ĐỊNH TINH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM

Cholerae lên men không sinh khí, có khả năng làm dịch hóa gelatin Có khả năng khử nitrat thành nitrit và phân giải trytophan thành indol Vibrio cholerae phát triển được ở vùng có nồng

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

SVTH: NHÓM 8

NỘI DUNG

Hình ảnh về Vibrio cholerae dưới kính hiển vi sau khi

được nhuộm màu

1 1 Giới thiệu về Vibrio Cholerae

Phân loại khoa học

Giới thiệu về Vibrio Cholerae

1

- Thuộc giống Vibrio

- Phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả năng di dộng

- Phát triển ở nhiệt độ 420C, có thể tồn tại cả ở nước mặn và nước ngọt

- Phát triển nhanh trong thực phẩm ở nhiệt độ thường và

trong thực phẩm giữ lạnh - đông lạnh nhưng ở điều kiện khô không sống quá 48h

- Rất nhạy với nhiệt nên loại bỏ dễ dàng bằng đun nấu

V cholerae gây bệnh dịch tả do vệ sinh kém, nguồn nước ô

nhiễm, nhưng cũng có thể gây ngộ độc thực phẩm

Các chủng V.cholerae gây dịch chủ yếu thuộc 2 nhóm huyết

thanh O1 và O139

Cholerae lên men không sinh khí,

có khả năng làm dịch hóa gelatin

Có khả năng khử nitrat thành nitrit

và phân giải trytophan thành indol

Vibrio cholerae phát triển được ở

vùng có nồng độ muối cao 3%

Có khả năng lên men đường glucose,

sucrose,mannose, khử lysine

Cách thức sinh trưởng của Vibrio cholerae Cách thức sinh trưởng:

Quy trình phân tích2

Tiến hành phân tích

V Cholerae trên TCBS

Thử nghiệm sinh hóa

TN sinh hóa sơ bộ

TN sinh hóa khẳng định

Kháng huyết

thanh

Bước 4

TN sinh hóa sơ bộ

- Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS để cấy sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl

- Ủ ở nhiệt độ 370C trong 18 – 24h.

- Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh hóa.

TN sinh hóa sơ bộ

 TN trên môi trường TSI/KIA

Kết quả

Trên môi trường TSI (phải), môi trường KIA

(trái)

 TN với các canh thang trypton muối

V cholera phát triển được trong ống canh thang có

nồng độ NaCl là 0%, 1%, 3% và làm đục môi trường

Cấy khuẩn lạc từ TSA vào các ống canh thang muối trypton có dải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10%

TN sinh hóa sơ bộ

 TN lên men – oxy hóa

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán

lỏng Hugh – Leifson glucoza hoặc O/F glucoza Phủ khoảng 1 –

2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống Ủ các ống

nghiệm ở nhiệt độ 370C trong 1 – 2 ngày

V cholerae lên men glucoza làm môi

trường Hugh – Leifson từ màu tím

chuyển thành vàng Môi trường O/F từ màu xanh thành vàng

TN sinh hóa sơ bộ

Đặt giấy lọc lên một nắp đĩa

petri, nhỏ 2 -3 giọt thuốc thử

oxidaza Dùng que cấy vô

trùng lấy các khuẩn lạc từ môi

trường TSA ria lên vị trí đã

nhỏ thuốc thử oxidaza V

cholera làm vết ria có màu tím

thẫm hoặc xanh thẫm sau 10

giây

 TN oxidaza

TN sinh hóa sơ bộ

 Nhuộm gram

V Cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.

TN sinh hóa sơ bộ

TN sinh hóa khẳng định

Cấy vi khuẩn từ TSA vào

một ống canh thang trypton

TN sinh hóa khẳng định

 TN cacbonhydrat

Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính

khi môi trường giữ nguyên màu

đỏ.

V Cholerae cho phản ứng

sacaroza, manniton, mannoza

dương tính và lactoza, cellobiza,

arabinoza âm tính Lên men đường manniton (+) vàng hoặc vàng với bong bóng khí, (-) đỏ

 TN decacboxylaza/ dehydrolaza

→ lysine (+), arginine (-), ornithine (+), control (-)

TN sinh hóa khẳng định

 TN ure

Có thể dùng đĩa ONPQ thay cho thuốc thử ONPQ Hòa tan

khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối

sinh lý Đặt đĩa ONPQ vào đáy ống rồi ủ ẩm và đọc kết quả

như trên V cholera cho phản ứng ONPQ dương tính khi

37 o C

Pứ (+)

Màu vàng

Thử nghiệm Oxidase (a) +

Thử nghiệm indole (b) +

Lên men Glucose +

Lên men Frutose +

Lên men Mannose +

Lên men Lactose

-Lên men Arabinose

Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một

giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối

Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V

nhóm 1

Bảng 1 – Phân biệt V cholerea O1 và V cholerae non – O1

Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh

Dung dịch muối sinh

Đọc kêt quả

Phát hiện hoặc không phát hiện được V.cholera trong

25 g mẫu

3 Ví dụ 3

Phương pháp nghiên cứu

 Xác định V cholerae bằng phản ứng hóa sinh

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu

 Xác định V cholerae bằng kỹ thuật m-PCR

 Ly trích DNA

 Chạy mPCR

 Điện di

 Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 1X trên gel

agarose 1,5%, thời gian điện di là 50V/45 phút

 Sau khi điện di, bảng gel agarose dược nhuộm bằng dung dịch

ethium bromide 1/10.000 và nhận diện nhờ máy chiếu tia UV

Kết quả

Dung dịch pepton muối kiềm (Môi trường 1) Địa điểm

Bảng So sánh tỷ lệ phát hiện V.cholerae giữa phương pháp sinh hóa và

m-PCR DNA ly trích từ dung dịch tăng sinh

L/O/G/O