Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc aspergillus niger

Mục đích của đề tài là xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH, nguồn cơ chất cảm ứng, hàm lượng đường bổ sung glucose, nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellu

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA NẤM MỐC

ASPERGILLUS NIGER

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

LÂM TUẤN KIỆT

LÊ HOÀNG THỤY ANH NHƯ

NĂM 2013

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA NẤM MỐC

Cảm tạ

Xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại học An Giang Ban chủ nhiệm khoa Nông nghiệp và tài nguyên thiên nhiên, Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện

để chúng em hoàn đề tài nghiên cứu khoa học

Hội đồng phản biện đã góp ý và bổ sung để đề tài của chúng em được hoàn thiện hơn về mặt lý thuyết tạo cơ sở thuận lợi cho tiến hành thí nghiêm

Ban quản trị thiết bị thí nghiệm trường Đại học An Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng các dụng cụ và thiết bị trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Cô Dương Thị Huỳnh Như và cô Đặng Thị Như Thủy đã tận tình hướng dẫn chúng em trong việc sử dụng các thiết bị

Đặc biệt là cô Lê Hoàng Bảo Ngọc đã luôn hỗ trợ rất nhiều cho chúng

em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học

Tóm lược

Đề tài “Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng

sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc Aspergillus niger” được tiến

hành tại phòng thí nghiệm Khoa Nông nghiệp – Tài nguyên thiên nhiên, trường Đại học An Giang Mục đích của đề tài là xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH, nguồn cơ chất cảm ứng, hàm lượng đường bổ sung (glucose), nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của

nấm mốc Aspergillus niger

Nghiên cứu được tiến hành trên 5 thí nghiệm:

- Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến

quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

- Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình

sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

- Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm lượng cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng

hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

- Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm

- Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tối ưu là 30 o C và 15 giờ

- pH môi trường nuôi cấy tối ưu là pH = 5

- Cơ chất và hàm lượng bổ sung tối ưu là rơm với tỷ lệ 10%

- Hàm lượng đường (glucose) bổ sung tối ưu với tỷ lệ là 0,1%

- Nguồn nitơ và hàm lượng bổ sung tối ưu là pepton với tỷ lệ là 0,1%

- Thành phần môi trường nuôi cấy cơ bản cuối cùng (trấu 56,25%, cám

43,75%), các thành phần khác bổ sung theo tỷ lệ % trên môi trường nuôi cấy

cơ bản (cám, trấu)

Mục lục

Cảm tạ i

Tóm lược ii

Mục lục iii

Danh sách bảng vii

Danh sách hình viii

Danh sách các chữ viết tắt x

Chương 1 Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Nội dung 2

Chương 2 Lược khảo tài liệu 4

2.1 Giới thiệu chung về enzyme 4

2.1.1 Khái niệm enzyme 4

2.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 4

2.1.2.1 Nhiệt độ 4

2.1.2.2 Nồng độ cơ chất 4

2.1.2.3 Độ pH 5

2.1.2.4 Các chất ức chế enzyme 5

2.2 Tổng quan về enzyme cellulase 5

2.2.1 Sơ lược về enzyme cellulase 5

2.2.2 Cơ chất cellulose 6

2.2.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase 8

2.2.4 Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose ) 9

2.3 Nấm sợi Aspergillus niger 10

2.3.1 Phân loại nấm Aspergillus niger 10

2.3.2 Đặc điểm cấu tạo 11

2.3.3 Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ Aspergillus niger 12

2.3.4 Nguồn phân lập 13

2.4 Giới thiệu thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Aspergillus niger 13

2.4.1 Cám 13

2.4.2 Trấu 14

2.4.3 Cơ chất cảm ứng 14

2.5 Kỹ thuật nuôi cấy 15

2.6 Các phương pháp thu nhận enzyme 15

2.6.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào 15

2.6.2 Phương pháp lọc 16

2.6.3 Chiết rút enzyme 16

2.7 Một số nghiên cứu về thu nhận enzyme cellulase 17

2.7.1 Nghiên cứu trong nước 17

2.7.2 Nghiên cứu ngoài nước 17

Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Phương tiện nghiên cứu 19

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.1.2 Nguyên liệu 19

3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 19

3.1.4 Hóa chất 19

3.2 Phương pháp tiến hành 20

3.2.1 Quy trình sản xuất 20

3.2.2 Giải thích quy trình 20

3.2.2.1 Sản xuất bột giống Aspergillus niger 20

3.2.2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 21

3.2.2.3 Trộn giống vi sinh vật 21

3.2.2.4 Nuôi cấy 21

3.2.2.5 Thu enzyme 21

3.3 Tiến hành thí nghiệm 22

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 22

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 23

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 24

3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 25

3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 26

Chương 4 Kết quả và thảo luận 28

4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 28

4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt

tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 29

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 31

4.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 32

4.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 33

Chương 5 Kết luận và khuyến nghị 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Khuyến nghị 36

Tài liệu tham khảo 37

Phụ chương A Phương pháp chuẩn bị thí nghiệm 40

1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 40

2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme endoglucanse (phương pháp DNS) (Whitaker, 2003) 40

2.1 Nguyên tắc 40

2.2 Chuẩn bị mẫu 40

2.2.1 Dung dịch CMC (1 %) 41

2.2.2 Pha hỗn hợp Na2CO3/NaHCO3 41

2.3 Chuẩn bị thuốc thử 41

2.4 Tiến hành 41

2.5 Tính kết quả 41

3 Xây dựng đường chuẩn glucose 42

4 Tạo pH thích hợp cho quá trình nuôi cấy nấm Aspergillus niger bằng dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) 43

Phụ chương B Một số hình ảnh thí nghiệm 44

Phụ chương C Kết quả phân tích thống kê 49

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 49

3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 50

3.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm lượng cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 51

3.3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc

Aspergillus niger 53

3.3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm

mốc Aspergillus niger 54

Danh sách bảng

Trang

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của cám 14

Bảng 2: Thành phần của nguyên liệu rơm, bã mía, mùn cưa 15

Bảng 3: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 23

Bảng 4: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 2 24

Bảng 5: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 3 25

Bảng 6: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 4 26

Bảng 7: Bố trí các nghiệm thức ở thí nghiệm 5 27

Bảng 8: Lượng cơ chất cho vào trong quá trình thí nghiệm 42

Bảng 9: Kết quả đo OD dựng đường chuẩn glucose 42

Bảng 10: Bảng pha dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) 43

Bảng 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến hoạt tính của enzyme cellulase 49

Bảng 12: Phân tích phương sai của Hoat tinh - TN1 49

Bảng 13: So sánh trung bình nghiệm thức - TN1 50

Bảng 14: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến enzyme cellulase 51

Bảng 15: Phân tích phương sai của Hoat tinh theo pH – TN2 51

Bảng 16: So sánh trung bình nghiệm thức - TN2 51

Bảng 17: Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm lượng cơ chất bổ sung đến hoạt tính enzyme cellulase 51

Bảng 18: Phân tích phương sai của Hoat tinh – Loại 3 tổng bình phương – TN3 52

Bảng 19: So sánh trung bình nghiệm thức – TN3 52

Bảng 20: So sánh trung bình nghiệm thức– Đối chứng_TN3 53

Bảng 21: Ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase 53

Bảng 22: Phân tích phương sai của Hoat tinh – Loại 3 tổng bình phương – TN4 53

Bảng 23: So sánh trung bình nghiệm thức – TN4 54

Bảng 24: Ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase 54

Bảng 25: Phân tích phương sai của Hoat tinh – Loại 3 tổng bình phương – TN5 55

Bảng 26: So sánh trung bình nghiệm thức – TN5 55

Bảng 27: So sánh trung bình nghiệm thức – Đối chứng_TN5 55

Danh sách hình

Trang

Hình 1: Cấu tạo phân tử cellulose 7

Hình 2: Cấu trúc của ligno-cellulose 7

Hình 3: Cấu trúc của CMC 8

Hình 4: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase 9

Hình 5: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase 9

Hình 6: Cơ chế hoạt động của β-D-glucoside glucohydrolase 9

Hình 7: Nấm Aspergillus niger 11

Hình 8: Cấu trúc tinh thể endoglucanase (EC.3.2.1.4) từ Aspergillus niger 13

Hình 9: Quy trình sản xuất chế phẩm enzym cellulase từ nấm Aspergillus niger 20

Hình 10: : Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 28

Hình 11: Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 30

Hình 12: : Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm lượng cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấyđến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 31

Hình 13: : Ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 32

Hình 14: Ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 34

Hình 15: Đường chuẩn glucose 43

Hình 16: Mẫu bột giống sau khi nuôi cấy 7 ngày 44

Hình 17: : Bột giống có mật độ bào tử 8,97.106 CFU /g bột bào tử 44

Hình 18: Mẫu nuôi cấy Aspergillus niger từ 13-24h 44

Hình 19: Mẫu nuôi cấy Aspergillus niger từ 38-48h 45

Hình 20: Dịch lọc enzyme thô 45

Hình 21: Enzyme sau khi ủ với CMC ở 400C trong 30 phút 46

Hình 22: Dung dịch Na2CO3/NaHCO3 46

Hình 23: Hỗn hợp enzyme và CMC sau khi cho dung dịch Na2CO3/NaHCO3 46

Hình 24: Hỗn hợp enzyme và CMC được xử lý ở 1000C 47

Hình 25: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS) trước khi đun 47 Hình 26: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS) sau khi đun ở 1000C 48

pha loãng với 16 ml nước cất dùng để đo OD 48

Chương 1 Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề

Enzyme là một chất xúc tác sinh học được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp do đó công nghệ sản xuất enzyme mang lại lợi nhuận rất lớn cho nhà sản xuất (Nguyễn Đức Lượng, 2004), thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp

và ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase…(Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007)

Cellulase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng nhất trong công nghiệp và sản xuất ngày nay Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: exoglucanase hay C1 (EC 3.2.1.91), endoglucanase hay Cx (EC 3.2.1.4) và β-glucosidase (EC 3.2.1.21), có khả năng hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose (Trần Thạnh Phong, 2004) Cellulase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, xử lý rác thải, sản xuất nhiên liệu sinh học

Trong nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, cần bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong đường tiêu hóa động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn động vật…

Trong công nghiệp thực phẩm, để chế biến thực phẩm như sản xuất cà phê ở Việt Nam việc sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase tăng khả năng ly trích dịch quả để xử lý bóc vỏ cà phê…

Trong công nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh, cellulase

có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác

Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, ở giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo

ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5 %

Theo Bhat (2000), khoảng 20 % trong số 1 tỷ USD là doanh thu từ enzyme cellulase, hemicellulase và pectinase trên thế giới Thị trường enzyme công nghiệp sẽ tăng từ 1,7 - 2,0 tỷ USD đến năm 2005 Ở nước ta, nhu cầu sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có cellulase trong chế biến thức ăn chăn nuôi và trong các ngành công nông nghiệp khác ngày càng nhiều, hằng năm chúng ta phải nhập ngoại một lượng lớn các nguồn enzyme này (Trần Thạnh Phong, 2004)

Việc tận dụng phụ phế liệu công nông nghiệp làm nguồn carbon để sản

xuất cellulase bởi Aspergillus niger bằng phương pháp lên men chìm và lên

men bán rắn rất được nhiều nước trên thế giới quan tâm

Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp nhiệt đới đa dạng, phong phú và ngày càng phát triển Vì vậy, mà nguồn phụ phế liệu nông nghiệp rất dồi dào như bã mía, cám gạo, rơm rạ… chứa một lượng cellulose và hemicellulose cao có thể sử dụng làm nguồn carbon để cảm ứng cho

Aspergillus niger sinh tổng hợp cellulase bằng phương pháp lên men bán rắn

Ngoài ra, đây còn là nguồn cơ chất rẻ tiền và ổn định để sản xuất cellulase trên quy mô lớn

Hiện nay, có rất nhiều loại môi trường được sử dụng để nuôi cấy cho

Aspergillus niger sinh tổng hợp cellulase nhưng hiệu suất còn giới hạn Vì vậy

đề tài “Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng

hợp enzyme cellulase của nấm mốc Aspergillus niger” được tiến hành nhằm

tìm ra được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase từ Aspergillus niger làm tiền đề cho việc nghiên cứu quy trình sản

xuất chế phẩm enzyme celluase trong nước

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH, nguồn cơ chất cảm ứng, hàm lượng đường bổ sung (glucose), nguồn nitơ đến khả năng

sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc Aspergillus niger

1.3 Nội dung

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh

tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

- Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp

enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng (cellulose) và hàm lượng cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme

cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường

nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus

niger

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc

Aspergillus niger

Chương 2 Lược khảo tài liệu 2.1 Giới thiệu chung về enzyme

2.1.1 Khái niệm enzyme

Enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học (Đỗ Quý Hai, 2008) với mức đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp Enzyme có trong tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007) Trong phản ứng enzyme xúc tác các phân

tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là cơ chất, enzyme sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau Enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác Enzyme không chỉ có thể xúc tác trong cơ thể sống, mà sau khi tách ra khỏi hệ thống sống chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác ở những điều kiện nhất định Enzyme có tính đặc hiệu cao, mỗi enzyme chỉ tác dụng trên một hay một số cơ chất nhất định ở nhiệt độ và áp suất bình thường

2.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme

2.1.2.1 Nhiệt độ

Mỗi enzyme hoạt động tốt nhất ở khoảng nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ thích hợp cho enzyme cellulase hoạt động 550 C, bền ở 30 - 450 C (Zhuang và ctv, 2007) Khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu, hoạt động của enzyme giảm và tốc độ phản ứng sẽ giảm theo Sự tăng nhiệt độ làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn Các phức chất emzyme - cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao enzyme bị biến tính Khi cấu hình

vị trí xúc tác không còn phù hợp với cơ chất enzyme mất hoạt tính xúc tác Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm Tần số va chạm giữa chúng thấp dẫn đến ít phức hợp enzyme - cơ chất hình thành và tốc độ phản ứng giảm Nhiệt độ tối ưu là 40 - 500 C, cao hơn 500 C enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc xúc tác giảm Đến 60 - 800 C, enzyme mất khả năng hoạt động Ở 1000 C enzyme hoàn toàn mất tác dụng (Phạm Thị Ánh Hồng, 2003)

2.1.2.2 Nồng độ cơ chất

Tốc độ phản ứng của phần lớn các phản ứng biến đổi theo nồng độ của

cơ chất và nồng độ enzyme Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng chỉ khi nồng độ cơ chất tương đối thấp Khi nồng độ cơ chất lớn tốc độ phản ứng ít phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hướng đạt cực đại do nồng

độ enzyme có mặt quyết định Ở nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme

có trung tâm hoạt động chưa liên kết với cơ chất Nên việc tăng hạn chế cơ chất là tăng tốc độ phản ứng Tuy nhiên, ở nồng độ cơ chất cao, hầu hết các trung tâm phản ứng đã liên kết với cơ chất làm cho số phân tử enzyme trở thành yếu tố giới hạn Khi số phân tử enzyme tăng tốc độ phản ứng cực đại tăng lên tương ứng

2.1.2.3 Độ pH

Mỗi một enzyme hoạt động tối ưu tại một giới hạn pH thích hợp chẳng hạn pepsin hoạt động tối ưu ở pH = 2, trypsin hoạt động tối ưu ở pH = 8,5, cellulase bền pH = 5,5 và hoạt tính cao ở pH = 6 (Zhuang và ctv, 2007) Khi

pH lệch sang hai bên phía pH tối thích, hoạt tính của enzyme giảm xuống

2.1.2.4 Các chất ức chế enzyme

Hoạt tính của enzyme bị thay đổi khi có mặt của chất ức chế

Chất ức chế cạnh tranh: các chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ chất Chất ức chế gắn thuận nghịch vào trung tâm phản ứng của enzyme cạnh tranh với cơ chất, khiến cho hoạt động xúc tác của enzyme chậm lại Khi chất

ức chế được giải phóng hoạt động xúc tác của enzyme trở lại mình thường

Chất ức chế không cạnh tranh: chất ức chế không cạnh tranh không gắn vào vị trí xúc tác mà gắn thuận nghịch vào vị trí khác trên enzyme Điều này

sẽ làm thay đổi cấu hình của vị trí hoạt động không còn phù hợp với cơ chất Vùng mà chất ức chế cạnh tranh gắn vào enzyme gọi là vị trí di lập thể (allosteric site) và gây ra hiệu ứng dị lập thể (allosteric effect) Khi chất ức chế giải phóng, hoạt động xúc tác của enzyme trở lại bình thường

2.2 Tổng quan về enzyme cellulase

2.2.1 Sơ lược về enzyme cellulase

Tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp chất cellulose Tất cả các enzym cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây:

 1,4 -D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH) Enzym cắt đầu cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzym này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase

và avicellase

 1,4 -D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG) Enzym này tham gia phân giải liên kết -1,4 glucoside trong cellulose và -D-glucanase Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose Enzym này còn có một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 -D-glucanase, C-cellulase

 -D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21) Enzym này tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học, chúng

có tên là cellobiase và -glucosidase

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym EG có tác dụng phân cắt tốt trên cellulose vô định hình và đặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tính như CMC, HEC Vì vậy, để xác định hoạt tính enzym này người ta thường sử dụng

cơ chất là CMC Còn các enzym CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô định hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính Trong hệ thống enzym CBH thì enzym CBH I tấn công từ đầu khử, trong khi CBH II tấn công vào đầu không khử của chuỗi cellulose

Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzym trên Đầu tiên enzym EG tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của chuỗi Tiếp sau đó các enzym CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose Việc phân cắt cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzym thứ ba

-glucosidase Vì vậy tuy rằng enzym -glucosidase không có tác dụng trên

chuỗi cellulose nhưng nó vẫn được xếp vào hệ thống enzym cellulase

2.2.2 Cơ chất cellulose

Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật Trong bông nó chiếm trên 90 %, còn trong gỗ hơn 50 % Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật Ơ tế bào thực vật và ở tế bào một số loài vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi Khi đun sôi với acid sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các -D-glucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết -1,4 glucoside Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết -1,4 glucoside Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 C và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000 - 14.000 gốc đường và được cấu tạo như sau:

Đầu không khử Đầu khử

Hình 1: Cấu tạo phân tử cellulose

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000 - 2500000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vander Waals và liên kết hydro

Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, các

vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:

- Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở mạch cacbon của mạch khác Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này

- Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals

Ở vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng

Hình 2: Cấu trúc của ligno-cellulose

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình

Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự

do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl

Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn Số lượng cellulose thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật Người ta thấy rằng, lượng cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể chiếm đến 80 – 90 %

Ở vi sinh vật cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự như ở thực vật Ở đó, cellulose thường thuộc loại vô định hình Chính vì thế việc phân hủy chúng thường rất dễ thực hiện

2.2.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

(EC.3.2.1.91): Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose

Hình 4: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase

(Nguyễn Hoàng Phúc và ctv, 2012)

dextrinase) (EC 3.2.1.74): enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4

-β-D-glucoside giữa mạch của chuỗi cellulose, linchenin và các β-D-glucan của

ngũ cốc

Hình 5: Cơ chế hoạt động của 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase

(Nguyễn Hoàng Phúc và ctv, 2012)

Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21): enzyme này thủy

phân gốc β-D-gluoside không khử ở đầu tận cùng để phóng thích ra β –

glucose

Hình 6: Cơ chế hoạt động của β-D-glucoside glucohydrolase

(Nguyễn Hoàng Phúc và ctv, 2012)

2.2.4 Hoạt lực của enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose )

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại

enzyme cellulase như: endoglucanase, exoglucanase và β –glucoside Một

trong ba loại enzyme trên không tự thủy phân cellulose đến cùng

Từ những nghiên cứu riêng lẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu

tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulose, nhiều nhà khoa học đều

đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân

hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải

thích khác nhau về cơ chế tác động của cellulose, trong đó cách giải thích do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận

Theo Erikson và ctv (1980), cơ chế tác động hiệp đồng của ba loại cellulase như đầu tiên endoglucanase tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kết β-1,4- glucosid và tạo ra các đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của endoglucanase và exoglucanase tạo ra các celloligosaccherit mạch ngắn cellobiose, β –glucosidase thủy phân tiếp và tạo thành glucose

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulose trong điều kiện

tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành đồng bộ, xảy ra rất chậm Mỗi loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp hợp ưu việc một loài enzyme Chính vì thế cần phải khai thác enzyme cellulose từ nhiều nguồn vi sinh vật

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực của enzyme như: nhiệt độ, pH, nồng

độ cơ chất, ion kim loại…(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3 Nấm sợi Aspergillus niger

2.3.1 Phân loại nấm Aspergillus niger

Hình 7: Nấm Aspergillus niger

(Nguồn: http://www.fungalcell.org/asexual-development-image-gallery)

2.3.2 Đặc điểm cấu tạo

Aspergillus thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi

Imperfecti) sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào

tử

Aspergillus niger gây bệnh mốc đen trên trái cây và rau củ như: nho, củ

hành, đậu phộng và làm hư hỏng thực phẩm Một số nòi của Aspergillus

niger có khả năng tạo ra độc tố mycotocxin

Aspergillus niger là vi sinh vật hiếu khí nên có thể tìm thấy ở các môi

trường giàu oxy, chúng sinh trưởng tốt trên bề mặt các cơ chất giàu cacbon, cũng có thể sống ở môi trường không có chất dinh dưỡng như tường nhà ẩm

Ba môi trường thường dùng để nuôi cấy nấm Aspergillus niger là: môi

trường Czapek dox agar, môi trường Sabouraud agar, môi trường Potato dextro agar (Nguyễn Thị Thanh Tuyền, 2009)

Nấm Aspergillus niger có màu đen nâu thường được gọi là nấm sợi

màu đen Khi mới phát triển sợi nấm có màu trắng, sau đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn đen Chỉ có bào tử của chúng là có màu đen huyền Từ một sợi đầu tiên chúng phân nhánh tạo ra 2 - 4 nhánh sợi nhỏ Từ các nhánh này sẽ phát triển thành đỉnh bào tử và từ đó phát triển thành những bào tử màu đen

Aspergillus niger có khả năng tạo nhiều enzyme khác nhau như amylase,

maltase, protease, pectinase, glucoamylase và cả cellulase

Nấm Aspergillus niger trên môi trường Czapek nhiệt độ nuôi cấy 270 C

ở 10 ngày tuổi có đường kính 2,5 - 3,0 cm, màu đen Khối bào tử trần đỉnh bọng hình cầu, sau hình tia tỏa tròn hoặc tách thành các cột 700 - 800 m đường kính, đôi khi các khối bào tử trần nhỏ màu nâu đen Giá bào tử trần nhẵn, dài 1,5 - 3,0 cm Bọng đỉnh giá hình cầu đường kính 45 - 75 m Cuống thể hình thành phần lớn 5 - 6 x 20 - 30 m, đôi khi 6 – 10 x 60 - 70 m Bào

tử trần hình cầu, phần lớn 4 - 5 m đường kính, ráp hoặc có gai không đều, thành chuỗi gốc non (Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000)

Nấm Aspergillus niger khi mọc trên môi trường Sabouraud agar phủ

đầy lông tơ và đầy bột, ban đầu có màu trắng chuyển dần sang màu nâu và trở thành màu đen đến đen huyền Bào tử đính có vách nhẵn, xung quanh vách bào tử đính màu nâu, xù xì hình thành những chuỗi hạt

Loại nấm mốc này thích hợp phát triển ở độ ẩm 60 % do đó môi trường nuôi cấy phải đạt được độ ẩm này, nếu cao quá sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu thấp hơn nấm mốc sẽ sinh bào tử gây giảm hoạt tính enzyme

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường rắn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, lúc này bào tử bắt đầu trương nở và hô hấp Ở giai đoạn này có xảy

ra nhiều biến đổi: nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc sữa, thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi, khối môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành

- Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài khoảng 14 - 18 giờ Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản như toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh có thể nhìn rõ được sợi nấm, môi trường được kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường

sẽ tăng nhanh do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi, các enzyme được hình thành

và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh là tốt nhất

- Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài khoảng 10 - 12 giờ Lúc này nhiệt

độ khối môi trường sẽ giảm dần, cường độ hô hấp giảm dần một cách rõ rệt Màu sắc của sợi nấm bắt đầu thay đổi và thể hiện màu đặc trưng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.3 Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ Aspergillus niger

Theo Hurst (1977), endoglucanase từ Aspergillus niger có trọng lượng

phân tử 26.000 Dalton, hoạt động ở pH và nhiệt độ tối ưu là 4,0 và 450 C

Galas và Romanowska (1997), cho biết -glucosidase (EC.3.2.1.21) từ

Aspergillus niger IBT - 90 có trọng lượng phân tử khoảng 200 kDa, điểm

đẳng điện là 4,05 và chứa 33 % carbohydrate Enzyme này thủy phân cellobiose ở pH và nhiệt độ tối ưu là 4,8 và 650 C

Theo báo cáo gần đây của Gokhan CORAL (2002), dịch nuôi cấy

Aspergillus niger Z10 trong môi trường Czapek Dox chứa CMC 1 %, sau khi

cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2 % CMC) phát hiện có 2 vạch protein có hoạt tính thủy phân CMC với trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000

và 50.000 Dalton

Ở Aspergillus niger có hai gene mã hóa cho endoglucanase là eglA,

eglB và hai gene mã hóa cho exoglucanase là chbA và chbB Cả eglA và eglB

thiếu domain CBD và vùng liên kết ChbB có một domaain xúc tác và một

đuôi CBD tách biệt với domain xúc tác bởi một liên kết peptid giàu

Ser/Pto/Thr; trong khi chbA chỉ có domain xúc tác thiếu đuôi CBD và liên kết peptid Gần đây, một gene mới được cô lập là eglC, mã hóa cho endoglucanase là eglC, emzyme này tham gia thủy phân xyloglucan và được

điều hào bởi protein XlnR (protein hoạt hóa phiên mã), protein này không chỉ điều hòa sự biểu hiện của các gene mã hóa hệ enzyme thủy phân xylan mà còn kiểm soát sự phiên mã của các gene mã hoá hệ enzyme thủy phân cellulose

như eglA, eglB, chbA và chbB.

2.3.4 Nguồn phân lập

Vùng phân bố của Aspergillus niger rất rộng do có thể sinh trưởng trên

nhiều cơ chất khác nhau như: các loại ngũ cốc, quả chín, da động vật, phân hữu cơ và trên một số loại nhựa (Nguyễn Thị Thanh Tú, 2010)

2.4 Giới thiệu thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Aspergillus niger

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của cám

2.4.3 Cơ chất cảm ứng

Để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường cho thêm vào môi trường nuôi cấy “chất cảm ứng”, thường là cơ chất tương ứng với enzyme cần tổng

hợp (Đồng Thị Thanh Thu, 2003)

Do cellulase thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose nên cơ chất cảm ứng

dùng để sản xuất enzyme chủ yếu bã mía Bã mía chiếm tỷ lệ lớn trong các

phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam Với thành phần chứa hơn 45 % là cellulose (Nguyễn Thị Thanh Tú, 2010)

Bảng 2: Thành phần của nguyên liệu rơm, bã mía, mùn cưa

Cơ chất

cảm ứng Cellulose (%)

Hemicellulose (%)

Lignin (%)

(Nguồn:http://text.123doc.vn/text-doc/78663-luan-van-tot-nghiep-nghien-cuu-2.5 Kỹ thuật nuôi cấy

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006) thì môi trường sau khi làm nguội được trải đều lên các khay (thay khay bằng hộp nhựa 17 x 11,5 x 7,5 cm) với chiều dài 2 - 3 cm và tiến hành trộn giống vi sinh vật vào khối lượng môi trường sao cho thật đều

Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5 – 20 % so với khối lượng của môi trường Sau khi trộn giống, các khay chứa môi trường sẽ được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều khiển nhiệt độ và độ ẩm không khí

Nhiệt thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28 - 32o C nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều không có lợi cho nấm sợi phát triển

Thời gian nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme vào khoảng 36 - 60 giờ Điều này còn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, điều kiện môi trường cũng như điều kiện nuôi cấy

2.6 Các phương pháp thu nhận enzyme

Đối với tế bào vi sinh vật phải tiến hành tách bằng phương pháp ly tâm hoặc bằng phương pháp lọc Phần dịch thu được của một trong hai phương pháp là dịch chế enzyme ngoại bào Phần sinh khối vi sinh vật sau ly tâm hoặc lọc chứa enzyme nội bào (Nguyễn Thị Hiền, 2012)

2.6.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào

Muốn thu nhận được enzyme nội bào của vi sinh vật phải tiến hành phá

vỡ tế bào, nhưng phá vỡ tế bào vi sinh vật rất phức tạp vì tế bào vi sinh vật có kích thước nhỏ và thành tế bào có cấu trúc khá đặc trưng Do đó phá vỡ tế bào

vi sinh vật đòi hỏi phải có những phương pháp rất đặc trưng

Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học

+ Phương pháp đồng hóa áp lực cao: đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin) Tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén

Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có khác nhau Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau

+ Phương pháp nghiền ẩm: phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi thủy tinh có kích thước 0,2 – 1 mm để tăng quá trình phá

vỡ tế bào Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh có độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.6.2 Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme sau khi phá vỡ tế bào sinh vật hay sau khi lên men thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan

Lọc là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch Lọc là phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ và độ nhớt của dung dịch thường rất cao làm cản trở quá trình lọc Tốc độ lọc phụ thuộc vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc,

áp suất khi lọc độ nhớt, sức đề kháng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Trong công nghiệp sản xuất enzyme từ sử dụng phương pháp lọc: lọc

ép, lọc chân không, lọc theo dòng chảy cắt ngang, lọc thông thường

2.6.3 Chiết rút enzyme

Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút enzyme trước hết là nhiệt độ

Để tránh mất hoạt tính hoặc vô hoạt cần chiết rút và tiến hành kết tủa ở nhiệt

độ thấp (từ 3 - 50 C) các thao tác phải nhanh Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như: NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tác dụng của chất điện ly còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút như dùng máy nung thì cả 3 chất điện ly trên điều có tác dụng, còn nếu chỉ để lắng thì NaCl có tác dụng tốt hơn vì vậy cần dùng chất điện ly thích hợp để tăng hiệu suất chiết rút enzyme (Đỗ Quý Hai, 2008)

2.7 Một số nghiên cứu về thu nhận enzyme cellulase

2.7.1 Nghiên cứu trong nước

Lê Hồng Mai (1989) nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc tính

của cellulase (typ CMCase) ở Apergillus niger VS-1 trên môi trường lên

men bán rắn

Huỳnh Anh (2001) nghiên cứu về nấm sợi Trichoderma reesei sinh

tổng hợp enzym cellulase trên môi trường lỏng với nguồn cacbon là CMC

Nguyễn Thị Kiều Hoa (2002) nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê

Hoàng Quốc Khánh (2003) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc

điểm cellulase của Apergillus niger Rnnl 363 trên môi trường lên men bán rắn

với cơ chất là trấu xay và mật rỉ đường (thời gian nuôi tối ưu là 56 giờ, cellulase thu được hoạt động ở pH và nhiệt độ tối ưu tương ứng là 5,5 và 500C

Trần Thạnh Phong (2004) khảo sát khả năng sinh tổng hợp

enzym cellulase từ Trichoderma reesei và Apergillus niger trên môi trường lên

men bán rắn

Lê Thị Hồng Nga (2005) nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc (Trần Thạnh Phong, 2004)

2.7.2 Nghiên cứu ngoài nước

Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzyme cellulase Enzyme

celluase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma và Aspergillus

Ở Mỹ, năm 1983 phòng thí nghiệm của Quân đội Mỹ ở Natik và trường

đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản

xuất cellulase đầu tiên Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983)

Gokhale (1991) cho biết (NH4)2SO4, (NH4)HPO4 và dịch triết bắp là

nguồn nitơ tốt nhất cho Apergillus niger NCIM 1207 sinh tổng hợp cellulase;

pH và nhiệt độ nuôi cấy tối ưu lần lượt là 3,0 - 3,5 và 280 C

YU (1998) đã nuôi cấy Trichoderma reesei Rut 30 trong môi trường

chứa 5% bột cellulose và 1 % cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g (Khưu Phương Yến Anh, 2007)

Sonia Couri (2000) khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như

polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ Apergillus niger 3T5B8

trên nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật

Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy Apergillus

niger trong môi trường Czapek - Dox chứa CMC 1 %, cho chạy điện di trên

gel SDS - PAGE (chứa 0,2 % CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton

Kang (2004) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase và

hemicellulase của Aspergillus niger KK2 trên môi trường lên men bán rắn với

cơ chất là hỗn hợp rơm và cám mì Hoạt tính giấy lọc 19,5 IU/g sau 4 ngày nuôi cấy, hoạt lực CMC 129 IU/g, - glucosidase 100 IU/g, xylanase 5070/g

và - xylosidase 193 IU/g sau 5 - 6 ngày lên men

Đến nay, nhìn chung các công trình nghiên cứu ngày càng nhiều và chuyên sâu để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ enzyme cellulase trong đời sống và sản xuất, đồng thời trong các nghiên cứu tiếp theo hứa hẹn còn nhiều khám mới về công nghệ enzyme

Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh vật trường Đại học An Giang

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2012 đến tháng 05/2013

3.2 Phương pháp tiến hành

3.2.1 Quy trình sản xuất

3.2.2 Giải thích quy trình

3.2.2.1 Sản xuất bột giống Aspergillus niger

- Chuẩn bị nguyên liệu (40 gram): gồm tấm gạo, cám tỷ lệ (1:1) được đựng trong túi PE Bổ sung 17 ml nước cất pH = 5 để tạo độ ẩm 60 % và pH

thích hợp cho nấm Aspergillus niger phát triển Điều chỉnh pH nước bằng

1 - 1,5 at, trong 30 phút Sau khi hấp thanh trùng, làm nguội nguyên liệu ở nhiệt độ (300 C – 400 C) Trải đều nguyên liệu trên hộp nhựa (17 x 11,5 x 7,5 cm) với chiều dày 2 - 3 cm

Hình 9: Quy trình sản xuất chế phẩm enzym cellulase từ

nấm Aspergillus niger

Bảo quản 40 C

Nghiền Nguyên liệu (15 g)

Trích ly (nước cất) Lọc

Nhân giống

Giống sản xuất

Xử lý nguyên liệu (Tạo độ ẩm và pH thích hợp)

Hấp tiệt trùng (121 0C, 1 – 1,5 at trong 30 phút)

Trộn giống nấm mật độ 8,97.106 CFU/g bột bào tử

- Chuẩn bị giống: ống thạch trữ giống Aspergillus niger Tỷ lệ giữa số

ống thạch và mẫu nuôi cấy (1:1) Cho 2 ml nước cất vào ống thạch, dùng que cấy trộn đều

- Cấy giống: Dùng pipet hút 1 ml hỗn hợp trong ống thạch cho hộp chứa nguyên liệu, trộn đều nguyên liệu và giống

- Ủ mẫu : ủ mẫu ở 300C , trộn mẫu ở 24 và 48 giờ tiếp theo Tiếp tục ủ mẫu trong 7 ngày

- Sấy mẫu: sau 7 ngày khi thấy mẫu xuất hiện bào tử màu đen ở mật độ dày đặc thì đem mẫu đi sấy ở 500 C trong 24 giờ

- Thu bột bào tử: sau khi sấy 24 giờ, đem mẫu đi xay nhuyễn, đựng trong túi PE, bảo quản ở 40 C

3.2.2.2 Chuẩn bị nguyên liệu

- Môi trường nuôi cấy: cám, trấu ray cho sạch Cám được bảo quản ở nhiệt độ 40 C

- Cơ chất (vỏ bắp, bã mía, mùn cưa, rơm) được rửa sạch, phơi khô 2 - 3 ngày Sau đó cắt nhỏ hoặc xay, cho qua ray để lựa chọn kích thích hợp lý (khoảng 0,5 - 1,0 cm)

- Tạo độ ẩm và pH cho môi trường nuôi cấy: Cho thêm dung dịch đệm

có pH thích hợp, lượng dung dịch đệm để tạo độ ẩm 60 % được tính theo phương pháp được đề cập ở phụ chương

- Bổ sung nguồn nitơ theo khối lượng thích hợp của thí nghiệm

- Nguyên liệu được đựng trong túi PE, sau đó đem hấp thanh trùng ở

121o C, 1 – 1,5 at, trong 30 phút Sau khi hấp thanh trùng làm nguội nguyên liệu ở 30 – 400 C Trải đều nguyên liệu trên hộp nhựa (17 x 11,5 x 7,5 cm) với chiều dày 2 - 3 cm

3.2.2.3 Trộn giống vi sinh vật

tử, 5% môi trường nuôi cấy tương đương:

+ Thí nghiệm (1, 2, 3): 4,485.105 CFU/g môi trường nuôi cấy tương đương 0,75 g bột bào tử

+ Thí nghiệm (4): 3,588.105 CFU/g môi trường nuôi cấy môi trường nuôi cấy tương đương 0,6 g bột bào tử

+ Thí nghiệm (5): 3,588.105 CFU/g môi trường nuôi cấy môi trường nuôi cấy tương đương 0,6 g bột bào tử

- Trộn đều bột giống và nguyên liệu trong hộp nhựa

3.2.2.4 Nuôi cấy

- Ủ mẫu ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo từng thí nghiệm