THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME GLUCOSE OXIDASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger VỚI CÔNG SUẤT 300 TẤN NĂM

THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYMEGLUCOSE OXIDASE TỪ NẤM MỐC Aspergillusniger VỚI CÔNG SUẤT 300 TẤN NĂM Enzyme glucose oxidase (GOD)1.1.1. Giới thiệuNấm có khả năng sản xuất một loạt các enzyme khác nhau cho phép chúng sử dụngnhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng (Gouka et al., 1997). Trong số cácenzyme không thủy phân có nguồn gốc nấm, glucose oxidase (EC 1.1.3.4) đã cho thấycác ứng dụng công nghệ quy mô lớn kể từ đầu những năm 1950 (Fiedurek andGromada, 1997). Enzym GOD còn được gọi là βDglucose:oxygen 1oxidoreductasehay EC 1.1.3.4 (Ferri et al., 2011).Glucose oxidase bản thân nó không hoạt động, nhưng với sự hiện diện của những cơchất đặc trưng (Tongbu et al., 1996), enzyme được sử dụng để oxy hóa trực tiếp phân tửglucose hoặc oxygen. Các sản phẩm của phản ứng này là gluconic acid và hydrogen(Sandip et al., 2009, Nguyễn Đức Lượng, 2004, Phạm Thị Trân Châu và Phan TuấnNghĩa, 2006).

Enzyme này được sản xuất bởi một số loài nấm và côn trùng, và biểu hiện hoạtđộng kháng khuẩn khi có oxy và glucose (Wong et al., Apr 2008).

Enzyme glucose oxidase là một dimer gồm hai tiểu đơn vị giống hệt nhau, cả hai đềuđược mã hóa bởi cùng một gen, cấu trúc 3D đã được làm sáng tỏ Trung tâm hoạt độngnơi glucose liên kết là trong một ổ sâu Enzyme, giống như nhiều protein hoạt động bênngoài tế bào, được bao phủ bởi chuỗi carbohydrate

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của glucose oxidase 1.1.3 Cấu tạo

GOD là một protein lưỡng phân gồm hai tiểu đơn vị (monomer) giống nhau, trọnglượng phân tử 192.000 Dalton Mỗi tiểu đơn vị, cuộn vào trong hai miền protein(domain): một miền gắn với cơ chất, β-D-glucose, trong khi đó miền còn lại liên kếtkhông đồng hóa trị với flavin adenine dinucleotide (FAD), là tác nhân oxy hóa mạnh.FAD là thành phần phổ biến trong các phản ứng oxy hóa khử sinh học, với chức năngnhận và cho điện tử Trong glucose oxidase, FAD hoạt động như một chất nhận điện tử,làm cho nó bị khử thành FADH2, FADH2sau đó bị oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuốicùng, phân tử oxy sẽ bị khử thành hydrogen peroxide (H2O2) (Witt et al., 2000,Witteveen et al., 1992)

1.1.4 Cơ chế tác dụng

Glucose oxidase xúc tác quá trình oxi hóa của β-D-glucose thành D-glucono-δ-lactoneđồng thời xảy ra sự hình thành của hydrogen peroxide Trong sự hiện diện củaperoxidase (POD) và hydrogen peroxide (H2O2) tham gia vào một phản ứng thứ hai liênquan đến acid p-hydroxybenzoic và 4-aminoantipyrine với sự hình thành định lượng củamột quinoneimine phức hợp thuốc nhuộm được đo ở 510 nm

Các phản ứng có liên quan là:

Hình 1.3 Phản ứng liên quan khi hiện diện hydrogen peroxide (Bergmeyer et al., 1974)

Glucose oxidase từ khuôn mẫu đã được nghiên cứu bởi một số người nhà nghiên cứu.Enzyme xúc tác quá trình oxi hóa của β-D-glucose thành D-glucono-δ-lactone Đặctrưng cơ chất của nó đã được kiểm tra, và cho thấy nó cũng tác động lên2-deoxy-glucose, D-mannose, D-galactose và D-xylose

- Bộ cảm biến glucose để kiểm tra bệnh đái tháo đường

Những người bị đái tháo đường cần kiểm tra thường xuyên lượng glucose trong máu đểbiết được sự dao động lượng glucose có thể dẫn đến sự tăng đường huyết (lượngglucose trong máu cao) và sự giảm đường trong máu (lượng glucose trong máu thấp) để

kiểm soát căn bệnh Hiện tại, quá trình kiểm tra như thế được thực hiện bằng cách sửdụng mẫu máu trích từ ngón tay và máy đo xách tay vài lần một ngày Bộ cảm biếnđược sử dụng để đo lượng đường glucose trong máu GOD là một trong những enzyme

có thể được dùng trong bộ cảm biến Những bộ cảm biến làm việc bằng cách giữ lại vếtcủa lượng electron đi qua một enzyme khi nối nó với một điện cực và đo điện tích tổng

Bộ cảm biến được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: kiểm tra glucose cho sựlên men, phân tích nồng độ glucose trong thức uống không cồn, dùng cho kiểm tra máu

và huyết thanh, cảm biến sinh học nhiệt thu nhỏ dùng cho tất cả loại máu, cảm biếnglucose dùng cho tất cả loại máu, bộ cảm biến sinh học glucose cho huyết thanh từ máungười

- Pin sinh học

Pin sinh học là cần thiết khi muốn có nguồn năng lượng nhỏ để duy trì các quátrình hoạt động Pin sinh học chuyển năng lượng hóa sinh thành năng lượng điện sửdụng chất xúc tác sinh học Pin sinh học gồm bộ hai điện cực được điều chỉnh bởienzyme xúc tác sinh học để oxi hóa/khử cơ chất [20] Một kiểu pin sinh học sử dụngenzyme làm chất xúc tác sinh học ví dụ như GOD và microperoxidase-8 được sử dụngtrên anot và catot [20] Trên anôt GOD oxi hóa glucose tạo ra H2O2, nó đi qua lớpmàng xốp ngăn giữa hai điện cực và bị khử bởi enzyme microperoxidase-8 trực tiếpnhận điện tử từ thanh điện cực cacbon

- Phụ gia thực phẩm và thức uống

GOD được sử dụng thành công trong việc loại bỏ glucose dư và O2 trong thực phẩm và

đồ uống để kéo dài thời hạn sử dụng H2O2 tạo ra bởi phản ứng enzyme là chất khửtrùng tốt và có thể được loại bỏ sau đó bằng cách sử dụng enzyme thứ hai catalase(CAT) có thể chuyển H2O2 thành O2 và nước GOD/CAT được sử dụng để loại bỏglucose trong quá trình sản xuất bột trứng, tránh quá trình sẫm màu gây ra bởi phản ứngMaillard và sử dụng trong công nghiệp làm bánh để giúp cải thiện cảm quan cho ruộtbánh mỳ và bánh sừng bò GOD còn có thể được sử dụng để loại bỏ oxy của không khí

ở đầu chai đồ uống trước khi chúng được đóng kín Hệ thống GOD/CAT kiểm soát quátrình sẫm màu phi enzyme trong bảo quản và chế biến trái cây, purê Quá trình loại bỏoxy bởi hệ thống enzyme đem lại hiệu quả ổn định Thêm vào đó, GOD được sử dụng

để ngăn ngừa sự mất màu và vị cũng như để ổn định màu, vị trong bia, cá, đồ hộp và đồuống không cồn bằng cách loại bỏ oxy từ thực phẩm và đồ uống Ví dụ như, chúng được

sử dụng để giảm sự biến màu xảy ra trong rượu và mayonnaise Hệ thống enzymeGOD/CAT có thể làm chậm quá trình oxi hóa lipit trong mayonnaise giữ ở 50C và250C Trong mayonnaise có chứa dầu đậu tương nguyên chất, và đến một nửa dầu thựcvật thêm vào với dầu cá, hệ thống enzyme có chức năng loại bỏ oxy trong quá trình oxyhóa glucose, do đó làm giảm sự có mặt của oxy cho sự chuyển hóa lipit Năm 2006,Bonet đã nghiên cứu ảnh hưởng của GOD đến tính chất lưu biến bột nhào và chất lượngbánh mì và thấy rằng GOD có khả năng cải thiện bột nhào lúa mì và tính chất bánh mì.Tuy nhiên, mức độ enzyme thêm vào phải rất cẩn thận, vì có thể có những ảnh hưởngngược lại do thêm vào enzyme quá thừa.

- Sản xuất rượu độ cồn thấp

GOD được sử dụng trong công nghiệp sản xuất rượu, nó có thể làm giảm độ cồn củarượu nhờ loại bỏ glucose vì glucose tạo ra cồn Nhiều thí nghiệm được thực hiện vàngười ta nhận thấy quá trình xử lý trước nước quả nho với hệ enzyme GOD/CAT đểchuyển bớt glucose có trong dịch quả thành axit gluconic, quá trình này có thể làm giảm

độ cồn khoảng 2% Thêm vào đó, GOD còn có khả năng ức chế quá trình hỏng rượunhờ vào tác dụng diệt khuẩn của nó [20] GOD có khả năng sử dụng trong công nghiệprượu, nó làm giảm độ cồn của rượu nhờ loại bỏ glucose (bằng cách chuyển thànhδ-glucono-1,5-lactone), vì glucose có thể chuyển thành cồn Các thí nghiệm đã chỉ rarằng xử lý rượu bằng GOD có thể làm giảm độ cồn sinh ra khoảng 2% Thêm vào đó,GOD có thể ức chế quá trình hỏng rượu nhờ vào khả năng diệt khuẩn ảnh hưởng lên vikhuẩn axit axetic và vi khuẩn axit lactic trong suốt quá trình lên men

- Vệ sinh răng miệng

GOD cũng như lactoperoxidase có thể được sử dụng như chất chống vi khuẩn trong sảnphẩm chăm sóc răng miệng Khoang miệng chứa những loài Streptococci nhưStreptococci mutans, ảnh hưởng đáng kể làm phân hủy răng và có ở hầu hết mọi người.H2O2 tạo thành bởi hoạt động của GOD là chất diệt khuẩn hiệu quả Khả năng củaGOD tiêu diệt S mutans là nhờ có chuỗi kháng thể lớn

- Axit gluconic

GOD cũng được sử dụng trong thương mại để sản xuất axit gluconic nhờ quá trình thủyphân của δ-glucono-1,5-lactone, sản phẩm cuối cùng của xúc tác GOD Axit gluconicđược sử dụng như phụ gia thực phẩm hoạt động giống bộ điều chỉnh axit, trong dung

dịch khử trùng hay quá trình tẩy màu trong sản xuất thực phẩm và như muối trong hợpphần hóa học hay cấp thuốc Axit gluconic cũng được sử dụng như chất làm chua nhẹtrong thịt và công nghiệp da thuộc Nó còn được sử dụng trong công nghiệp xây dựngnhư phụ gia trong xi măng để tăng lực cản và sức bền dưới điều kiện thời tiết khắcnghiệt Nó xuất hiện tự nhiên trong mật ong, trái cây và rượu.

- Công nghiệp dệt

GOD có những ứng dụng trong công nghiệp dệt như tạo ra H2O2 để tẩy trắng Năm

2002, Tzanov đã cố định GOD liên kết cộng hóa trị trên chất nền nhôm oxit và kính chokết quả khôi phục cao Lượng H2O2 lớn nhất là 0.35 g/l và 0.24 g/l đạt được sau 450phút để GOD cố định trên chất nền kính và nhôm oxit một cách riêng biệt H2O2 tạothành được kiểm tra để tẩy trắng sợi bông dệt và nhận thấy phù hợp để tiêu chuẩn hóaquá trình tẩy màu Từ khi axit gluconic được sản xuất, người ta không sử dụng chất ổnđịnh khác Năm 2008, Opwis ứng dụng đồng thời GOD và peroxidase, ông bắt đầu vớiglucose như cơ chất cho GOD, H2O2 được tạo thành và được sử dụng ngay lập tức bởiPOD oxi hóa hợp chất màu trong bể nhuộm Những enzyme này được sử dụng trongquá trình khử màu và tẩy trắng của sợi tự nhiên trong công nghiệp dệt

1.1.6 Nguồn thu nhận

Trong tự nhiên enzym GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh

trường của nấm mốc, nhất là các loài Aspergillus niger, Penicillium notatum, P.

glaucum, P amagasakiense, P chrysogenum, P vitale và một số loài Penicillium khác

(Nguyễn Trọng Cẩn et al., 1998, Đặng Thị Thu et al., 2012, Fiedurek and Ilczuk, 1992).Nguồn vi sinh vật có khả năng sản xuất ra enzyme GOD tốt nhất là các chủng nấm mốc

Aspergillus niger, Penicillium glaucum và nấm men Saccharomyces cerevisiae Enzyme

GOD thu được dưới dạng enzyme nội bào (Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae) hay ngoại bào (Penicillium glaucum) được làm sạch với mức độ khác nhau, tùy theo

mục đích sử dụng (Trần Thị Châu, 2010)

Aspergillus niger được chứng minh lượng enzyme nội bào – enzyme liên kết với thành

tế bào cao (Kim et al., 2006), thuận lợi cho hiệu suất quá trình thu nhận và tinh sạch cao

Không những vậy, glucose oxidase từ Aspergillus niger, EC 1.1.3.4 khi phân tích chúng

cho hoạt tính đặc hiệu và phạm vi rộng (Frederick et al., 1990) Theo Jan Fiedurek và

Zdzislaw Ilczuk sử dụng chủng Aspergillus niger có những ưu điểm sau để sinh tổng

hợp enzyme GOD (Fiedurek and Ilczuk, 1992):

- Trong điều kiện thích hợp, Aspergillus niger có thể tạo ra các lượng enzyme với

- Các loài Aspergillus niger trong công nghiệp sản xuất protein hiệu quả, với số

lượng cao gấp nhiều lần so với trong tự nhiên

- Tính ổn định về mặt di truyền là khá cao Các biến đổi di truyền, và mối đe dọacủa sự lai giống hầu như không được nhắc đến

1.2 Nấm mốc Aspergillus niger

Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có các

loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có giá trị sử dụng trong

sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ… (Zambare, 2010)

Nấm Mốc – Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm

nông công nghiệp và ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới Van Tieghem là người

đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu

như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cốc, hạt bắp… Nó gây ra một căn bệnh được gọi

là nấm mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, đậu phộng, và làmột chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm (Wang et al., 2006)

Hình 1.4 Nấm mốc Aspergillus niger

Hiện nay, Aspergillus niger được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất enzyme

(điển hình như α – amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase ), trong côngnghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric,acid gluconic,…

1.2.1 *Phân loại

Giống Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu vào năm 1729 (Micheli, 1729) Năm 1901

Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn(Deuteromycotina) này (Wehmer, 1901) Raper and Fennell chỉ dùng một tên

Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần Như vậy Aspergillus niger có vị trí

phân loại như sau: giới Fungi, lớp Fungi imperfecti, bộ Moniliales, họ Aspergillaceae, loài Aspergillus niger (Raper and Fennell, 1965).

Hiện nay, nấm mốc – Aspergillus niger được phân loại như sau:

Giới (Kingdom): Fungi

Ngành (Phylum): Ascomycota

Lớp (Class): Eurotiomycetes

Bộ (Order): Eurotiales

Họ (Family): Trichocomaceae

Chi (Genus): Aspergillus

Loài (Species): Aspergillus niger

*Phân bố (Tieghem, 1867, Machlis, 1966)

Aspergillus niger phân bố nhiều trong tự nhiên như đất, xác bã thực vật, hoa quả,… vàđặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp Chúng là vi sinh vật hiếu khí sống hoại sinhhoặc ký sinh, không có khả năng quang hợp tạo chất hữu cơ mà sống nhờ khả năng hấpthụ các loại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ty

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cấu trúc vi thể: Bào tử dính dài trơn không màu hay nâu, thể bình 2 đáy, túi nấm tròn

đầu xòe Aspergillus niger sinh sản bằng hình thức bào tử dính không có túi bao bọc.

Cơ thể dạng sợi, gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi (lypha), hợp lại thành

hệ sợi nấm (mycelium) Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồmhai loại:

- Khuẩn ty dinh dưỡng: Khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thước nhỏ, màutrắng Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trường nuôi cấy đểhút dưỡng chất Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng

- Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn hơnkhuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt Khuẩn ty sinh sản hướng vào không khí đểlấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già

Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành cáchạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản hình thành cácbào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen (Trần Thanh Trúc, 2013)

Hình 1.5 Bào tử của Aspergillus niger

Thành của khuẩn ty nấm có cấu tạo sợi, thành phần hóa học chính là chitin và glucan.

Cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc Cuống bào tử trơn nhẵn, trong suốt hoặc nâunhạt, cuống bào tử có phần phình to ở đầu tạo thành bọng lớn dạng hình cầu được gọi làbọng đỉnh giá hình cầu (vesicle), trên có mọc lên những thể bình là cơ quan tạo bào tửđính (conidi) và từ ngọn thể bình sinh ra các chuỗi bào tử đính (conidia) Loài

Aspergillus niger được phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử

đính màu đen (Raper and Fennell, 1965)

1.2.3 Đặc điểm sinh học

Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6ᴼC – 8ᴼC và tối đa là 45ᴼC –

47ᴼC, tối ưu ở 28ᴼC – 35ᴼC, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23% Nó chỉ sinhtrưởng và phát triển khi có mặt O2 ở pH tối ưu là 4 – 6.5, cũng có những chủng

Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2 Sự thay đổi pH của môi trường nuôi cấy từ 3

đến 6.5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus niger (Hoàng Bá Thanh Hải,

2010)

Trên môi trường thạch Czapek, Aspergillus niger mọc thưa, đường kính khuẩn lạc khoảng 4cm Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn lạc Aspergillus

niger mọc tốt và to hơn, đạt đường kính trung bình khoảng 6 cm Môi trường thạch

malt, so với trên môi trường thạch Czapek – cao nấm men, cho kết quả khuẩn lạc mọctốt nhưng không to (Diba et al., 2007)

Dưới kính hiển vi nấm Aspergillus niger có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử

đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo bọnghình cầu 5-6 x 20-30 µm, đôi khi 6-10 x 60-70 µm Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhấthình tam giác cân ngược, lớp thứ 2 hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, có gainhọn, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4-5 µm (Học Viện Quân Y, 2008)

Khả năng lên men đường: Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường

đơn và đường đôi như: glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose Đối với

các loại đường như galactose, sorbose và lactose, Aspergillus niger cho kết quả đồng

hóa ở mức độ kém hơn (Rubio and Navarro, 2006, Petruccioli and Federici, 1993)

1.2.4 Hình thức sinh sản

Aspergillus niger có thể sinh sản theo hai hình thức chính:

- Sinh sản sinh dưỡng: từ một đoạn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát triển thành một hệsợi nấm Khuẩn ty của nấm mốc có thể lẫn vào bụi, không khí bay đi khắp nơi, gặp điềukiện thuận lợi sẽ nhanh chóng phát triển thành khuẩn lạc mới (Samson et al., 1995,Machlis, 1966)

- Sinh sản vô tính: Aspergillus niger sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidium).

Hầu như các bào tử trần là các bào tử ngoại sinh, nghĩa là được hình thành ở bên ngoài

tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell) Các bào tử này sinh ra trực tiếp trên khuẩn

ty hoặc đặc biệt là cuống bào tử trần (conidiophone) (Alexopoulos and Mims, 1979,Samson et al., 1995)

1.2.5 Điều kiện sinh trưởng

1.2.5.1 Nguồn carbon

Trong suốt quá trình lên men, nguồn cacbon không chỉ đóng vai trò như thành phầnchính để xây dựng vật liệu tế bào mà còn được sử dụng trong quá trình tổng hợppolysaccharide và đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào Tỷ lệ cacbonđược chuyển hóa có thể ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối hay sản phẩm chuyểnhóa (chính hoặc phụ) Lượng đường chuyển hóa càng nhanh sẽ giúp tế tào phát triển

càng nhanh, kết hợp với sự tạo thành lượng lớn các sản phẩm liên quan hay các chấtchuyển hóa chính.

Năm 1995, Hatzinikolaou và Macris đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cacbon

khác nhau đến sự phát triển và sinh tổng hợp GOD của A niger Mặc dù nấm mốc A.

niger phát triển trên tất cả các nguồn cacbon mà họ đã kiểm tra, nhưng enzyme GOD

chỉ thể hiện hoạt tính cao khi sử dụng các nguồn glucose, saccharose và rỉ đường Hơnnữa, glucose (ở dạng tinh khiết hoặc là sản phẩm thuỷ phân saccharose bởi invertase) làtác nhân cảm ứng chính cho sự phiên mã gen của enzyme GOD Năm 2001, Kona đã sửdụng saccharose như nguồn cacbon chính khi sử dụng nguồn dinh dưỡng thương mại có

chứa nước ngâm bắp để thực hiện lên men cho A niger Năm 1960, Kusai nhận thấy saccharose là nguồn carbon tốt nhất cho P amagasakiense sản xuất GOD Dù sao, nếu

pH của môi trường phát triển được duy trì trong suốt quá trình nuôi thì glucose là nguồncacbon được lựa chọn

1.2.5.2 Nguồn nitơ

Nitơ vô cơ bao gồm khí amoniac, muối amoni hoặc nitrate Amoniac được sử dụng đểđiều chỉnh pH Muối amoni như amoni sulphate thường tạo môi trường axit khi vi sinhvật sử sụng ion NH4+ và giải phóng ra axit tự do Mặt khác, nitrate thường gây rakhuynh hướng kiềm hoá khi chúng được chuyển hóa Amoni nitrate trước hết sẽ gây rakhuynh hướng axit khi ion amoni được sử dụng Khi các ion amoni cạn kiệt, nitrat sẽđược sử dụng như nguồn nitơ thay thế và tạo ra môi trường kiềm Năm 1995,Hatzinikolaou và Macris nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến sự

phát triển và hoạt tính tổng của GOD từ A niger nuôi trênnguồn carbon duy nhất là

saccharose và rỉ đường Họ nhận thấy nồng độ peptone có ảnh hưởng rõ ràng đến toàn

bộ quá trình sản xuất GOD Với saccharose và rỉ đường làm nguồn cacbon, hoạt tínhcực đại của GOD đạt được lần lượt tại 1÷2% và 0.2÷0.3% peptone Năm 2001, Konakhảo sát ảnh hưởng của nước ngâm bắp là nguồn dinh dưỡng duy nhất cho sản xuất

GOD từ A niger và nhận thấy hoạt tính của GOD tăng lên từ 550 Uml− 1 đến 640

Uml− 1, trong khi đó các nguồn nitơ khác không thể cải thiện thêm khả năng tổng hợpGOD.

1.2.5.3 Canxi cacbonat (CaCO3) - tác nhân cảm ứng

Năm 1995, Petruccioli nhận thấy việc bổ sung của CaCO3 vào môi trường phát triểntrong bình tam giác và trong thùng lên men sẽ ngăn cản pH giảm xuống trong suốt quátrình nuôi, điều này là cần thiết khi tối ưu hóa quá trình sản xuất GOD Năm 1988,Rogalski cho thấy sự tổng hợp của GOD rất nhạy cảm bởi sự tăng lên của nồng độCaCO3 (0÷4,5%) ứng với hoạt tính cực đại tăng lên gần 3,5% Hatzinikolaou và Macris

cho rằng CaCO3 gây cảm ứng mạnh trong quá trình sinh tổng hợp GOD của A niger và

đã chứng minh nó là cần thiết cho quá trình sản xuất Năm 1996, Hatzinikolaou đã nuôi

A niger sử dụng môi trường nuôi tối ưu của Rogalski và chứng minh khả năng cảm ứng

của CaCO3 khi sản xuất GOD (tối ưu 4%), nó cũng duy trì pH của môi trường nuôitrong khoảng 6,5÷6,8 Người ta nhận thấy hoạt tính của enzyme glucolytic vàglucose-6-phosphate isomerase là cao hơn trong môi trường phát triển không cóCaCO3, trong khi đó GOD và catalase (CAT) là khá thấp Sự có mặt của CaCO3 sẽ làmtăng hoạt tính của GOD và CAT đồng thời hoạt tính của glucose-6-phosphate isomerasegiảm xuống Việc thêm CaCO3 vào môi trường phát triển có thể gây ra sự chuyển hóa

từ phân hủy glucose đến chu trình pentose phosphate do đó làm tăng lên hoạt tính củaGOD CaCO3 vào môi trường phát triển gây ra những thay đổi về hoạt tính của GOD,CAT, 6-phosphofructokinase (6-PFK) và glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-PDH) 6-PFK là enzyme điều khiển chủ yếu chu trình Embden-Meyerhof-Parnas(EMP) trong hầu hết các tế bào sống Hơn nữa năm 2001, Liu cho thấy những tế bàophát triển trong môi trường không có CaCO3 tạo ra mức độ cao của 6-PFK và số lượngthấp của G-6-PDH, GOD và CAT Việc thêm CaCO3 vào môi trường phát triển làm tăng

sự tạo thành GOD và CAT, và làm giảm sự sự tổng hợp của 6-PFK Do đó, quan sát này

có thể chỉ ra rằng CaCO3 gắn liền với sự chuyển hóa từ chu trình phân hủy đườngglucose (EMP) đến quá trình oxi hóa trực tiếp glucose bởi GOD

1.2.5.4 Thành phần môi trường khác

Nồng độ GOD trong A niger có thể được tăng lên bởi các loại hydrocarbon khác nhautrong suốt quá trình nuôi Năm 1994, Li và Chen cho rằng có một sự tăng lên cực đạihoạt tính GOD nội bào 43%, 110% và 31% khi thêm vào riêng từng loại n-dodecane,n-hexadecane và dầu đậu nành Điều này được cho là do sự tăng lên của hiệu quả tổnghợp enzyme trong tế bào bởi n-dodecane and n-hexadecane và sự tăng lên của sinh khốivới việc thêm vào dầu đậu nành Năm 1996, Fiedurek nghiên cứu ảnh hưởng của thànhphần môi trường khác nhau và chất ức chế chuyển hóa của quá trình sản xuất GODtrong A niger, và nhận thấy thay thế ammonium phosphate với natri nitrate trong môitrường muối cơ bản làm tăng đáng kể hoạt tính GOD đến 269,6% Hơn nữa, hoạt tínhGOD nội bào tăng đến 68,3% trong sự có mặt của natri orthovanadate (1 mM) và hoạttính GOD ngoại bào tăng trong sự có mặt của hematin (1 mM), choline (40 mM) vàTween 80 (0,1%) Sự tăng lên của hoạt tính GOD ngoại bào thu được trong khoảng31,4÷53,9%.

1.2.5.5 Ảnh hưởng của thông khí và khuấy trộn

Sự di chuyển khí-lỏng là nhân tố giới hạn trong quá trình lên men hiếu khí Một trongnhững nguyên nhân chính là do tính hòa tan thấp của oxi trong môi trường lên men khi

so sánh với tính hòa tan của nguồn cacbon, nitơ và các dinh dưỡng khác Sự cung cấpoxi càng trở ngại hơn trong môi trường nhớt, nơi có nồng độ tế bào cao và thường thấytrong quá trình lên men của nấm Vì vậy thông khí và khuấy trộn là hai nhân tố quantrọng cho quá trình lên men hiếu khí Sự thông khí của môi trường phát triển hiếu khíđáp ứng yêu cầu cung cấp oxi cũng như loại bỏ khí thải ra Oxi cung cấp cho sự pháttriển và sản xuất trong quá trình nuôi nấm được đảm bảo bởi sự thông khí và khuấytrộn

Năm 2000, Fiedurek và Gromada xác định phương pháp mới làm tăng oxi hòa tan trongmôi trường phát triển bằng cách thêm vào H2O2 như nguồn oxi duy nhất CAT được tạo

ra bởi vi sinh vật xúc tác phân hủy H2O2 thành nước và oxi tự do, trong trường hợp này,

H2O2 đóng vai trò như cả chất cho điện tử và chất nhận điện tử trong phản ứng Oxi

tinh khiết cũng được chứng minh là có lợi cho tốc độ tăng trưởng của A niger khi nuôi

chìm Tốc độ tăng trưởng tăng từ 61 mg trọng lượng nấm khô/100 ml/h (thông khí vớikhông khí) đến 95 mg trọng lượng nấm khô/100 ml/h (thông khí với oxi tinh khiết) So

sánh hoạt tính GOD nuôi ở 24h của A niger đã khuấy trộn lần lượt ở 460, 700 và 900

rpm cho thấy hoạt tính của quá trình nuôi đã khuấy trộn ở 700 rpm khoảng 20÷24% caohơn quá trình nuôi thông khí ở 460 rpm Tăng tốc độ máy khuấy trộn hơn nữa không cảithiện được tốc độ tăng trưởng hay sản xuất GOD Quá trình nuôi bão hòa oxi đạt đượchiệu suất nấm sợi cao hơn và sớm hơn 8h so với khi nuôi thông khí Tuy nhiên, sự tựphân cũng cao hơn trong môi trường nuôi đã bão hòa oxi Thêm vào đó, độ nhớt củamôi trường nuôi bão hòa oxi là khoảng 50% thấp hơn quá trình nuôi thông khí Thành tếbào của quá trình nuôi thông khí được nhận thấy dày hơn và bền hơn quá trình nuôi bãohòa oxi, do đó làm cho tế bào bão hòa oxi có sức chịu đựng kém hơn trong thiết bịkhuấy trộn Đồng thời hoạt tính GOD của quá trình nuôi bão hòa oxi gấp đôi của

quá trình nuôi thông khí Bất lợi duy nhất của việc sử dụng oxi tinh khiết là vấn đề kinh

tế khi thực hiện ở qui mô lớn

1.2.5.6 Ảnh hưởng của pH nuôi

Trong số các thông số vật lý, pH của môi trường phát triển đóng vai trò quan trọng bởi

nó gây ra sự thay đổi hình thái trong sinh vật và trong sự tiết enzyme pH là một yếu tốquan trọng có ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của vi sinh vật bởi nó ảnh hưởng đếntính hòa tan và hấp thu chất dinh dưỡng, hoạt tính enzyme, hình thái màng tế bào, sựhình thành sản phẩm và các phản ứng oxi hóa khử Sự thay đổi pH trong suốt quá trìnhphát triển của sinh vật cũng ảnh hưởng đến sự ổn định sản phẩm trong môi trường pHnuôi có thể có những ảnh hưởng sâu sắc đến tốc độ sản xuất và tổng hợp enzyme pHthích hợp cho quá trình sản xuất GOD có thể khác nhau do sự tối ưu quá trình phát triển.Hầu hết các chủng thương mại đã sử dụng cho sản xuất GOD có pH tối ưu giữa 6,0 và

7,0 thuận lợi cho tăng trưởng và sản xuất enzyme Trong nhiều quá trình, một số thànhphần môi trường như CaCO3 và các phosphate khác có khả năng đệm thì không cầnthiết phải điều chỉnh pH.

1.2.5.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ tăng trưởng

Nhiệt độ bên trong của vi sinh vật phải cân bằng với môi trường của nó vì hoạt động visinh vật rất nhạy cảm với nhiệt độ môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trìnhsản xuất GOD có liên quan đến sự tăng trưởng của vi sinh vật Trong số các loại nấm,hầu hết các nghiên cứu sản xuất GOD được thực hiện với nấm sợi trong vùng nhiệt độ

từ 25÷37°C Hiệu suất tối ưu của GOD đạt được ở 27÷37°C cho A niger Năm 1995,

Hatzinikolaou và Macris đã khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tăng trưởng đến toàn bộquá trình sản xuất GOD ở 22,5°C đến 32°C, và nhận thấy 27,5°C là nhiệt độ tối ưu

CHƯƠNG 2 PHÂN TÍCH, LỰA CHỌN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

CÔNG NGHỆ

2.1 Quy trình sản xuất

Quy trình sản xuất enzyme GOD được đề xuất theo hình 2.1:

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất glucose oxidase từ Aspergillus niger

2.2 Thuyết minh quy trình

2.2.1 Chuẩn bị môi trường

2.2.1.1 Nhân giống

Mục đích: Kích hoạt giống gốc và tạo điều kiện cho vi sinh vật thích nghi với môitrường lên men sản xuất trên quy mô công nghiệp, đồng thởi tạo đủ lượng giống để sảnxuất

Cách tiến hành: Giống được giữ ở trạng thái hoạt động trên các ống thạch nghiêngpotato dextrose agar (PDA) bằng cách cấy chuyền mỗi tháng một lần và bảo quản ở 4oC.Nuôi cấy lắc bào tử giống khoảng 5 – 6 ngày tuổi trên môi trường nhân giống (Bảng2.2.) pH được điều chỉnh về 5.5 với HCl 1N hoặc NaOH 1N trước khi hấp khử trùng.Sau khi làm nguội, giống được cấy và tăng sinh trong 24h trên máy lắc ở 30oC và 225vòng/phút (Hatzinikolaou and Macris, 1995)

Bảng 2.1 Thành phần môi trường PDA

* Dịch chiết từ 200g khoai tây có thể thay thế bằng 4g bột chiết khoai tây

Môi trường PDA - Potato Dextrose Agar - dành cho nấm và vi khuẩn - CHỦNG VI

SINH VẬT CHUẨN ATCC (chungvisinh.com) Bảng 2.2 Thành phần môi trường nhân giống (Hatzinikolaou and Macris, 1995)

KH2PO4 0.2

2.2.1.2 Môi trường lên men sản xuất enzyme

Theo Hatzinikolaou và Macris, các nguồn carbon được sử dụng trong quá trình sản xuất

glucose oxidase từ A niger chủ yếu là glucose và ở mức độ thấp hơn là sucrose Việc sử

dụng các nguồn carbon rẻ hơn dường như rất cần thiết cho việc cải thiện vấn đề kinh tếcủa quá trình (Hatzinikolaou and Macris, 1995) Những chất hoặc môi trường thươngmại này bao gồm whey váng sữa phô mai (cheese whey permeate), rượu ngô dốc (Cornsteep liquor – CSL) và mật rỉ (Kona et al., 2001) Sự sụt giảm chi phí môi trường chothấy CSL là một nguyên liệu hiệu quả cho quá trình lên men CSL là một nguồn dinhdưỡng phong phú chứa các vitamin, khoáng chất và carbohydrate (Formanek, 1998) Cóthể xác định sự kết hợp dẫn đến việc sử dụng mật rỉ như là nguồn carbon tốt nhất vàtăng cường hoạt động của enzyme khoảng 40 lần (Hatzinikolaou and Macris, 1995).Theo Bankar và cộng sự, hoạt tính glucose oxidase tăng đáng kể 28.93 lần (từ 0.00993đến 0.29 U/mL) với môi trường bổ sung CaCO3(Bankar et al., 2008) Theo Liu và cộng

sự, CaCO3 cho thấy có ảnh hưởng cảm ứng mạnh mẽ đến sự sinh tổng hợp enzyme vàcần thiết cho sự cảm ứng của enzyme GOD (Liu et al., 2001) Trong quá trình tổng hợp

GOD từ nấm mốc A niger, muối canxi cacbonat có tác dụng kích thích quá trình sinh

tổng hợp cá enzyme GOD và catalase trong khi canxi clorua lại có tác dụng kìm hãm(Lu et al., 1996, Hamid et al., 2003)

Do đó, môi trường lên men sản xuất enzyme glucose oxidase từ nấm mốc A niger được

đề xuất theo bảng 2.3

Bảng 2.3 Thành phần môi trường lên men (A.R et al., 2007)

Mục đích: Làm nguội gần đến nhiệt độ lên men nhằm tạo điều kiện thích hợp về mặtnhiệt độ cho vi sinh vật phát triển.

Lưu ý: Thời gian thực hiện quá trình này không nên kéo dài để tránh bị nhiễm vi sinh

Hình thức và phương thức lên men: GOD có thể được tổng hợp bằng hình thức lên menchìm từ nguồn carbon như glucose, sucrose, tinh bột và một số chất dinh dưỡng với sự

có mặt của O2bởi các chủng nấm mốc hoặc nấm men (Nguyễn Trọng Cẩn et al., 1998,Thành et al., 2005, Lê Ngọc Tú et al., 2004) Hình thức lên men này cũng được áp dụngrộng rãi trong sản xuất glucose oxidase công nghiệp hiện nay Đa số trong các nghiêncứu và công nghiệp, người ta sử dụng phương thức lên men gián đoạn để sản xuất

enzyme GOD (A.R et al., 2007, Liu et al., 2001, Liu et al., 2003, Hatzinikolaou et al.,1996) Ngoài ra, lên men gián đoạn có khá nhiều ưu điểm như: thiết lập và vận hành quátrình đơn giản, thường dùng cho các phản ứng sử dụng enzyme dạng tự do và ảnhhưởng của việc tạp nhiễm là không lớn, các sản phẩm có giá trị cao đặc biệt là cùng mộtthiết bị có thể dùng cho nhiều giai đoạn phản ứng chuyển hóa các vật liệu khác nhau(Đặng Thị Thu et al., 2012) Từ đó, hình thức lên men chìm và phương thức lên men

gián đoạn được lựa chọn để sản xuất enzyme GOD từ nấm mốc A niger.

Thiết bị lên men: Nhiều nghiên cứu sử dụng bể lên men có cánh khuấy (stirred-tank

bioreactor) trong sản xuất glucose oxidase từ A niger (A.R et al., 2007, Liu et al., 2003,

Hatzinikolaou et al., 1996, Trần Thị Châu, 2010) Ngoài ra, trong thiết bị lên men có lắpđặt cánh khuấy có ưu điểm giúp vi sinh vật được phân bố đều, tăng diện tích tiếp xúcvới cơ chất và oxy từ đó tăng khả năng tạo sản phẩm Do đó, đề xuất lựa chọn thiết bịlên men có cánh khuấy

Hình 2.2.Mô hình thiết bị lên men sản xuất enzyme trong công nghiệp

Cách tiến hành: Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ khoảng 30oC, tiến hành cấygiống và lên men ở điều kiện: nhiệt độ 30oC, pH 5.5, silicone lỏng được sử dụng nhưchất phá bọt nếu cần (A.R et al., 2007) Theo Sandip B Bankar và cộng sự, hoạt tính

glucose oxidase tăng từ 0.29 đến 2.05 U/mL (7 lần) khi giảm thời gian nuôi cấy từ 96xuống 72h (Bankar et al., 2008) Do đó, lựa chọn thời gian lên men kéo dài 72h.

2.2.4 Lọc thu sinh khối

Mục đích: Lọc tách riêng sinh khối và dịch canh trường, loại bỏ dịch và thu sinh khối cóchứa enzyme

Thiết bị lọc: Lựa chọn sử dụng phương pháp lọc chân không Đây là phương pháp lọcđược ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học cóhoạt tính Trong đó, lọc chân không quay (rotary vacuum filter) được sử dụng nhiều hơn

cả (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Máy lọc chân không thùng quay được ứng dụng để táchsinh khối vi sinh vật khỏi dung dịch canh trường và để lọc huyền phù có cấu trúc củacác thể vẩn rắn (cấu trúc sợi, keo hay không định hình) (Lê Văn Hoàng, 2007)

Cấu tạo thiết bị lọc chân không thùng quay (Lê Văn Hoàng, 2007):

Thùng quay được phân chia ra thành một số khoang mà một vòng các khoang này trựctiếp qua bốn vùng, là những vùng cơ bản trong thiết bị lọc chân không dạng thùng quay:

- Vùng I (130 149÷ oC): lọc dưới chân không xảy qua lớp trên thùng và đồng thờichất cặn nằm trên đó

- Vùng II (54 55÷ oC): cặn được sấy khô do đó bị hút vào, không khí mang ẩm từchất cặn

- Vùng III (90 100÷ oC): tiến hành rửa chất cặn bằng xối nước hoặc dung dịch rửakhác

- Vùng IV (85 55÷ oC): không khí được vào bên trong địa phẩn để tiến hành thổi vàlàm rời chất cặn, tiến hành làm sạch bộ lọc khỏi chất cặn để khôi phục các tinh chất lọccủa nó

Các khoang của thùng quay được bao phủ bới tấm đục lỗ và bị kéo căng bởi vật liệu lọc

Số vòng quay thay đổi nhịp nhàng trong giới hạn 0.13 đến 3 vòng/phút Tấm đáy dướithùng có máng chảy và máy khuấy lắc hoạt động nhờ bộ dẫn động riêng biệt có số vòngquay đến 0.3 vòng/phút

Máy lọc chân không thùng quay được thiết kế theo chế độ nạp liệu đến 1/3 và 2/3 đườngkính, phụ thuộc vào tính lắng đọng của huyền phù Góc nạp liệu tối ưu 130 149÷ o

Hệ tạo chân không gồm bơm chân không, các thùng chứa phần lọc, nước rửa và bộ thuhồi Bộ lọc được chế tạo bằng thép không rỉ, chất dẻo và các vật liệu được bọc cao su,cho nên có thể ứng dụng để lọc các huyền phù có tính ăn mòn ở nhiệt độ từ 0 đến 50oC

Hình 2.3 Thiết bị ly tâm dạng thùng quay

Cách tiến hành: Canh trường sau lên men được bơm vào thiết bị lọc Thu sinh khối chứaenzyme và loại bỏ dịch canh trường Sinh khối sau lọc nằm lơ lửng trong đệmphosphate 0.1 M (pH 6) (Anjum Zia et al., 2007)

Lưu ý: Nếu CaCO3 được thêm vào môi trường, dịch sau lên men được acid hóa về pH2.5 với HCl 4N trước khi lọc để chuyển hóa CaCO3 không tan thành CaCl2 hòa tan(A.R et al., 2007)

2.2.5 Phá vỡ tế bào

Mục đích: Thu nhận enzyme GOD nội bào thô

Thiết bị: Lựa chọn máy đồng hóa áp lực cao

Nguyên lý: Dựa vào gradient áp suất đột ngột, sự nhiễu loạn cao, sự tạo bọt cũng nhưlực cắt mạnh được kích thích dưới sự giảm áp suất mạnh của huyền phù bùn nén cao(lên đến 900 bar) Trong quá trình này, hạt bùn và màng tế bào vỡ giải phóng các chấtnội bào (Guangyin and Youcai, 2017)

Cách tiến hành: Hệ sợi nấm bị phá vỡ sử dụng máy đồng hóa áp lực cao hoạt động ở ápsuất 950 bar (Hatzinikolaou et al., 1996)

Hình 2.4 Thiết bị đồng hóa áp lực cao 2.2.6 Ly tâm thu dịch

Mục đích: Tách bỏ phần không tan, thu phần dịch lỏng chứa enzyme GOD thô

Nguyên tắc: Ly tâm là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhaubằng cách quay chúng trong dung dịch quanh một trục (trong rôto máy ly tâm) ở tốc độcao (Stephenson, 2016) Khi huyền phù được quay với tốc độ hoặc số vòng quay mỗiphút nhất định (RPM), lực ly tâm làm cho các hạt chuyển động hoàn toàn khỏi trục Lựctác dụng lên các hạt (liên quan đến trọng lực) được gọi là lực ly tâm tương đối (RelativeCentrifuge Force – RCF) Các thành phần đậm đặc hơn của hỗn hợp di chuyển khỏi trụccủa máy ly tâm, trong khi các thành phần ít đậm đặc hơn của hỗn hợp di chuyển về phíatrục (Majekodunmi, 2015)

Thiết bị ly tâm: Mẫu ly tâm là hệ huyền phù và nấm mốc có kích thước khá lớn – đườngkính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm nên không cần

ly tâm ở tốc độ quá cao (Nguyễn Văn Bá et al., 2005) Bên cạnh đó, quá trình ly tâm xảy

ra ở quy mô công nghiệp với công suất lớn Thiết bị ly tâm dạng đĩa tuy tốc độ ly tâmkhông cao so với thiết bị ly tâm dạng ống nhưng mức độ phân ly cao, công suất lớn phùhợp với quy mô công nghiệp (Harrison et al., 2015) Do đó, lựa chọn thiết bị ly tâmdạng đĩa để thu dịch lỏng chứa glucose oxidase thô

Cấu tạo thiết bị ly tâm dạng đĩa: Máy ly tâm đĩa là một hệ thống các hình nón đảongược đồng tâm quay nhanh được đặt gần nhau để giảm thiểu thời gian thu giữ các hạt

hoặc chất lỏng dày đặc ở gia tốc không thứ nguyên tương đối cao Huyền phù đi vàotrục quay và bị đẩy xuống đáy đĩa quay Áp lực thúc đẩy huyền phù đi lên Chất lỏngnặng hơn được đẩy tới các lỗ ở cuối mỗi kênh đĩa cho đến khi nó đến rìa ngoài của đĩa.Chất lỏng nhẹ hơn chảy lên các kênh đĩa và ra khỏi máy ly tâm (Harrison et al., 2015).

Hình 2.5 Thiết bị ly tâm dạng đĩa

Cách tiến hành: Sau khi phá tế bào, tiến hành ly tâm với lực ly tâm 10000g trong 20phút ở nhiệt độ thấp (4oC – 10oC) để tránh hiện tượng biến tính của enzyme (Bhatti etal., 2006)

2.2.6 Kết tủa

Mục đích: Tách và tinh chế enzyme GOD

Nguyên tắc: Kết tủa bằng muối là một trong những cách phổ biến để tách protein Khảnăng hòa tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính hóa lý tự nhiên, pH, nhiệt

độ, nồng độ muối,… Phương pháp kết tủa bằng muối dựa trên cơ sở sự khác nhau vềkhả năng kết tủa protein ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hòa) xác định đểloại bỏ một phần protein tạp của dung dịch enzyme (Scopes, 1994)

Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 Vìloại muối này có độ hòa tan cao, rẻ tiền, cũng như có độ ion hóa cao Thêm vào đó, kếttủa thu được bằng phương pháp này ổn định, ít bị biến tính nhưng phải tiến hành quátrình loại muối Ở trạng thái bình thường, các nhóm mang điện tích trên bề mặt enzyme

sẽ liên kết với các phân tử nước bao quanh qua liên kết hydro tạo lớp áo nước quanhphân tử Khi thêm muối (NH4)2SO4vào với nồng độ cao, các phân tử muối sẽ phân lythành các ion, các ion này liên kết với các phân tử nước làm cho enzyme mất lớp áonước, liên kết lại với nhau và tủa xuống (Mukherjee and Banerjee, 2006) Các thiết bị

dùng trong quá trình tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thépkhông rỉ để tránh bị ăn mòn do nồng độ muối cao Ngoài ra, ở một chỉ số pH xác định,mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đó mà độ lớn của nó phụ thuộc vào sốlượng các nhóm điện tích dương và điện tích âm Kết quả là ở chỉ số nồng độ ion H+cốđịnh, các protein trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau Các phân tử proteinmang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dungdịch Do đó, pH của dịch nghiên cứu cũng ảnh hưởng đến quá trình kết tủa của enzymeGOD (Burgess and Deutscher, 2009).

Hình 2.6 Mô hình thiết bị kết tủa (Martinez et al., 2019)

Cách tiến hành: Tủa muối ammonium sulfate bão hòa ở 85% bão hòa tại pH 5, 0oC vàđược giữ qua đêm ở 4oC Theo Muhammad Anjum Zia và cộng sự cũng như H.N Bhatti

và cộng sự, ở 85% bão hòa của ammonium sulfate bão hòa sẽ cho hoạt tính enzyme caonhất (Bhatti et al., 2006, Anjum Zia et al., 2007) Ứng với độ bão hòa đó, theo ĐặngMinh Nhật, pH 5 là điều kiện tốt nhất để kết tủa enzyme bằng (NH4)2SO4(Đặng MinhNhật and Bùi Viết Cường, 2012)

2.2.7 Ly tâm thu tủa

Mục đích: Tách tủa enzyme

Thiết bị ly tâm: Lựa chọn sử dụng thiết bị ly tâm dạng đĩa vì thiết bị ly tâm dạng đĩa cómức độ phân ly cao và công suất lớn hơn so với thiết bị ly tâm dạng ống (Harrison et al.,2015), đồng thời quá trình ly tâm không yêu cầu tốc độ ly tâm quá cao

Cách tiến hành: Sau 24h kết tủa, tách tủa enzyme bằng cách ly tâm với lực ly tâm10.000g trong 30 phút (Bhatti et al., 2006) Để đảm bảo hoạt tính enzyme, quá trình lytâm thường diễn ra ở điều kiện nhiệt độ thấp (4oC – 10oC) Tủa thu được hòa tan trong

đệm phosphate 0.1 M (pH 6) với thể tích đúng bằng thể tích enzyme thô ban đầu (Bhatti

độ sản phẩm thấp và thời gian sấy ngắn cho phép sấy phun xử lý các vật liệu cực kỳnhạy cảm với nhiệt (Nath and Satpathy, 1998)

Nhanh chóng trong quá trình sấy, nhiệt độ của vật liệu sấy thấp, sản phẩm nhận được ởdạng bột có kích thước nhỏ không cần phải nghiền lại và có độ hòa tan lớn là ưu điểmcủa máy sấy phun mặc dù vẫn có một số nhược điểm như kích thước phòng sấy tươngđối lớn, sự phức tạp về cơ cấu phun, hệ thu hồi bụi và tháo dỡ sản phẩm Vì sấy quánhanh, nhiệt độ vật liệu trong suốt chu kỳ sấy không vượt quá nhiệt độ của ẩm bốc hơi(60 70÷ oC) và thấp hơn nhiều so với nhiệt độ của tác nhân sấy (Lê Văn Hoàng, 2007).Glucose oxidase có thể được sấy trong công nghiệp bằng phương pháp sấy phun (Nathand Satpathy, 1998)

Quá trình sấy phun có thể được mô tả bằng 3 giai đoạn chính: sương hóa (atomization),chuyển đổi giọt chất lỏng thành hạt (droplet-to-particle conversion) và thu thập hạt(particle collection) Theo hình 2.8, dung dịch được bơm vào máy phun (atomizer), chiadòng nhập liệu lỏng thành những giọt nhỏ, sau đó các giọt này được đẩy vào buồng khíkhô (drying chamber) nơi xảy ra sự bốc hơi ẩm dẫn đến hình thành các hạt khô, cuốicùng bằng cách sử dụng một thiết bị thích hợp các hạt khô được tách ra khỏi môi trườngsấy và sau đó được thu thập trong bể (Santos et al., 2017)

Theo Yamamoto và Sano, khi nồng độ sucrose tăng thì hoạt tính enzyme được giữ lạisau quá trình sấy tăng và ảnh hưởng của việc bổ sung dithiothreitol (DTT) ở nồng độ 2

mM là rất đáng chú ý (Yamamoto et al., 1985)

Hình 2.7 Sơ đồ biểu diễn cơ chế sấy phun.

(1) Sương hóa (Atomization) (2) Chuyển đổi giọt chất lỏng thành hạt

(Droplet-to-particle conversion) (3) Thu thập hạt (Particle collection) (Santos et al.,

2017)

Hình 2.8 Thiết bị sấy phun trong công nghiệp

Cách tiến hành: Dung dịch glucose oxidase sau khi kết tủa được đưa vào máy sấy phuncùng với chất trợ sấy, sấy đến khối lượng không đổi với điều kiện sấy: nhiệt độ khôngkhí (Tair= 70oC), tốc độ không khí (UA= 1.0 m/s) (Yamamoto et al., 1985)

Lưu ý: Nồng độ chất khô trong dung dịch đem đi sấy lớn hơn 10% (Lê Văn Hoàng,

2007)

2.2.9 Bao gói

Mục đích: Hoàn thiện sản phẩm, dễ dàng bảo quản và vận chuyển

Cách tiến hành: Sau quá trình sấy và thu nhận enzyme GOD dạng bột, tiến hành đónggói bằng thiết bị bao gói tự động với khối lượng định sẵn

Hình 2.9 Thiết bị bao gói trong công nghiệp

(nguồn:

https://www.hebeitech.com/Roll-Film-Auger-Multi-Lane-Sachet-Packing-Machine-Pow der-Packaging-Granule-Packing-Machine-China-Manufacture-pd90974226.html)

CHƯƠNG 3:TÍNH TOÁN CÂN BẰNG VẬT CHẤT

;;’3.1 Kế hoạch sản xuất

Thời gian nghỉ và làm việc trong 1 năm được thống kê theo bảng 3.1:

Bảng 3.1 Số ngày nghỉ và làm việc trong năm

Ngày Chiến thắng (ngày 30 tháng 4 dương lịch) 01 ngày

Ngày Quốc tế lao động (ngày 01 tháng 5 dương

Ngày Quốc khánh (ngày 02 tháng 9 dương lịch) 01 ngày

Ngày Giỗ Tổ Hùng Vương (ngày 10 tháng 3 âm

Ngày Chủ nhật và bảo trì máy móc, thiết bị 55 ngày

Thời gian làm việc 300 ngày

Công suất sản xuất enzyme GOD: 300 tấn/năm

Thời gian lên men một mẻ kéo dài 72h (mục 2.2.3)

Thời gian nghỉ giữa các mẻ: 12h

Tổng thời gian một mẻ: tmẻ = 72 + 12 = 84h Số mẻ sản xuất được trong một

𝑡𝑚ẻ = 300 ×2484 =

Công suất sản xuất enzyme trên mỗi mẻ: 3.5 tấn/mẻ = 3500

𝑐ô𝑛𝑔 𝑠𝑢ấ𝑡 𝑛ă𝑚

𝑠ố 𝑚ẻ = 30086 =

kg/mẻ

Theo Nguyễn Văn Mùi, chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm GOD loại IV dạng bột khô có

hoạt tính riêng khoảng 1.5 U/mg = 1500 U/g (Nguyễn Văn Mùi, 2005).

Tổng hoạt tính enzyme thu được sau một mẻ nuôi cấy:

(U)

1500 ×1000 ×3500 = 5 25 × 109

3.2 Tính toán cân bằng vật chất cho từng quá trình

Hiệu suất thu hồi của từng quá trình trong sản xuất enzyme GOD được thống kê theobảng 3.2:

Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi của các quá trình

Lọc chân không thu sinh khối 99% (Hatzinikolaou et al.,

1996)

Kết tủa 88% (Hatzinikolaou et al.,

1996)

3.2.1 Quá trình sấy phun

Lượng sản phẩm sau quá trình sấy: Msau sấy= 3500 kg/mẻ

Độ ẩm vật liệu trước quá trình sấy: x1= 90% (Yamamoto and Sano, 1992)

Độ ẩm vật liệu sau quá trình sấy: x2= 7% (Schutyser et al., 2012)

Lượng ẩm tách ra trong quá trình sấy: W

Theo Nguyễn Bin và cộng sự, phương trình vật liệu chung (3.1) và công thức tính lượng

ẩm bay hơi (3.2):

Mtrước sấy = Msau sấy+ W (3.1) (Nguyễn Bin et al., 2006b)

W = 𝑥1 − 𝑥 Mtrước sấy(3.2) (Nguyễn Bin và Cộng sự., 2006b)

2

100 − 𝑥 2 ×

W = 𝑥1 − 𝑥 (Msau sấy+ W) = (3500 + W)

2

100 − 𝑥

2 × 100 − 790 − 7 ×

W = 29050 kg/mẻ

Hiệu suất quá trình đạt 95% (Bảng 3.2) nên lượng sản phẩm trước khi sấy là:

Mtrước sấy= Msau sấy× 100 W = 3500 29050 = 32734.21 kg/mẻ

95 + × 10095 +Chất trợ sấy: 10% sucrose (Yamamoto et al., 1985)

Khối lượng sucrose bổ sung: Msucrose= 10%×Mtrước sấy = 10%×32734.21 =

3273.421 kg/mẻ

3.2.1 Quá trình ly tâm thu tủa

Hiệu suất quá trình đạt 90% (Bảng 3.2)

Lượng sản phẩm trước khi ly tâm:

Mtrước ly tâm= 32734.21× 10090 = 36371.34 kg/mẻ

Sau quá trình kết tủa thu được lượng sản phẩm 36371.34 kg bao gồm enzyme và lượngmuối đã bổ sung vào là Mammonium sulfate= 4156.53 kg (mục 3.2.3), khối lượng riêng củamuối (NH4)2SO4làρ = 1.77 g/cm3= 1.77 kg/L, khối lượng riêng của enzyme GOD

Hiệu suất của quá trình đạt 88% (Bảng 3.2)

Lượng sản phẩm trước khi kết tủa:

Mtrước kết tủa= 36371.34× 10088 = 41331.07 kg/mẻ

Enzyme GOD thương mại của Santa Cruz Biotechnology được sản xuất từ Aspergillus

niger có khối lượng riêng là:ρ = 1.00 g/cm3= 1000 kg/m3

𝐺𝑂𝐷

𝑡𝑟ướ𝑐 𝑘ế𝑡 𝑡ủ𝑎 ρ 𝐺𝑂𝐷

= 41331.071000

Với thể tích dung dịch trước khi kết tủa là 41.331 m 3, sử dụng phần mềm tính toánlượng muối ammonium sulfate “Ammonium Sulfate Calculator” để xác định lượng

muối cần thiết là 4156529.55 g = 4156.53 kg để có độ bão hòa 85% tại 0oC

Với hiệu suất quá trình đạt 88% nên lượng muối kết tủa được enzyme là:

Mammonium sulfate tủa= 4156.53×88% = 3657.75 kg

Khối lượng riêng của muối (NH4)2SO4là 1.77 g/cm3= 1.77 kg/L nên thể tích muối(NH4)2SO4kết tủa là: Vammonium sulfate tủa= 3657.751.77 = 2066.53 L

3.2.2 Quá trình ly tâm thu dịch

Hiệu suất quá trình đạt 87% (Bảng 3.2)

Lượng sản phẩm trước khi ly tâm:

Mtrước ly tâm= 41331.07× 10087 = 47506.98 kg/mẻ

Khối lượng riêng của sinh khối là:ρ = 1.1 g/cm3= 1100 kg/m3(Harrison et

sinh𝑠𝑖𝑛ℎ 𝑘ℎố𝑖 al., 2015) Do dung dịch trước ly tâm chỉ bao gồm sinh khối và đệm:

Vtrước ly tâm= 𝑀𝑡𝑟ướ𝑐 𝑙𝑦 𝑡â𝑚 = = 43.188 m 3 Quá trình phá vỡ tế bào

ρ sinh𝑠𝑖𝑛ℎ 𝑘ℎố𝑖

47506.98 1100Hiệu suất quá trình đạt 95% (Bảng 3.2)

Lượng sản phẩm trước khi phá vỡ tế bào:

Mtrước PVTB= 47506.98× 10095 = 50007.35 kg/mẻ

Khối lượng riêng của sinh khối là:ρ = 1.1 g/cm3= 1100 kg/m3(Harrison et

sinh𝑠𝑖𝑛ℎ 𝑘ℎố𝑖 al., 2015) Do dung dịch trước khi phá vỡ tế bào chỉ gồm lượng sinh khối sau lọc nằm lơlửng trong đệm:

𝑡𝑟ướ𝑐 𝑃𝑉𝑇𝐵 ρ

sinh𝑠𝑖𝑛ℎ 𝑘ℎố𝑖

50007.35

Quá trình lọc chân không thu sinh khối

Hiệu suất quá trình đạt 99% (Bảng 3.2)

Lượng sản phẩm trước khi lọc:

Mtrước lọc= 50007.35× 10099 = 50512.47 kg/mẻ Quá trình lên men

Giả sử hiệu suất quá trình lên men đạt 95%

Tổng hoạt tính enzyme thu được sau quá trình lên men:

1500×1000 × 50512 47 =7.58× 1010 (U) Như vậy, để đạt được công suất đặt ra là 300 tấn/năm, trong đó mỗi mẻ sản xuất được

3500 kg thì cần xây dựng quy trình sản xuất với tổng hoạt tính enzyme thu được sau quá trình lên men của một mẻ nuôi cấy là 7.58× 1010U.

- Nồng độ sinh khối của Aspergillus niger trong canh trường sau 72h nuôi cấy là:

Thể tích trước lên men: Vtrước lên men= Vmôi trường= 138× 10095 = 145 (m 3 )

Khối lượng sinh khối cần để đạt được hoạt tính 7.58× 1010U sau một mẻ lênmen là: Msinh khối= 7.58 ×1056122.4510 =1350618.157 (g)≈1.35 (tấn)

Bảng 3.3 Khối lượng và thể tích nguyên liệu cần dùng cho một năm

Thành phần Số lượng Số lượng cho một mẻ Số lượng cho một

Bể lên men có thể tích làm việc là: Vlàm việc= Vmôi trường + Vgiống cấy= 145 + 14.5 = 159.5

m 3 Chọn hao phí là 20% (Riet and Tramper, 1991b)

Thể tích bể lên men: Vbể= 𝑉𝑙à𝑚 𝑣𝑖ệ𝑐 199.375 (m3) 200 (m 3 )

80% = 159.580% = ≈ Chọn 2 bể lên men có thể tích 100 m3giống nhau

Theo Nguyễn Hoàng Lộc, thiết bị lên men có cánh khuấy được thiết kế với các yêu cầu(Nguyễn Hoàng Lộc, 2006b):

- Tỷ lệ chiều cao trên đường kính của bể lên men là 2/1 hoặc 3/1 và thường đượckhuấy bằng hai hoặc ba turbine khuấy (cánh khuấy) Trục cánh khuấy được gắn trên nắphoặc từ đáy của thùng bằng giá đỡ

- Tỷ lệ đường kính cánh khuấy (DI) trên đường kính của bể (DT) thường là từ 0.3 –0.4 Trong trường hợp thiết bị lên men có hai cánh khuấy, khoảng cách giữa cánh khuấythứ nhất với đáy bể và khoảng cách giữa hai cánh khuấy bằng 1.5 đường kính cánhkhuấy Khoảng cách này giảm xuống còn 1.0 so với đường kính cánh khuấy trongtrường hợp thiết bị lên men có ba cánh khuấy

- Bốn vách ngăn (baffles) cách đều nhau thường được thiết kế để ngăn cản sự hìnhthành dòng xoáy làm giảm hiệu suất pha trộn Chiều rộng vách ngăn thường bằng 1/10đường kính bể (tank)

- Trong trường hợp thiết bị lên men hiếu khí (aerobic fermenter), một bộ phun lỗđơn (single orifice sparger) hoặc một bộ phận phun vòng được sử dụng để sục khí chothiết bị lên men Bộ phận phun được đặt ở giữa cánh khuấy cuối cùng và đáy bể

- pH trong thiết bị lên men có thể được duy trì bằng cách dùng dung dịch đệmhoặc bộ điều chỉnh pH (pH controller).

- Nhiệt độ được điều chỉnh bằng hệ thống gia nhiệt và làm lạnh tự động

4.1.1 Bể lên men

Chọn tỷ lệ chiều cao (HT) : đường kính (DT) là 2 : 1 (HT/DT= 2) Công thức tính thể tích

𝑇 2 × 𝐻 𝑇

Chiều cao lưỡi cánh khuấy: Hs= 0.2× DI= 0.2×1.32 = 0.264 (m)

Tỷ lệ chiều rộng cánh khuấy và đường kính cánh khuấy loại turbine đĩa phẳng là 0.25

(Hooker et al., 1990) (W I = 0.25D I)

Chiều rộng cánh khuấy: WI= 0.25× DI= 0.25×1.32 = 0.33 (m)

Với chiều cao bể là 8 m, bể lên men sẽ được thiết kế gồm 2 cánh khuấy Theo NguyễnHoàng Lộc, trong trường hợp thiết bị lên men có hai cánh khuấy khoảng cách giữa cánhkhuấy thứ nhất với đáy bể và khoảng cách giữa hai cánh khuấy bằng 1.5 đường kínhcánh khuấy (mục 4.1) Vì vậy:

Khoảng cách giữa cánh khuấy thứ nhất với đáy bể và khoảng cách giữa hai cánhkhuấy là: 1.5× DI= 1.5×1.32 = 1.98 (m)≈2 (m)

4.1.3 Tốc độ cánh khuấy

Chọn loại cánh khuấy turbine 6 cánh Rushton Theo Klaas van’t Riet và Tramper,cánh khuấy turbine có giá trị Np (power number – hệ số công suất) cao hơn hầu hết cácloại cánh khuấy khác Điều này có nghĩa là nó sử dụng năng lượng tương đối nhiều hơn

Mô hình cho thấy năng lượng tiêu thụ tỷ lệ thuận với công suất bơm của cánh khuấy.Điều này có nghĩa là việc khuấy trộn quy mô lớn trong bể có cánh khuấy turbine sẽ tốthơn so với các cánh khuấy Np thấp hơn ở cùng tốc độ và đường kính cánh khuấy Vìcánh khuấy turbine có đầu vào công suất lớn hơn cánh khuấy có hệ số công suất thấphơn trong các điều kiện giống hệt nhau, nên cánh khuấy turbine là cánh khuấy được sửdụng rộng rãi nhất trong thiết bị lên men (Riet and Tramper, 1991c)

Giả sử bể hoạt động ở chế độ chảy xoáy hay chảy rối (Re > 10000), Np= 5.5 (Riet and

Tramper, 1991c)

Chọn P s /V = 10000 W/m 3(Riet and Tramper, 1991d)

Công suất cánh khuấy: Ps= 10000×100 = 1000000 (W) = 1 (MW)

Khối lượng riêng của canh trường: ρ = 1.03 × 10 3 kg/m 3 = 1030 kg/m 3 (Fujita et al.,1994)

Độ nhớt canh trường: η = 0.001428 kg/m.s = 0.001428 Pa.s (Fujita et al., 1994).

Ta có công thức: Ps= Np × ρ × N3×DI5(Riet and Tramper, 1991c)

Trong đó: Ps: Công suất cánh khuấy (W)

Np: Hệ số công suất: Khối lượng riêng của enzyme GOD trong canh trường (kg/m3)ρ

4.1.1 Tính toán tốc độ cung cấp O 2 (Oxygen Transfer Rate – OTR)

OTR trong bể được tính như sau: OTR = KLa (C*

OL– COL)

×

Trong đó: KLa: Hệ số truyền khối (s-1)

C*

OL: Nồng độ oxy trong pha lỏng cân bằng với pha khí (mg O2/L)

COL: Nồng độ oxy trong pha lỏng (mg O2/L)Quan hệ của KLa và một số thông số theo công thức thực nghiệm:

KLa = 2× 10-3× 𝑃𝑠

𝑉 𝑏ể

( )0.7× 𝑢

𝐺 0.2

Trong đó: 𝑢 : Vận tốc bọt khí (m/s) = 0.7 cm/s = 0.007 m/s (Trager et al.,

𝐺1989)

Hệ số truyền khối: KLa = 2× 10-3× 100000.7× 0 0070.2= 0.468 (s -1 )

Theo định luật Henry, C*

OL phụ thuộc vào áp suất riêng phần của oxy trong khí sử dụng(po) và độ hòa tan của oxy (Ho): C*

OL= po× Ho

Trong đó: po: áp suất riêng phần của oxy trong khí sử dụng = 0.21 atm (do sử

dụng khí trời để sục nên áp suất của khí là 1 atm, tỷ lệ oxy trong khí quyển là 21%)

Ho: độ hòa tan của oxy trong môi trường lên men được duy trì ở

30oC, áp suất 1 atm = 37.1 (mg O 2 /L) (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006a).

C*

OL= 0.21×37.1 = 7.791 (mg O 2 /L)

Giả sử C = 50%× C* (Riet and Tramper, 1991d)

Thông số tốc độ sử dụng oxy đặc trưng cho quá trình sinh trưởng của vi sinh vật trong

bể phản ứng có công thức tính như sau: OUR = qo× Xt

Trong đó: qo: tốc độ sử dụng O2riêng (mmol O2/gsinh khối khô.h) = 5.3 mmol O2/gsinh

khối khô.h (Paul et al., 1999)

Xt: nồng độ sinh khối trong canh trường sau một mẻ lên men (g/L) = 9.8 g/L(mục 3.2.7)

OUR = 5.3×10-3×32×9.8 = 1.662 (g/L.h)

4.1.3 Kết luận

OTR > OUR (6.563 > 1.6621) → Hệ thống cung cấp khí thiết kế có khả năng cung cấp

đủ lượng O2xuyên suốt quá trình lên men diễn ra trong bể

4.1.4 Kiểm tra hệ số ngập lụt

Ngập lụt là hiện tượng mà dòng khí chiếm ưu thế so với mô hình dòng chảy Ngập lụtxảy ra khi năng lượng được tiêu hao bởi không khí (Pg (W)) cao hơn năng lượng củacánh khuấy (Ps (W)) Klaas van’t Riet và Tramper kết luận rằng dữ liệu trong tài liệuphải thỏa mãn các tiêu chí sau thì kết quả mới được xem là thiết kế bể có cánh khuấy tốt(Riet and Tramper, 1991a):

(m/s) (4.1)ϑ

𝑡𝑖𝑝 > 1 5 − 2 5

Pg< Ps(W) hay 𝐹𝑔𝑠 (4.2)

𝑁 × 𝐷𝐼3 < 0 3× 𝑁

2 × 𝐷 𝐼 𝑔

Trong đó:ϑ : tốc độ đầu cánh khuấy = (Riet and Tramper, 1991e)

𝐼(m/s)

: lưu lượng thể tích khí tại áp suất cánh khuấy (m3/s) = 5

𝑔 = 0 3× 3.532

2 × 1.32 9.81 = 0 504

P g < P s

Thỏa mãn các tiêu chí để hiện tượng ngập lụt không xảy ra

4.2 Thiết bị lọc chân không

Chọn thiết bị lọc chân không dạng thùng quay LZGW-12

Bảng 4.1 Đặc tính kỹ thuật của thiết bị lọc chân không dạng thùng quay LZGW-12