CÔNG NGHỆ CHUYỂN GENE Ở THỰC VẬT

Chuyển gene là đưa 1 đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau. Chuyển gene ở Thực vật là quá trình chuyển một hoặc một số DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật nhằm tạo ra tính trạng mới mà trước đó loại thực vật đó không có theo mong muốn của con người.

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN GENE Ở THỰC VẬT

III CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

IV MỘT SỐ THÀNH TỰU

I KHÁI NIỆM CHUNG

I KHÁI NIỆM CHUNG

1 Chuyển gene

Chuyển gene là đưa 1 đoạn DNA ngoại lai vào genome của một cơ thể

đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau

2 Chuyển gene ở Thực vật

Chuyển gene ở Thực vật là quá trình chuyển một hoặc một số DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật nhằm tạo ra tính trạng mới mà trước đó loại thực vật đó không có theo mong muốn của con người

3 Thực vật chuyển gene

Là thực vật mà cơ thể chúng có gen ngoại lai chèn vào trong DNA

genome của nó Gene ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào sinh dục

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

• Các bước cơ bản của quá trình chuyển gene:

- Xác định gene liên quan đến tính trạng quan tâm

- Phân lập gene (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện genomic DNA)

- Gắn gene vào vector biểu hiện để biến nạp

- Biến nạp vào E.Coli

- Tách chiết DNA plasmid

- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác nhau

- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc

- Tái sinh cây biến nạp

- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gene (PCR hoặc Southern blot) và đánh giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA

hoặc các thử nghiệm in vivo khác…)

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

Chuyển gene trực tiếp

Nhờ Agrobcacterium

tumefaciens

Nhờ vector virus

Bằng vi đạn Bằng kĩ thuật xung

điện

PP vi tiêm

Bằng kĩ thuật siêu

âm Chuyển trực tiếp vào

protoplast

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

1.Chuyển gene gián tiếp

a.Nhờ Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium có khả năng lây nhiễm thực vật bằng cách chuyển 1

đoạn DNA của nó (T-DNA) vào tế bào chủ Khi DNA vi khuẩn hợp nhất với NST thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn Kết quả là gây ra bệnh khối u hình chóp và bệnh rễ tơ ở nhiều loài cây cảnh và cây ăn quả

Hình 1 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

* Nguyên lý:

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như 1 vector chuyển

gene các nhà khoa học đã loại bỏ các gene gây khối u và gene mã hóa opine ở vùng T-DNA và thay thế vào đó là các gene chỉ thị và gene

ngoại lai mong muốn, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và trái của T-DNA và các gene vir Gene ngoại lai sẽ được chuyển vào tế bào và hợp nhất với NST của genome

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Ưu điểm

- Gene ít bi đào thải

- Số lượng bảo sao ít hơn Do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau

- Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật

•Nhược điểm

- Có phổ tấn công giới hạn

- Ít có khả năng gây khối u cho cây một Lá mầm (do nhóm cây này tiến hóa nhất nó tích lũy nhiều cơ chế kháng bệnh, các tế bào bị thương có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo như cây Hai lá mầm)

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

1.Chuyển gene gián tiếp

b Nhờ vector virus

Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, người ta còn dùng virus làm vector

chuyển gen vào cây trồng Chuyển gen nhờ virus có thể thuân lợi vì virus

dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật, đồng thời virus có thể mang đoạn DNA lớn hơn nhiều so với khả năng của plasmid

Tuy nhiên, virus làm vector phải đáp ứng các tiêu chí sau:

+ Hệ gen của virus là DNA

+ Virus có khả năng di chuyển từ TB sang TB khác qua các lỗ ở vách

tê bào

+ Có phạm vi ký chủ rộng (trên nhiều loài cây)

+ Không gây hại đáng kể đến thực vật

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Ưu điểm:

- Hiệu quả chuyển gen cao

- Biểu hiện gen mạnh trong tế bào vật chủ

•Nhược điểm:

- Thao tác phức tạp

- DNA của virus khó ghép nối với hệ gen thực vật.

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Nguyên lý

Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại năng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt) Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng Sự bùng nổ khí helium ở 1000 psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ

1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng

về phía các tế bào đích Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA

Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối Các tế bào biến đổi di truyền có thể được

sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng

Các tế bào đơn đã chọn lọc có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn

bộ cây Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Hình 5 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của hệ thống dội bom.

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Ưu điểm:

- Thao tác dễ dàng

- Có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô

- Các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao

- Cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn

•Nhược điểm:

- Đòi hỏi thiết bi đắt tiền

- Tần số biến nạp ổn định thấp, chỉ nghiên cứu các gene tạm thời Tuy nhiên, gần đây phương pháp này đã thành công trên lúa, đu đủ, bông đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

b Sử dụng kĩ thuật xung điện

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Nguyên lý của phương pháp này là một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong

tế bào

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Hình 6 Cuvette nhựa có điện cực (trái) và máy xung gene (hãng Biorad)

(phải)

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Hình 7 Sơ đồ bố trí mạch điện của máy xung gene.

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện

áp cao Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù

tế bào Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5 - 1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di

10.000-II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Quy trình: Tạo dung dịch tế bào huyền phù

Tạo xung điện với hiệu điện thế cao, trong thời gian ngắn

Protoplast bị thủng một số chỗ DNA thâm nhập, gắn vào hệ gene thực vật Nuôi cấy trong môi trường thích hợp, tách các protoplast đã được biến nạp

Nuôi cấy in vitro, tái sinh cây

Chọn lọc cây chuyển gene

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Ưu điểm

- PP này có thể thực hiện với các mô in vivo còn nguyên vẹn

- Đoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn

•Nhược điểm

- Tỉ lệ các tế bào được chuyển gene còn thấp

- Sức sống của tế bào giảm khi đột ngột bị sốc điện

- Việc tái sinh ở một số loài còn khó khăn

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

c Sử dụng vi tiêm

Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA  được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương đối cao

Vi tiêm được tiến hành trên hệ thống thiết bị vi tiêm Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao tác

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Hình 8 Các máy làm kim (hãng Narishige)

1 Máy gia cố kim Microforge

2 Máy mài kim

3 Máy kéo kim tự động Pipette Puller.

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

Hình 9 Máy vi thao tác Olympus (Hãng Narishige)

1 Kính hiển vi soi ngược      2 Máy vi điều chỉnh

Hình 10 Vi tiêm DNA vào tế bào.

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Ưu điểm:

- Có thể tối ưu lượng DNA đưa vào tế bào

- Quyết định được đưa DNA vào loại tế bào nào

- Có thể đưa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được

- Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù hạn chế về số lượng cũng có thể tiêm chính xác

- Có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây

•Nhược điểm

- Mỗi lần chỉ tiêm được 1 phát tiêm và chỉ với 1 tế bào

- Thao tác đòi hỏi độ chính xác cao

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

d Chuyển trực tiếp vào protoplast

Ðể DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast Protoplast có thể được duy trì trong môi

trường nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này Quá trình chuyển gen như thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản, không cần có vector

Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với PGE (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện

Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ

Agrobacterium không thể thực hiện được

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Ưu điểm:

- Hiệu quả chuyển gene cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công

- Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền

•Nhược điểm:

- Qúa trình phức tạp, tốn nhiều công sức

- Chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

e Sử dụng kĩ thuật siêu âm

Chuyển gene bằng cách sử dụng sóng siêu âm làm cho protoplast

bị biến đổi tạo các lỗ giúp cho DNA ngoại lai xâm nhập vào tế bào

Hình 11 Máy tạo sóng siêu âm.

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

Sau khi siêu âm, đem các protoplast nuôi trong môi trường thích hợp, chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gene Nuôi cấy in vitro để tái sinh cây Chọn lọc cây và đem trồng môi trường ngoài

II MỘT SỐ KĨ THUẬT CHUYỂN

GENE Ở THỰC VẬT

•Ưu điểm:

- Chuyển được lượng protoplast nhiều

- Không độc hại với tế bào

•Nhược điểm

- Gía thành thiết bị tương đối cao

- Đòi hỏi thao tác và thời gian thực hiện chuẩn xác

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Một số hướng nghiên cứu chính trong lĩnh vực này như sau: Cây trồng chuyển gene kháng các nấm gây bệnh, cây trồng chuyển gene kháng các vi khuẩn gây bệnh, cây trồng chuyển gene kháng virus gây bệnh, cây trồng chuyển gene kháng côn trùng phá hoại, cây trồng chuyển gene cải tiến các protein hạt, cây trồng chuyển gene sản xuất những loại protein mới, thực vật biến đổi gene để sản xuất các acid béo thiết yếu, làm sạch đất ô nhiễm, làm thức ăn chăn nuôi…

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

2.1 Cây trồng chuyển gene kháng các nấm gây bệnh

Nấm bệnh là những tác nhân gây hại cây trồng rất nặng, nhất là ở các nước nhiệt đới có độ ẩm cao

Các enzyme làm thoái hóa các thành phần chính của vỏ tế bào nấm chitin và β-1,3 glucan là loại đang được chú ý Khi chuyển gene chitinase vào cây thuốc lá đã tăng hoạt tính kháng nấm gây hại Sự biểu hiện đồng thời của cả hai gene chitinase và glucanase trong thuốc lá làm cho cây có tính kháng nấm gây hại cao hơn cây có một gene độc lập Tương tự, cà chua cho tính kháng nấm Fusarium cao hơn hẳn sau khi được chuyển cả hai gene nói trên

2.2 Cây trồng chuyển gene kháng các vi khuẩn gây bệnh

Đối với bệnh vi khuẩn, hướng nghiên cứu tạo giống mới bằng công nghệ gene chỉ mới bắt đầu

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

2.3 Cây trồng chuyển gene kháng côn trùng phá hoại

Sử dụng hóa chất để phòng trừ sâu bọ côn trùng vừa đắt tiền vừa tác động xấu đến môi trường Các cây trồng như bông, ngô và khoai tây chuyển gen đang được sản xuất thương mại biểu hiện độc tố của Bacillus thuringensis (Bt) để tạo ra tính kháng đối với các côn trùng loại nhai-nghiền (chewing insects) Vi khuẩn B thuringensis tổng hợp các protein δ-endotoxin tinh thể được mã hóa bởi các gen Cry Khi côn trùng ăn vào bụng, các prototoxins bị đứt gãy trong dạ dày kiềm của côn trùng để tạo thành độc tố hoạt động Các liên kết này tạo ra thành các lỗ chân lông và cuối cùng là gây chết côn trùng

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Ngô chuyển gen Bt có khả năng tiêu diệt chọn lọc các côn trùng gây hại và

cây ngô tự nhiên không chuyển gene.

2.4 Cây trồng chuyển gene cải tiến các protein hạt

Công nghệ chuyển gene ở thực vật 10/14 Người ta đã đưa gen mã hóa cho một loại protein chứa các amino acid có lưu huỳnh cao bất thường vào cây đậu lupin với mục đích biểu hiện ở hạt Kết quả là tăng 100% hàm lượng protein trong hạt Hạt này được dùng để nuôi cừu, tăng trọng lượng 7% và sản lượng lông tăng 8% so với cừu nuôi bằng loại hạt bình thường Thành công này thúc đẩy các nhà nghiên cứu đưa gen này vào biểu hiện ở lá cây cỏ, nhằm cải tiến cân bằng amino acid không thay thế ở dạ cỏ

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Hạt và hoa của cây đậu Lupin

2.5 Cây trồng chuyển gene sản xuất những loại protein mới

Ví dụ điển hình của hướng ứng dụng này: Người ta đã tạo ra được hai loại thuốc lá chuyển gene, mỗi loại có khả năng sản xuất một trong hai mạch immunoglobin nhẹ và nặng Thế hệ con sinh ra từ sự lai hai loại cây trên biểu hiện được một kháng thể hoạt động gồm hai loại mạch với hàm lượng cao (1,3% tổng protein của lá) và có tất cả các đặc tính của một kháng thể đơn dòng sản sinh từ hybridoma Thaumatin là những protein được chiết xuất từ thịt quả của cây Thaumatococus danielle, có độ ngọt gấp 1.000 lần đường saccharose Người ta đã thành công trong việc chuyển một gen mã hóa cho thaumatin (thaumatin II) vào cây khoai tây, tạo một cây khoai tây có lá, thân rễ, củ đều ngọt Kết quả này mở ra một triển vọng rất lớn đối với cây ăn quả ngọt

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

2.6.Thực vật biến đổi gene để sản xuất các acid béo thiết yếu

Như chúng ta biết, nguồn cung cấp chủ yếu về các acid béo thiết yếu là dầu cá và tài nguyên hải sản đang bị cạn kiệt và sự gia tăng độc tố

ở các loại hải sản khác nhau cũng đang trở thành một nguy cơ tiềm tàng

Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất các acid béo thiết yếu có tiềm năng to lớn trong việc phát triển một nguồn cung cấp thay thế

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Cây Arabidopsis thaliana.

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU

2.8 Làm thức ăn chăn nuôi

Một thế hệ cây trồng chuyển gene mới, được thiết kế đặc biệt cho ngành chăn nuôi đang được phát triển Những loại cây trồng này được thiết kế với những thay đổi quan trọng về hàm lượng các thành phần chính (ví dụ: protein và amino acid) hay các thành phần thứ yếu (ví dụ: các loại vitamin và khoáng chất) Vì những loại cây trồng chuyển gene này được dùng với mục đích làm thức ăn chăn nuôi nên sẽ khác với các loại cây trồng bình thường, tiến trình chuẩn y các loại cây trồng này sẽ cần có thêm những đánh giá về sự an toàn của chúng khi để con người và vật nuôi tiêu dùng

II CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU