ tinh sạch là 5.37 và hiệu suất thu nhận là 75.51 %

- Trọng lượng phân tử CMCase trong khoảng 53.08 kDa đến 86.24 kDa

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BẢNG xii

CHƯƠNG 1 1

MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 MỤC ĐÍCH 1

1.2 NỘI DUNG THỰC TẬP 2

CHƯƠNG 2 3

TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 3

2.1.1 Định nghĩa 3

2.1.2 Tính chất ưu việt của enzyme 3

2.1.2 Nguồn thu nhận enzyme 4

2.1.2 Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật 5

2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME CELLULASE 6

2.2.1 Định nghĩa và phân loại 6

2.2.2 Cấu tạo của cellulase 8

2.2.3 Tính chất của enzyme cellulase 10

2.2.4 Cơ chế tác động 10

2.2.5 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 12

2.3 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER 14

2.3.1 Vị trí phân loại của nấm mốc Asp niger 14

2.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sinh thái của Aspergillus niger 14

2.3.3 Cá đặc tính cấu trúc của hệ enzyme cellulase từ Aspergillus niger 15

2.3.4 Một số nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 16

2.4 NUÔI CẤY VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULASE 17

2.4.1 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 17

2.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của vi sinh vật 18

2.5 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN THU NHẬN ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER 21

2.5.1 Định nghĩa 21

2.5.2 Ưu điểm 22

2.5.3 Nhược điểm 22

2.6 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME 22

2.6.1 Tách chiết enzyme 22

2.5.1 Làm sạch enzyme 23

2.7 GIỚI THIỆU VỀ SẮC KÝ LỌC GEL 24

2.7.1 Bản chất của phương pháp 24

2.7.2 Một số thông số vật lý của phương pháp 25

2.7.3 Đặc tính hóa học của gel 26

2.8 SƠ LƯỢC VỀ PHÂN TÁCH ENZYME TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE 27

2.9 SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG ENZYME CELLULASE 29

2.9.1 Sản xuất cellulase 29

2.9.2 Ứng dụng của enzyme cellulase 30

CHƯƠNG 3 32

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 32

3.1.1 Thời gian 32

3.1.2 Địa điểm 32

3.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 32

3.2.1 Nguồn gốc vi sinh vật 32

3.2.2 Cơ chất 32

3.2.3 Hóa chất 33

3.2.4 Thiết bị 34

3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

3.3.1 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận chế phẩm cellulose thô 34

3.3.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 35

3.3.2.1 Nguyên tắc 35

3.3.2.2 Thực hành 36

3.3.3 Xác định hoạt tính enzyme cellulose theo phương pháp CMCase 38

3.3.3.1 Nguyên tắc 38

3.3.3.2 Hóa chất và dụng cụ, thiết bị 38

3.3.3.3 Thực hành 39

3.3.4 Phương pháp tinh sạch CMCase bằng sắc ký lọc gel (sắc ký rây phân tử) 41 3.3.4.1 Nguyên tắc 41

3.3.4.2 Hóa chất và dụng cụ 41

3.3.3.3 Các bước tiến hành 41

3.3.5 Phân tách enzyme cellulase bằng điện di trên gel SDS-PAGE 43

3.3.5.1 Nguyên tắc 43

3.3.5.2 Hóa chất và dụng cụ, thiết bị 44

3.3.5.3 Thực hành 46

3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 47

3.4 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 47

3.4.1 Thí nghiệm 1 – Khảo sát tìm dung môi chiết tách enzyme tối ưu 47

3.4.1.1 So sánh hiệu quả tách enzyme của nước và đệm acetat pH= 5 47

3.4.1.2 Khảo sát tỉ lệ CT : DM tối ưu để tách chiết enzyme cellulase 48

3.4.2 Thí nghiệm 2 – Khảo sát tỷ lệ cồn, tỷ lệ acetone và nồng độ muối tối ưu để tủa enzyme 49

3.4.2.1 Khảo sát tỷ lệ cồn dùng để tủa enzyme 49

3.4.2.2 Khảo sát tỷ lệ acetone dùng để tủa enzyme 50

3.4.2.3 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa tối ưu để tủa enzyme 51 3.4.3 Thí nghiệm 3 - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme 52

3.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme 52

3.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 53

3.4.3.3 Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme cellulase 54

3.4.4 Thí nghiệm 4 -Tiến hành chạy sắc ký lọc gel tinh sạch enzyme CMCase 54 3.4.5 Thí nghiệm 5– Phân tách hệ enzyme cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE 55

CHƯƠNG 4 56

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

4.1 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER 56

4.2 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 57

4.2.1 Xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của Aspergillus niger 57

4.3 CHIẾT XUẤT THÔ ENZYME CELLULASE VÀ TỦA PROTEIN TỪ

4.3.1 Chiết xuất enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 64

4.3.1.1 Tách enzyme thô bằng nước 64

4.3.1.2 Tách enzyme thô bằng đệm acetate 65

4.3.1.3 Tách enzyme thô bằng nước muối sinh lý 65

4.3.1.4 So sánh dịch chiết enzyme thô khi tách bằng nước, đệm acetate và nước muối sinh lý 66

4.3.2 Kết tủa ezyme bằng cồn lạnh 67

4.3.3 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cellulase sau khi tủa bằng cồn ở tỷ lệ 1:4 69

4.3.3.1 pH tối ưu 69

4.3.3.2 Nhiệt độ tối ưu 70

4.3.4 Kết tủa ezyme bởi acetone 71

4.3.5 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cellulase sau khi tủa bằng acetone ở nồng độ 70 % 73

4.3.5.1 pH tối ưu 73

4.3.5.2 Nhiệt độ tối ưu 74

4.3.6 Kết tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 bão hòa 74

4.3.7 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cellulase sau khi tủa bằng muối ở nồng độ 70% bão hòa 76

4.3.7.1 pH tối ưu 76

4.3.7.2 Nhiệt độ tối ưu 77

4.3.8 So sánh hoạt tính CMCase và hàm lượng protein với ba tác nhân tủa khác nhau: cồn lạnh, acetone và muối (NH4)2SO4 bão hòa 79

4.4 TIẾN HÀNH TINH SẠCH ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỌC GEL 79

4.4.1 Chế phẩm enzyme cellulase với tác nhân tủa là cồn lạnh, với tỷ lệ dịch chiết thô : cồn là 1 : 4 79

4.4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme cellulase khi

tủa cồn sau sắc ký 81

4.4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme cellulase khi tủa cồn sau sắc ký 81

4.4.2 Chế phẩm enzyme cellulase với tác nhân tủa là acetone với nồng độ 70 % 81

4.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme cellulase khi tủa acetone sau sắc ký 83

4.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme cellulase khi tủa acetone sau sắc ký 83

4.4.3 Chế phẩm enzyme cellulase với tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 70 % bão hòa 84

4.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme cellulase khi tủa muối sau sắc ký 86

4.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme cellulase khi tủa muối sau sắc ký 86

4.4.4 So sánh độ tinh sạch của enzyme cellulase sau khi tủa bằng 3 tác nhân: cồn lạnh, acetone và muối (NH4)2SO4 bão hòa 86

4.5 KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL SDS- PAGE 87

CHƯƠNG 5 91

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91

5.1 KẾT LUẬN 91

5.2 KIẾN NGHỊ 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93

PHỤ LỤC 95

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Sơ đồ thủy phân liên kết β-1,4-O-glucoside của cellulase 6

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vị trí cắt của enzyme 8

Hình 2.3: Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase 11

Hình 2.4: Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 12

Hình 2.5: Sơ đồ hệ thống hình thành enzyme cảm ứng 17

Hình 2.6: Tách các phân tử bằng lọc gel 25

Hình 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzyme 53

Hình 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzyme 53

Hình 3.3: Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme theo thời gian 54

Hình 4.1: Hoạt lực CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy Asp niger theo kế hoạch leo dốc 63

Hình 4.2: Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme cellulose bằng nước cất 64

Hình 4.3: Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme cellulose bằng đệm acetate pH 5 63

Hình 4.4: Hoạt tính CMCase (UI/g) và hàm lượng protein (mg) trong 5 ml dung dịch tủa enzyme đã pha trong đệm 68

Hình 4.5: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase khi tủa bằng cồn ở tỷ lệ 1:4 69

Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase khi tủa bằng cồn tỷ lệ 1:4 70

Hình 4.7: Hoạt tính CMCase (UI) và hàm lượng protein (mg) trong 5 ml dung dịch tủa enzyme đã pha trong đệm 72 Hình 4.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase khi tủa bằng acetone ở tỷ

Hình 4.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase khi tủa bằng acetone

ở tỷ lệ 1:4 74

Hình 4.10: Hoạt tính CMCase (UI) và hàm lượng protein (mg) trong 5 ml dung dịch tủa enzyme đã pha trong đệm 75

Hình 4.11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme CMCase khi tủa bằng muối ở nồng độ 70 % bão hòa 76

Hình 4.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme CMCase khi tủa bằng muối ở nồng độ 70 % bão hòa 77

Hình 4.13: Sắc ký đồ Biogel P- 100 (tủa bằng cồn) 80

Hình 4.14: Sắc ký đồ Biogel P- 100 (tủa bằng acetone) 82

Hình 4.15: Sắc ký loại muối bằng gel Sephadex G- 25 84

Hình 4.16: Sắc ký đồ Biogel P- 100 (tủa bằng muối) 85

Hình 4.17: Kết quả chạy điện di của các dịch enzyme 87

Hình 4.18: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa LogM của những protein trong thang chuẩn với Rf 88

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Đặc tính cấu trúc của Exoglucana 9

Bảng 2.2: Đặc tích kỉ thuật của một số phương pháp tinh sạch enzyme 24

Bảng 3.1: Thành phần hóa học của vỏ cà phê 33

Bảng 3.2: Thành phần hóa học của cám mì 33

Bảng 3.3: Thành phần khoáng của môi trường czapeck 35

Bảng 3.4: Bảng đường chuẩn albumin 37

Bảng 3.5: Bảng đường chuẩn glucose 39

Bảng 3.6: Dung môi và tỉ lệ tách chiết enzyme 48

Bảng 3.7: Khảo sát tỷ lệ CT- DM chiết tách enzyme 48

Bảng 3.8: Tỷ lệ dung môi ethanol và dịch chiết enzyme thô 50

Bảng 3.9: Tỷ lệ dung môi aceton và dịch chiết enzyme thô 51

Bảng 3.10: Tỷ lệ dung môi (NH4)2SO4 và dịch chiết enzyme thô 52

Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả thực tập tốt nghiệp 56

Bảng 4.2: Mã hóa các biến số (các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh ra CMCase của Aspergillus niger) 57

Bảng 4.3: Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY- 24 58

Bảng 4.4: Hoạt lực CMCase từ Aspergillus niger theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy 59

Bảng 4.5: Pha chế môi trường nuôi cấy Asp niger theo kế hoạch leo dốc 63

Bảng 4.6: Hoạt tính và hàm lượng của dịch enzyme thô khi tách bằng nước 64

Bảng 4.7: Hoạt tính và hàm lượng của dịch enzyme thô khi tách bằng đệm acetate 65

Bảng 4.8: So sánh kết quả tủa enzyme bằng nước cất và đệm acetate pH 5 66

Bảng 4.9: Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô trong 1g chế phẩm 67

Bảng 4.10: Hoạt tính CMC (UI/g) và hàm lượng protein (mg) trong 5 ml dung dịch tủa enzyme đã pha trong đệm 68 Bảng 4.11: Khảo sát pH từ pH 3 đến pH 8 theo hoạt tính CMCase khi tủa bằng cồn ở

tỷ lệ 1:4 (UI/g CP) 69

tủa bằng cồn ở tỷ lệ 1:4 (UI/g CP) 70 Bảng 4.13: Hoạt tính CMCase (UI/g) và hàm lượng protein (mg) trong 5 ml dung dịch tủa enzyme đã pha trong đệm 72 Bảng 4.14: Khảo sát pH từ pH 3 đến pH 8 theo hoạt tính CMCase khi tủa bằng acetone

ở nồng độ 70% (UI/g CP) 73

C) từ 30, 40, 50, 60, 70, 80 theo hoạt tính CMCase khi tủa bằng cồn ở tỷ lệ 1:4 (UI/g CP) 74 Bảng 4.16: Hoạt tính CMCase (UI/g) và hàm lượng protein (mg) trong 5 ml dung dịch tủa enzyme đã pha trong đệm 75 Bảng 4.17: Khảo sát pH từ pH 3 đến pH 8 theo hoạt tính CMCase khi tủa bằng muối ở nồng độ 70% bão hòa (UI/g CP) 76

tủa bằng muối ở nồng độ 70% bão hòa (UI/g CP) 77 Bảng 4.19: So sánh hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của 3 quá trình tủa 78 Bảng 4.20: Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein dịch tủa cồn trước và sau sắc ký 80 Bảng 4.21: Khảo sát pH từ pH 3 đến pH 8 theo hoạt tính CMCase tủa cồn sau sắc ký (UI/g CP) 81

cồn sau sắc ký (UI/g CP) 81 Bảng 4.23: Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein dịch tủa aceton trước và sau sắc

ký 83

Bảng 4.24: Khảo sát pH từ pH 3 đến pH 8 theo hoạt tính CMCase tủa aceton sau sắc

ký (UI/g CP) 83

Bảng 4.25: Khảo sát nhiệt độ (oC) từ 30, 40, 50, 60, 70, 80 theo hoạt tính CMCase tủa acetone sau sắc ký (UI/g CP) 83

Bảng 4.26: Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein dịch tủa muối trước và sau sắc ký 85

Bảng 4.27: Khảo sát pH từ pH 3 đến pH 8 theo hoạt tính CMCase tủa muối sau sắc ký (UI/g CP) 86

Bảng 4.28: Khảo sát nhiệt độ (o C) từ 30, 40, 50, 60, 70, 80 theo hoạt tính CMCase tủa muối sau sắc ký (UI/g CP) 86

Bảng 4.29: So sánh độ tinh sạch của chế phẩm enzyme với 3 tác nhân tủa khác nhau trong 1 g chế phẩm khi tiến hành chạy sắc ký 87

Bảng 4.30: Giá trị Rf và Log10M của thang protein chuẩn 88

Bảng 4.31: Trọng lượng phân tử của dịch enzyme thô 89

Bảng 4.32: Trọng lượng phân tử của dịch enzyme tủa bằng cồn đã qua sắc ký 89

Bảng 4.33: Trọng lượng phân tử của dịch enzyme tủa bằng acetone đã qua sắc ký 89

Bảng 4.34: Trọng lượng phân tử của dịch enzyme tủa bằng muối đã qua sắc ký 90

glucose, mật đường thay thế cho phương pháp thủy phân bằng acid

Công nông nghiệp ngày càng phát triển, lượng chất hữu cơ thải ra càng nhiều Trong đó, phụ liệu của nhà máy xay cà phê hạt là một ví dụ điển hình, vỏ cà phê chiếm khoảng 40- 45% khối lượng hạt cà phê Hiện nay, nước ta có diện tích trồng cà phê khoảng 500.000 ha, sản lượng đạt 738.000 tấn/ năm (2006), hàng năm thải ra khoảng 332.000 tấn vỏ Tận dụng phụ phế liệu này làm nguồn carbon để sản xuất enzyme cellulase bằng cách nuôi cấy nấm sợi trên môi trường lên men bán rắn đã thu hút được

sự quan tâm của nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam

Từ nhu cầu thực tế giải quyết vấn đề còn tồn đọng nhằm góp phần giảm ô nhiễm môi trường và có thể tận dụng một cách có hiệu quả rác có nguồn gốc cellulose nói chung và nguồn phụ phế liệu của công nghiệp cà phê nói riêng là nguyên nhân của đề

tài luận văn: “TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG, TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH

ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER TRÊN MÔI

TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN”

1.2 MỤC ĐÍCH

- Tách chiết enzyme cellulase từ canh trường nuôi cấy Aspergillus niger và khảo

sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme

- Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử của enzyme Carboxylmethyl

Cellulase CMCase từ nấm mốc Aspergillus niger

1.3 NỘI DUNG THỰC TẬP

Khảo sát thành phần môi trường cảm ứng để chủng nấm mốc Aspergillus niger

cho hoạt lực enzyme cao nhất

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như: Tỷ lệ vỏ cà phê : cám mì; độ ẩm; pH; nồng độ dung dịch dinh dưỡng; thời gian nuôi cấy và tỷ lệ giống đến khả năng sinh

tổng hợp cellulase của nấm mốc Aspergillus niger

Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng: nhiệt độ, pH ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase, từ đó xác định được các điều kiện môi trường tối ưu nhất

cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

Quy hoạch thực nghiệm, tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ

nấm mốc Aspergillus niger

Tinh sạch enzyme cellulase bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Xác định trọng lượng phân tử của enzyme được tủa với muối, acetone và cồn lạnh bằng phương pháp điện di trên gel SDS- page

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME

2.1.1 Định nghĩa [1], [9]

Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro) Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác

Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh,…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng

C, áp suất thường, không acid mạnh hay kiềm mạnh,…)

Hiện nay, người ta khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tinh thể Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y và một số ngành công nghiệp đặc biệt như công nghiệp chế biến thực phẩm (bia, rượu, nước chấm, bánh mì)

2.1.2 Tính chất ưu việt của enzyme [1], [4], [9], [12]

pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính

Enzyme có tính chất đặc hiệu cao trên những cơ chất nhất định và xúc tác theo một kiểu phản ứng nhất định

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể kiểm soát dễ dàng bằng các yếu tố như: nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, chất hoạt hóa,…

Enzyme thường có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ enzyme

có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất trong khoảng thời gian ngắn Ví dụ, trong

phản ứng thủy phân sacharose, nếu dùng sacharase làm chất xúc tác thì tốc độ phản

lần so với khi dùng acid làm xúc tác

2.1.3 Nguồn thu nhận enzyme [1], [4], [5], [19]

Vì enzyme là chất không thể chế biến bằng phương pháp tổng hợp hóa học nên người ta thường thu chúng từ các nguồn sinh học

 Nguồn động vật

Niêm mạc dạ dày bê dưới 5 tháng tuổi tách chiết được rennin làm đông tụ sửa dùng trong sản xuất phomat Niêm mạc dạ dày động vật như heo, bò, chim,… tách chiết được pespin tác dụng thủy phân protein

Tuyến tụy chứa các loại enzyme như protease, amylase, lipase, nuclease,…

Enzyme từ động vật thường ít sử dụng do nguồn nguyên liệu ít, giá thành cao

 Nguồn thực vật

Papain từ nhựa đu đủ xanh thủy phân tốt protein Hạt đại mạch nẩy mầm (malt)

có chứa amylase Bromelin là protease thu nhận được từ các phần chồi, thân, quả của trái thơm có khả năng phân giải protein cao

Nguồn thực vật có giá thành cao, sản xuất quy mô lớn sẽ gặp khó khăn, không có hiệu quả kinh tế

 Nguồn vi sinh vật

Đây là nguồn nguyên liệu vô tận, enzyme tích lũy trong môi trường nuôi cấy do

đó thuận lợi cho việc thu chế phẩm enzyme Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có nhiều

ưu điểm nổi bật:

- Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn

các ngành công nghiệp

- Có thể chọn giống vi sinh vật tăng khả năng tổng hợp enzyme bằng cách gây đột biến, biến nạp,…tạo được enzyme theo ý muốn

- Sản xuất enzyme từ vi sinh vật có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp

2.1.4 Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật [4], [9]

Công nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật phát triển nhanh từ năm 1960, khi sản xuất công nghiệp tạo kháng sinh từ vi sinh vật tạo enzyme amylase, glucoamylase, glucoisomerase để thu các loại đường đơn và loại bỏ hoàn toàn công nghệ cổ điển Ngay sau khi phát hiện ra sự tồn tại khách quan của vi sinh vật xung quanh ta vào thế kỷ 17 thì ngành công nghiệp lên men trên toàn thế giới đã phát triển với tốc độ rất mạnh mẽ Đồng thời, các nhà khoa học cũng lần lượt làm sáng tỏ bản chất của quá trình lên men, các công trình nghiên cứu về enzyme bắt đầu phát triển mạnh mẽ và đạt những thành tựu đáng kể

Cho đến ngày nay, việc khai thác và sử dụng enzyme không chỉ còn là quá trình

áp dụng thủ công mà đã phát triển thành một ngành công nghiệp với những kỹ thuật hoàn chỉnh và đem lại những nguồn lợi không nhỏ Đã phát hiện khoảng 2000 enzyme khác nhau nhưng chỉ khoảng 140 enzyme có thể thương mại được Trong đó, cellulase

là enzyme có nhiều ứng dụng trong trong công nghiệp và đời sống

Các enzyme được sử dụng trong công nghiệp: amylase, protease, catalase, isomerase, penicilinase

Các loại enzyme được sử dụng trong phân tích: gluco oxidase, alcoholdehydrogenase, clolesterol oxidase

Các loại enzyme sử dụng trong dược phẩm như: asparaginase, protease, lipase, streptokinase

Những điều kiện cần lưu ý khi quyết định xây dựng hoặc nâng cao năng suất của công nghiệp enzyme như sau:

- Giống vi sinh vật: có thể tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme bằng nhiều con đường khác nhau Trong đó, biện pháp thay đổi yếu tố di truyền (đột biến, tái tổ hợp) đang được quan tâm

- Tối ưu hóa quá trình lên men

- Áp dụng những tiến bộ của công nghệ chế tạo máy để tạo ra những thiết bị lên men hiện đại

- Áp dụng công nghệ cố định enzyme để sử dụng lặp lại được nhiều lần

2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME CELLULASE

2.2.1 Định nghĩa và phân loại

 Định nghĩa [3], [9], [10], [13]

Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm hòa tan Phức hợp cellulase là hệ enzyme phức tạp Một mặt như enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose là chất cảm ứng không chặt chẽ), một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm soát bởi cơ chế kiềm chế

dị hóa

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác

β-1,4-Hình 2.1: Sơ đồ thủy phân liên kết β-1,4-O-glucoside của cellulase

Cellulose là một loại homopolimer của β-D-glucose Các gốc β-D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucan Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất là 3 enzyme khác nhau: endoglucanase có kí hiệu EC.3.2.1.4, exoglucanase có kí hiệu EC.3.2.1.91, β-glucosidase có kí hiệu EC.3.2.1.21

 Phân loại [4], [9], [11], [18]

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1: thủy phân liên kết O- và S-

http://afmb.cnrs-mrs.fr/pedro/CAZY/db.html) Cellulase là một phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau:

Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme

Cx Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng Các enzyme Cx được chia thành hai loại: exo β-1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo β-1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose

Hiện nay, cellulase được chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase hoặc D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4) Dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (còn gọi là

(cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91) Dạng 3 là β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Các cellulase có nguồn gốc khác nhau được sắp xếp thành các họ Trước đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase được chia làm 6 họ: A, B,

C, D, E và F Sau đó, cellulase được chia thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác Hiện nay, các cellulase được sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7,

8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vị trí cắt của enzyme

2.2.2 Cấu tạo của cellulase [9], [13]

Enzyme cellulase có bản chất protein được cấu tạo bởi các đơn vị acid amin, các acid amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH-, tuy nhiên trong cấu trúc

có gắn các phần phụ khác Cấu trúc không gian cellulase bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác nhưng được gắn thêm đuôi vùng glycosil hóa và cuối đuôi này là vùng gắn kết với cellulose Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường -CO-NH- của protein

và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme

Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30 – 110 Kdalton (Beguin, 1990 và cộng sự 1991) Cấu trúc không gian khoảng 280 – 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase thường khoảng 300 - 450 acid amin (Gillees và cộng sự 1992) và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin

Bằng cách bẻ gãy các liên kết β-1,4-glucan, hệ enzyme cellulase đã thủy phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose Trong đó, exoglucanase là enzyme chính trong quá trình thủy phân cellulose

Exoglucanase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn cellulose qua một vùng liên kết đƣợc glycosil hóa cao Exoglucanase gồm có 2 chuỗi gọi là chuỗi A và chuỗi B Cả 2 chuỗi đều có 434 gốc nhƣng giữa chúng cũng có sự khác nhau để phân biệt

Bảng 2.1 Đặc tính cấu trúc của Exoglucanase

2.2.3 Tính chất của enzyme cellulase [9], [11], [13]

Cellulase bị ức chế bởi các phản ứng của nó nhƣ glucose, cellobiose Thủy ngân

ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác nhƣ Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ

2.2.4 Cơ chế tác động [4], [12], [18]

Quá trình thủy phân cellulose tự nhiên nhờ enzyme đƣợc thực hiện bởi một phức

hệ enzyme cellulase, bao gồm các enzyme: endoglucanase, exoglucanase và β- glucosidase Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose Enzyme β-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu, enzyme này thủy phân cellobiose thành cellohexose (D-glucose)

Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose) Sau đó các sợi này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra glucose (Lee et al., 2002)

Hình 2.3: Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulase

(Lee et al., 2002)

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác nhƣ glucozidase (cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose Kết quả tạo ra các cello oligosaccharide mạch ngắn, cellobiose và glucose Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo thành glucose

exo-β-1,4-Hình 2.4: Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase

2.2.5 Vi sinh vật tổng hợp cellulase

 Giới thiệu về các nhóm sinh vật sinh tổng hợp cellulase

Cellulase có mặt trong hạt của thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm

và ốc sên Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn cung cấp cellulase khá phong phú gồm các

xạ khuẩn, vi khuẩn, niêm khuẩn, nấm mốc Popov (1875) là người đầu tiên xác nhận khả năng phân giải cellulose của vi sinh vật hiếu khí G Van Interson (1903), phát hiện khả năng phân giải cellulose của các VSV kị khí

Trong điều kiện hiếu khí các loài nấm phân hủy cellulose mạnh hơn rất nhiều so với các loài vi khuẩn Ngược lại trong điều kiện yếm khí thì các loài vi khuẩn lại tỏ ra

có khả năng này mạnh hơn các loài nấm sợi

 Xạ khuẩn

Nhiều tác giả đã nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn

Streptomyces, Actinomyces,… Các ông đã nhấn mạnh rằng, trong cùng một loài, hoạt

tính phân giải cellulose ở các chủng khác nhau là khác nhau

Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lượng và Đặng

Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và Streptomyces reticuli cũng

Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas Persica sp.nov và Cellulomonas Iranensis sp.nov (Elberson, 2000)

Vi khuẩn kị khí: Clostridium Thermcellum, Clostridium Cellulovorans (Murashima, 2002), Clostridium Cellulotiticus (Parsigegla, 1998)

 Niêm khuẩn (Myxobacterales)

Gồm các giống: Promyxobacterum, Cytophaga, Sporangium, Sporocytophaga

 Nấm sợi

Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp một lượng lớn cellulase thuộc

giống Alternaria, Trichoderma, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum,…chúng được

tách từ đất xung quanh các vùng rễ cây, từ mẫu thực vật, từ than bùn và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose

Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus như Asp.niger (Coral et al., 2002, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), Asp.candidus (Hong et al.,

2001, Milala et al., 2009), Asp.flavus (Ojumu et al., 2003), Asp.fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), Asp.oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989,

de la Mata et al., 1992, Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng, 2003) đều có khả năng

sinh enzyme Các nhóm thuộc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al.,

1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) cũng có khả năng tổng hợp cellulase cao

2.3 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

2.3.1 Vị trí phân loại của nấm mốc Aspergillus niger [2]

- Loài: Aspergillus niger

2.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sinh thái của Aspergillus niger [10], [11]

Nấm mốc Aspergillus niger có cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử và không có diệp lục,

sử dụng gián tiếp nguồn hữu cơ có sẵn để sinh sống

Khuẩn lạc Aspergillus niger trên môi trường Czapeck yeast agar (CYA) có dạng

lông nhung, khi còn non có màu trắng, khi già có màu đen, mặt trái của petri thường

có màu vàng nhạt đến vàng sáng

Cuống sinh bào tử được sinh ra từ khuẩn ty khí sinh, có chiều dài 1-3 mm có vách tế bào trơn bóng và trong suốt Đỉnh cuống phình ra có dạng hình cầu được gọi là bọng, có đường kính 50 – 70 µm, sinh ra 2 lớp thể bình; bình thứ nhất hình tam giác cân ngược; lớp thứ hai hình chai, sinh ra bào tử đính hình cầu; bào tử đính có đường kính 4-5 µm, có màu nâu đen, vách bào tử đính có dạng xù xì

Aspergillus niger sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu là 6-8 oC, tối đa là 45 – 47 o

C,

C (Panasenko, 1967) Aspergillus niger là nấm chịu khô: Ayerst

(1966) cho biết bào tử đính có thể nẩy mầm trong môi trường có thế nước 0,77 và 35

hợp để lên men bán rắn là 60-65 %, chỉ sinh trưởng trong môi trường có sự có mặt của

niger sinh trưởng được ở pH= 2

Độc tố: Aspergillus niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và sử dụng

rộng rãi trong chế biến thực phẩm Tuy nhiên, theo thông tin gần đây có 2 trong 19

chủng Aspergillus niger phân lập được sinh ra ochratoxin A (Abarca, 1994)

Sinh thái: Aspergillus niger chiếm ưu thế ở vùng nhiệt đới, bào tử màu đen nên

không bị ảnh hưởng bởi tia mặt trời và tia UV

Tác hại: Aspergillus niger làm hư hại trái cây sau thu hoạch như: táo, chanh, lê,

nho, gây nhiễm phomat, sống bám trên đồ gỗ, đồ da, gây thối rữa chồi cây hoa bông vải, thối rữa thân cây

Ứng dụng trong công nghiệp: từ lâu nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng

Aspergillus niger để sản xuất các chế phẩm sinh học như acid hữu cơ, các loại enzyme,

các chế phẩm giàu protein: điều chế acid citric (E330), gluconic acid (E574) De

Menezes đã nghiên cứu sử dụng khoai mì lên men bằng Aspergillus niger để sản xuất cồn Villarelue sử dụng khoai mì lên men bằng Aspergillus niger để tạo chế phẩm giàu protein dùng trong chăn nuôi Noomham nuôi cấy Aspergillus niger để thu nhận

enzyme amylase Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa đã nghiên cứu sử dụng

Aspergillus niger để nâng cao chất lượng sắn lát phục vụ chăn nuôi

2.3.3 Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ Aspergillus niger [10], [12]

Theo Hurst (1977), endoglucanase từ Aspergillus niger có trọng lượng phân tử là

C

Galas và Romanowska (1977), cho biết β-glucosidase (EC 3.2.1.21) từ

Aspergillus niger IBT-90 có trọng lượng phân tử khoảng 200 kDa, điểm đẳng điện là

4,05 và chứa 33% carbohydrate Enzyme này thủy phân cellobiose ở pH=4,8 và nhiệt

C

Theo báo cáo của Gokhan CORAL (2002), dịch nuôi cấy Aspergillus niger Z10

trong môi trường Czapeck Dox chứa CMC 1 %, sau khi cho chạy điện di trên gel PAGE (chứa 0,2 % CMC) phát hiện có 2 vạch protein có hoạt tính thủy phân CMC với trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton

SDS-Ở Aspergillus niger có hai gen mã hóa cho endoglucanase là eglA và eglB Hai

gen mã hoá cho exoglucanase là cbhA và cbhB Cả EglA và EglB thiếu domain CBD vùng liên kết CbhB có một domain xúc tác và một đuôi CBD tách biệt với domain xúc tác bởi một liên kết peptide giàu Ser/Pto/Thr, trong khi CbhA chỉ có domain xúc tác, thiếu đuôi CBD và liên kết peptide Gần đây một gen mới được cô lập là EglC, mã hóa cho endoglucanase, enzyme này tham gia thủy phân xyloglucan được điều hòa phiên mã bởi protein XlnR (protein hoạt hóa phiên mã), protein này không chỉ điều

hòa sự biểu hiện của các gen mã hóa hệ enzyme thủy phân xylan mà còn kiểm soát sự phiên mã các gen mã hóa hệ enzyme thủy phân cellulose như eglA, eglB, cbhA, cbhB

2.3.4 Một số nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ

Aspergillus niger [10], [12], [18]

nitơ tốt nhất cho Aspergillus niger NCIM 1207 sinh tổng hợp cellulase, pH và nhiệt độ

C

Sonia (2000), đã khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzyme như:

polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ Aspergillus niger 3T5B8 trên các

nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzyme trong tách chiết dầu thực vật

Aguiar (2001), nuôi cấy chủng Aspergillus niger IZ9 trong các môi trường có

nguồn carbon khác nhau: glucose, bã mía không được tiền xử lý, bã mía được tiền xử

Hoạt lực cellulase trên môi trường có giấy lọc khoảng 0,44 UI/ml và 0,26 UI/ml trong môi trường có bã mía được tiền xử lý với dung dịch NaOH 4 % sau 192 giờ nuôi cấy Theo Kang (2004), đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase và

hemicellulase của Aspergillus niger KK2 trên môi trường lên men bán rắn với cơ chất

là hỗn hợp rơm và cám mì Hoạt tính giấy lọc là 19,5 UI/g sau 4 ngày nuôi cấy Hoạt tính CMC 129 UI/g, β-glucosidase 100 UI/g, xylanase 5070 UI/g và β-xylosidase 193 UI/g sau 5-6 ngày lên men

Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu của Lê Hồng Mai (1989) về sinh tổng hợp và

một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở Aspergillus niger VS-1 trên môi trường

lên men bán rắn với cơ chất là trấu xay và mật rĩ dường (thời gian nuôi cấy tối ưu là 56

C) Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và ctv đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và

đặc điểm của cellulase từ chủng Aspergillus niger NRRL-363 Qua nghiên cứu, tác giả

đã tìm ra được một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thải công nghiệp như mật rỉ đường

2.4 NUÔI CẤY VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULASE

2.4.1 Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng [9], [12], [13]

Cellulase là một enzyme thuộc hệ enzyme cảm ứng Cellulase chỉ được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên môi trường chứa cellulose hay dẫn xuất của cellulose và lactose, còn trên môi trường chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase không được sinh ra (Bisaria và Mishra, 1989; Beguin, 1990; Kubicek, 1993) Một trong các phân tử kích thích nấm sợi sinh tổng hợp cellulase có hiệu quả nhất là sophorose (Mandelset al., 1962; Nisizawaet al, 1971), chất này có nguồn gốc từ các phân tử celloligosacharide

Hình 2.5: Sơ đồ hệ thống hình thành enzyme cảm ứng

Tuy nhiên, có sự khác nhau trong nguyên lý điều hòa sinh tổng hợp cellulase giữa

các loại nấm sợi, glucose và xylose cảm ứng Aspergillus tereus biểu hiện cellulase nhưng không cảm ứng Trichoderma reesei QM9414 (Hrmovas et al., 1991); D-xylose cảm ứng Aspergillus niger biểu hiện CbhA và CbhB

Phân tích sự biểu hiện cellullase ở mức độ phân tử được thực hiện trên các đối

tượng nấm sợi như Trichoderma reesei (El-Gogary et al., 1989; Fowler và Brown,

1992; Seiboth et al., 1992; Fowler et al., 1993; Kubicek, 1993b; Penttila et al., 1993;

Stangl et al., 1993), P.chrysosporium (Covert et al., 1992b) và Aspergillus niger

(Macro et al., 1999) Các nghiên cứu này, đã chứng minh rằng khả năng sinh tổng hợp

cellulase ở các loài nấm sợi này được điều hòa ở mức độ phiên mã Qua kiểm chứng các kết quả sinh hóa, phát hiện các phân tử mRNA mã hóa cho hệ cellulase từ các loài nấm sợi sinh trưởng trên cơ chất cellulose và trên lactose nhưng không phát hiện trên

môi trường có cơ chất là glucose Ở T.reesei, các thành phần chính của hệ cellulase

(CBHI, CBHII, EGI, EGII) được biểu hiện đồng thời trong các điều kiện cảm ứng khác nhau (Fowler và Brown 1992; Penttila 1993) Trong đó, mức độ mRNA mã hóa cho các thành phần khác ở trạng thái ổn định Theo Gritzali và Brown (1979), tỷ lệ enzyme CBHII cao nhất (chiếm khoảng 50 %) trong hỗn hợp cellulase được tiết ra bởi

Các nguồn carbon khác như: glucose, cellobiose, acetat, citrate, oxalate, succinat

và những sản phẩm trung gian của chu trình krebs, nếu trong môi trường có nồng độ rất ít thì có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển và tạo ra enzyme, nhưng nếu nồng

độ cao có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cellulase Glycerin chỉ có tác dụng kích thích vi sinh vật sinh trưởng và phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme

Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và ctv (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập

từ bể ủ rác thải là glucose và CMC

Theo Acharya và ctv (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho các chủng

Asp.niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và ctv (2003), chủng Asp.flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng

hợp cellulase khi sử dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cưa được xem là nguồn cơ chất tối ưu

 Nguồn nitơ

Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất rõ rệt đến việc tạo thành cellulase ở nấm Theo Sin và Sinden (1951) Khi sử dụng hết 1 g nitơ nhiều vi sinh vật phân giải cellulose sẽ phân giải được khoảng 24 – 25 g cellulose

Trong môi trường nuôi cấy, các muối amon làm acid hóa môi trường nên nó ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme cellulase mà thậm chí còn ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme và có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành

Nitrat là nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase còn cao ngô kích thích sinh ra exoglucanase I (CBHI) và exoglucanase II (CBH II) Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự có mặt các acid amin, các nguyên tố khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác

Nghiên cứu của Narasimha và ctv (2006) cho thấy, các chủng Asp.niger có thể sử

dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như: urea, peptone, ammonium nitrate Trong

đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này

Nguồn nitrogen là urea và bột đậu tương ảnh hưởng mạnh mẽ tới quá trình

tổng hợp cellulase của chủng Asp.niger NRRL-363 (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003); Acharya và ctv (2008) khi nghiên cứu trên chủng Asp.niger cho thấy

peptone, ammonium sulfate và urea là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng

Asp.niger sinh tổng hợp cellulase Ở một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt nguồn

Xuân et al., 2005) Bột đậu tương là nguồn nitrogen thích hợp cho chủng Penicillium

sp DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006)

 Các nguyên tố khoáng

Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng sinh tổng hợp cellulose của

vi sinh vật Trong đó Fe, Mn, Zn có tác dụng kích thích tạo thành enzyme cellulase ở nhiều chủng Nồng độ tối ưu của Zn là 1,11 – 2,2 mg/l, Fe là 2 – 10 mg/l, Mn là 3,4 – 27,2 mg/l

 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật Hoạt động của các loài vi sinh vật dựa trên sự chuyển hóa của hàng loạt các phản ứng theo những trình tự xác định Khi nhiệt độ tăng các phản ứng cũng tăng, nhưng khi nhiệt độ tăng quá một giới hạn nào đó thì tốc độ các phản ứng sẽ giảm

Các loài khác nhau thì có nhiệt độ họat động khác nhau, như Aspergillus niger, Trichoderma koningi phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25 – 30 oC, đối với các loài xạ

nhiều enzyme phân giải cellulose trên môi trường nuôi cấy chứa cellulose vi tinh thể (Avicel) và cao nấm men

Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50

C

Ở các chủng nấm mốc nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase nằm trong khoảng từ 28 - 50 °C (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Ojumu et al., 2003,

Narasimha et al., 2006, Omojasola and Jilani, 2008) Chủng Penicillium sp

DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase tối đa ở nhiệt độ 30 °C (Trịnh Đình Khá, 2006)

 pH ban đầu trong môi trường

pH của môi trường có ảnh hưởng không giống nhau đối với những loài vi sinh vật khác nhau Nhiều loài nấm phát triển và phân giải cellulose mạnh ở pH= 4 đến

pH= 6, Fusarium Oxysporum và Trichoderma Koningi có thể phát triển và phân giải

cellulose trong môi trường có pH= 1.8 - 2

pH thích hợp đối với các chủng vi khuẩn ưa ấm sinh tổng hợp cellulase là 6,5 - 7,0 và pH tối ưu là 7,0; còn các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt là 7,0 - 7,5 và pH tối ưu là

7,5 (Trần Đình Toại et al., 2008) Chủng Bacillus sinh tổng hợp mạnh nhất ở pH= 7,5

Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh trong môi trường có pH ban đầu là 8,0 (Tăng Thị Chính et al., 1999) Chủng xạ khuẩn

Actinomyces griseus lại thích hợp ở pH trung tính (Nguyễn Đức Lượng và Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999) Các chủng nấm Aspergillus lại thích hợp trong khoảng pH từ 4,5 -

6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999, Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani, 2008)

2.5 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BÁN RẮN THU NHẬN ENZYME

CELLULASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER

2.5.1 Định nghĩa

Lên men bán rắn là quá trình vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất trên cơ chất rắn (cám, trấu, bột bắp, các loại phụ phế phẩm nông nghiệp), được làm ẩm với nước nhưng không có dòng nước tự do (hàm lượng nước từ 30 – 70 00%), phụ thuộc vào khả năng hấp thụ nước của cỏ chất và thế nước tối thiểu cần cho sự sinh trưởng vi sinh vật

Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi Aspergillus niger sinh cellulase thường là bã

mía và cám mì Để môi trường không dính bết khi hấp chín người ta trộn thêm một lượng nhỏ (không quá 15 – 20 %) trấu nhỏ, mạt cưa,…và được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác, sau đó hấp chín và được thanh trùng bằng hơi nước nóng ở

C trong 35 – 48 giờ, trong phòng thoáng khí, vô trùng, có độ ẩm không khí 80 – 90 %

Để đảm bảo cho nấm mọc đều trên bề mặt môi trường và sử dụng được nhiều chất dinh dưỡng để sản sinh enzyme, lớp môi trường rắn cần phải mỏng, chiều dày chỉ khoảng 2 – 5 cm

2.6 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME

2.6.1 Tách chiết enzyme [9], [19]

Trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân, microxom, mitokondri,…) của tế bào Các phân tử enzyme không có khả năng đi xuyên qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó, có thể chiết rút enzyme nội bào trước hết là phải phá vỡ cấu trúc tế bào Có thể phá vỡ cấu trúc tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền với bột thủy tinh hoạt làm đồng hóa bằng các thiết bị đồng hóa) tác dụng của các dung môi hữu cơ (rượu butylic, aceton, glycerin, etyl-

acetate,…), của sóng siêu âm

Việc tách enzyme ra khỏi tế bào gặp rất nhiều khó khăn, do đó khi tách chúng phải hết sức lưu ý:

+ Enzyme có trong tế bào vi sinh vật với lượng nhỏ so với các thành phần khác

Do đó, việc tách và thu nhận thành phần nhỏ này là điều khó khăn

+ Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động bởi

các yếu tố bên ngoài

+ Enzyme là protein Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống protein enzyme

Do đó, việc tách protein – enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất định

Để tách chiết enzyme từ môi trường rắn người ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính và các dung dịch đệm thích hợp Trong đó nước được sử dụng rộng rãi và cho kết quả tốt nhất Cho môi trường nuôi cấy vào nước với tỉ lệ thích hợp

và khuấy đều trong một thời gian thích hợp Sau đó loại bỏ cặn, lấy dịch trong chứa enzyme hòa tan bằng phương pháp lọc và ly tâm

Nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95 % và trong dịch chiết không chứa các hợp chất không tan Nước thường dùng để chiết có nhiệt độ 25 – 28 % Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10-15 % chất khô hòa tan và được

C

Các enzyme được chuyển từ tế bào vào nước do sự chênh lệch nồng độ Dịch khếch tán hay dịch tách enzyme được cô đặc dưới áp suất thấp trong chân không sao

2.6.2 Làm sạch enzyme [9], [13]

Trong dịch chiết ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc kí (sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel

Phương pháp làm sạch enzyme sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là dùng dung môi hữu cơ Các dung môi hữu cơ (ethanol, acetol, isopropanol,…) làm giảm hằng số điện môi của môi trường Lực hút tỉnh điện tỉ lệ thuận với hằng số điện môi Vì vậy, các enzyme, các chất protein cũng như các chất có phân tử lượng thấp trong hệ dịch nước-dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống Tủa bằng cồn và aceton trong điều kiện lạnh cho kết quả tốt nhưng ở nhiệt độ thường làm biến tính enzyme, nên khi tủa phải giữ ở nhiệt độ lạnh Đồng thời, cần có một thể tích cồn và aceton rất lớn, do vậy chỉ thích hợp dùng trong phòng thí nghiệm

phải quy định cụ thể từng đối tượng sử dụng hoặc muốn sử dụng rộng rãi cần phải loại muối bằng cách thẩm tích qua màng bán thấm

Phương pháp tủa protein bằng điểm đẳng điện dựa trên nguyên tắc giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa về điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH= pI phân tử protein trung hòa về điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất là dễ kết tủa

Phương pháp sắc kí trao đổi ion dựa trên cơ sở trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc trong dung dịch đệm pha loãng và các tác nhân trao đổi ion, tác nhân trao đổi ion có thể là nhựa trao đổi ion

Ngày nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme Do đó, việc làm sạch enzyme thật sự chỉ có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng kết hợp với nhau, tạo ra phương pháp nối tiếp nhau một cách hài hòa nhất

2.7 GIỚI THIỆU VỀ SẮC KÝ LỌC GEL [14]

Các đại phân tử sinh học được tinh sạch bằng cách sử dụng các kỹ thuật sắc kí,

kỹ thuật này phân tách chúng theo sự khác biệt về các đặc tính của chúng

Bảng 2.2: Đặc tính và kỹ thuật của một số phương pháp tinh sạch enzyme

Sắc kí đảo phase Nhận biết sinh học (tính

2.7.1 Bản chất của phương pháp

Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân tử và phân tích định lượng tương tác phân tử

Hình 2.6: Tách các phân tử bằng lọc gel 2.7.2 Một số thông số vật lý của phương pháp

+ Giới hạn tách (exclution limit): là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel Ví dụ, giới hạn tách của G -50 có FR từ 1.500-30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel

+ Phạm vi tách (Fructionation range): thí dụ, sephadex G -50 có FR từ 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được phân tách dễ dàng bởi G -50

1.500-+ Độ ngậm nước (water regain): là trọng lượng nước mà 1 g bột gel khô hút

quanh hạt, do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột