Xây dựng qui trình xác định hàm lượng acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột qua chế biến ở nhiệt độ cao bằng phương pháp lcmsms

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lựa chọn phương pháp phân tích acrylamide có thể kể đến là: độ tan, khối lượng phân tử nhỏ, độ bay hơi thấp… Acrylamide là sản phẩm công nghiệp do sự thủy phâ

MỞ ĐẦU

- Acrylamide là một hoá chất công nghiệp sử dụng chủ yếu là để sản xuất polyacrylamide; nó cũng vừa được phát hiện trong thực phẩm với hàm lượng khá cao Acrylamide được hình thành trong quá trình chiên, nướng và đút lò của nhiều loại thực phẩm khác nhau, đặc biệt là các thực phẩm giàu tinh bột như khoai tây và các sản phẩm ngũ cốc Các nhà khoa học trên thế giới quan tâm đến acrylamide vì tính độc hại của

nó trong thực phẩm, chính là khả năng gây ung thư và phá huỷ DNA

Nó là nguyên nhân gây ra những khối u ở chuột phòng thí nhiệm, dù chưa có bằng chứng chứng minh phơi nhiễm acrylamide qua thực phẩm

là nguyên nhân gây ung thư ở người Nó cũng được biết đến là chứng độc thần kinh ở người và ảnh hưởng đến quá trình sinh sản của con người Nhiều quốc gia và các hiệp hội quốc tế thực hiện đánh giá nguy

cơ độc hại của acrylamide trong thực phẩm và đưa ra kết luận rằng cần

có nhiều nỗ lực giảm hàm lượng chất này xuống thấp nhất có thể [15]

- Acrylamide được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm chiên, nướng, đút lò, nó tồn tại trong những sản phẩm thực phẩm chế biến công nghiệp cũng như nấu tại nhà Acrylamide có phổ biến trong các sản phẩm chế biến từ khoai tây ở nhiệt độ cao (khoai tây chiên, snack khoai tây…), ngũ cốc, bánh mì nướng, bánh quy, các sản phẩm bánh công nghiệp, cà phê Chưa có tổ chức cũng như quốc gia nào đưa ra được hàm lượng tối đa cho phép của Acrylamide trong thực phẩm [15]

- Trong cuộc sống bận rộn ngày nay, thực phẩm ăn nhanh, chế biến sẵn trở nên được ưa chuộng ở Việt Nam đặc biệt là snack khoai tây, mì ăn liền…, ẩn trong nó là những mối nguy tiềm tàng ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng

- Nhiệm vụ của Viện Vệ Sinh Y Tế Công Cộng-Thành Phố Hồ Chí Minh là tham vấn cho Bộ Y Tế đánh giá mối nguy ảnh hưởng đến sức

khoẻ người dân, xác định chất này trong thực phẩm là giai đoạn đầu của quá trình

- Góp phần vào giai đoạn này, đồng thời tận dụng các thiết bị sắc ký hiện

có tại Viện, chúng tôi thực hiện đề tài xây dựng qui trình xác định hàm lượng

Acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột qua chế biến ở nhiệt độ cao bằng phương pháp LC-MS/MS

Mục tiêu thực hiện đề tài:

1 Xây dựng qui trình xác định acrylamide trên 2 nền mẫu chính snack khoai tây và mì ăn liền:

- Khảo sát các điều kiện tách chiết mẫu và phân tích trên thiết bị

- Xác định giá trị sử dụng của phương pháp đã xây dựng

2 Áp dụng qui trình vừa xây dựng phân tích 30 mẫu snack khoai tây và

mì ăn liền sản xuất tại Việt Nam

TỔNG QUAN

CHƯƠNG 1: ACRYLAMIDE

1.1.Cấu tạo, tính chất và ứng dụng của acrylamide [8], [46]

Acrylamide là chất hóa học có công thức phân tử C3H5NO, công thức cấu tạo

phân tử lượng 71.08g/mol và tên IUPAC là prop-2-enamide, với tính chất vật lý

+ Nhiệt độ sôi: 136 oC ở 3.3 kPa / 25 mmHg

+ Ở điều kiện phân hủy không nhiệt tạo thành NH3, có tham gia của nhiệt độ

sẽ phân hủy thành CO, CO2, NOx…

+ Độ tan của acrylamide trong dung môi phân cực và không phân cực thay đổi rất lớn

Bảng 1.1: Độ tan của Acrylamide trong những dung môi khác nhau

(Habermannm, 1991; American Cynamid, 1969)

Nước 215.5 Methanol 155

Ethanol 86.2 Acetone 63.1 Pyridine 61.9 Acetonitrile 39.6

Ethylene glycol monobuthyl ether 31

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lựa chọn phương pháp phân tích acrylamide có thể

kể đến là: độ tan, khối lượng phân tử nhỏ, độ bay hơi thấp…

Acrylamide là sản phẩm công nghiệp do sự thủy phân của acrylonitrile

Acrylamide được sử dụng để tổng hợp các polyacrylamide làm chất keo tụ: dùng trong xử lý nước uống và nước thải, làm môi trường điện di, sử dụng trong công nghiệp làm giấy, tinh chế quặng…Một vài acrylamide được dùng trong sản xuất thuốc nhuộm và sản xuất các monomer khác

1.2 Sự hình thành Acrylamide trong thực phẩm

Acrylamide trong thực phẩm được Swedish National Food Administration công bố lần đầu tiên vào tháng 4 năm 2002 [14] Cơ quan này đã sử dụng máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) để phát hiện

và khảo sát trong diện rộng các loại thực phẩm với số lượng hơn 100 mẫu thực phẩm các loại Các nhà nghiên cứu nhận thấy acrylamide không được tìm thấy trong các loại thực phẩm chưa qua chế biến và thực phẩm luộc Trong các sản phẩm khoai tây chiên hoặc các sản phẩm ngũ cốc được chiên hoặc nướng như bánh bích qui … hàm lượng acrylamide nằm trong khoảng từ 100-2300 µg/kg Hơn một nửa số mẫu khoai tây chiên được khảo sát có hàm lượng acrylamide trên 1000 µg/kg

Nghiên cứu tiên phong trên đã mở đầu cho hàng loạt các nghiên cứu khác nhau về khảo sát đánh giá thực trạng hàm lượng acylamide trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau, trong đó tập trung chủ yếu vào các đối tượng thực phẩm giàu tinh bột và được chế biến ở nhiệt độ cao ở các quốc gia khác nhau như Na Uy, Anh, Mỹ, Úc, Hồng Kông… Năm 2003, Australia đã tiến hành khảo sát 112 mẫu thực phẩm giàu tinh bột trên thị trường cả nước, qua khảo sát cho thấy hàm lượng acrylamide trung bình trong khoai tây chips là 501μg/kg Từ kết quả khảo sát cơ quan này cũng tính lượng acrylamide đưa vào cơ thể trung bình là 1.4μg/kg khối lượng

cơ thể ngày dựa trên khối lượng cơ thể là 67 kg

Tại Hồng Kông, năm 2002 K.S.Leung và cộng sự đã sử dụng máy sắc

ký lỏng LC-MS/MS khảo sát 400 mẫu thực phẩm, chủ yếu là thực phẩm

truyền thống Châu Á tại Hồng Công cho thấy acrylamide được phát hiện

chủ yếu trong những nhóm như gạo và sản phẩm của gạo, mỳ, bánh và

những sản phẩm bột nhão dùng làm bánh…Những nhóm có hàm lượng

acrylamide cao là những sản phẩm liên quan đến bánh bích qui Hàm

lượng acrylamide cao nhất được tìm thấy trong những sản phẩm khoai tây

với hàm lượng từ 1500 – 1700 µg/kg Các sản phẩm có độ giòn làm từ bột

lúa mạch có hàm lượng acrylamide thấp hơn, dao động trong khoảng 440

µg/kg, tiếp đến là các sản phẩm làm từ bắp 65 – 230 µg/kg và sau cùng là

sản phẩm làm từ bột gạo 15 – 42 µg/kg

Báo cáo ngày 30 tháng 4 năm 2009 của EFSA (European Food Safety

Authority) [10] đã đưa ra kết quả khảo sát Acrylamide năm 2007 trong

Trung bình µg/kg

Maximum µg/kg

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy acrylamide được hình thành trong phản ứng Maillad và chất chính để hình thành acrylamide là asparagine (một acid amine)

và đường khử (glucose, fructose, sucrose…) [45]

Hình 1.1: Cơ chế hình thành acrylamide theo phản ứng Maillard

Hàm lượng acrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng đường

và asparagine trong thực phẩm, nhiệt độ chế biến thực phẩm, thời gian chế biến… Nhiệt độ càng cao thì acrylamide hình thành càng nhiều, thời gian

chế biến, hàm lượng đường và asparagine cũng tỉ lệ thuận với sự hình thành acrylamide

Hình 1.2: Nồng độ acrylamide(µg/kg)trong hambuger phụ thuộc nhiệt độ chế biến [35]

1.3 Độc tính của acrylamide

Acrylamide được phát hiện trong thực phẩm vào tháng 4 năm 2002 tại Thụy Điển, chủ yếu trong các loại thực phẩm giàu tinh bột khi chiên hoặc nướng ở nhiệt độ cao trên 120oC Đã có nhiều nghiên cứu để xác định mức độ ảnh hưởng của acrylamide đối với con người thông qua các thử nghiệm trên động vật Con đường chính dẫn đến phơi nhiễm acrylamide là do tiếp xúc với các monomer acrylamide qua da, qua đường hô hấp và qua đường ăn uống Acrylamide được đưa vào qua đường miệng với liều trên 100 mg/kg trọng lượng cơ thể thì gây ngộ độc cấp và LD50 là >150 mg/kg trọng lượng cơ thể.[14]

* Mức độ phơi nhiễm của con người đối với acrylamide: [6], [10], [39] Năm 2002, tổng hợp các số liệu thu thập được từ các nước Úc, Na

Uy, Hà Lan, Thụy Điển và Mỹ, Ủy ban FAO/WHO đã đưa ra phơi nhiễm ước lượng của người dân đối với acrylamide là từ 0,3 - 0,8 μg/kg khối lượng cơ thể/ngày Tuy nhiên con số này chỉ mang tính tham khảo vì tại thời điểm này, những thống kê về loại thực phẩm bị ô nhiễm acrylamide

và số lượng mẫu chưa được đầy đủ

Nghiên cứu năm 2004 khảo sát trên quần thể dân số Hà Lan cho thấy

loại thực phẩm đóng vai trò chủ yếu đối với phơi nhiễm acrylamide của

người dân là các sản phẩm khoai tây chiên (31%), sản phẩm chiên dòn

(15%), còn lại là cà phê (13%), bánh bích qui, bánh mì

Phơi nhiễm của quần thể dân số trung bình là 1μg/kg khối lượng cơ

thể/ngày) (JECFA 2005) thấp hơn 500 lần so với 0,5 mg/kg khối lượng cơ

thể/ngày (lượng cao nhất không gây ảnh hưởng đến hệ thần kinh) [11]

Tuy nhiên IARC kết luận: acrylamide thuộc nhóm 2A là chất có thể

gây ung thư cho con người mặc dù không có bằng chứng đầy đủ về khả

năng này đối với con người Nhưng có bằng chứng đầy đủ trên thực

nghiệm về khả năng gây ung thư trên động vật do acrylamide và chất

chuyển hóa glycidamide phản ứng cộng hóa trị với DNA ở chuột

Acrylamide và glycidamide cộng hóa trị với haemoglobin ở những người

bị phơi nhiễm và ở chuột; đồng thời acrylamide gây đột biến gen và sai

hình (đột biến) nhiễm sắc thể trong tế bào mầm của chuột [23]

1.4 Các qui định về acrylmide:

Sau đây là một vài tiêu chuẩn cho phép của hàm lượng acrylamide

Bảng 1.3: Một vài tiêu chuẩn cho phép về hàm lượng acrylamide [8]

Vật liệu bao gói thực phẩm 10 μg/kg EU Commission, 2002b

Nước uống 1 μg/l WHO-World Health Organization

1.5 Các phương pháp phân tích acrylamide trong thực phẩm:

Đã có rất nhiều các nghiên cứu đươc đăng tải trong hầu hết các tạp chí khoa học

về phương pháp phân tích acrylamide trong thực phẩm từ năm 2002 đến nay

- Các phương pháp xác định acrylamide dựa trên các thiết bị sắc ký khí và

sắc ký lỏng với các đầu dò khác nhau (ECD; UV, DAD…):

o Sắc ký lỏng pha đảo đầu dò PDA được sử dụng xác định acrylamide trong snack khoai tây theo Vural Gokmen, Hamide Z

Senyuva, Jale Acar, Kemal Sarioglu, Thổ Nhĩ Kỳ năm 2004 [17]

o Theo nghiên cứu của E.K Paleologos, M.G Kontominas thuộc đại học Ioannina, Hy Lạp Acrylamide đươc xác định bằng sắc ký lỏng pha thường đầu dò UV [32]

o Yonghong Zhu *, Genrong Li, Yunpeng Duan, Shiqi Chen, Chun Zhang, Yanfei Li nghiên cứu xác định acrylamide trong thực phẩm giàu tinh bột qua chế biến nhiệt bằng sắc ký khí đầu dò ECD [44]…

Tuy nhiên, do sự phức tạp của các nền mẫu thực phẩm các phương pháp này không hiệu quả để phân tích acrylamide ở hàm lượng vết [43]

- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS ) cũng là phương pháp lựa chọn ưu tiên khi hàm lượng Acrylamide thấp hơn 50 µg/kg ở sản phẩm ngũ cốc sau tạo dẫn xuất (brom hóa) [33]

- Đầu dò khối phổ được ưu tiên chọn lựa khi kết hợp với sắc ký lỏng để dễ dàng khẳng định lại cấu trúc vì acrylamide là chất có khối lượng phân tử nhỏ mà nền mẫu thực phẩm lại vô cùng phức tạp [17] [43]

Một số các qui trình phân tích acrylamide trong một vài sản phẩm thực phẩm,

sử dụng các dung môi chiết khác nhau, các cách làm sạch khác nhau được trình bày ở bảng 1.4

Bảng1 4: Một số các phương pháp xác định acrylamide trong thực phẩm:

Snack khoai tây MeOH

Carrez I&II SPE Oasis HLB

Hexan Bromate hóa EtOAc

GC-ECD GC-MS

[41]

Mì ăn liền, snack

khoai tây, bánh qui H2O Hexan Bromate hóa

EtOAc

GC-ECD GC-MS

[44]

Carrez I + Carrez II Bromate hóa EtOAc-Hexane (4:1) Cột Florisil

Khoai tây chiên,

snack khoai tây H2O SPME

LC-MS/MS

[38]

Snack khoai tây,

thịt, bánh mì H2O SPE Isolute Multi-Mode

300mg

LC-MS/MS [40]

Sản phẩm Dung môi

chiết

Làm sạch &

dẫn xuất Thiết bị đo Tham khảo

Snack khoai tây,

ngũ cốc, bánh mì,

cà phê

H2O (80oC)

CH2Cl2SPE MAX/MCX SPE Envi-carb

LC-MS/MS [36]

Khoai tây chiên,

snack khoai tây,

bánh mì, bánh qui

0.01mM acid acetic

Carrez I + Carrez II SPE Oasis MCX

Sản phẩm từ khoai

tây và ngũ cốc H2O

SPE Oasis HLB SPE Bond Elut-Accucat

LC-MS/MS [18]

Ghi chú:

SPE Oasis HLB: cột chiết pha rắn C18 nối silicagel HLB của Oasis

SPE Bond Elut-Accucat: cột chiết pha rắn với chất mang là hỗn hợp mạch C8 và chất trao đổi cation (SCX) và cả anion mạnh (SAX) của Agilent

SPE Isolute Multi-Mode: cột chiết pha rắn với chất mang là hỗn hợp mạch C18

và chất trao đổi cation (SCX) và cả anion mạnh (SAX)

SPE MAX/MCX: kết hợp 2 cột chiết pha rắn với chất mang là chất trao đổi

cation (MCX) và anion trung bình (MAX)

* Ưu và nhược điểm của các phương pháp xác định acrylamide:

Thiết bị sắc ký lỏng LC với các đầu dò UV, DAD:

• Ưu: thiết bị rẻ tiền, xử lý mẫu đơn giản

• Nhược: dễ gây sai số, nhầm lẫn khi mẫu có nền phức tạp

Thiết bị sắc ký khí GC với các đầu dò ECD:

• Ưu: thiết bị rẻ tiền

• Nhược: quá trình xử lý mẫu phức tạp khi phải tạo dẫn xuất

• Ưu: xử lý mẫu đơn giản

• Nhược: dễ gây sai số, nhầm lẫn khi mẫu có nền phức tạp

Thiết bị LC-MS/MS:

• Ưu: xử lý mẫu đơn giản

• Nhược: thiết bị đắt tiền

Sắc ký lỏng pha đảo: pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa Pha động thường là dung môi phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, sắc ký lỏng pha đảo được sử dụng nhiều

1.6.1.2 Nguyên tắc: Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng

dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do đó, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau trong cột tách và tách khỏi nhau

1.6.1.3 Sơ lược các bộ phận chính của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng

cao:

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính sau: bơm, bộ

tiêm mẫu, cột sắc ký, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu

Hình 1 3: Sơ đồ một thiết bị HPLC

• Bơm: tạo áp lực giúp pha động di chuyển trong hệ thống, tạo dòng ổn định

khi thành phần pha động thay đổi Áp lực bơm sử dụng tùy thuộc vào tốc

độ dòng, độ nhớt pha động và kích thước pha tĩnh.Gồm 2 chế độ:

o Chế độ đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi, thời gian

phân tích dài, độ phân giải kém

o Chế độ gradient dòng: thành phần pha động thay thổi trong quá

trình phân tích

• Bộ tiêm mẫu: Dùng đưa mẫu vào hệ thống, bao gồm van 6 cổng, vòng

mẫu (loop) cho phép tiêm một thể tích giống nhau vào thiết bị…

• Cột sắc ký: thường làm bằng thép không rỉ; có đường kính 2.1 – 7.6mm,

chiều dài cột 1 – 30cm, đường kính hạt 3 - 10µm; trơ, có thành phẳng và

chịu được áp suất cao

DUNG

MÔI 1

DUNG MÔI 2

Tùy tính chất của chất cần phân tích mà ta có thể lựa chọn cột phân tích (pha tĩnh), pha động

Hình 1.4: Sơ đồ lựa chọn pha tĩnh [47]

Acrylamide tan tốt trong nước và các dung môi phân cực, là chất trung tính, háo nước nên cột tách được chọn là cột pha đảo C18

1.6.2 Khối phổ:[31]

1.6.2.1.Khái niệm: Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định

khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể được tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích như proton hóa, loại bỏ electron…Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất

Cấu tạo của thiết bị khối phổ: gồm 3 phần chính: nguồn ion hóa, bộ phận phân tích khối và đầu dò

1.6.2.2.Nguyên tắc: Mẫu được ion hóa trong buồng ion hóa, sau đó được

đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính thông qua phần mềm xử lý và lưu trữ

1.6.2.3 Cấu tạo của thiết bị khối phổ: gồm 3 phần chính: nguồn ion hóa,

bộ phận tách ion và đầu dò ion

• Nguồn ion hóa: là nơi tạo ion, sử dụng các kỹ thuật: ion hóa phun điện tử (ESI-electrospray ionization), ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI-atmospheric pressure chemical ionization), ion quang hóa học ở áp suất khí quyển (APPI- atmospheric pressure photoionization)

o Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI):

• Ion được tạo ra trong pha dung dịch

• Thích hợp cho chất không bền nhiệt, chất khá phân cực, chất có phân tử khối lớn

• Quá trình tạo ion: Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc

ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại áp thế cao và sau

đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao quản Dưới tác dụng của điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản Các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do

sự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ dần thành những hạt mang điện nhỏ hơn Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí N2 bị bơm hút ra ngoài Điện thế dương ở đầu kim tạo ion dương, điện thế âm ở đầu kim tạo ion âm và được quyết định tùy theo chất khảo sát Các chất có tính acid tạo ion âm ở pH cao, các chất có tính baz tạo ion dương ở pH thấp

Hình 1.5: Kỹ thuật ion hóa phun điện tử

o Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường (APCI):

• Ion được tạo ra trong pha hơi

• Thích hợp cho chất không bền nhiệt, chất ít phân cực, chất có phân

tử khối nhỏ

• Quá trình tạo ion: phân tử chất phân tích và dung môi đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử khí N2 phun ra và đi vào vùng phóng điện (corona discharge), hiện tượng ion hóa xảy ra:

Cơ chế tạo ion dương:

•OH + M → (M-H)- + H2O

Hình 1.6: Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

o Kỹ thuật ion hóa quang hóa học ở áp suất khí quyển:

• Quá trình tạo ion: Kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật APCI nhưng hỗn hợp khí hơi đi qua vùng chứa các tia photon của đèn Krypton (hay UV) để tạo ion (thay vì vùng phóng điện)

Hình 1.7: Kỹ thuật ion hóa quang hóa học ở áp suất khí quyển

Hình 1.8:Phạm vi ứng dụng của các kỹ thuật ion hóa trong

LC-MS/MS

• Bộ phân tích ion (bộ phân tích khối lượng):

o Bộ tứ cực (Triple quad): Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực

song song Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa

dòng một chiều và điện thế tần số radio Các tứ cực đóng vai trò là

một bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vào, các ion

chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z

Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua tứ cực

Hình 1.9:Cấu trúc bộ phân tích khối Triple Quad

o Bộ phân tích bẫy ion (Qtrap): bao gồm một điện cực vòng với

nhiều điện cực bao xung quanh, điện cực đầu cột ở trên và ở dưới

Các ion sau khi đi vào bẫy ion được bẫy lại cho đến khi một điện áp

tần số radio (Rf) được áp lên trên điện cực vòng, các ion khác m/z

trở nên không ổn định và sẽ đi về hướng đầu dò Do điện áp Rf

khác nhau trong hệ mà thu được một phổ khối lượng đầu đủ Các

ion tồn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự

khác nhau về m/z, đồng thời có thể thực hiện quá trình bắn phá để

thu được các mảnh con, từ đó phân tích theo m/z của ion con Về nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu để thực hiện MS n lần, tuy nhiên thực tế chỉ có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần

o Bộ phân tích thời gian bay (TOF-time of flight): dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới đầu dò với cùng một năng lượng Do các ion có cùng năng lượng nhưng khác nhau về khối lượng nên thời gian đi tới đầu

dò sẽ khác nhau Các ion nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn do có vận tốc lớn hơn, các ion lớn sẽ đi chậm hơn Thời gian bay tới đầu dò của một ion phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của ion đó Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhưng có thể phân tích không hạn chế khối lượng ion

• Bộ phận phát hiện ion:

o Nguyên lý: tạo tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng điện do điện tích di chuyển

o Có 2 loại bộ phát hiện phổ biến: nhân electron và nhân quang điện

• Bộ phát hiện nhân electron: là đầu dò phổ biến, có độ nhạy cao Các ion đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron, các electron thứ cấp được dẫn tới các dinot tiếp theo và tạo ra các electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron

• Bộ phát hiện nhân quang cũng tương tự như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo tạo ra các electron, nhưng các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn photpho và giải phóng ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Ưu điểm của kỹ thuật này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn

1.6.3 Thiết bị LC-MS/MS (Shimadzu LC 20AD – AB Sciex TripleQuad 5500)

Hình 1.10: Hệ LC-MS/MS sử dụng phân tích Acrylamide

Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu LC 20AD:

gradient áp suất cao, 2 bơm, 2 dòng dung môi, hệ thống tiêm mẫu tự động

Nguồn ion hóa: 2 nguồn ion hoá ESI và APCI

Hình 1.11: Nguồn ion hóa Turbo-V

Bộ phân tích khối: với tứ cực cong (Qurved LINAC Collision Cell)

buồng va chạm áp suất cao, tăng tốc ion xuyên qua buồng va chạm,

làm tăng tốc độ phân tích, loại bỏ hiệu quả phân tử không mang điện

nền, phù hợp với kỹ thuật UHPLC

Hình 1.12: Bộ phân tích khối của thiết bị Khối phổ AB Sciex TripleQuad

5500MS (với thiết kế mới Qurved LINAC Collision Cell)

*Một vài chế độ quét phổ sử dụng ở thiết bị Triple Quad

Chế độ quét phổ MRM-multiple reaction monitoring: Q1 chọn mảnh

ion mẹ [M+H]+, Q2 phân mảnh ion được chọn, Q3 giám sát một mảnh ion

con được chọn, chỉ ion con được chọn mới được phát hiện tại đầu dò Độ

nhạy của chế độ quét MRM chính là khả năng bao nhiêu ion con được tạo

ra Kỹ thuật này sẽ làm giảm nhiễu nền

Chế độ quét ion con-Product ion scanning: Q1 lựa chọn mảnh ion mẹ,

Q2 phân mảnh ion được chọn, Q3 bẫy và quét tất cả các ion con được phân

mảnh Kỹ thuật này cho phép xác định các hợp chất có cùng thời gian rửa

giải

1.7 Tiêu chuẩn để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử:

[2], [3], [5], [9], [12], [19], [20] ,[21], [22], [37]

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp thử là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose) Kết quả của Xác định giá trị sử dụng của phương pháp thử có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích Xác định giá trị sử

dụng của phương pháp thử là một phần không thể thiếu nếu muốn có

một kết quả phân tích đáng tin cậy

Để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử cần dựa vào các thông

số sau:

1.7.1 Các thông số xác định giá trị sử dụng của phương pháp thử:

- Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không

có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất

cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác.Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích

- Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một quy trình Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với các chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc Như vậy, tính chọn lọc có thể bao trùm cả tính đặc hiệu Do các phương pháp phân tích thường có nhiều chất cùng xuất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thường mang tính khái quát hơn

- Khoảng tuyến tính: là khoảng của đường thẳng thể hiện sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với tín hiệu của thiết bị được thể hiện qua hệ số tương quan gần bằng 1 (0.995 cho đa số các chất phân tích)

- Giới hạn phát hiện của phương pháp: là nồng độ chất phân tích thấp nhất

có trong mẫu mà phương pháp có khả năng phát hiện được với độ tin cậy

là 99% khác biệt so với mẫu trắng

- Giới hạn định lượng: là mức nồng độ mà phương pháp cho kết quả định lượng với độ tinh cậy nhất định

- Độ chính xác: là sự gần đúng giữa giá trị kết quả thử nghiệm và giá trị chấp nhận (giá trị thực) Độ chính xác được xác định thông qua 2 thông số: độ đúng (truenesss) và độ chụm

• Độ đúng: là sự gần đúng giữa giá trị trung bình của một loạt thí nghiệm với giá trị thực Độ đúng thường được biểu diễn thông qua

1.7.2 Mức chấp nhận cho các thông số trong xác định giá trị sử dụng của phương pháp thử:

Bảng 1.5: Thông số cơ bản và mức chấp nhận theo tài liệu “Hướng dẫn

kiểm soát chất lượng trong phòng kiểm nghiệm” [1]

STT Thông số kỹ thuật Mức chấp nhận Ghi chú

4

Độ chọn lọc ( mức độ đáp

ứng của nền mẫu, hóa chất

và mẫu kiểm soát)

6 Độ lặp lại_RSDwr (%) ≤ 20 Tại mỗi mức khảo sát

7 Độ tái lặp nội bộ PTN_ RSDwR (%) ≤ 20 Tại mỗi mức khảo sát

8 Giá trị mẫu trắng (blank)

< 30% giới hạn định lượng công bố của phương pháp thử

THỰC NGHIỆM

2.1 Nguyên liệu (Dụng cụ, thiết bị, hoá chất - chất chuẩn)

- Cân phân tích 4 số lẻ (độ nhạy 0,1 mg) Metler-Toledo

- Máy lắc ngang IKA HS 260 basic

- Máy lắc Vortex

- Máy ly tâm Universal 320R Hettich

- Máy đánh siêu âm

- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hiệu Shimadzu

+ Bơm LC – 20AD XR

+ Autosampler SIL – 20AD XR

+ Degasser DGU – 20 A5

+ Interface CBM – 20A

+ Cột sắc ký phân tích: Inertsil ODS – 3V, 5 µm, 150 mm x 4,6 mm

- Đầu dò khối phổ 2 lần(MS/MS) AB Sciex TripleQuad 5500

Turbo V source: kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI)

2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn

Chất chuẩn:

- Acrylamide 99.5%, hãng sản xuất Fluka, mã đặt hàng 01696, số lô

1254876

- Nội chuẩn Acrylamide(2,3,3-D3) 98%, hãng sản xuất CIL, mã đặt hàng

122775-19-3, số lô PR-17278

- Mẫu chuẩn được chứng nhận CRM BD 273 Sample No 0660 Toasted

Bread (425 ± 29) ng/g

Hóa chất

Bảng 2.1:Các dung môi, hóa chất sử dụng trong bài nghiên cứu

Dung môi, hóa chất Độ tinh khiết Hãng sản xuất

J.T.Baker

Primary Secondary Amine (PSA) LC/MS/MS grade Agilent

Chroma Bond

Nước siêu sạch

* Cách pha:

Chất chuẩn:

Dung dịch chuẩn gốc acrylamide - AA 500µg/ml: cân chính xác khoảng 25.0

mg acrylamide vào cốc có mỏ 5 ml, thêm nước siêu sạch để hoà tan và chuyển

dung dịch này vào bình định mức 50 ml, tráng rửa cốc nhiều lần, định mức đến

vạch bằng nước siêu sạch Dung dịch này được bảo quản ở 4oC, trong chai tối

màu, ổn định trong 1 năm

Dung dịch nội chuẩn acrylamide (2,3,3-D3) - AAD3 500µg/ml: cân chính xác

khoảng 12.5 mg acrylamide vào cốc có mỏ 5ml, thêm nước siêu sạch để hoà tan

và chuyển dung dịch này vào bình định mức 25 ml, tráng rửa cốc nhiều lần, định

mức đến vạch bằng nước siêu sạch Dung dịch này được bảo quản ở 4oC, trong

chai tối màu, ổn định trong 1 năm

Dung dịch chuẩn trung gian AA 100µg/ml: lấy chính xác 2.0 ml chuẩn gốc AA

500µg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu sạch đến vạch Dung dịch này được bảo quản trong chai tối màu, ở 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định trong

2 tháng

Dung dịch chuẩn trung gian AA 10µg/ml: lấy chính xác 0.2 ml chuẩn gốc AA

500µg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu sạch đến vạch Dung dịch này được bảo quản trong chai tối màu, ở 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định trong

2 tháng

Dung dịch nội chuẩn AAD3 10µg/ml: lấy chính xác 0.2 ml chuẩn gốc AA

500µg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu sạch đến vạch Dung dịch này được bảo quản trong chai tối màu, ở 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định trong

2 tháng

Dung dịch chuẩn trung gian AA 1µg/ml: lấy chính xác 1 ml chuẩn gốc AA

10µg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu sạch đến vạch Dung dịch này được bảo quản trong chai tối màu, ở 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định trong 1 tuần

Dung dịch nội chuẩn AAD3 1µg/ml: lấy chính xác 1 ml chuẩn gốc AAD3

10µg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu sạch đến vạch Dung dịch này được bảo quản trong chai tối màu, ở 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định trong 1 tuần

Chuẩn làm việc: được chuẩn bị theo bảng 2.2

Bảng 2.2: Chuẩn bị dung dịch làm việc

Chuẩn V-dd AAD3 1µg/ml

(µl)

V-dd AA 1µg/ml (µl) Tổng thể tích (ml) Nồng độ AAD3 (ng/ml)

Chuẩn

V-dd AAD3 1µg/ml (µl)

V-dd AA 1µg/ml (µl)

Tổng thể tích (ml)

Nồng độ AA (ng/ml)

V-dd AA 10µg/ml (µl)

Tổng thể tích (ml)

Nồng độ AA (ng/ml)

6 50 20 1 200

V-dd AAD3 1µg/ml (µl)

V-dd AA 100µg/ml (µl)

Tổng thể tích (ml)

Nồng độ AA (ng/ml)

Dung môi:

Dung dịch HCOOH 0.01%: thêm 100µl HCOOH 100% vào 999.9 ml nước siêu

sạch, lắc đều đánh siêu âm

Dung dịch HCOOH 0.1%: thêm 1000µl HCOOH 100% vào 999.0 ml nước siêu

sạch, lắc đều đánh siêu âm

Dung dịch HCOOH 0.5%: thêm 5000µl HCOOH 100% vào 995.0 ml nước siêu

sạch, lắc đều đánh siêu âm

Dung dịch HCOOH 0.01% - ACN (85:15): trộn 850 ml dung dịch HCOOH

0.01% với 150 ml ACN, khuấy đều, đánh siêu âm

Dung dịch HCOOH 0.01% - ACN (95:5): trộn 950 ml dung dịch HCOOH

0.01% với 50 ml ACN, khuấy đều, đánh siêu âm

Dung dịch HCOOH 0.01% - ACN (98:2): trộn 980 ml dung dịch HCOOH

0.01% với 20 ml ACN, khuấy đều, đánh siêu âm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện để phân tích Acrylamide trên đầu dò khối phổ

- Khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện để phân tích Acrylamide trên hệ thống sắc ký lỏng

- Khảo sát một số quy trình xử lý, tách chiết Acrylamide trên nền mẫu Snack khoai tây và mì ăn liền

- Xây dựng quy trình định lượng Acrylamide

- Thẩm định quy trình định lượng Acrylamide bằng các phương pháp thống

kê

- Áp dụng phương pháp được xây dựng trên đối tượng là các mẫu snack khoai tây và mì ăn liền

2.2.1 Khảo sát các thông số khối phổ:

Nguồn ion hoá:

Để tạo được ion ổn định trong phân tích acrylamide 2 kỹ thuật ESI và APCI đều

có thể sử dụng do acrylamide không bền nhiệt, phân cực (thích hợp khi sử dụng ESI) và có khối lượng phân tử nhỏ (thích hợp khi sử dụng APCI) Tham khảo từ các nghiên cứu [16], [24], [25], [27], [36], [38], [42] chúng tôi chọn ESI + làm

kỹ thuật ion hoá

Tối ưu nguồn ion hoá và hệ thống MS/MS: [4]

Dùng chương trình tự động có trong phần mềm Analyst 1.5 để tối ưu hoá các thông số của hệ thống (Compound Optimization, FIA Optimazation of ion source)

* Compound Optimization – tối ưu hoá hợp chất xác định trên khối phổ

- Nhận danh ion mẹ và ion con (Q1 Scan và Product ion scan)

Tiêm trực tiếp chuẩn Acrylamide (AA) 100µg/l và Acrylamide-D3

(AAD3) 100µg/l vào buồng ion hoá, không qua cột sắc ký để nhận danh

thông qua tỉ lệ m/z để tìm mảnh mẹ (Q1 scan) và mảnh con (Product ion

scan)

- Tối ưu hoá các thông số khối phổ (Optimization of MS parameters):

Tiêm trực tiếp chuẩn AA và AAD3 nồng độ 100 µg/l vào đầu dò khối

phổ bằng bơm syringe pump (chế độ infusion) tốc độ 0.7 µl/phút

Tìm thế tạo ion mẹ DP:

Sử dụng kiểu chạy “Q1 MS” để xác định thế tạo ion DP Khảo sát theo thế

mặc định trong phần mềm (5V – 200V), bước nhảy (step) cố định: 5V

Chọn thế cho ra cường độ tín hiệu (intensity) của ion mẹ cao nhất

Tìm năng lượng phân mảnh ion CE:

Sử dụng kiểu chạy “product ion” để xác định năng lượng phân mảnh ion

CE Khảo sát theo thế mặc định trong phần mềm, bước nhảy (step) cố

định: 5V Chọn năng lượng cho ra cường độ tín hiệu của ion con là cao

nhất

* FIA Optimazation of ion source – Tối ưu hoá nguồn tạo ion bằng kỹ thuật

phân tích tiêm dòng

Tiêm chuẩn AA, AAD3 nồng độ 100 µg/l và dung môi pha động vào đầu dò khối

phổ bằng bộ tiêm mẫu tự động và bơm LC

Bảng 2.3: Các thông số khảo sát của nguồn ion hoá bằng kỹ thuật FIA

Khí va đập – Collision Gas (CAD) (psi) 3; 4; 5;6

Khí làm sạch – Curtain Gas (CUR) (psi) 10; 15;20

Khí phun sương – Neb Gas (GS1) (psi) 30; 35; 40; 45

Khí bay hơi dung môi – Turbo Gas (GS2) (psi) 30; 35; 40; 45

Thế ion hoá – Ion Spray Voltage (IS) (V) 1500 - 5500

Nhiệt độ khí làm khô – Temperature (TEM) (oC) 400 – 700

* Chọn thông số tối ưu và nhập vào phương pháp chạy

2.2.2 Khảo sát các thông số sắc ký

Acrylamide là chất rất phân cực, thời gian lưu giữ trên cột sắc ký lỏng pha đảo khá kém, khi sử dụng các đầu dò khác khối phổ khó đạt được độ nhạy và độ chính xác mong muốn

Đối với việc phân tích acrylamide sử dụng đầu dò khối phổ, nhiều nghiên cứu đã chọn cột sắc ký pha đảo Cột được chọn phải tạo được sự cân bằng trong lưu giữ những chất phân cực và không phân cực Theo các nghiên cứu [28], [32],[33],[41], các cột sắc ký pha đảo thường được chọn là Hypercarb, Atlantis dC18, Inerstsil ODS 3…, là những cột pha đảo với cấu trúc được thiết kế phù hợp cho phân tích các hợp chất từ phân cực đến kém phân cực

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột phân tích: Inertsil ODS – 3V, 5 µm,

150 mm x 4,6 mm

2.2.2.2 Chọn pha động:

Acrylamide là chất phân cực, dung môi pha động được chọn là nước có bổ sung acid formic (làm tăng khả năng ion hóa của acrylamide) và một lượng vừa phải ACN để lôi kéo bớt tạp chất của nền mẫu tách ra khỏi chất cần phân tích

2.2.3 Khảo sát quy trình chiết acrylamide trong mẫu snack và mì gói

Để phân tích Acrylamide trong mẫu chúng ta phải chọn được dung môi chiết nó hòan tòan ra khỏi nền mẫu, loại bỏ các tạp chất để mẫu phân tích được sạch, tránh làm thoái hóa cột phân tích, tránh các hiện tượng ảnh hưởng nền (matrix effect) như hiện tượng giảm ion (ion suppression) đến quá trình phân tích trên máy Các tạp chất có trong nền mẫu cần phải loại bỏ: Các protein, tinh bột, các hợp chất béo, các hợp chất màu, các loại phụ gia tạo vị, chất bảo quản, các loại muối

2.2.3.1 Chọn khối lượng mẫu xử lý:

Theo các nghiên cứu [7], [17], [18], [24], [25], [26], [32], [34], [36], [38], [40],

AA trong các nền mẫu và thiết bị phân tích Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn lấy 1g mẫu để phân tích, lượng mẫu phù hợp với hàm lượng acrylamide theo khảo sát [10] không quá nhỏ để phát hiện và lượng tạp vừa phải có thể loại

bỏ

2.2.3.2 Chọn dung môi chiết:

Dung môi chiết phải chiết được hòan toàn acrylamide ra khỏi nền mẫu mà không kéo theo tạp chất, theo hầu hết các nghiên cứu nước là dung môi thường được chọn lựa, nhưng đồng thời hòa tan một số protein có trong mẫu khoai tây (những chất cùng chiết có cùng m/z) [34]

.Chúng tôi tiến hành khảo sát các loại dung môi và hỗn hợp dung môi hòa tan tốt

nhất acrylamide: nước, methanol, ethanol (bảng 1.1) và theo nghiên cứu [26], aceton là dung môi hòa tan tốt acrylamide mà không kéo theo các tạp chất khác

có trong mẫu

2.2.3.3 Chọn cách thức làm sạch dung dịch chiết:

Theo hầu hết các nghiên cứu, làm sạch dung dịch chiết bằng cột chiết pha rắn SPE được sử dụng, các quá trình này khá hiệu quả nhưng lại rất tốn kém (cột SPE đắt tiền)

Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn làm sạch dựa vào việc loại béo bằng Hexan, hấp phụ các tạp chất (protein tan trong nước, đường, phẩm màu tan trong nước ) trên lượng nhỏ vừa phải PSA và MgSO4

n-Ta có quy trình phân tích tổng quát cần xây dựng:

Hình 2: Sơ đồ tổng quát qui trình phân tích acrylamide

Cặn Loại béo Chiết trực tiếp Hexane

Dịch chiết Chiết AA Dung môi đơn: nước, aceton, MetOH, EtOH Hỗn hợp dung môi

Dịch mẫu đã làm sạch

Làm sạch PSA MgSO

4

LC-MS/MS Phân tích

1g mẫu

2.3.4 Cách thức xác định giá trị sử dụng của phương pháp thử: [1], [2], [3],

- Phân tích mẫu thử hoặc mẫu trắng thêm chuẩn ở hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần So sánh kết quả với mẫu trắng, phải cho tín hiệu chất cần phân tích

- Phân tích mẫu không có chất phân tích nhưng có chất cấu trúc tương tự chất phân tích (nếu có): Phải cho kết quả âm tính (đối với phương pháp định tính) và không được ảnh hưởng đến kết quả định lượng của chất phân tích (đối với phương pháp định lượng)

- Trong trường hợp những chỉ tiêu phân tích không thể có mẫu trắng (sample blank) để xác định tính chọn lọc/đặc hiệu, có thể thực hiện các thí nghiệm trên các mẫu trắng thuốc thử (reagent blank), tức là thực hiện phân tích các bước tương tự như khi phân tích mẫu nhưng không có mẫu

thử

- Sắc ký khối phổ

Sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt

để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP (điểm nhận dạng – identification point) đối với các phương pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất Cách tính điểm IP đối với các kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ khác nhau được quy định theo bảng 2.4

Bảng 2.4: Số điểm IP đạt được đối với các kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối

phổ

LC-MS/MS 1 ion mẹ, 2 ion con 4 (1 + 2 x 1.5)

LC-MS/MS/MS 1 ion mẹ, 1 ion con, 2

ion cháu

5.5 (1 + 1 + 2 x 1.5)

Đối với mẫu dương tính thực hiện đánh giá tỉ lệ ion phụ so với ion chính theo bảng 2.5

Bảng 2.5: Qui định tỉ lệ ion phụ so với ion chính theo 2002/657/EC

Tỉ lệ ion phụ (% so với ion chính) Giới hạn sai lệch cho phép trên

- Bao gồm đường chuẩn sử dụng cho việc định lượng

- Bao phủ từ 0 – 150% hoặc từ 50% - 150% nồng độ quan tâm hoặc nồng

độ thường gặp phải (MRPLs, PLs)

- Nên lặp lại ít nhất 2 lần hoặc hơn khi thực hiện xác định khoảng tuyến tính nhằm thể hiện tính ngẫu nhiên trong phân tích

2.3.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD):

- Cách 1: sử dụng tỉ số tín hiệu trên nhiễu nền (S/N):

o Phân tích ít nhất 20 mẫu thực không chứa chất phân tích

o Đo nhiễu nền (N) tại vùng xuất hiện của peak chất cần phân tích

o Thêm chuẩn vào mẫu ở các nồng độ nhỏ dần đến khi đạt được tỉ số S/N ≥ 3

o Nồng độ cho tín hiệu với S/N ≥ 3 là LOD của phương pháp

o Tính giá trị trung bình TB và độ lệch chuẩn SD từ các kết quả thu được

o LOD được tính theo công thức LODcal = 3xSD

o Đánh giá LOD đã tính được: R = TB/ LODcal

o Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

o Nếu R < 4 thì LOD của phương pháp lớn hơn giới hạn tính toán, cần phân tích lại với việc thêm chuẩn nhiều hơn và tính lại R

o Nếu R > 10 thì LOD của phương pháp nhỏ hơn giới hạn tính toán, cần phân tích lại với việc thêm chuẩn ít hơn và tính lại R

- Xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu đã thêm chuẩn theo phương pháp cần xác định giá trị sử dụng

- Tính hàm lượng cho từng mẫu phân tích

- Tính hàm lượng trung bình, độ lệch chuẩn SD, độ lệch chuẩn tương đối RSD % ( r (%) ) cho các mẫu thêm chuẩn

- Tính độ lệch chuẩn tương đối trung bình cho tất cả các mẫu phân tích Các công thức tính:

i end i

i

C V X

m

×

=Trong đó,

Xi : Hàm lượng tìm thấy của mẫu i (ng/g)

Ci : Nồng độ của mẫu phát hiện trên máy theo đường chuẩn ( ng/ml)

Vend: Thể tích định cuối của mẫu (ml)

mi: Khối lượng mẫu i (g)

Hàm lượng trung bình i

TB

X X

trong đó Xilà hàm lượng tìm thấy và n là số mẫu khảo sát

Độ lặp lại r được chấp nhận khi r ≤ 20% [1]

2.3.4.6 Độ tái lặp trong phòng thí nghiệm:

- Chọn 24 mẫu (cùng nền mẫu) thêm chuẩn mỗi 6 mẫu tại các nồng độ 200; 500; 1000; 5000 ng

- Lặp lại bước trên ít nhất 2 lần với người thao tác khác nhau và trong những điều kiện môi trường khác nhau ( hóa chất, thuốc thử lô khác nhau, nhiệt độ phòng khác nhau, thiết bị khác nhau…) nếu có thể

- Xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu đã thêm chuẩn theo phương pháp cần xác định giá trị sử dụng

- Tính hàm lượng trung bình, độ lệch chuẩn SD, độ lệch chuẩn tương đối RSD % cho các mẫu thêm chuẩn

Các công thức tính:

Hàm lượng trung bình i

TB

X X

n

= ∑

trong đó Xilà hàm lượng tìm thấy và n là số mẫu khảo sát

Độ lặp lại Rw được chấp nhận khi Rw ≤ 20% [1]

- Độ tái lập nội bộ phòng thí nghiệm được đánh giá thông qua hệ số RW và

độ đồng nhất thống kê của các kết quả thử nghiệm trong những điều kiện môi trường khác nhau

- Sử dụng phân tích phương sai 1 yếu tố của phần mềm Excel 2003 để đánh giá đồng nhất thống kê của các kết quả thử nghiệm trong những điều kiện môi trường khác nhau

2.3.4.7 Độ đúng:

Muốn xác định độ đúng cần phải tìm được giá trị đúng thông qua sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận) và phương pháp xác định độ thu hồi

- Sử dụng CRM (certified reference material – vật liệu chuẩn được chứng nhận) được cung cấp bởi các tổ chức có uy tín trên thế giới Các mẫu CRM luôn có kết quả kèm theo khoảng dao động, do đó khi phân tích mẫu CRM có thể đánh giá được độ đúng dựa vào khoảng dao động cho phép

• Phân tích lặp lại 6 lần mẫu vật liệu chuẩn đã được chứng nhận (CRM)

• Nhiều tổ chức có uy tín như USFDA, EURACHEM, ICH quy định tính độ chệch (bias) để xác định độ đúng như sau: